Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Безматричный синтез пептидов из аминоацил-тРНК на рибосомах Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Безматричный синтез пептидов из аминоацил-тРНК на рибосомах Escherichia coli"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЮСУПОВА Гульнара Жйпаровна

УДК 547.963.3

БЕ ¿МАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ ИЗ АМИНОА1Щ-тРНК НА РИБОСОМАХ ESCHERICHIA COLI

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1987

Работа выполнена в Институте белка АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук,

академик А.С.Спирин

Официальные оппоненты: кандидат бколоплесккх наук

А.С.Степанов

доктор биологических наук,' профессор Р.С.Шакулов

Ведущая организация: Тартуский государственный университет.

Защита состоится / ¿ о ~~ ~Т-\1 —

в час на заседании Специализированного ученого

совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

/

Ученый се1фетарь совета кандидат химических наук

.Н.Каграманов

ВВЕДЕНИЕ

- -. Наиболее удойной моделью для изучения белок-синтезирукадего аппарата клетки является бесклеточная система. С ее помощью удается проследить весь путь реализации генетического кода от ДНК до готовой белковой молекулы в пробирке.

В настоящее время бесклеточная система синтеза белка может быть составлена из хорошо охарактеризованных, высокоочвденных компонентов. В литературе описаны различные типы бесклеточных систем, в которых в качестве матрицы может быть использована ДНК или природная мРНК, а также синтетические полинуклеотиды. Наиболее простая и хорошо изученная система синтеза пептида состоит из очищенных рибосом, искусственного полинуклеотида, аминоацил-тРНК бел:совых факторов элонгации (ef-tu и ef-g) и ГГФ. Хотя в такой системе отсутствуют стадии инициации и терминации, но синтезируется пептид в соответствии с кодовой специфичностью матричного полинуклеотида.

Разработан ряд других модельных бесклеточных систем трансляции, таких как система бесфакторной ("неэнзиматической") трансляции (в отсутствие факторов элонгации и ГТФ), или твердофазная система трансляции (когда рибосомы считывают матричный полинукле-отид, ковалентно привязанный к твердому носителю - целлюлозе или сефарозе). Эти бесклеточные системы трансляции позволяют проводить функциональные исследования молекулярных механизмов транслокации, а также изучать энергетику рибосомного синтеза белка, ложное кодирование и т.п.

Нами создан новый тип бесклеточной системы, в которой синтез пептида из аминоацил-тРНК на рибосомах осуществляется в отсутствие матричного полинуклеотида.

Нель настоящей работы. Изучение синтеза полипептидов на рибосомах Escherichia, coli в отсутствие матричного полинуклеотида. Решались следующие вопросы: i) реализуется ли нормальный механизм элонгации пептида при безматричном синтезе на рибосоме; 2) все ли аминоацил-трнк являются активными субстратами для безматричного синтеза; 3) что определяет эффективность аминоацил-тРНК как субстрата для синтеза пептида в отсутствие матрицы - собственно структура тРНК или характер аминокислотного остатка.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые было продемонстрировано, что рибосомы Б.coli в отсутствие матричного полинуклеотида способны полимеризовать аминокислотные остатки в полипептид, используя аминоацил-тРНК в качестве субстрата. Покат-

зано, что при безматричном синтезе реализуется типичный рибосом-ный механизм элонгации пептида, требующий присутствия обоих факторов элонгации, ти и G, и энергии ТТФ. Среди изученных 16 ами-ноацил-тРНК были выявлены как эффективные субстраты для безматричного синтеза, так и неэффективные аминоацил-тРНК, из которых синтеза пептида без матрицы не наблюдали. Лучшим субстратом для безматричного синтеза пептида на рибосоме оказалась лизил-тРНК. Показано, что собственно структура тРНК®13 определяет ее способность служить субстратом для элонгации пептида на рибосомах в отсутствие матрицы; природа аминокислотного остатка, как оказалось, существенной роли не ихрает. Осуществление транслокации в отсутствие матрицы доказало, что ведущим актом при транслокации является перемещение самой тРНК, а не матрицы..

Предложенная бесклеточная система синтеза пептида в отсутствие матрицы имеет значение как модельная система для более детального изучения рибосомного аппарата клетки. Особенно это касается изучения вклада кодон-антикодоновых взаимодействий на разных этапах рибосомного синтеза пептида.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 21 рисунок, 3 таблицы и список литературы из 231 наименования. Работа состоит из четырех основных глав - "Бесклеточные системы синтеза из Escherichia coli" (анализ данных литературы), "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов" и заканчивается "Выводами".

