Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термодинамические аспекты механизма взаимодействия тРНКPhe с Р и А сайтами 70s рибосомы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Термодинамические аспекты механизма взаимодействия тРНКPhe с Р и А сайтами 70s рибосомы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

СОБОЛЕВА Наталия Георгиевна УДК 577.217.347

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИВ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА ЮАЖЮДЕЙСТВШ гИЖРЬе с р и А САйТА1М 70з РИБОСОШ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза белка Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им Б.П. Константинова РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор Кириллов C.B.,

кандидат биологических наук научный сотрудник Катунин В.И.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Рапопорт В.Л.

доктор медицинских наук, Гайцхоки B.C.

Вздуцая организация: Новосибирский институт биоорганической

химии СО РАН (г.Новосибирск).

Защита диссертации состоится " ¡^oL " (^¿^/^^/¿hi9®5 г-в часов на заседании специализированного Совета

Д 063.38.23 при СПбГТУ по адресу: С-Петербург, ул Политехни- • ческап, д.29, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технического университета.

Автореферат разослан " " 19э5 '

Ученый секретарь

специализированного совета О.Л.Власова.

Актуальность проблемы. Точность трансляции и ряд других, связанных с этим процессов, таких, как сдвиг рамки считывания, миссенс-ошибки и т.д. зависят и определяются кодон-антикодоно-вым взаимодействием тРНК с матрицей в рибосоме. На это взаимодействие влияют многие факторы и, в частности, модификация оснований в антикодоне и других местах антикодоновой петли тРНК. Одной из характерных черт тРНК является то, что она содержит много модифицированных нуклеотидов, количество которых может достигать 20% общего числа нуклеотидов в ней. Структурная сложность многих модифицированных нуклеотидов, их расположение в особых сайтах молекулы тРНК и повсеместность присутствия в тРНК разных организмов позволяют думать, что они играют важную роль в процессе функционирования тРНК в рибосоме.

В литературе имеется много качественных данных, посвященных модифицированным нуклеотидам. Роль модифицированных нуклеотидов в точности и эффективности трансляции изучалась на примерах супрессорных тРНК при взаимодействии их с натуральной матрицей in vivo. Это достаточно сложные системы, которые позволяют лишь качественно оценить .влияние модификаций:

Кодон-антикодоновое взаимодействие достаточно подробно изучено на примере простых модельных систем без рибосом (взаимодействие комплементарных олигонуклеотидов или двух тРНК с комплементарными или близко комплементарными антикодонами). Уделялось также внимание изучению взаимодействия антикодоновой шпильки с рибосомальными субчастицами и рибосомой в целом.

Очевидна необходимость получения количечтвенных данных о кинетике и термодинамике элементарных взаимодействий тРНК с матрицей в рибосоме, роли замен и модификаций основания в различных положениях антикодона и антикодоновой ттли.

Целью данного исследования являлось изучение механизма взаимодействия молекулы тРНК с матрицей на рибосоме, роли модифицированного нуклеотида в положении 37 в этом взаимодействии в новой модельной системе, более приближенной к ситуации ln vivo, содержащей тРНК, синтетическую матрицу noj¡n(U) и 70S рибосому.

Задачи представленной работы заключались: во-первых, в получении в препаративных количествах следующих производных дрожжевой деацилированной тРНК?1^ -

1

тРНК^ддд - замещение Gm(34) на G(34) и Y(37) на А(37), тРНК^|с - замещение Gm(34) на G (34), А (35) на С (35) и У(37) на (3(37),

тРНК^у6 - исходная тРНК^^у С отщепленным Y-основанием в

положении 37 без разрыва сахарофосфатного остова;

во-вторых, в изучении механизма взаимодействия полученных про__рь<а

изводных деацилировчнной тРНК с Р сайтом комплекса (70S + + поли(и)] и определение термодинамических параметров этого взаимодействия;

в-третьих, в изучении механизма кодон-антикодонового взаимо___Php

действия аминоацил-тРНК'у на А сайте комплекса C70S+nojra(U)), при условии, что Р сайт занят де актированной тРНК^у6; в сравнении термодинамических параметров этих взаимодействий..

Научная новизна результатов и практическая ценность работы.

Роль модифицированного нуклеотида с 3'-стороны антикодона при кодон-антикодоновом взаимодействии тРНК с матрицей на рибосоме представляет значительный интерес. ■

Для изучения роли гипермодифицированного нуклеотида с 3'-стороны антикодона в кодон-антикодоновом взаимодействии был выбран путь энзиматического замещения нуклеотидов антикодоно-вой петли тРНК in vitro.

