Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия тРНК и тРНК-метилаз флуоресцентными и оптическими методами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия тРНК и тРНК-метилаз флуоресцентными и оптическими методами"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ кОЛЕКУЛЯРНОИ БИОЛОГШ

На правах рукописи УДК 577.217

КУЗНЕЦОВА Наталья Вадимовна

Изучение взаимодействия тРНК и тР1Ж-метилаз фяуоресцентньшш и оптическими методами

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в лаборатории физики биополимеров Института молекулярной биологии АН СССР

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, член-корр. АН СССР Волькенштейн М.В.

кандидат физико-математических наук Борисова О.Ф.

доктор биологических наук Фаворова 0.0.

кандидат физико-математических наук Разживия А.П.

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова

АН СССР

Защита состоится " ¿-¿-ссИгЯ- 19^8 года в часов на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Официальные оппоненты:

молекулярной биологии АН СССР

Автореферат разослан

года

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транспортные РНК занимают центральное место в биосинтезе белка, выполняя функцию адапторной молекулы, ответственной за перевод последовательности нуклеотидных триплетов в последовательность аминокислот.

В настоящее время молекулы тРНК достаточно хорошо охарактеризованы по первичной, вторичной и третичной структуре. Установлено принципиальное единство вторичной структуры ("клеверный лист") и пространственной организации (ь - конформация) различных тРНК.

Для обеспечения безошибочной реализации геномной информации тРНК разной аминокислотной специфичности, должны обладать индивидуальными особенностями структуры в пределах общейь - конфорыации.

Уникальное разнообразие химической структуры тРНК достигается благодаря присутствию в молекуле модифицированных (необычных) нуклеотидов. Наиболее распространенной модификацией полинуклео-тидной цепи является метилирование. Этот процесс катализируется рядом высокоспецифичных ферментов - тРНК-метилтрансфераз (К.Ф.2. 1.1.). Метилазы переносят метильнуго группу с б -аденозил-ь -мети-онина на определенный атом одного из 4-х нуклеотидов, занимающего строго определенное положение в цепи тРНК, или на 2Г-гидроксильную группу рибозы.

Известно, что метилирование повышает термостабильность тРНК, стабилизирует ее третичную структуру, в раде случаев влияет на скорость аминоацилирования. Степень посттранскрипционных модификаций, в частности, метилирования тесно связана с физиологическими и патологическими процессами в клетке. Однако роль различных модификаций тРНК остается до конца не выясненной (Киселев и др., 1984, ВЗ'огк et а!,1987).

Метилтрансферазы представляют собой удобный объект для изучения общих принципов функционирования олигомерных ферментов. Фермент-субстратные комплексы метилазы и тРНК являются хорошей моделью для исследования общих принципов белково-нуклеинового узнавания, а также проблемы специфичности ферментов.

Метилтрансферазы, вследствие их лабильности и сложности выделения в гомогенном состоянии, изучены относительно слабо.

Для рада тРНК-метилтрансфераз, например, (гуанозин-2-) Т.ШегторЫХив НВ27, (аденин-1-) Т. ъЬегторМ1ивНВ8£аденин-1-) и. (гуанин-Т-) печени крысы определены молекулярные массы ферментов, константы Михаэлиса и максимальная скорость реакции метилирования.

В ряде случаев достигнут успех в изучении механизмов взаимодействия метилаз и тРНК. Показано, что третичная структура тРНК играет существенную роль в метилировании ( Venkstern, 1971» Shershneva et al., 1973i Matsumoto et al., 1937)« Получены данные о роли различных участков молекулы тРНК в образовании комплекса с метилазами (Гамбарян, 1980).

Данные о структуре комплексов, содержащих метилтрансферазу, о взаимном структурном влиянии фермента и субстрата при образовании комплекса в настоящее время практически отсутствуют. Изучение этой стороны вопроса представляется достаточно актуальным.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении первой стадии каталитической реакции метилирования тРНК - образования фермент-субстратного комплекса. В качестве объекта были выбраны тРНК(аденин-1-)-метилтрансфераза Therms -thermophilus НВ8 (К.Ф.2.1Л.36) (далее метилаза) и индивидуальные тРНК дрожжей и Escherichia coli.

В задачи работы входило исследование субъединичного строения фермента и структурных перестроек молекулы белка в широком диапазоне изменений концентрации метилазы и температуры раствора (204 Т4 90°С), а также изучение стабилизирующего действия инертных белков и субстрата - тРНК на структуру фермента.

Так как исследуемый фермент выделен из экстремальных термофильных организмов, выяснялись возможные механизмы, повышающие термостабильность белка.

Дальнейшее исследование затрагивало различные аспекты комп-лексообразования метилазы и тРНК: определение констант ассоциации фермент-субстратных комплексов и числа субъединиц белка, взаимодействующих с тРНК (20 4 Т 480°С), термостабильность тРНК в комплексе, изучение жесткости связывания белкового и нуклеинового компонентов и пространственной структуры фермент-субстратных комплексов.

Задачи работы включали также исследование влияния фермента на вторичную и третичную структуру тРНК при образовании комплекса. Изучался один из принципиальных вопросов о возможном восстановлении высшей структуры тРНК при взаимодействии с метилазой в интервале температур, превышающих темпзратуру плавления тРНК (^вО^).

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведен детальный анализ четвертичной (субъединичной) структуры тРНК(аденин-1-)-метилтрансферазы Thermus thermophilus НБ8 с использованием ряда'флуоресцентных и других оптических методов. Показано, что фермент имеет лабильную субъединичную структуру. В зависимости от концентрации белка в растворе и температуры (20 4Т470°С) в состав молекулы метилазы входит от одной до 8+2 субъединиц, фермента одинаковой молекулярной мессы (25000).