Апробация "работы состоялась на заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основная часть экспериментальной работы выполнена непосредственно автором диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Рибосомный синтез полилизина из лизил-тРНК в отсутствие матричного полинтклеотида

Для проверки возможности синтеза пептида на рибосомах е.coli в отсутствие матрицы наиболее удобной моделью явилась бесклеточная система синтеза гомопептида из одной аминоацил-тРНК в присутствии очищенных факторов элонгации. В данной главе приведены результаты по использованию лизил-тРНК в качестве субстрата дая матрнце-независимого синтеза гомопептида (полшшзина) на рибосомах. отметим, что ранее было известно, что лизил-тРНК и полили-зил-тРНК в отсутствие кодон-антикодоновых взаимодействий могут

связываться с рибосомой, но об элонгации пептида сообщений не было.

На рис.1 представлена кинетика включения [.14с]лизина в ТХУ-иа^уо^-нерастворимый продукт в так называемой полной системе беэ-матричного синтеза, содержащей высокоочищенные препараты рибосом, факторы элонгации ти и а, ГГФ и ГТФ-регенерирующуга систему. Из представленных данных видно, что происходит значительный синтез олиголизина, который является полностью зависимым от присутствия рибосом. Матрице-независимый синтез олиголизина требует

Рис.1. Кинетика синтеза С 4с]полилизина на рибосомах е.сои из р4с1 лизил-тРНК в отсутствие матрицы. (•) - полная система (рибосомы, Г1. , факторы элонгации ти и в, ГТФ, I с! лизил-трнк); (■) - то же, но без ер-й, (дУ- то же, но без ем?, ; (х) - то же, но без рибосом. и

также присутствия обоих факторов элонгации, ти и й, как это видно из рис.1. Интересно, что система безматричного синтеза не работает при удалении даже одного фактора элонгации ти; в этом случае, очевидно, слабое неэнзиматическое связывание лизил-тРНК не обеспечивает синтеза полилизина.

Рис.2. Злюция I 4с1олиго-лизинов с колонки с КМ-цел-люяозой. А -г. полная система (рибосомы, 114с]лиэил-тРНК, Факторы элонгации ти и а, ГШ, В - та же система, но без ЕР-б. Инкубация цри 37 °С 30 мин, 10 МГЛ МвС12.

20 до 60

номер фракции

Использование колонок с км-целлгаозой позволило оценить дайну синтезируемых лизиновых пептидов в бесклеточной системе безматричного синтеза (рис.2). В системе, содержащей оба фактора элонгации, наблвдается синтез олиголизинов от двух до семи лизиновых остатков в пептвдной цепи. Исключение ef-g из инкубационной смеси приводит к накоплению дилизиновых остатков. Это означает, что лизил-тРНК в отсутствие матрицы правильно занимает Р-участок и аг-участок (при участии ef-tu и ГТФ) на рибосоме, в результате чего возможна реакция транспептидации. образуемая днли-зил-тРНК, однако, не транслоцируется в отсутствие ef-g, и на этом синтез останавливается. Добавление ef-g в систему цромоти-рует повторные транслокации, в результате чего элонгация цродол-жается, и образуются пептиды большей длины.

2. Сравнение поли(А)-зависимого и безматричного синтеза полилизина из лизил-тРНК в бесклеточной системе

В предыдущей главе показано, что рибосомы е.coli в отсутствие поли(А) способны использовать лизил-тРНК в качестве субстрата для синтеза полилизина. В данной главе приведены результаты сравнения двух бесклеточных систем синтеза полилизина на рибосомах е.coli: в присутствии поли(А) и в отсутствие матричного поли-нуклеотида.

На рис.3 представлена зависимость синтеза полилизина от концентрации ионов Mg2+ в среде в двух системах - поли(А)-зави-симой и матрще-независимой. Оптимальной концентрацией MgCi2 в среде при 100 мМ NH^ci для поли(А)-независимого синтеза полилизина является 10-12 Ш. Поли(А)-направляемый синтез олиголизина

с о

S

у» ошмоа L isj шшшша nj

j1 4cJ лизил-тРНК на рибосомах Е.со-

Синтез полилизина из

5 Ю 15 го

100

хлорамфеникап, мкМ

тетрациклин, мкМ

Рис.4. Зависимость синтеза [ 4с]полилизина на рибосомах в бесклеточной системе е.coli от концентрации ингибитора в среде: А -в присутствии хлорамфеникола; В - в присутствии тетрациклина. (•/ - поли(А)-независимая система синтеза полилизина; (а) - поли Ш-направляемая система синтеза полюшзина. Инкубация 30 минут при 37 °С.