В настоящей работе была модифицирована и применена к данным условиям методика замен тетрануклеотидов в антикодоновой петле дрожжевой фенилаланиновой тРНК.

В настоящей работе впервые проведено колйчественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с заменами нуклеотидов в 35-м и 37-м положениях антикодоновой петли с Р сайтом [70S + поли(ü)]-комплекса. Определены термоданамические парамв тры связывания этих тРНК. Показано, что модифицированный нуклеозид (Y37), расположенный с 3'-стороны антикодона тРНК, стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие на Р-сайте благодаря стэккнг-взакмодействию со стопкой оснований кодон-антикодона (изменение энтальпии взаимодействия с -39 ккал/моль до -24 ккал/моль при замене Y на л и до -16 ккал/моль при отщеплении Y-основания). Установлено, что замена второго основания антикодона одновременно с заменой 37-го нуклеотида (GmAAY - GCAG)

приводит к еще Солее выраженному изменению энтальпии взаимодействия (с -39 до -б ккал/моль), что характерно для взаимодействия без матрицы. В то же время, константа ассоциации такой модифицированной тРНК увеличивается на три порядка величины в присутствии поли(и).

Определено изменение числа ионов магния, принимающих участие во взаимодействии перечисленных модифицированных тРНК с Р сайтом комплекса [70S + поли(и)]. Y-основание обуславливает связывание' в среднем двух ионов магния.

PVip

Исследовано безматричное связывание тРНК^у с Р сайтом 70S

рибосом. Показано, что модифицированный нуклеозид (Y37), расположенный с 3'-стороны антикодона тРНК, взаимодействует непосредственно с гидрофобным центром Р сайта рибосомы (снижение константы ассоциации в 5 раз при отсутствии матрицы при отщеплении Y-основания, без изменения сродства при замене его на немодифицированный гуанин).

Php

Определены константы связывания амшгаацил-тРНК^у с А сайтом комплекса, при условии, что на Р сайте находится тРНК^у3.

Оказалось, что одновременное отсутствие Y-основания в обоих, сайтах снижает константу ■ связывания аминоацил-тРКН_у на А сайте на порядок по сравнению с аминоацил-?РНК+у, что позволяет ггоедположить наличие взаимодействия модифицированных осно-

Php

ваний, принадлежащих двум тРНК на разных сайтах.

Все перечисленные результаты получены впервые. Практическое и теоретическое значение работы заключается в том, что еыяснз-ны дополнительные детали механизма взаимодействия мРНК и тРНК с рибосомой, что делает более завершенной общую схему биосинтеза Сежа.

По теме диссертации опубликованы: I препринт, 2 статьи и тезисы двух докладов. Результаты- доложены на XV Международной конференции, посвященной тРНК (Франция, 1993), на Международной конференции, посвященной модифицированным нуклеотидам FHK (Франция 1994).

Объем работы - 153 страницы, в том числе 24 рисунка и 10 таблиц. Диссертация состоит из "Введения", "Обзора литературы" (глава I), "Материалов и методов" (глава II), результатов экспериментальных исследований и их обсуждения (главы III и IV), "Выводов" и "Списка литературы" (184 ссылки).

Глава I. Обзор литературы. Рассматриваются и обсуждаются литературные данные о роли модифицированных и гипермодифицирован- ' шх нуклеотидов тРНК в трансляционном процессе, о влиянии модифицированных нуклеозидов на кодон-контекст-чувствитвльность, о влиянии гинермодифицированных нуклеозидов в 37-м положении тРНК на стабилизацию кодон-антикодонового взаимодействия тРНК с матрицей на рибосоме. Обсуждаются и сравниваются модельные системы, на примере которых изучалось кодон-антикодоновое взаимодействие. Обсуждается возможность тРНН-тРНК-взаимодейст-вия в клеточных рибосомах.

Глава II. Материалы и методы. Приведены описания экспери-менгалы_1х методик выделения препаратов рибосом и их субчастиц, деацилированной тРНК из E.coli, деацилированной тРНК+у из

дроюгей, Р1ге-тРНк|11®0-|1, Phe-TPHK^6; препаратов тРНК, радио-

активномеченых или % по З'-концу. Описаны методы получения аминоацил-тРНК синтетаз из дрожжей, нуклеотидилтрэнсферазы из E.coli. иписан выбор условий для количественных измерений взаимодействия матрицы и тРНК с рибосомами.