Определена область критических концентраций белка (< 20мкг/мл^ или 8•Ю~'м субъединиц), в которой олигомеры метилазы диссоциируют на субъединицы. Следствием этого процесса является уменьшение удельной активности фермента»

В области 70 4Т 4 90°С обнаружен кооперативный переход молекул белка в крупные ассоциаты, размер которых (а ) по данным интенсивности рассеяния УФ-света а~320 нм. В присутствии тРНК размеры образующихся ассоциегов ¿<¿260+320 нм. Ассоциация метилазы, по-видимому, является одним из механизмов, повышающих термостабильность фермента. Этот результат имеет дбщее значение для термофильных белков. В последнее время аналогичные данные получены для глутаминовой синтетазы экстремального термофила Bacillus caldolytlcus (Merkler et al., 1988).

Разработан флуоресцентный метод определения относительного изменения степени спиральности нуклеиновых кислот в свободном состоянии и в комплексе с белками в средах, сильно' рассеивающих УФ-свет при высоких температурах (70-80°С). Метод основан на измерении квантового выхода флуоресценции, .константы связывания и кажущегося числа мест связывания бромистого этидия на двухцепо-чечных участках нуклеиновой кислоты.

С помощью разработанного метода впервые показано стабилизирующее действие лабильной субъединичной структуры фермента по отношению к субстрату. Структура тРНК остается стабильной при температурах, превышающих ее температуру плавления, только при образовании комплекса с 3 и более субъединицами фермента. Активными являются комплексы, молекулярная масса которых равна 100-170 кДа.

С помощью поляризованной флуоресценции бромистого этидия впервые показаны конформационные изменения в структуре тРНК при взаимодействии с ферментом. Добавление активного белка к расплавленной при 80°С'тРНК^ дрожжей приводит к ренатурации ее двухспиральных участков. Эффект восстановления высшей структуры специфичен по отношению к природе РНК.

Полученные результаты способствуют поиску аналогичных закономерностей лабильной четвертичной структуры белков (стабилизирующая, восстанавливающая) у других ферментов.

Разработанный метод н подходы, примененные в данной работе для изучения взаимодействия тРНК и тРНК-ыетилазы, могут быть с успехом использованы для исследования различных белково-нукдеиновых комплексов, в особенности при высоких температурах в рассеивающих свет средах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" (Дущино, 1985J, У1 Всесоюзном симпозиуме по конформационнкм изменениям в биополимерах и растворах (Тбилиси, 1985), на конкурсе научных работ молодых ученых ИМБ АН СССР ( 1986}, на 111 Симпозиуме "Равновесная динамика структуры биополимеров" (Дущино, 1987), У Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, 1987Jи на конкурсе научных работ Ш АН СССР(1987).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав литературный обзор, материалы и методы, экспериментальные результаты, обсуждение результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на -///"страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 7 таблиц. Список литературы включает -/¿о ссылок.

СОДЕРЖАШЕ РАБОТЫ

Принятые сокращения: БЭ - бромистый этвдий Трп - триптофан

дц - двухцепочечные участки нуклеиновой кислоты 1. МАТКРЛШ и методы

1.1. Препараты.

Исследуемый фермент тРНК(аденин-1-)-метилтрансфераза (К.Ф.2. 1.1.36) выделен по разработанной методике (Морозов и др., 1984) из бактерий Thermus thernophilus НВ8 в гомогенном состоянии. Удельную активность фермента определяли стандартным методом

(Morozov^ al.,1982)B качестве субстрата использованы индивидуальные тРНК^ дрожжей (Shershneva et а1,1973)и тРНК^ тРНК^'Escherichia coli фирмы "Boehringer Mannheim" (ФРГ). Бромистый зтидий фирмы "Serva" (ФРГ)..

Эксперименты проводили в О,(ИМ какодилатном буфере, рН 7, содержащем О,IM KaOl 0,002М IlgGlg (буфер А).

1.2. Флуоресценция бромистого этидия.

Молекулы БЭ флуоресцируют с высоким квантовым выходом при инте-ркаляции в двойную спираль нуклеиновых кислот с высокой константой связывания (Le Pecq, Paoletti, 1 дб^вободный и адсорбированный с низкой константой связывания на одноцепочечных участках нуклеиновой кислоты БЭ практически не флуоресцирует. Поляризация флуоресценции (Р) свободного БЭ равна 2—355. При связывании красителя с нуклеиновой кислотой величина Р значительно возрастает. Изменения интенсивности флуоресценции -позволяют использовать БЭ для оценки количества дц участков, доступных для взаимодействия с красителем, в свободной и связанной с белками нуклеиновой кислоте, а возрастание Р для изучения комплексообразования нуклеиновой кислоты и белков.

Контрольные опыты показали, что БЭ (4Ю~®М) не взаимодействует с метилазой (20^Т4 90°С) и не влияет на удельную активность фермента.

Степень поляризации флуоресценции Р связана с временем вращательной релаксации макромолекулы (j>) уравнением Перрена-Вебе-ра ( Perrin, 1934, Weher, 1952):

(I/P - l/3)/(I/P0 - 1/3) = (I + 3t/j>) Щ

где P - предельная величина поляризации для БЭ, адсорбированного на нуклеиновой кислоте, равная 41,55? при условии T/g—О, где вязкость раствора, Т - абсолютная температура ( PRWahl et al.,1970) t- длительность флуоресценции БЭ в комплексе с тРНК, измеренная на фазовом флуорометре и равная 18+0,5 не.

Величина j) зависит от гидродинамического объема (Т) (молекулярной массы), формы и внутренней гибкости макромолекулы. Для сферических молекул J> выражается в аналитическом виде:

¿^Зцу/ьТ (2)

С использованием ряда методов, в том числе, поляризованной флуоресценции, было показано, что молекула тРНК моделируется эллипсоидом вращения с отношением осей 2,5 (Surovaya et al., 1970).

По уравнению (I) вычислялиj>комплексов тРНК и метилазы.

1.3. Графики связывания бромистого этидия на тРНК.