требует несколько больших концентраций ионов оптимальная концентрация %2+ лежит в интервале 15-17 ММ. Интересно отметить, что при этих концентрациях мвС12 безматричный синтез полилизина почти полностью ингибирован.

Значительная разница двух систем наблвдалась и при изучении влияния типичных ингибиторов рибосомного синтеза белка, таких как хлорамфеникол ж тетрациклин. Из данных, представленных на рис.4А и 4В видно, что элонгация полилизина в отсутствие кодон-антшсодоновых взаимодействий является более чувствительной к действию ингибиторов.

Оказалось также, что системы поли(А)-зависимого и безматричного синтеза полилизина в разной степени зависят от концентрации ГТФ и"компонентов ГТФ-регенерирущвй системы. На рис.5 представлена зависимость синтеза полилизина от концентрации ГТФ (в отсутствие компонентов ГТФ-регенерирующей системы). Видно, что синтез полилизина в отсутствие кодон-антикодоновых взаимодействий требует больших концентраций ГТФ, в отличие от матрице-зави-симой системы. Можно предположить, что связывание аминоацил-тРНК с рибосомой без матрицы сравнительно малоэффективно, и на одну вступающую в реакцию транспептидации аминоацил-трщ расходуется гораздо больше молекул ГТФ, чем при матричном связывании.

Еще одной иллюстрацией, демонстрирующей разницу между двумя системами - поли(А)-зависимого и безматричного синтеза полилизина - являются данные по центрифугированию рибосом из этих двух систем в градиенте концентрации сахарозы (рис!б). Видно, ч4о комплекс полилизил-тРНК.поли(А)»703 рибосома гораздо ста-

Рис.5. Зависимость синтеза [ 4с]полилизина в бесклеточной системе Е. coli на рибосомах в зависимости от концентрации ГТФ в среде. (•) -система безматричного синтеза полилизина; (а) - поли(А)-нацравляемая система синтеза полилизина. Инкубация 30 минут цри 37 °С.

ГТФ, мкМ

номер фракции

Рис.6. Центрифугирование рибосом в градиенте концентрации сахарозы. Инкубационная смесь, объемом 0,28 мл. содержала И2 пмолей рибосом (инкубация 30. минут при 37 °С). А - поли(А)-за-висимая система синтеза Р^с] полилизина; В - система безматричного синтеза [14с] полилизина. Центрифугирование при 40000 об/мин в течение 2 часов, +4 °С, ротор , Зр1псо Ь5-50.

бильнее, чем соответствущий безматричный комплекс полилизил-тРНК»рибосома. Так, в первом случае, в зоне ios рибосом находится 50 % TXy-Na2wo4-HepacTBopHMoro меченого продукта, а в случае матрице-независимого синтеза полилизина в этой зоне находится лишь 18 % тотального ТХУ-Ма^о^-нерастворимого меченого продукта.

3. Синтез других гомопептидов из аминоацил-тРНК на •рибосомах в. coli в отсутствие матричного полинуклеотияа

В предыдущих главах показано, что лизил-тРНК оказалась эффективным субстратом для безматричного синтеза. Возникает вопрос, может ли рибосома использовать другие аминоацил-тРНК для безматричного синтеза или лизил-тРНК является исключением.

Так как способность осаздаться трихлоруксусной кислотой и условия этого осаждения могут сильно варьировать для различных гомопептидов, был использован более универсальный метод оценки способности рибосом полимеризовать пептид из аминоацил-тРНК. Для этого рибосомы из бесклеточной системы сорбировали на нитро-целлшозные фильтры по методу Ниренберга и йедера. Поскольку на фильтре сорбируются рибосомы, содержащие как пептидил-тРНК, так и аминоацил-тРНК, проводили сравнение количества меченого материала на рибосомах из двух систем. Полная система содержит рибосомы l14cj аминоацил-тРНК, факторы элонгации тц и g, ГТФ и ГГФ-регенерирукщую систему, в этой системе созданы все условия для элонгации, и рибосомы, помимо [14с]аминоацил-тРНК, могут содержать [14cJпептидил-тРНК. Другая система содержит все перечисленные выше компоненты кроме ef-g. в такой системе запрещена транслокация, а следовательно запрещена и элонгация пептида. Рибосомы в этой ef-t -зависимой системе содержат [14с] аминоацил-тРНК и, возможно, [1 *с]дипептидил-тРНК (см. рис.2В). Способность рибосом синтезировать пептид оцределяли по разнице радиоактивности, связанной с рибосомами, взятыми из двух инкубационных смесей: содержащей оба фактора элонгации ти и G, и содержащей только ef-tu (см-, пунктирную линию на рис.7А,В,С и последнюю колонку в таблице 1).