Главы III,IV посвящены изложению результатов экспериментов по взаимодействию полученных модифицированных тРНК с заменами нуклеотидов в антикодоновой петле с Р сайтом рибосомы из E.coli. Приведены термодинамические параметры этих взаимодействий. Определен вклад Y-основания в безматричное связывание^

"Phû

тРНК с рибосомой. Установлена взаимосвязь между числом ионов магния, принимающих участие в матричном взаимодействии тРНК с рибосомами и наличием Y-основания е антикодоновой петле дрожжевой тРНК^1е. Представлены данные по взаимодействию Рйе-тРНК^уе с А сайтом рибосомы из E.coli, при условии, что Р

Php

сайт занят деацилированной тРНК*у• В "Обсуждении результатов"

проводится анализ и интерпретация полученных данных и сравнение их с данными из литературы.

I. Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРКК с заменами в антикодоне и в 37 положении с Р сайтом 70S рибосомы.

I.I. Для исследования функции модифицированного нуклеотида в Php

антикодоновой петле tPHKqдду в данной работе были синтезированы видоизмененным методом энзиматического замещения тетрану-

Аом А©ц

С с

с ?

А А

р<л С pG С

v^rj рч^/аАикышЧ^П Р^/

<=Р А

СтА

и у Gm А А 1

Cm Ар

U

Gm Ар Л

2

АР

РИКША^]^

СтАрв'

3

СрАрАрАон РНК -лдглал

pGO

dio

Т4 - ккнАаА-^ооитжи/ рррА

Сок А pGC

öiso

Cm А Up А А

А0' pG С

-öuo-

¿ОН

с pG С

Cm А А

СтАА рнк.диглзл CmA нидеот1Ши.С

_ A GAA PPPC.PPPAGAA

pG

Рис.1. Схема синтеза тРНКР1ге с измененной антжодоновой пет-

ркр

лей. I-исходная дрожжевая тРНК£^Ау. 2 - фрагменты 1-36 и 38-76 после очистки их от примеси нерасщегошшейся тГНК препаративным электрофорезом в 10% ПААГ. 3 - фрагмента 1-33 и 33-74 дрожжевой фенилаланинозой тРНК, образующиеся после обработки соединения 2 РНКазой А. 4 - фрагменты тРНК поело присоединения тетрануклеотида gaaa. 5 - фрагменты тРНК после кинлрова-шя. 6 - тРНК с измененной антикодояовой петлей и невосстановленным 3"-концом. 7 - тРНК с измененной антикодояовой петлей к восстановленным 3'-концом.

клеотида 34-37 производные дрожжевой деацилкрованной тРНК (Bruce and Ulilenbeck, 1982):-

tPHKGAAA " замещение Gm(34) на G(34) и Y(37) на A(37), tPHKq^Iq - замещение Gm(34) на С. (34), A (35) на С (35) и У(37) на G(37),.

Ii

Php Php

tPHK_y - исходная тРНК^ ^у c отщепленным Y-основанием в

положении 37 без разрыва сахарофосфатного остова, (рис.1).

1.2. Кинетика связывания деацилированной тРНК на Р сайте. Из трех сайтов Р, А и Е на 70S рибосоме деацилировзнная

TPHKPhe (как из E.coli, так и из дрожжей) имеет наибольшее сродство к Р сайту (Семенков и др.,1985) и сязывается с ним приблизительно в 100 раз быстрее, чем с А сайтом (LUI et al.,1986). Поэтому, при малых концентрациях деацилированной тРНК^ду первым будет заполняться Р сайт. Измерения термодинамических параметров взаимодействия тРНКР1ге (как нативной, так и мс инфицированных) с Р сайтом необходимо проводить при небольшом избытке рибосом над тРНК или приблизительно равных количествах рибосом и тРНК.

Изучение кинетик связывания и диссоциации четырех исследуемых видов тРНКРЬе с Р сайтом комплекса [70S рибосома+поли(и)]

рЬа

показало, что уровень связывания тРНК после нескольких часов инкубации не зависит от того, с какой стороны система подходит к раЕцовесик - путем диссоциации или ассоциации комплекса. Это означает, что при выбранных нами условиях инкубации система достигает равновесия.

1.3. Определение констант связывания дрожжевых деацилиро-ванных тРНК.

