Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЮЦЕРНЫ И ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВОГО К ФУЗАРИЮЗУ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЮЦЕРНЫ И ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВОГО К ФУЗАРИЮЗУ МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ"

А ~ 505-5-9

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи МЕЗЕНЦЕВА Ольга Юрьевна

УДК 581.146.0

СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЮЦЕРНЫ И ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВОГО К ФУЗАРИЮЗУ, Р "ГОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

03.00.23 — биотехнология

■ • - . Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии именч К А Тимирязева

Научный руководитель — академик РАСХН, доктор с х. на>к, профессор В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты доктор биол наук 3. Б. Шамина, канд биол наук Л. М. Хромова

Ведущее учреждение—Научно исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится 6 июля 1992 г. на заседании специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева.^ 10 Ч&С .

Адрес 127550, г Москва, ул Тимирязевская, д 49, сектор защиты диссертаций

С диссертацией мол* о ознакомитьс '»-чадьной науч-

ной библиотеке ТСХА а

Автореферат разос. к (Р» . .^/Ч 1Г>2 г.

Ученый с специализир 'ват кандида. *5ио

% С. Лосева

ОБДОШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. .

Получение высоких урожаев зерновых и кормовых культур невозможно без долговременной устойчивости сортов к фитопатогенам. Для ускоренного создания ценного селекционного материала наиболее перспективен отбор резистентных форм в культуре клеток и тканей. Эффективность клеточной селекции повышается в тысячи раз по сравнению с традиционными методами, так как позволяет манипулировать с многомиллионными популяциями клеток, отбирать устойчивые и регенерировать из них растения. Осуществление направленного отбора в строго, контролируемых условиях С in vitro ) дает возможность изучать небольшие количественные различия в полигенно наследуемой

горизонтальной или общей устойчивости.

Проблема защиты от фузариоза - одна из наиболее актуальных, во'всех регионах возделывания пшеницы и люцерны. Это обусловлено сильной вредоносностью патогена, его широкой специализацией, экологической пластичностью, большим'разнообразием видов рода *и-sarium Ik ;, способность» быстро образовывать новые агрессивные

расы. V".v. "• •'•'

. Возмогюсть отбора In vitro устойчивых к фузариозу форм люцерны с " , .льзованием в качестве исходного материала клоноэ с высоки' нерационным' потенциалом была установлена в работах , амери .¿ских ( ЙагЪтаа et а! 1984) и итальянских ученых ( Аг-eioni Отбор.осуществился не уровне каллусов, а

■ в качестве селективного агента был использован культуральный : фильтрат гриба Fusarium охуврогш» . Имеются>акге сведения по ; отбору клеточных линий, устойчивых к культурельному фильтрату гриба и'регенерации. из них. растений ( Binarova et al., 1990).

- • " Г" ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. евльскохоз академии им. К. A/fTn*K£

Инв. №. .-

Однако, анализ других р^оот в этой нетрадиционной области селекции растений показал, что наиболее а^икетвен отбор in vitro лишь в той случав, если а качестве селективного ¡o-кторз лспользу-

емя химически определенный токсин или его аналог, a а качестве

К)

иатериала исследований - клеточные суспензионные культ,,рък~га люцерне эта Схема селекции la vitro до оих пор не испытьшаДчсь.

. Сведения по отбору в культуре клеток пыеницы устойчивых к фузарвму-.растений в научно-технической и патентной литературе также отсутствуют.

Цель и задачи исследований.

Цель настоящей работы - создание исходного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методами клеточной селекции.

В связи с этим в задачу наших исследований входило:

1. Усовершенствовать методику получения растений-регенеран-тов люцерны при образовании КОЛ непосредственно из экспланхов-отрезков стеблей.

2. Отработать методику получеьия растений-регенерантов пшеницы при образозинид П.СК из неарелых соцветии и отбор генотипов с хорошей perenepj«i<OHHoii спосооностыо.

3. Изучить влияние 1узариевой кислоты и ферментов на клеточные и каллусные культуры люцерны.

4. Изучить влйчние ФулэриезоЦ кислоты и ферментов на каллусные культуры пшеницы.

5. Выявить опт/ыальные селективные условия для отоора клеточных и каллусиых .ь.шлй с коиплексной устойчивостью к фузариозу.

6. Изучить сочьклональную всричоельность признаков растений-регенерантов, получанных 11з отоорашшх линий.

7. Провести сравнительное изучение устойчивости к фузарио-. зу растений.люцерны и пшеницы, полученных из клеточных ли?ий, . культивируемых в селективных и обычных условиях. .'.-'.

.8. Усовершенствовать метода оценки отобранного материала в культуре in vitro. . , .