Графики построены в координатах Скэтчарда как зависимость г/С^ от 1, гдet=C2/Cp - молярная концентрация связанного с тРНК БЭ, отнесенная к молярной концентрации нуклеотидов, С^ - концентрация свободного красителя в молях. Концентрацию связанного БЭ (С^) определяла флуориметрическим методом, измеряя интенсивность флуоресценции ({/) БЭ при наличии свободного и связанного с тРНК красителя, по уравнению:

с2/с0 * (а-VI)/Эх. (3)

$4, ~ интенсивность флуоресценции свободного и полностью связанного БЭ соответственно, С0 - суммарная концентрация красителя.

По наклону линейного участка графиков Скэтчарда определяли кажущуюся константу связывания (К), по пересечению линейного участка с осью абсцисс - кажущееся число мест связывания (а.) БЭ на тРНК (ин-теркалированный краситель).

График связывания БЭ на .ДНК и РНК, построенный флуориметрическим методом, хорошо удовлетворяет теоретической кривой, рассчитанной при условии, что БЭ взаимодействует с 3 нуклеотидными парами (Борисова и др., 1984, 1987).

1.4. Метод определения количества дв.ухцепочечных участков в тРНК, доступных для взаимодействия с БЭ, при высоких температурах в средах, сильно рассеивающих свет.

Разработанный метод основан на измерении квантового выхода (<^), константы связывания (К) и интенсивности флуоресценции (У ) БЭ. Метод применим в растворах с высокой ионной силой при малых заполнениях красителем нуклеиновой кислоты и позволяет оценить величину и, БЭ на свободной и связанной с метилазой тРНК в зависимости от температуры.

Для начального линейного участка графиков Скэтчарда можно записать (СгоШегБ, 1968) I

С2(Т)/С2(Т0) (4)

При условии К.С«I, используя (3) и (4):

(О-Ул)к^ У-Г „ (5)

Относительное изменение линейно связано с изменением интенсивности флуоресценции полностью связанного с тРНК БЭ (.

Если все дц участки нуклеиновой кислоты доступны для интеркаля-ции БЭ, то параметр л^/л^отражает изменение степени спиральное™ нуклеиновой кислоты в зависимости от температуры. При образовании

комплекса с белком часть дц участков может быть "экранирована" от взаимодействия с БЭ либо дестабилизирована. В этом случае Иу/Я^отражает относительное изменение количества дц участков, доступных' для связывания с БЭ.

Получены калибровочные кривые, характеризующие температурное изменение интенсивности флуоресценции'БЭ, связанного с нуклеиновой кислотой, как функцию Кг^т/Нт<1%о , а также Кт/К„ и •

1.5. Собственная флуоресценция фермента как метод изучения структуры метилазн и ее комплексов с тРНК.

Известно, что флуоресценция белков определяется ароматическими аминокислотными остатками: фенилаланином, тирозином и триптофаном.

Показано, что флуоресценция метилазы в УФ-области в значительной степени обусловлена Трп остатками. Флуоресценцию фермента исследовали при возбуждении 296 нм, где поглощение фенилаланиновых и ти-розиновых остатков практически отсутствует.

Наиболее чувствительными параметрами к изменению структуры метилазы являются интенсивность и поляризация флуоресценции Трп остатков фермента.

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре "Aminco SPF - 1000" (США).

1.6. Рассеяние света в УФ-области метилазой и фермент-субстратными комплексами исследовали при 230-350'нм в зависимости от температуры (20<Тб90°С). Коэффициент мутности {J-) (рассеяние) измеряли в единицах оптической плотности как кажущееся поглощение. При измерении ji при 280 нм учитывали поглощение метилазы (Ямакс = 280-283 нм). При 260, 300-350 нм вклад поглощения фермента в JL пренебрежимо мал.

Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре "Beckman" model 26, 27 (США).

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

2. Изучение субъединичной структуры метилазы Т. thermophilics НВ8.

2.1. Флуоресценция Трп остатков метилазы

Параметры собственной флуоресценции фермента приведены в таблице I. Анализ спектров флуоресценции мзтилазы и ее тушение йсдис-тым калием показали, что Трп остатки расположены как на поверхности, так и внутри белковой глобулы. Вклад в суммарную интенсивность внутренних (а^=0,3) и поверхностных Трп остатков (ао-0,36, 83=0,34) при концентрации метилазы-^.20 мкг/мл практически одинаков (классификация Трп остатков по Бурштейну, 1977).

Из сравнения данных по квантовому выходу ( ^эксп^ и Длительности флуоресценции ("Сэксп) с теоретически рассчитанными значениями ^ и следует, что на долю флуоресцирующих Трп остатков фермента приходится " 1/3 от их общего количества (см. табл. Я).

Таблица I

Параметры флуоресценции Трп остатков метилазы Г.йЬегторЬИие НВ8.

концент-i рация белка, мкг/мл i . макс' нм &JL, нм %коп %еор т эксп, НС ^Теор, не Р,%

»20 341 58 ~0,06 0,17 -2,7 2,9 ~12

3-5 -344 ~59 ~0,04 - - - -6

Примечание: Литс, - максимум и полуширина спектра флуоресценции метилазы, ъ, Р - квантовый выход, длительность и поляризация флуоресценции Трп остатков фермента.

2.2. Изменения в структуре фермента при его разбавлении до низких концентраций, исследованные при 20°С.

Молекула фермента состоит из одинаковых по молекулярной массе субъединиц (мол. масса субъединицы по данным электрофореза в денатурирующих условиях равна л25000). Молекулярная масса нативного белка, определенная методом гель-фильтрации, равная70000, что соответствует субъединицам белка (Морозов и др., 1984).

Известно, что удельная активность тРНК-метилаз уменьшается при их разведении. Присутствие инертных белков препятствует инактивации ферментов.

Для изучения структурных изменений в метилазе при ее разведении исследованы квантовый выход и поляризация флуоресценции Трп остатков фермента в присутствии и в отсутствие инертного белка (рис.1!