В данной главе описаны результаты по использованию 16 ами-ноацил-тРНК в качестве субстратов для безматричного синтеза полипептидов. На рис.7 в качестве иллюстрации цриведены величины синтеза гомопептидов из [14с]лизил-тРНК, [14 с] серил-тРНК и [14с] фенилаланил-тРНК в системе безматричного синтеза гомопептидов на фоне величин связывания соответствующих аминоацил-тРНК в такой же системе без ef-g, в зависимости от концентрации MgCl2 в среде. Из рис.ТА видно, что только наличие обоих факторов элонгации ти и g приводит к резкому увеличению количества [1полилизил-тРНК на рибосоме.

На рис.7В в качестве примера другого эффективного субстрата приведены величины связанной с рибосомами метки при использова-

Т

Еис.7. Зависимость связывания [ 4с]аминоацил-тРНК и синтеза Т_14с]пептвдил-тРНК на рибосомах е.coli в отсутствие матрицы от концентрации MgCi2 в среде. Метод сорбции рибосом на фильтрах. (Инкубация 30 минут цри 37 °С.) А.{•) - полная система (P^cl лизил-тРНК,. рибосомы, еу-т , ef-g. ГТФ); (а) - то же, но без ef-g; («7- то же, но без ер-тц; (х) - то же, но без ер'в; пунктирная линия - разность между кривыми (•) и (а) (собственно синтез полилизина). Г1, л

B. (о) -.полная система (L с.]серил-тРНК, рибосомы, ep-tu, ep-g, ГТФ); (п) - то же, но без ef-g;(x)- то же, но без ер'в; цунк-тирная линия - разность между кривыми (о) и (а) (собственно синтез полисерина); itii

c. (о) - полная система (I. Ыфенилаланил-тРНК, рибосомы, ер-т , ep-g, ГТФ); (п) - то же, но без ep-g; (х) - то же, но без ер'а; пунктирная линия - разность между кривы® (о) и (□) (собственно синтез полифенилаланина).

нии [14с]серил-тРНК в безматричной системе связывания амино-ацил-тРБК и синтеза пептида при различных концентрациях МвС12 в среде. Видно, что присутствие фактора элонгации в в инкубационной смеси приводит к значительному увеличению количества [14с]серина, связанного с рибосомами. Это означает, что рибосома использует серил-тРНК в качестве субстрата для безматричного синтеза гомопептвда.

В качестве демонстрации неэффективного субстрата для без-, матричного синтеза пептида выбран фенилаланил-тРНК. Из кривой, представленной на рис.7С, видно значительное ЕР-тц-зависимое связывание [14с]фенилаланил-тРНК с рибосомами. Присутствие в инкубационной смеси ЕР-в практически не.стимулирует увеличения связанной с рибосомами метки, т.е. не приводит к существенной полимеризации фенилаланиновых остатков на рибосоме.

Результаты вышеприведенных опытов и опытов по использованию в качестве субстратов еще '13 ашноацил-тРНК в аналогичных системах при оптимальных концентрациях МаС12 представлены в таблице I. Сравнение концентраций мв2+ , оптимальных для полимеризации соответствующих аминоацильных остатков на рибосоме в -отсутствие матричного полинуклеотида, показало, что все они лежат в пределах от -10 до 13 мМ. Следует отметить, что в связи с малым содержанием некоторых тРНК в препаратах суммарной тРНК удалось провести анализ только 26 аминоацил-тРНК. Из этих 16 аминоацил-тРНК лучше всего связываются с рибосомами в отсутствие матрицы лизил-тРНК, глицил-тРНК, метионил-тРНК, лейцил-тРНК и валил-тРНК, а хуже всего - глютаминил-тЕНК, аспартил-тРНК, треонил-тРНК, пролил-тРНК, изолейцил-тРНК и аланил-тРНК; глютаминил-тРБК практически не связывается с рибосомами в отсутствие матрицы. Корреляции между способностью аминоацил-тРНК связываться с непрограммированннми рибосомами и служить в качестве субстрата для синтеза пептида не обнаружено. Лучшими субстратами для синтеза гомопептвдов на рибосомах в отсутствие матрицы оказались лизил-тРНК, аспартил-тРНК, треонил-тРНК и се-рнл-тРНК • (лизил-тРНК> серил-тРНК> треонил-тРНКз= аспартил-тРНК). Синтез пептидов был малоэффективен или его практически не наблюдалось из глютаминил-тРНК, аспарагинил-тРНК, метионил-тРНК, фенилаланил-тРНК, пролил-тРНК и изолейцил-тРНК.