Относительно высокое сродство де актированных тРНКр11е к Р-

участку комплекса (70S рибосома + матрица поли(П)] позволило _

провести измерения их констант ассоциации методом переменного

объема, когда во всех пробах содержатся одинаковые количества

компонентов, причем количественное отношение 70S/TPHK ZI. По

наклону изотерм Лэнгмюра в обратных координатах (зависимости

I/ß от I/г, рис.2) определяли константы ассоциации на Р сайте

Php

всех четырех видов деацилированной тРНК .

1.4.Изучение зависимости от концентрации ионов магния констант связывания тРНК с заменами в антикодоновой петле с Р сайтом риоосом.

Мы провали подробное сравнительное изучение зависимости констант связывания от концентрации ионов магния для этих

1

ПЬр

Рис.2. Изотермы адсорбции дрожжевых деацилированных тРНК на Р сайте комплекса [TOS рибосома * пот(И)) при 30 °С. Инкубационная смесь содержала в 0,1 - 3 мл буфера I (20 мМ ÎMg^+J): 10 пмоль TOS рибосом, 10 мкг поли(11), 7 пмоль деаци-лированной TFHK. ' I) TPHK^|AÏ-, 2)'тРНК^|л, 3) тРККР^А(1,

4) тРНК^у3. ß - средняя доля связанной комплексом (TOS рибосома + поли(и)] деацилированной тРНК, г-концентрация свободных рибосом.

Php

четырех видов дрожжевой деацилированной тРНК с P сайтом 70S рибосом E.coli. На рис.3 приведены зависимости lg Ка от lg для всех четырех видов дрожжевой деацилированной тРНК. Из-за больших различий в величинах констант ассоциации для нативной и модифицированных rFHK измерения проводили при разных температурах. Для всех видов тРНК наблюдается сильная зависимость константы ассоциации от концентрации ионоз магния. При изменении концентрации ионов магния от 10 до 20 мМ коне-

ij/Co А ' IgKc в

9 а* -

6 И" 8 :

7 7

6 1 « 6 . ■ ... . .1——

•а -17 -1в -«.г -16 -а -<■» -,6 «9 См^'З

Рис.3. Зависимость 18 Ка от СМ82+1.

А. (о—о) тРНК^у, 25 °С; (4-1) тРНК^ , 25 °С.

Б. (•—«) тРНК^дС, О °С; (х—х) тРНК^у6« 0 °с-

танты ассоциации изменялись в 15 - 50 раз для разных видов тРНК. Эмпирические зависимости констант ассоциации от логарифма концентрации магния представлены прямыми линиями. Наклон этих зависимостей отракает разность количества ионов участвующих во взаимодействии тРНК с Р сайтом комплекса [70Б рибосома *'поли(и)) и ионов магния, связанных с отдельными-компонентами, в предположении , что участки связывания ионов магния независимы (Таблица I). '

Таблица I. Число ионов магния, принимающих участие во взаимо-

рьр

действии дрожжевых деацилированных тРНКГ11С с Р сайтом комплекса [70S рибосома + поли(11)]#.

Вид тРШ TFHKGSAAY tPHKGAL •tPHKGC!G тРНК^у6

п 5,6 +0,6 * . 5,0 + 0,7 . 3,9 + 0,2 2,7 + 0,7

Определяется как тангенс угла наклона графика зависимости Ка от [ при постоянных температуре, рН и концентрации Ш.С1.

Количество ионов магния, вовлеченных во взаимодействие двух дрожжевых деацилированных тРНК (tPHKq^?,y, тРНк5д?,), с Р

сайтом комплекса [70S рибосома * поли(1Г) ] в среднем равно 5, для tPHKqqIq приблизительно 4. Удаление Y-основания из антико-доновой петли дрожжевой фенилаланиковой тРНК уменьшает число ионов магния, принимающих участие во взаимодействии тРНК с рибосомой на Р сайте до трех (2,7 + 0,7). Вероятнее всего, ион магния локализуется в антикодоновой петле (Labuda, Porschke, 1932). Когда мы удаляем Y-основание, нарушается координационная связь иона магния через молекулу воды с Y, хотя координационная связь с фосфатным остатком (Р-37) и с другими основаниями остается. Следовательно, насыщение ионами магния быстрее

Php Php

происходит для тРНК_у , чем для тРНК^у .

I.5.Термодинамика взаимодействия дрожжевых модифицированных тРНК на Р сайте.