Рис.1. Зависимость квантового выхода (а) и поляризации флуоресценции (б) Трп остатков метилазы от ее концентрации в растворе. (I) - буфер А + 150 мкг/мл инсулина быка, (2) - буфер А, Т = 20°С.

При наличии в растворе инертного белка ^ и Р практически не меняются (кривая 1). В отсутствие инертного белка Р остаются постоянными только в области концентраций метилазы У> 20 мкг/мл (8'10~^М субъединиц) (кривая 2). Дальнейшее уменьшение концентрации фермента приводит к резкому падению и Р. Спектры флуоресценции сдвигаются на 2-4 нм в длинноволновую область (см. табл. I). Изменение этих параметров флуоресценции свидетельствует об увеличении вклада поверхностных Трп остатков метилазы в остаточную флуоресценцию фермента при низких концентрациях(3-5 мкг/мл), вследствие диссоциации олигомерных молекул метилазы на субъединицы. Диссоциация сопровождается уменьшением активности. Инертный белок препятствует распаду фермента на субъединицы.

2.3. Температурно-зависимые структурные изменения метилазы.

Спектры возбуждения и флуоресценции Трп остатков метилазы не меняются в интервале 20 Т < 80°С, интенсивность и степень поляризации уменьшаются (рис.2).

По возрастанию степени поляризации флуоресценции Трп остатков фермента (рис.2,б) и по увеличению рассеяния УФ-света (рис.3) в узком интервале температур (75-80°С) зарегистрирован кооперативный

Рис.2. Температурная зависимость интенсивности (а) и поляризации (б) флуоресценции Трп остатков метилазы. Концентрация метилазы (3+б)-1(Г^М. Стрелками показан прямой (о) и обратный ход (•) кривых.

переход молекул метилазы в ассоциаты.

Средняя температура перехода - 79°С, полуширина первхода-4°С (рис.3, кривая I). Для оценки размеров ассоциатов исследовали зависимость интенсивности рассеяния УФ-света молекулами метилазы от длины волны возбуждения (260-320 нм) при 80 и 90°С. Показано, что интенсивность рассеянного света линейно зависит от параметра (1/Д?). Согласно теории рассеяния это означает, что размеры образующихся

Рис.3. Температурная зависимость рассеяния света метилазой (1,1)^ ее комплексами с тРИК^-дрожжей (2, 3, 4),/-ко-эффициент мутности при 260, 320 нм (Т) и 300 нм (2-4). Концентрация ме-тилазы 4,8*10 М (I), 8-Ю-7М (2), 2-Ю~7М (3), 4-Ю~7М (4), тРКК - 4-10~7М (2), 8-Ю_7М (3),

5,2-10-% (4). а'-А -

обратный ход кривых (1-4)

ассоциатов (°£-) фермента соизмеримы с длиной волны возбуждения (&~Х= 320 нм). При охлаждении раствора, предварительно нагретого до 80°С, наблюдается неполное разрушение ассоциатов. Процесс имеет гистерезксный характер (рис.2,б). При охлавдении раствора, предварительно нагретого до 90°С, рассеяние лишь незначительно уменьшается (рис.3, кривая IV Следовательно, крупные ассоциаты не разрушаются, что может быть связано с частичной инактивацией (денатурацией) фермента. Показано, что при Т = 90°С в отсутствие субстрата или инертных белков, стабилизирующих метилазу, фермент в течение 15 мин полностью теряет удельную активность.

В присутствии тРНК^- в интервале 7<Э-90°С также наблюдается кооперативный переход мо^ек^л <|ермента в ассоциаты (рис.3, кривые 2-4). Средняя температ'урамтггмёре увеличения концентрации тРНК сдвигается к Л83°С, полуширина перехода увеличивается до~17°С. Интенсивность рассеянного света линейно зависит от (1/д5). Следовательно, размеры ассоциатов сС =260-320 нм. При охлавдении раствора активность фермента сохраняется, ассоциаты разрушаются .(рис.3, кривые 3—4^. Этот результат подтверждается данными электронной микроскопии, полученными Беляевой в совместной работе, (Борисова и др. 1988). При исследовании препаратов метилазы и тРНК, предварительно нагретых до 80°С, обнаружены ассоциаты, размеры которых 10^^40 нм.

Согласно данным электронной микроскопии молекулы фермента в присутствии и в отсутствие тРНК при 20°С образуют структуры в виде округлых образований - "дисков" диаметром 8-И нм и высотой 4-5 нм.

Расчет показал, что в состав такого "диска" входит 8+2 субъединицы метилазы.

Таким образом, с использованием Трп флуоресценции метилазы, рассеяния УФ-света и электронной микроскопии показано, что в интервале 20 4Т^70°С при концентрации'фермента ^ 20 мкг/мл молекулы метилазы содержат 8+2 субъединиц ("диски" метилазы). Концентрация 20 мкг/мл является критической, ниже этого значения наблюдаются структурные изменения метилазы, связанные с диссоциацией фермента на субъединицы. Установлена область температур (*ЧЬ-ЯОРС), где происходит ассоциация молекул фермента. В присутствии тРНК крупные ассоциаты не образуются. Образование ассоциатов из молекул нативного фермента, по-видимому, способствует повышению его термостабильности.

3. Комплексообразование тРНК и метилазы.

3.1. Изучение фермент-субстратных комплексов с помощью собственной флуоресценции метилазы в области 20-75°С. ^ ^^

Образование комплексов метилазы с тРНК Е. coli или с tPHKj дрожжей сопровождается тушением флуоресценции Трп остатков ферменте и возрастанием их степени поляризации от->42 до ^20^. Причиной тушения может быть стэкинг-взаимодействие Трп остатков метилазы с основаниями тРНК, а также структурные перестройки в ферменте, вызванные присоединением субстрата.