4. Рибосомный синтез полипептшга из индивидуальной

аминоацил-тРНК в отсутствие матричного полинуклеотида

В цредыдущих главах было показано, что рибосомы, незапро-граммированные матрицей, могут синтезировать полипептиды, используя в качестве субстрата некоторые аминоацил-тРНК. Для этого процесса необходимо ЕР-ти-завискг.юе связывание аминоацил-тРНК, пептидилтрансферазная реакция и ЕР-(}-зависимая транслокация. Были выявлены как эффективные, так и неэффективные субстраты для безматричной элонгации. В этих работах были использованы высокоочшценные препараты рибосом, факторов элонгации т^л с и препарат суммарной тРНК, ацшщрованный лишь одной меченой аминокислотой.

Однако использование препаратов суммарной тРНК имело ряд недостатков. Црежде всего, нельзя было с абсолютной категоричностью исключить присутствие в них каких-либо олиго- или поли-нуклеотидов матричного типа» Кроме того, большое количество де-ацилированной тРНК в препаратах могло мешать одним аминоацил-

н

о

Таблица I

Связывание аминоацил-трНК и синтез пептидов из аминоацил-тРНК в отсутствие матричных полинуклеотидов на рибосомах Escherichia coli

¡Количество [14с]ами-!Количество! №№ !нокислоты на риоосо-!аминокисло4 пп

Аминокисло-!Количество [14cJ количество та (Аа) ¡аминокислоты на !аминокислоты, .'рибосомах (толь) ¡включенной !-!в пептид

№№! Аминокислота пп{ (Аа)

! ! i i i

¡мах (пмоль)

j +ep-Tu ! ¡(система !связыва- ! !ния аа- ! !тРНК) !

+EF-T.,, +EF-G 4жстема синтеза пептида)

!ты,включен^ ¡ной в пеп-! тид !

(пмоль) !

! +EP-TU r+EF-Tu, ! !(система!+EF-G ! ¡связыва-¡(система i !ния аа- ¡синтеза ! !тРНК) ¡пептвда)!

(пмоль)

1. лизин 3,0 10,2 7,2 5. Глицин 2,6 4,5 1,9

8. Аргинин 1,6 3,2 1,6 14. Метионин 2,7 3,0 0,3

7. Глутаминовая кислота 1,4 3,2 1*8 12. Фенилаланин 2,2 3,0 0,8

4. Аспарагиновая кислота 1,5 4,0 2,5 II. Цролин 1,0 2,0 1,0

16. Глутамин 0,1 0,1 0 15. Изолейцин 1,4 1,5 0,1

■13. Аспарагин 2,0 2,8 0,8 9. Лейцин 2,6 4,1 1,5

3. Треонин 1,3 4,0 2,7 6. Валин 3,2 5,0 1,8

2. Серин 2,0 6,5 4,5 10. Алании 1,5 3,0 1,5

тРНК и способствовать другим принимать участив в инициации или элонгации безматричного синтеза пептидов на рибосоме.

В данной главе приведены результаты по использованию препаратов индивидуальных лизил-тРНЮ®13 и фенилаланил-тРНК®311 в системе безматричного синтеза пептида.

Рис.8. Кинетика синтеза [^с]полилизина из [14с]лизил-тРНК-11ИЗ в бесклеточной системе е.coli в отсутствие .матрицы. 1- полная система ([14с Jлизил-тРНКлиз, рибосомы, ЕР-Т„, EF-G, ГТФ); 2 - то же, но без EP-G.

На рис.8 цредставлены кинетика включения [14с]лизина из [14с] лизил-тРНК®13 в ТХУ-Иа2\У04-нерастворимый продукт при инкубации рибосомной бесклеточной системы в отсутствие поли(А). Видно, что рибосомы E.coli, нез апрограммированные матрицей, используют в качестве субстрата индивидуальную лизил-тРНК®03 и полимери-зуют лизиновые остатки в пептид. Важно отметить, что используемая в качестве субстрата для безматричного синтеза [14с]лизил-тРНЕС®13 получена с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном факторе элонгации Ти из Thermus thermophilus; такой метод получения исключает присутствие примесей матричного типа в препарате обогащенной [1^с]лизил-тРНК"13. Из представленных данных следует, что для безматричного синтеза олиголизина из [1 ^лизил-тРНК®13 строго необходима EF-G-зависимая транслокация: исключение фактора элонгации G из системы приводит к полному подавлению синтеза пептида.