Природа 3'-соседа антикодона тРНК оказывала существенное влияние на антикодон-антикодоновое взаимодействие двух тРНК с комплементарными антикодонами (GrosJean et al.,lS76), в частности, влияя на энтальпию взаимодействия. Мы изучили влияние 3'-соседнего антикодону нуклеотида на кодон-антикодоновое взаимодействие на Р сайте рибосомы.

На рис.4 приведены зависимости Вант-Гоффа для связывания различных видов деацилкрованной дрожжевой тРНК с Р сайтом комплекса [70S рибосома * поли(и)], а вычисленные по ним термодинамические данные приведены в таблице 2.

Известно, что основной вклад в энтальпию образования комплексов в водном растворе вносит стэкинг-взаимодействие оснований. При калориметрическом изучении плавленйя деойной слирали поли(А)-поли(11) наблюдалось изменение энтальпии процесса от 7,4 до 8,2 ккал/моль на пару оснований (Pongs and Reinwalû, 1973). Энтальпии для коротких двойных спиралей удобнее измерять в "единицах стэкинга", а не в "парах оснований", при условии,. что (п+1) пара оснований соответствует п "единицам стэкинга". Следовательно, величина лН=24 ккал/моль для взаимодей-Php

ствия tPHKqaaa с Р сайтом будет соответствовать 8 ккал/моль на "единицу стэкинга". Очевидно, что образуются 3 единицы стэкин-

"DVip

га. В результате тРНК_у , которая может образовать только 2 единицы стэкинга, имеет энтальпию IS ккал/моль. Удаление Y-основания ведет к неким структурным изменениям в антикодоновой петле тРНКР1ге (Kearns et al.,1973).

<эКа

9 6 7

3.3 3.4 3.5 3.6 5.3 3.-4 3.5 3.6 3.7

1/Т" (О5.!-»**"1

Рис.4. Зависимость lg Ка от обратной температуры (I/T). А. (•-•, тРНК^Ау. (А-А) тРНК^; 10 мМ IMg2*]. Б. (о—о) tPHKqq|q, (х—х) тРНК^е; 20 мМ tMg2+l.

Таблица 2. Термодинамические параметры связывания различных видов дрожжевой деацилированной тРНК№е с Р сейтом комплекса [70S рибосома + поли (II)].

Вид ТРНК tMg2+], МЫ дН°,ккал/моль дБ0, кал/(моль*К)

*fHKGMAY.' TPHKGCAG тРШ™е 10 10 20 20 -(39 + 3) -(24 + 5) -(6 + 2) -(16 +4) -(96 + 12) -(44 + 18) 20 + 7 -(16 + 12)

Php

Замена второго основания антикодона тРНКцщдду аЛвнозина на цитозин и 37-го нуклеотида (Y-основания) на гуянозин привела, как и следовало ожидать, к драматическим последствиям: энталь-

Php

пия взаимодействия с Р сайтом комплекса [70S рибосома

* поли (U)] упала до -6 ккал/моль. Данные значения энтальпии

Php

характерны для безматричного взаимодействия тРНКгис с Р сайтом 70S рибосом (Кириллов, 1983). По-видимому, в данном случае специфическое кодон-энтиКодоновое- взаимодействие . на Р сайте 70S рибосомы отсутствует.

1/СхЮ-^, /Л."'

Рис.5. Безматричное связывание деацилированной тРНК с Р сайтом 70Э рибосом.

Измерения проводили в присутствии 20 мМ 200 мМ

Ш4С1, О °С. I) тРНК^у. 2) тРНК^д0; 3) тРНК^у6- V - средняя степень заполнения рибосом лигандом (моль/моль), С -концентрация свободной тРНК.

Таблица 3. Константы безматричного связывания трех видов дрож-

рьР

жевой деацилированной .тРНК с Р сайтом 70S рибосомы при 20 мМ и О °С.

Вид тРНК tFHCLY TPHKGCAG тРНК™е

Ka-M_I (5,0±I,2)*I06 (4,I±I,0)*I06 (I,0i0,2)*I06

Поли(и) сильно влияет на взаимодействие tFHK£c|q с Р сайтом комплекса (70S +поли(Ч)). В отсутствие матрицы поли(Ь') величины констант ассоциации очень близки (рис.5). Добавление же поли(0) повышает и константу ассоциации тРНК^ув (до 1010 М-1 при 20 мМ Mg2*, 0°С), и константу связывания тРНК^д0 (1,4'Ю9 М~1), причем последняя возрастает на три порядка величины. Сходный стимулирующий эффект поли(11) наблюдается также для Fmet-TPHKFmet, при связывании на Р сайте 70S рибосом (Sarnlnsky et al.,1980).