Тушение Трп.. флуоресценции изучали в широкой области изменений концентраций фермента (^20 мкг/мл) в интервале 20^Т^75°С, т.е. ниже температуры перехода фермента в ассоциаты.

Из кривых тушения (ркс.4) рассчитывали число субъединиц метилазы (И ), взаимодействующих с тРНК, и константы диссоциации фермент-субстратных комплексов (таблица 2). При расчете предполагали, что N в свободном ферменте и связанном с тРНК является величиной неизменной. При этом условии расчет в области критических концентраций белка (<20 мкг/мл) приближенный и позволяет оценить средние значения н и Кдисс.

Получена зависимость величины tl от исходной концентрации фермента в растворе при 20°С (рис.5). В области концентраций белка выше критического значения н = 9+2. При пойкжении концентрации метилазы до ~3 мкг/мл н уменьшается дол2. Этот результат подтверждает данные о диссоциации метилазы на субъединицы при разбавлении фермента (см.2.2.). Вычисленные значения констант ассоциации фермент-субстратных комплексов (К) свидетельствуют о высоком

Таблица 2

Константы ассоциации (Касс), диссоциации (Кдисс) и число субъединиц (N ) тРНК(аденин-1~)-метил-трансфераэы ТЬегвшБ ЛегторЬИив НВ8 в комплексе с одной молекулой тРНК

т,°с концентрация Относительная .—Т Кди^с1о8'М ы

фермента в моляхг, субъединиц, С'10,М удельная актив-4$; ность фермента,% асс >Г метод

гкс тРНК Escherichia coli

20 1.6 100 4,2 2,4 Трп фл.

20 4,8 100 2,2 4,5 -5 -п-п-

20 11,2 ^ 100 "20 (80 С,20 мин) 3,3+0,2 3+0,2 А'Э —. Ц_

20 4 0,05 - - __ц_

20 4 ^2 (90°С,15 мин) 0 - - —и—

54 4 100 5,5+1 1,8+0,4 "8 —и—

62,70 4 90 8,5+1,5 1,2+0,2 "8 —а—

20 3,2 - 8 100 3,8+0,3 2,6+0,2 I фл. БЭ

20 8 - 11,2 100 ш 6+0,2 1,6+0,2 3 —/ —

тРНКт дрэкжей

20 4 100 4+1 2,5+0,5 Л/ 6 Трп фл.

75 4 . 40 0,5 - - — й—

54 4-8 100 II+2 0,09+0,0г 2 фл. БЭ

- активность фермента, выдержанного при 20°С, условно принята за 100% в скобках указаны условия инактивации фермента

++

J_1_

w

_L

30 мкг/мл

Рис.4

Рис.5

Рис.4. Тушение флуоресценции Трп остатков метилазы (I) и бычьего сывороточного альбумина (2) при добавлении тРНЦ*>'1/'В.со11, SQ-концентрация тРНК в молях, Еп - исходная концентрация белка в молях субъ-

' Q л

единиц. Eq=20 мкг/мл (Ямкг/мл=4-10 М субъединиц). Т=20 С. Прямая 1ШН/ 1о соответствует минимуму интенсивности флуоресценции метилазы, наблюдаемому при избыточных концентрациях тРНК. Лучи с индексом Ап пересекают экспериментальную кривую в точках (1д- 1)/(1а~1миыУ (п - 1 )/п, где^ s =2, 3,... а . А = А - АП.^КДИСС/Е0, д Ajs(l/( щ. -I)) ХДА^ ЛА0 =I/h (Dixon, 1972).

Рис.5. Зависимость количества субъединиц метилазы (N ) в комплексе с тРНК от исходной концентрации фермента в растворе.

сродстве фермента к тРНК (см. табл. 2).

При увеличении температуры раствора до 70°С максимальное значение Щ остается равным "8. При 70°С высшая структура тРНК^^ значительно ослаблена (Тпл = 74°С в буфере А). Однако тРНК не утрачивает сродства к ферменту (К =(8,5+1,5)* пЛг*).

Частичная инактивация фермента приводит к значительному уменьшению величины KaCQ. Полностью инактивированная теплом метилаза не взаимодействует с тРНК (см. табл.2).

Таким образом, при ¿0 4 Т <70°С максимальное число субъединиц, взаимодействующих с тРНК с высокой константой связывания, равно 8±2. Суммарная молекулярная масса этих комплексов, рассчитанная с использованием их стехиометрии, равна 225±50 кДа. До данным гель-фильтрации основная активность обнаруживается в комплексах с мол. массами * 150 кДа (Борисова и др., 1986). По данным электронной микроскопии такие комплексы имеют форму "дисков", содержащих субъединиц (см. 2.3.) .

3.2. Изучение фермент-субстратных комплексов с помощью флуоресценции бромистого этидия.

Исследовано влияние инертного белка на комллексообразование тРНК и метилазы в области критических концентраций фермента.

Показано, что в отсутствие инертного белка образуются фермент-субстратные комплексы, состоящие из одной субъединицы метилазы и молекулы тРНК (1:1). Величина Р^.-j=80 не в«2 раза превышает j> свободной тРНК. Увеличение концентрации метилазы (>20 мкг/мл) приводит к скачкообразному переходу к более высокомолекулярным комплексам, в состав которых входит 3 и более субъединиц метилазы.

В присутствии инертного белка образуются фермент-субстратные комплексы, в которых минимальное число субъединиц метилазы в комплексе с тРНК равно 3-м, ^3.^=128 не. Вычисленные значения _Р свидетельствуют о жестком связывании тРНК и фермента в наносекуццном временном диапазоне.

Комплекс (1:1) хорошо моделируется эллипсоидом вращения с отношением осей 2,5. Комплекс (3:1) - менее асимметричным эллипсоидом с отношением осей 1,5.

Определены константы ассоциации фермент-субстратных комплексов, которые оказались величинами того же порядка, что и Касс, вычисленные по кривым тушения Трп флуоресценции метилазы (табл.2).