На рис.9 приведены величины синтеза полшшзина из [1^с]ли-зил-тРНКг113 в бесклеточной системе E.coli в отсутствие поли(А) в зависимости от концентрации Mgci2.видно, что Ле2+-оптимум синтеза находится в области 10-12 мМ. Необходимо отметить, что ранее полученная кривая Мв2+-зависимости безматричного синтеза полилизина из [14с]лизил-тРНК в присутствии всех других деацили-рованных тРНК имеет такой же мв2+-0птимум. Таким образом, характер кривой Мв2+-зависимости синтеза не зависит от того, какая тНЖ, суммарная или индивидуальная, была использована в качестве

1Мд"], мМ

рис.9. Зависимость синтеза ТХУ-11а2шо4-доаждаемого Пполилизина из ['Ч-с]лизил-тРНкЛиз на рибосомах в отсутствие матрицы от концентрации МзС12 в среде. 1 - полная система (Р\Плизил-гРНКдаз, рибосомы, ер-т' ЕР-О, ГГФ); 2 - то же, но безжР-б.

Рис,10. Кинетика включения [^н]Фенил-ал анина из [Зн]фекилаланил-тРНКФен в ТХУ-нерастворимый цродукт в бесклеточной системе Е.соИ. 1 - поли(у)-зависимый синтез полифенилаланина. I 2 - полная система синтеза в отсутст-

1? I вие поли(У) (|Зн]фенилаланил-тРНК®ен,

рибосомы, ер-ти, ер-в, ГТФ); 3 - то же, но без ер-й.

> X

источника аминоацил-тРНК.

На рис. 10 представлены данные по включению меченого фенил-аланина в ТХУ-нерастворимый продукт. Видно, что матричный поли-нуклеотвд (поли(у)) абсолютно необходим для синтеза полифенилаланина из Рн] фенилаланил-тРНК®311. Если рибосомы .не зацрограм-мщгаваны матрицей, полимеризации фенилаланиновых остатков не наблюдается, в этом случае наличие кодон-антикодоновых взаимодействий является необходимым условием для рибосомного синтеза полифенилаланина.

5. Рибосомный синтез полиФенилаланина из

ложноаыилированной Фенилаланил-тРНК^3 в отсутствие матричного полинуклеотида

В предыдущих главах было показано, что рибосомы е.coli в отсутствие матричного полинуклеотида способны использовать лизшг-тРНК и некоторые другие аминоацил-тРНК в качестве субстратов для синтеза пептида. Никакой корреляции между способностью аминоацил-тРНК связываться с непрограммированной рибосомой и участвовать в элонгации пептида не обнаружено. Не обнаружено также корреляции мезду характером аминокислотного остатка аминоацил-тРНК и ее способностью служить субстратом для безматричного синтеза.

Ответ на вопрос, что определяет эффективность аминоацил-тРЖ как субстрата для безматричного синтеза - собственно структура тРНК или характер аминокислотного остатка - могли бы дать результаты прямых экспериментов по использованию "химерных'1, т.е. ложноацшщрованных тРНК. В данной главе приведены данные по использованию фенилаланил-тРНК®13 в качестве субстрата в системе матрице-независимого синтеза пептида.

Рис.Ii. Кинетика включения [%] фенилаланина в ТХУ-нерастворимый продукт в бесклеточной системе синтеза в отсутствие матрицы. го , 1 - полная система синтеза из ['s] фенилаланил-тРНКЛ03 в отсутствие ПОЛИ(А) (рибосомы, EF-TU, ef-g, ГТФ); 2 - то же, но без ef-G; г3 , 3 - полная система синтеза из I Н] фенилаланил-тРИК^611 в отсутствие ПОЛИ(у) (рибосомы, ef-tu, ef-g, ГГФ), 4 - то же, но без ;ef-g.

На рис.И цредставлена кинетика синтеза полифенилаланина из фе-нилаланил-тРНК®13 на рибосомах E.coli в отсутствие матричного полинуклеотида. Показано, что рибосомы е.coli способны в отсутствие поли(А) полимеризовать полифенилаланин, используя в качестве субстрата [3н]фенилаланил-тРШс'1из; элонгация пептида строго зависит от присутствия EF-G в системе.