1.5. Безматричное связывание на Р сайте.

Php

Нуклеотид, расположенный с З'-стороны антикодона тРНК , вызывает э^нкт стабилизации не только кодон-антикодоноЕОго

связывания на Р-сайте. В отсутствие матрицы, а следовательно, и кодон-антикодонового взаимодействия, отщепление Y-основания из тГНКдЬдду при 20 мМ и О °С приводит к уменьшению

сродства этой тРНК к Р-сайту 70S рибосом в 5 раз (с 5*10® до I*IÔ6 М-1) (таблица 3), а замена его на немода£ицированный

Php

гуанозин почти не меняет сродство tPHKqq^q'(рис.5). Эти данные соответствуют, данным по флуоресцентной спектроскопии, показывающим, что антикодоновая петля тРНК, взаимодействующая с рибосомой, находится в гидрофобном окружении и эффективно защищена от доступа растворителя (Hardesty et al., 19Т8).

i ■

2. Роль модифицированного 3'-соседа антикодона при неэзима-

тическом взаимодействии аминоацил-тРНК на А сайте рибосомы.

Php

2.1. Измерение констант ассоциации Phe-тРНК с А сайтом T0S рибосом.

Влияние 3'-соседа антикодона на кодон-антикодоновое взаимодействие на Р сайте рибосомы изучалось в работах (Borer et al., 1983). Наибольший интерес представляет, конечно, изучение роли 3'-соседа антикодона на А сайте, где происходят главные события при декодировании, Неэнзиматическое взаимодействие аминоацил тРНК на А сайте является следующим . приближением к реальной системе декодирования с участием EF-Tu и СТР.

Мы измеряли константы связывания аминоац«1л-тРЖр^е на к сайте. Для этого сначала заполняли Р сайт.[3Н]-тРНК^е, после

двух часов инкубации в смесь добавляли i14C]Phe-TPHK^у6. Константу ассоциации определяли методом постоянного объема, варьи-

14 Phi*

руя в пробах количество [ ClPhe-тРНК^у (рис.6, таблица 4). Сравнивая данные таблицы 4, можно видеть, что когда натив-

рЬо

ная Phe-TPHKiv" связана с А сайтом, то влияние наличия или

" 1 Php

отсутствия У-сснования у деацилированной тРНК на Р сайте

невелико: Ка при О °С и 20 мМ [Mg^+] совпадают в пределах

погрешности эксперимента. Когда же с А сайтом связана Php

Phe-TPriK V » лишенная У-основания, то К„ для случая, когда на

Php

Р сайте нативная деацилированная тРНК:_!г, меньше константы

Php 1 Php

контрольного связывания (нативные 'тРНК*" и Phe-TPHK^" на Р и А сайтах соответственно) приблизительно на порядок. В случае же, когда на Р и А сайтах связаны тРНК, лишенные Y-осноьания,

Рис.6. Зависимость I/v от I/O для: 1> Phe-TPHK^6 на А' сайте,

Php n

2) Phe-TPHK_y на A сайте. Условия эксперимента: О С, 20 мМ

[Mg24-], объем инкубационной смеси 50 мкл.

А. Р сайт комплекса [70S рибосома + поли(Ц)] занят деацилиро-ванной тРНК+у6.

Б. Р сайт комплекса [70S рибосома+поли(и)] занят деацилирован-ной тРНК^уе.

Таблица 4. Константы ассоциации Phe-тРНЬг с А сайтом

-У

70S рибосом при 20 мМ ].

Р сайт (+Y) Р сайт < -Ï)

t°C 1 /Тх10 3, Ка, t°C 1/ТхЮ3, Ка, .

К"1 л/моль Г1 л/моль

tr 0 3,66 (8,0+1,2)х107 0 3,66 (7,0+1,3)х107

А сайт. 10 3,53 (5,0+1,4)х107 10 3,53 (3,0+0,3)х10'

Р1ге-тРНк|уе 15 20 3,47 3,41 (3,0+0,7)х107 (2,0+0,3)х107 15 20 3,47 3,41 (2,1+0,3)х107 (1,9+0,2)xlО7

А сайт Phe-TPHK^ye 0 10 15 20 3,66 3,53 3,47 3,41 (8,9+1,7)х10б (4,8+0,7)х1О6 (3,8+0,5)х106 (3,3+1,0)х106 0 10 15 20 3,66 3,53 3,47 3,41 (3,4+0,7)х10б (2,9+0,4)х10б (1 ,6+0,2)х10е (1 ,5+0,3)х106

то К0 для А сайта меньше, чем К0 для контрольного связывания в 23 раза.