Полученные результаты свидетельствуют о распаде молекул фермента на субъединицы при низких концентрациях (¿20 мкг/мл). Присутствие инертных белков стабилизирует фермент от диссоциации, что подтверждает данные, рассмотренные в 2.2.

Изучение комплексообразования метилазы и тРНК с помощью поляризованной флуоресценции БЭ позволило определить область концентраций фермента и тРНК, где образуются комплексы (1:1),(2:1), (3:1).

4. Влияние фермента на высшую структуру тРНК, исследованное с помощью флуоресценции бромистого этидия в интервале 20-80°С.

При образованли фермент-субстратного комплекса могут произойти изменения как в структуре фермента, так и в структуре, субстрата (тРНК). Показано, например, что молекулы тРНК, являющиеся тушителями флуоресценции метилазы, препятствуют образованию крупных ассо-циатов фермента и стабилизируют белок от инактивации при высоких температурах. С другой стороны, при взаимодействии тРЙК и метилазы нуклеиновый компонент может изменить свою конформацию на уровне вторичной и третичной структуры, как это имеет место при образовании комплекса тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазами (Киселев и др., 1984).

4.1. Изменения в структуре тРШ при образовании комплекса с ферментом при 20°С.

Известно, что количество БЭ, связанного с дц участками тРНК, зависит от особенностей вторичной и/или третичной структуры. При стабилизации третичной структуры тРНК, а также других РНК, например, рРНК е.со1^1 мРНК фага МБ2 (Борисова и др., 1984, -1987) или при образовании комплексов с белками часть дц участков "экранируется" от взаимодействия с БЭ по типу интеркалирования.

Влияние фермента на высшую структуру тРНК изучали путем сравнения связ^азания БЭ на свободной тРНК и в комплексе с метилазой.

тРНК^ дрожжей в буфере А связывает молекул БЭ, т.е. максимально возможное количество согласно ее вторичной структуре, представленной в виде модели "клеверный лист" (рис.6,а). По мере увеличения количества субъединиц метилазы в составе фермент-субстратного комплекса количество дц участков тРНК, доступных для связывания с БЭ, уменьшается (рис.6,а,б, таблица 3).

{т1с)-ю'4

тРНК^дрожжей (1) ив комплексе с метилазой (1:1) -(+) и (3:1) - (2), построенные в координатах Скэт-чарда.тРНК - 10 мкг/мл.

Рис.6, (а) - графики свя-вания БЭ со свободной

7 г з ч ь в г-юг

_!_I . I_:_I_

1 г з ч 5 г*

(б) - относительное изменение кажущегося числа мест связывания БЭ на тРНК в •

зависимости от соотношения конц. метилазы (Е0) и тРНЩ)

При молярном соотношении фермента и субстрата 8:1 количество дц участков, "экранируемых" метилаэой, составляет л»50% (рис.6,б). Данные об "экранировке" ферментом* 50% двойных спиралей находятся в хорошем соответствии с размером участка, "защищаемого" мэтилазой от расщепления нуклеазами (Гамбарян и др., 1938).

На примере тРНК^и тРНК^ С. <я(С показано, что фермент вызывает ослабление третичных взаимодействий в структуре тРНК. В силу особенностей третичной структуры этих тРНК значительная часть дц участков не взаимодействует с БЭ по типу интеркалирования. При обра зовгнии комплекса (1:1) количество связанного БЭ увеличивается 2 раза (таблица 3). Данные Гамбарян (1988) также свидетельствуют о нарушении высшей структуры тРНК и ослаблении взаимодействий ТТС-и Я-петель.

Таблица 3

Кажущиеся константы связывания (К) и максимальное количество связанных молекул БЭ (X*) со свободной тРНК и тРНК в комплексе с метилазой

препарат tfai tPHKj (1:1) (3:1) А* тРНК (1:1) Met тРНК^ (1:1)

V K-I05,M_I 4-5 8 4-5 8 2-3 8,3 2-3 2,6 ~ 5 2,6 л I 1Д л2 1Д

4.2. Изучение термостабильности тРНК в комплексе с метилазой.

Высшая структура тРНК играет существенную роль как на стадии "узнавания" метилазой своего субстрата, так и на стадии метилиро-^ вания. Однако при 80°С, где активность фермента максимальна, тРНК^ дрожжей практически расплавлена (ТПД=68°С в буфере А). В связи с этим возникает ряд вопросов:какова структура тРНК в комплексе с ферментом при высоких температурах, какую роль играет лабильная четвертичная структура метилазы при комплексообразовании с тРНК, способен ли фермент взаимодействовать с расплавленной тРНК и формировать (восстанавливать) ее высшую структуру.

Для изучения влияния субъединичной структуры фермента на гер-мостабильность тРНК исследовали температурную зависимость £ фермент-субстратных комплексов (1:1), (2:1) и (3:1). Для определения величины р строили графики в координатах 1/?2 от Т/£ * ZjZc, где ?2~ степень поляризации флуоресценции БЭ, полностью связанного с тРНК.

^ Зг (1/Рп - 1/3) (6)

20 40 60 Т°С

1/Р2 8

6

4 2

Рис.7. Температурная зависимость обратной величины поляри зации флуоресценции (З-Д^БЭ связанного со свободной тРНК£ (1) и в комплексе с метилазой а:1)-(2), (2:1)-(3), (3:1)-(4).

■мйг-

тРНК - 2-10

-7,,

(1,2),

-7.

3,6-10

(3,4), метилазы - 4-10"1''м (2), 10-6Ы (3), 2-10_6М (4) , БЭ - 5-Ю~7Ы.

-4

2 4 Т/^хТД,*Ю

где ^оС - тангенс угла наклона линейного участка кривых 1-4 рис.7.