Для сравнения приведены данные по использованию в системе безматричного синтеза [%]фенилаланил-тРНКфен, которая является неэффективным субстратом.

Сравнение кинетических кривых синтеза полифенилаланина из фенилаланил-тРНК®13 и полилизина из лизил-тРИК1®13 в безматричной системе синтеза показывает, что скорости синтеза этих полипептидов практически одинаковы (сравни рис.8 и н) (важно заметить, что в случае [14с]лизил-тРШгиз на рис.8 представлены эквиваленты 5 проб).

Рис.12. Зависимость,синтеза [-^полифенилаланина из [н ] фенилаланил-трй^лиз на рибосомах в отсутствие поли(А) от концентрации МвС1г в среде. инкубация 30 минут при 37 °С. -I - полная система П^фенилала-НИЛ-тРНК^3, ЕР-Тц, ГТФ);

2 - то же, но без

о .

На рисЛ2 представлена Mg -зависимость поли(А)-независимо-го синтеза полифенилаланина из фенилаланил-тРНК®13. Из представленной кривой видно, что безматричный синтез полифенилаланина на рибосомах е.coli имеет оптимум концентрации MgCl2 в области -И ММ. Таким образом, синтез обоих полипептидов - полилизина (рис.9) и полифенилаланина (рис.12) - из ашноацил-трнк?113 в отсутствие матрицы имеет одинаковый Мв2+-оптимум. На рис.12 также показано, что удаление ef-g из системы подавляет безматричный синтез полифенилаланина в широком интервале концентраций МвС12- Последнее снова подтверждает, что необходимым условием для безматричной элонгации является нормальная EP-G-зависимая транслокация.

Все эти результаты указывают на то, что собственно структура тРНК определяет ее способность служить субстратом для элонгации пептида на рибосомах в отсутствие матричного полинуклео-тида. Природа аминокислотного остатка аминоадил-тРБК®13, как оказалось, существенной роли не играет. По-видимому, структура самой тРНК^из обеспечивает ее правильное связывание с Р-участком и с А-участком рибосомы в отсутствие кодон-антикодоновых взаимодействий, в результате чего возможна реакция транспептидации. Присутствие EF-G и ГТФ вызывает транслокацию пептидил-тРНЕС®13,

а следовательно, обеспечивает элонгацию пептида, таким образом, взаимодействие тРНК®53 с кодоном не обязательно ни для правильного связывания аминоадил-тРНК с рибосомой, ни для транслокации.

На основании литературных данных о том, что тРНК в а- и Р-участках рибосомы конформационно различны, выдвинуто предположение, объясняющее различную эффективность аминоацил-тРНК в безматричном синтезе. Так, способность некоторых аминоацил-тРНК (лизил-, серил-, треонил- и аспартил-трщ) служить субстратом . для рибосомного безматричного синтеза пептида, очевидно, связана с их "конформацией ¿^-участка" в растворе и в комплексе с фактором элонгации ти, что обеспечивает связывание их в ^-участке рибосомы, незапрограшированной матрицей. Другие тРНК (например, фенил-аланил-тРНК^611) в свободном состоянии и в комплексе с ef-tu обладают "конформацией р-участка". По-видимому, посадка подобных тРНК в а-участок рибосомы возможна только в присутствии матричного полинуклеотида, в результате чего достигается перевод тРНК в "конформацию а-участка".

ВЫВОДЫ

1. Рибосомы Escherichia coli в отсутствие матричного полинуклеотида способны использовать лизил-тРНК, серил-тРНК, треонил-тРНК и аспартил-тРНК (лизил-тРНК> еерил-трнк > треонил-тРНК ггас-партил-тРНК) в качестве субстратов для синтеза полипептида. Для этого процесса строго необходимо ЕР-ти-зависимое связывание ами-ноацил-тРНК, пептидил-трансферазная реакция и EF-G-зависимая транслокация.

2. Среди изученных 16 аминоацил-тРНК пролил-, фенилаланил-и аспарагинил-тРНК оказались црактически не активными субстратами для элонгации в отсутствие матрицы. Очевидно, что для рибосомного синтеза гомопептида из данных аминоацил-тРНК необходимым условием является взаимодействие тРНК с кодоном.

3. Корреляции между способностью аминоацил-тРНК связываться с непрограммированными рибосомами и служить в качестве субстрата для синтеза пептидов не обнаружено.