Php

2.2. Термодинамика связывания РЬе-тРНК^у на А сайте.

На рис.7 представлены зависимости lg Ка от обратной температуры для связывания исследуемых аминоацил-тРНК на А сайте рибосомы, а в таблицах 5 и 6 приведены вычисленные по ним термодинамические параметры бесфакторного связывания амино-

ацил-тРПК^е на А сайте 70S рибосом. Изменение стандартного -Y

значения энтальпии системы как бы не "чувствует" наличия или

отсутствия Y-основания у деацилированной тРНК на Р сайте,

php

когда на А сайте связывается Phe-TPHK^y (энтальпия и свободная энергия связывания почти не меняются и составляют -II ккал/моль и -9,8 ккал/моль соответственно).

Php

Таблица 5. Термодинамические параметры связывания Phe-TPHK"

•л , "" Y

на А сайте при 20 мМ tKg^ 3. Р сайт занят деацилированной тРНК^у5•

А сайт ДН°, ккал AS0, кал AG0, ккал

моль моль'К моль

Phe-TPHK^S -(11,0 + 3,0) - (3,9 + 0,6) -(9,8 £ 2,7)

Phe-TPHH^e -(8,0 + 2,4) 2,3 + 0,4 -(8,7 £ 2,6)

-Таблица 6. Термодинамические параметры связывания

Phe-TPHK^he на А сайте при 20 мМ (Mg^l. Р сайт

ру,р

занят деацилированной тРНКЧ .

А сайт АН0, ккал AS0, кал AG0, ккал моль

моль моль•К

Phe-TPHK^y3 -(11,0 + 2,9) -(4.4 + 1,6) -(9,7 + 2,7)

Phe-TPHK^e -(6.8 + 1,9) 5,0 + 1,7 -(8,3 + 2,0)

«

-I7"

1/Т- КГ3

Рис.7. Зависимость lg Кд от обратной температуры для связывания аминозцил-тРНК на А сайте при 20 мМ.

1) (о—о) тРНКР£е на Р сайте, Phe-TPHK^e на А сайте;

2) (Д—Д).тРНКРуе на Р сайте, Phe-TPHKPye на А сайте;

3) («—в) тРНКР|6 на р сайте> РПе-тРНКРу6 на А сайте;

4) (А—А) тРНКРу6 на р сайте, Phe-TPHKPye на А сайте.

Php

Когда на А сайте связывается РЬе-тРНК_у без Y основания, то в случае тРНКРуе на Р сайте стандартная свободная энтальпия взаимодействия на А сайте снижается до -8 ккал/моль и в случае тРНКРуе на Р сайте до -6,8 ккал/моль. Стандартная .свободная энергия AG0 повышается примерно на I ккал/моль при взаимодействии Phe-TPHKPve с А сайтом по сравнению с нативной амино-

~ I Pire

ацил-тРНК независимо от того, деацилированная тРНК+у или

тРНКРуе находится на Р сайте.

Была выдвинута гипотеза (GrosJean et si..1984) о возможности влияния гипермодификации нуклеотида в 37-м положении Р-сай-товой тРНК на заполнение А сайта. Мы попытались оценить эффект наличия Y-основания в Р-сайт-связанной тРНК на взаимодействие аминоацил-тРНК о А сайтом. Действительно, константы ассоциации аминоацил-тРНК..-^ обличались вдвое в зависимости от того, tPHK^v6 и® tPKEÄ® была связана с Р"сайтом. Разница в энталь-

+1 -î Php

пиях взаимодействия составляла I ккал/моль. Для Phe- -tPHK*v такого эффекта m наблюдалось. Видимо, взаимодействие между гипермодифицированным основанием тРНК в Р сайте и антикодоно-вой петлей тРНК в А сайте достаточно слабое. При бесфакторном связывании с А сайтом Phe-TPHK^e, более сильном по сравнению со связыванием Phe-TPHK^y6. из-за ограниченной точности метода влияние наличия Y-основания на Р сайте не ощутимо. Еще меньше вероятность обнаружить этот эффект при еще более сильном факторном . связывании аминоацил-тРНК с А сайтом комплекса (рибосома + поли((Ш.