Изломы на графиках рис.7 связаны с изменением структуры свободной и связанной с метилазой тРНК, появлением значительной подвижности ее дц участков. О нарушении третичной структуры тРНК, а также потере жесткости связывания нуклеинового и белкового компонентов с ростом температуры свидетельствует уменьшение величины £ (таблица 4). Так как Касс тРНК и метилазы возрастает при повышении температуры (см.табл. 3), то диссоциация тРНК из комплекса при высоких температурах исключается.

Свободная тРНК "теряет" жесткую структуру при *45°С (кривая 1), величина £ уменьшается в ~ 2 раза и совпадает со значением £ , измеренным для фрагментов молекулы тРНК, расщепленной по антикодону, (Суровая, 1973) (табл. 4).

Таблица 4

Времена вращательной релаксации (р) свободной тРНК и тРНК в комплексе с метилазой

препарат тРНК^ 1:1 2:1 3:1 б'-фрагмент тРНК (35 нук} 3-фрагмент тРНК (42 нукл)

чР^, НС /ц. не 47*3 19±2 86±7 19±3 120±12 21±5 160^20 17 19

Примечание: значения и рассчитаны по уравнению (б) для 2-х линейных участков кривых 1-4^рис.7 соответственно и приведены к температуре 20°С.

^отеря внутренней жесткости в комплексах (1:1) и (2:1) наблюдается при Т>50 и 60°С соответственно (кривые 2,3).

Три субъединицы фермента стабилизируют структуру тРНК вплоть до~70°С (кривая 4).

При Т >70°С величина Р^ резко возрастает и достигает своего предельного значения (кривые 2-4). Этот результат свидетельствует об ассоциации фермент-субстратных комплексов при 75-80°С (см.2.3).

Плавление тРНК в комплексе с метилазой (рис.В) исследовали с помощью измерений кажущегося числа мест связывания БЭ на тРНК согласно разработанному методу (см.1.4.) .

0,5-

0,0

20

40

60

Т°С

Рис.8. Температурное изменение кажущегося числа мест связывания БЭ на дц участках тРНК^ в комплексе с метилазой: (1:1)- (1), (2:1) - (2),(3:1)-(3). (1') - изменение степени спр-ральности свободной тРНК^

СУЧ-МЧ}- Ч0- ка»у-

щееся число мест связывания БЗ на свободной тРНК при 20°С. (и, „=0,022).

Количество плавящихся дц участков в свободной тРНК и в комплексе (1:1) различается незначительно (кривые {,!) .

В комплексе (2:1)тРНК начинает плавиться при Т>60°С (кривая 2). Возрастание величины К-т/в области 40-50°С связано, по-видимому, с исчезновением "экранировки" и доступностью всех дц участков тРНК для взаимодействия с красителем, как это имеет место в свободной тРНК^ дрожжей при 20°С (см.4.1.) .

В комплексе (3:1) тРйк: не плавится до л 70°С и жестко связана с белком ("рис.8, кривая 3, рис.7, кривая 4). "Экранировка"^ 40$ дц участков тРНК метилазой не исчезает при повышении температуры до 70?

Таким образом, показано, что увеличение количества субъединиц фермента в комплексе с тРНК повышает ее термостабильность.

4.3. Ренатурация высшей структуры тРНК при взаимодействии с фер-

ментом.

—~'~""—— УДА/

При 80 С около * 80% молекул тРНК^ дрожжей находятся в расплавленном состоянии.

По мере добавления к тРНК нативного фермента наблюдается значительное возрастание интенсивности С /0о и степени поляризации

флуоресценции Р^ БЭ (рис.9,а,б, кривые 1),что свидетельствует об образовании фермент-субстратных комплексов и взаимодействии красителя с дц участками тРНК.

<Г

1/1.

р,.<

Рис.9. Изменение интенсивности (а) и поляризации фяуоресценции^Э (б), связанного с тРНК^ дрожжей (1,2) и 5$ рРНК £.сок (3), при добавлении в раствор метилазы. тРНК - 10 мкг/мл, 55 рРНК - 15 мкг/мл, БЭ - 8-10~?М Т = 80°С.

24 6 2 4 6 С^/Ср,«

При соотношении молярных концентраций метилазы и тРНК 6:1 ^/¡^достигает предельного значения, в * 3 раза превышающего начальную величину. Поляризация флуоресценции БЭ возрастает от ~ ь% до С использованием измеренных значений Р2 по уравнению (1) рассчитаны £ фермент-субстратных комплексов и определена их суммарная молекулярная масса (см. ур-ние (2)) . Вычисленное значение оказалось значительно•больше суммарной мол. массы комплексов 6:1. До-видимому, фермент-субстратные комплексы 6:1 образуют ассоциаты более высоких порядков (объединение **2-х "дисков" метилазя).

На основании полученных экспериментальных результатов можно предположить, что при 80°С структура тРНК а комплексе с ферментом ренатурирует. Ксли учесть, что при соотношении молярных концентраций метилазы и тРНК 6:1 возможна "экранировка" * 4.0% дц участков нуклеиновой кислоты от взаимодействия с БЭ (рис.6,б) , то практически все дц участки тРНК восстанавливаются.

Процесс ренатурации высшей структуры тРНК при образовании комплекса с метилазой Т^ЬегиорЬЦиз НВ8 высокоспецифичен. Во-первых, инактивированный фермент не взаимодействует с тРНК и не восстанавливает ее структуру (рис.9, кривые 2). Во-вторых, добавление натив-ного фермента к расплавленной при 80°С 55 рРНК не приводит к ренатурации ее структуры (кривые 3) .

Наблюдаемый эффект восстановления нативной структуры субстрата (тРНК) не является общей'закономерностью для термофильных метилаз. Так, например, тРНК(гуанозия-2-) - метилтрансфераза ТЬегтив ъьегто-рЬНиз НВ27 не метилирует тРНК, утратившие третичную структуру, (МаЪэитоЪо ей а1.,1987). Возможно, это связано с тем, что данная ме-тилаза не имеет вариабельную субьединичную структуру и катализирует

реакцию как мономер (20000). Мономер метилазы т.ШегторЬИив нвв (25000) не стабилизирует высшую структуру тРНК.