4. Рибосомы e.coli в отсутствие поли(А) способны полимеризо-вать лизиновые остатки в пептид, вплоть до семи аминокислотных остатков в цепи. Это означает, что при участии ef-tu и ГТФ, лизил-тРНК в отсутствие кодон-антикодоновых взаимодействий правильно занимает А- и р-участки рибосомы, в результате чего возможна реакция транспептидации и образуется дилизил-тРНК. добавление* ef-g

в систему промотирует повторные транслокации, в результате чего синтезируются олиголизины.

5. Обнаружена значительная разница мезду поли(А)-зависимой и безматричной системами синтеза полилизина по ряду признаков: а) оптимальной концентрацией MgCl2 в среде при <100 MM nh^ci для поли(А)-независимого синтеза полилизина является -10-12 ММ, а Мв2+-оптимум синтеза полилизина в поли(А)-зависимой бесклеточной системе находится в области более высоких концентраций MgCl2 (15-17 мм), при которых безматричный синтез полилизина полностью ин-гибирован; б) элонгация полилизина в отсутствие коДон-антикодоно-вых взаимодействий является более чувствительной к действию ри-босомных ингибиторов (хлорамфеникол, тетрациклин); в) синтез полилизина в отсутствие матричного полинуклеотида требует больших концентраций ГТФ, чем поли(А)-зависимая система синтеза полилизина; г) стабильность комплекса полилизил-гРНК*рибосома в присутствии поли(А) выше, чем в отсутствие матричного полинуклеотида

6. Результаты опытов с ложноацшшрованной тРИС®13 (фенил-аланил-тРНК®13) указывают на то, что собственно структура тРЩС11®3 оцределяет ее способность служить субстратом для элонгации пептида на рибосомах в отсутствие матричного полинуклеотида. Природа аминокислотного остатка существенной роли не играет. Отсюда следует, что взаимодействие тРНК®13 с кодоном не обязательно ни для правильного связывания аминоацил-тРНК®13 с рибосомой, ни

для транслокации. Последнее подтверждает, что ведущим актом при транслокации является транслокационное перемещение самой тРНК, а матрица, когда она есть, перемещается пассивно за счет кодон-антикодоновых взаимодействий.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Тналина Г.Ж., Белицина Н.В., Спирин А.С. Безматричный синтез полипептидов из аминоацил-тРНК на рибосомах Escherichia coli - Докл. АН СССР, -1982, 2Ш> с.741-745.

2. Белицина H.B., Тналина Г.Ж., Спирин А.С. Безматричный синтез олигопептидов из аминоацил-тРНК на рибосомах е.coli. - Тезисы докл. Шестого двустороннего симпозиума СССР-Франция "структура и функция белков и нуклеиновых кислот", Цхалтубо, 1982.

3. Юсупова Г.Ж. (Тналина),'Белицина Н.В., Спирин A.C. Рибосомный синтез пептида из аминоацил-тРНК в отсутствие матричного полинуклеотида: синтез полифенилаланина из фенилалашш-тРНКЛиз. -Биополимеры и клетка, -1986, 2» с.185-189.

4. Юсупова Г.Ж. (Тналина), Ремме Я.Л., Белицина Н.В., Спирин А.С. Рибосомный синтез полилизина из индивидуальной лизил-тИЖ в отсутствие матричного полинуклеотида. - Докл. АН СССР, 1986, 289. с.725-728.

5. Спирин А.С., Лим В.И., Белицина Н.В., Юсупова Г.Ж. Структурные аспекты синтеза белка на рибосомах. - Тезисы докл. Восьмого двустороннего симпозиума СССР^ранция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот", Москва, 1986.

6. Belitsina N.V., Tnalina G.Zh., Spirin A.S. Template-free ribo-somal synthesis of polylysine from lysyl-tRNA. - FEBS Lett., 1981, 121» P.289-292.

7. Belitsina H.V., Tnalina G.Zh., Spirin A.S. Template-free ribo-somal synthesis of polypeptide from aminoacyl-tRNAs. - BioSystems, 1982, Ijj, p.233-241.

8. Tnalina. G.Zh., Sclitrina ir.V., Spirin A.S. Tercpiate-rree riboso-.al synthesis of polypeptide from an-.inoacyl-tKI.'As. -FEBS Lett., 1986, 206, p.142-146.

T-I4366 04.08.87r. 3aK. 529P Tup. 125 3K3. yi.-H3R.n.-I,I

OraeiaTaHo m poTanpHme B OK'iM HUGH AH CCCP