Выеоды

1. С термодинамических позиций сделана количественная оценка вклада модифицированного оснозания Y во взаимодействие дрожжевой фенилаланиновой тРНК с матрицей на рибосоме.

2. Кодифицированное основание (Y37), расположенное с 3'-стороны антикодона тРНК, стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие на Р сайте благодаря стэкинг-взаимодействию со стопкой оснований кодон-антикодона (изменение энтальпии взаимодействия с -39 ккзл/моль до -24 ккал/моль при замене У на А и до -16 ккал/моль при отщеплении Y-основания) и взаимодействует непосредственно с гидрофобным центром Р сайта рибосомы (снижение константы ассоциации в 5 раз в отсутствии матрицы при отщеплении Y-основания, без изменения сродства при замене на немодифицироЕанный гуанин).

3.Гипермодафицированное основание Y в 37-м положении дрожжевой тИ1К№е обуславливает связывание по крайней мере деух ионов магния при взаимодействии с Р сайтом комплекса C70S рибосома +

матрица голи(1Ш.

4. Для кодон-антикодонового взаимодействия на Р сайте характерна низкая специфичность к нуклеотидам. Замена второго основания антикодона одновременно с заменой 37-го нуклеотида (GmAAY - GCAG) приводит к еще более выраженному изменению энтальпии взаимодействия (с -39 до -6) ккал/моль, что характерно для взаимодействия без матрицы, в то же время константа ассоциации такой модифицированной тРНК увеличивается на три порядка величины в присутствии поли(Ц).

Php

5. Удаление Y-основания из антикодоновой петли . Phe-TPHK снижает константу матричного бесфакторного связывания с -А сайтом комплекса [70S + поли(и)] в 10 раз. В противоположность взаимодействию на Р сайте, удаление Y-основания не ведет к значительному падению энтальпии взаимодействия, (энтальпия' уменьшается по абсолютному значению с 10 ккал/моль до 7 ккал/ /моль). Наличие Y-основания в антикодоновой петле деацилиро-ванной тРНК, связанной с Р сайтом, повышает сродство

Php

Phe-TPHK_y к А сайту в два раза, что свидетельствует о возможности взаимодействия двух молекул тРНК на А и Р сайтах.

6. Для получения препаративных количеств тРНК с желаемыми

заменами нуклеотидов в антикодоновой петле методика энзимати-

ческого замещения тетрануклеотида антикодоновой петли дрожже-Php

вой tPHKJj дду Д°лжна <3ыть усовершенствована применением препаративного электрофореза и оптимизацией концентраций ферментов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. В.И. Катунин, C.B. Кириллов, В.И. Махно, Н.Г. Соболева.

Php

Взаимодействие тРНК с Р сайтом рибосом из E.coli. Роль модифицированного нуклеотида в кодон-антикодоновом взаимодействии. //Препринт ШЯФ,-С.-П., ЭЕГуст 1992, No 1826, -С.32.

2. В.И. Катунин, Н.Г.Соболева, В.И.Махно, Э.А.Седельникова, С.М. Женодарова, C.B. Кириллов. Взаимодействие деацилированной фенилаланиновой тРНК из дрожжей с рибосомами S. coll. Роль

модафицированного нукпеотида в кодон-антикодоновом взаимодействии. //Молекулярная биология. -1994. -Т.28. -В.Б. -C.II7-I2I.

3. V.Katunln, N.Soboleva, V.Mahckno, E.Sedelnlcova, S.Zhe-nodarova and S. Kirillov. Effect of the nucleotide-37 on the interaction of tRNAPhe with the P site of Escherichia coli ribosomes. //Biochimie. -1994.-V.76.-P.51-57.

4. V.Katunln, V.Mahckno, E.Sedelnicoya, N.Sobolevq, S.Zhe-nodarova and S. Kirillov. Interaction of the deacylated tRNAplie with P site of E.coli ribosomes: role of modified nucleotide in codon-anticolon interaction. //Abstr. 15th International tFNA Workshop, Cap d'Agde, Prance.-4993.-P. 267.

5. V.Katunln, N.Soboleva, V.Mahckno, S. Kirillov. Effect or the nucieotide-37 on the Interaction of tRNAPhe with A and P site of Escherichia coll ribosomes. //Abstr. EMBÛ-CNRS Workshop on nucleotide modification and base conversion of RNA, Savoie, France. -1994. -P.10-7.

PTÏÏ ПШФ, ■ зак. 582, тир. 100, уч.-изд.л.1;22/Х1Ы994г. Бесплатно