ВЫВОДЫ.

1. С использованием ряда методов, включающих флуоресценцию бромистого этвдия, собственную флуоресценцию фермента, рассеяние УФ-света и электронную микроскопию, исследована субъединичная структура тРНК-

(адешщ-1-) -метилтрансферазы тьегтиз №егторЫ1ив НВ8 в свободной состоянии и в комплексе с тРНК в зависимости от температуры (20 £Т 6 90°С) и концентрации белка. Показано, что количество субъе-динит^ в составе свободного фермента и в фермент-субстратных комплексах изменяется от 1-й до 8±2 (20 4Т 4 70°С,). 'Наиболее устойчивы оли-гомеры, содержащие " 8 субъединиц одинаковой молекулярной массы(25000, По данным электронной микроскопии устойчивые олигомеры представляют собой структуры в виде округлых образований диаметром 8-11 нм и высотой 4-5 нм ("диски" метилазы).

2. Определена область критических концентраций фермента (<20 мкг/мл) в которой метилаза в отсутствие стабилизирующих структуру факторов (инертного белка или субстрата) диссоциирует на субъединицы. Диссоциация сопровождается уменьшением удельной активности фермента»

3. "В области 75-90°С зарегистрирован кооперативный переход олигоме-ров метилазы в ассоциаты, размеры которых по данным интенсивности рассеяния УФ-света и электронной микроскопии, соизмеримы с дайной . волны 320 нм. В присутствии тРНК размеры ассоциатов нативной метилазы на порядок меньше дайны волны падающего света:£¿<<^1=320 нм .

4. Двумя независимыми методами, по тушению триптофановой флуоресценции метилазы и возрастанию степени поляризации флуоресценции бромистого этидия, изучены комплексы метилазы и тРНК при 20 ^Т < 80°С. Определены константы ассоциации ( Касс ) фермент-субстратных комплексов: Касс*(2<-10) -10^ Ы-:Ч Показано, что дестабилизация, высшей структуры тРНК при 70°С не влияет на сродство к ферменту на стадии "узнавания",

5. Исследовано влияние вариабельной субъединичной структуры фермента на высшую структуру тРНК. С этой целью разработан метод определе-мя относительного изменения степени спиральности нуклеиновых кислот в свободном состоянии и в комплексе с белками в средах, рассеивающих УФ-свет при высоких температурах ?0-80°С. Метод основан на измерении кажущегося числа мест связывания БЭ на дц участках нуклеиновой кислоты.

6. Доказано, что д50% дц участков тРНК "экранируется" ферментом от связывания с бромистым зтиди?м. Результат согласуется с данными до "защите50% дц участков тРНК от расщепления нуклеазами.

7. Доказано, что часть третичных взаимодействий в тРНК "ослабляется"

прз образовании комплекса с ферментом. С другой стороны, термостабильность тРНК возрастает по мере увеличения количества субъединиц метилазы в комплексе.

8. Впервые получены экспериментальные данные о ренатурации (восстановлении) высшей структуры тРНК при образовании комплекса с натав-ным ферментом при 80°С. Процесс восстановления высшей структуры вы-сокоспецифачен по отношению к природе РНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Борисова О.Ф., Морозов И.А., Гамбарян A.C., Кузнецова Н.В., Венх-стерн Т.В. Исследование комплексообразования тРБК(аденин-1-)-метил-трансферазы с тРНК оптическими и биохимическими методами. Тезисы докладов Симпозиума с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Фазико-хими-ческие свойства биополимеров в растворах и клетках". Дущино, 1985, с.135.

2. Борисова О.Ф., Морозов И.А., Кузнецова Н.В., Гамбарян A.C., Венк-стерн Т.В. Использование флуоресценции триптофановых остатков тРНК (аденин-1-) -метилтрансферазы для исследования структуры фермента и его комплексов с тРНК. Молекуляр. биол., 1986, т.20, Ä 4, с.1126-1137.

3. Борисова О.Ф., Гречко В.В., Кузнецова Н.В., Сахарова Н.К., Тимо-хина Г.И. Сравнение пространственной организации РНК фага MS2 и 165 рРНК. Взаимодействие с красителями, специфичными ко вторичной структуре, нативной РНК и после ее гидролиза нуклеазой $ 1. Молекуляр. биол., 1987, т.21, JS 2, с.515-528.

4. Кузнецова Н.В., Борисова О.Ф., Морозов И.А., Гамбарян A.C., Венк-стерн Т.В. Изучение комплексов тРЫК(аденин-1-)- метилтрансферазы из Thermus theraophilus НВ8 и тРНК с использованием флуоресценции бромистого этидия. Молекуляр. биол., 1987, т.21, й 2, с.495-505.

5. Гамбарян A.C., Морозов И.А., Венкстерн Т.В., Кузнецова Н.В., Борисова О.Ф. Изучение комплексов тРНК (аденин-1-) -метилтрансферазы из Thernus thernophilus нВ8 с тРЖ ферментативными и спектральными методами. Молекуляр. биол., 1988, т.22, № 1, с.94-105.'

6. Борисова О.Ф., Кузнецова Н.В., Морозов И.А., Беляева H.H., Венкстерн Т.В. Температурно-зависимые структурные изменения в комплексах тРНК (аденин-1-^) -метилтрансферазы из Thermus thermophilus НВ8 и тРНК, исследованные оптическими и электронно-микроскопическими методами. Молекуляр. биол., 1988, т.22, № 3, с.

7. Кузнецова Н.В., Борисова О.Ф., Дончева Ü.H., Морозов И.А., Венкстерн Т.В. Влияние температуры на структуру тРНК в комплексе с тРНК (аденин-1-) -метилтрансферазой Ihermu-s thermophilus НВ8. Молекуляр. биол., 1988, т.22"^в печати/.