Научная новизна. Отработаны эффективные способы получения, ■культивирования и регенерации растений люцерны и пшеницы с использованием клеточных суспензионных культур, полученных непосредственно из тканей эксплантов.'Предложена принципиально новая - система отбора in. vitro . растений, устойчивых к фузариоэу с использованием а качестве селективных факторов пекто- и целлвлолити-■« ческих ферментов совместно с фузариевой кислотой.' Впервые'рззра- . . ботан способ Оценки растений на устойчивость к фузариозу, позволяющий вести отбор наиболее устойчив!« генотипов на ранних этапах селекции.. Способ, защищен авторским свидетельством¿*,- ... -

.'Практическая ценность и реализация результатов: Разработан- " •'. шло методы клеточной селекции лкцсрин и псеиицы позволяют существенно ускорить процесс отбора in vitro j устойчивых к фузариозу . ■;•форк за счет сокращения традиционных этапов получения первичного С каллуса..Эффективность клеточной, селекции повышается в результа- . . .'. те введения в культуру одновременно большого количества геноти-'

пов: и , быстрого получения' reTeporetiHbix: популяций. ■V В результате клеточной селекции,получено,8 шгаий'люцерны,.. \ : ':•'устойчивых-;к виду." ..oxysporum и;2. линии, - устойчивые к несколь-""юя>аи»аи :§уза$иев- G^sporum. Fi avenaceumsambucinun, .

-,'']?;.!си1йогии; 'E.javanicua,. ff.soiaai, P. 'redolens. ; .Отселекти-,роеаио по одкоа- клеточной линии,;устойчивой к: виду - F. exysporum. у сортов пшенпщ.: Зыряно'вка«'Омская 19. '. '. - '•.:'Всего получено

18 клонов растений - регенерантов сорта Зыряновка, 15 - сорта Омская 19. С устойчивостью к двум видам фузариев отобрана одна линия у сорта Омская 19 и две линии сорта Зыряновка. Всего получено 23 клона растений - регенерантов сорта Омская 19 и 18 - сорта Зыряновка.

Наряду с признаком устойчивости к фузариозу отселектирован-ные линии пшеницы обладали такне высоких ыорфогенетическим и ре-генерацион* ым потенциалом.

Полученный материал перспективен для дальнейшей селекции при создании устойчивых к фузариозу сортов.

Разработанный универсальный способ оценки растений на устойчивость к фузариозу используется в лаборатории иммунитета ВНИИ кормов на ранних этапах иммунологической'оценки при отборе устойчивых к фузариозу растений клевера лугового.

Апробация работы. Ооновные результаты исследований были до-лоиены на научно-практической конференции "Ученые Нечерноземья -развитию сельского хозяйства зоны" (Яеычиновка, 1991), на Всесоюзной научной конференции молодых ученых и аспирантов по актуальным проблемам интенсификации кормопроизводства (Москва, 1991), на научном семинаре кафедры с/х биотехнологии ТСХА. (Москва, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано & научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит иа введения, обзора литературы, описания примененных методов и экспериментальных глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 2<*9 наименований, в том числе 127 иностранных, и приложения. Работа изложена на ¿59 страницах машинописи, содержит 25 таблиц

-ч-

и иллюстрирована 29 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ•

Исходным материалом служили 32-хроыосомные растения клона Р54 сорта Дединовская люцерны северной ( Ме<Иса5о ЪогеаНз СгоэзЬО, обладающего выскоим регекерационкым потеициаяоы и В -сортов ярозой пшеницы: Московская 35,;Ангара 86, Диана 3, Омская 19,-Зыряновка, Энита, Академия, Н1еЬЬигу . Источником для получения клеточных суспензионных культур (КСК):и первичного каллуса у люцерны'служили сегменты растущей части стеблей, у пшеницы -незрелые соцветия. Индукцию каллусогенеза у эксплантов люцерны -осуществляли на агаризовэнной среде МВ5 (Мезенцев, 1980), а эмбриогенеза - путем добавления в среду.ЕАП в концентрации 0,2 мг/л. Дальнейшую регенерацию растений проводили культивируя эмбриоген-ную ткань на безгормональной среде с уменьшенным вдвое содержанием всех основных компонентов.

Клеточные суспензионные культуры люцерны получали двумя способами: I) помещая первичные каллусы в жидкую среду, мв и 2) поме щая в ту ке среду сегменты растущей части стеблей. Зо втором случае каллусообразование индуцировали непосредственно в жидкой.среде, содержащей повышенное количество ауксина (б мг/л 2,4-Д). Образование эмбриоидов в:обоих случаях осуществляли путем пятикратного уменьшения концентрации фитогормонов в среде.' ,

V ' Каллусные культуры пшеницы получали по способу, описанному в работе Нэддока и др.( Маааоск^ а!., 1983). ; •'.."' Клеточные, суспензионные культуры-пшеницы получали, помещая первичный-каллус или сегменты незрелых соцветий в кидкую среду : КЭ,' содержащую в качестве'ауксина"- дикам бу.з концентрации V мг/л,;а .такме аминокислоты•- .Ь-пролин,. Ь-зспэрагия и. Ь- ;

глчонии. В средь оаыаиЛ!" содор -дние хе-г-та елечэ 1 сахарозы. На от*л1аУ получен! I зпбрисгенього к^длуси / ¡.азвгчит ^пориолдоъ и гобегов использозали тнеик, ЛУК, а тик'е впадины по Ноги и1. (1983).

Дл1 клеточной ^елекцш ил устойчивость к 4узар озу .*слодь-аовали суспензионные культуры ¿-го л 3-го ц.тлов .'Вчи'ч ¿з се релине экспонента таю/ (¿лэы роста. Селективную сред/ создавали на основе агаризозинноЯ ьредц МБ, добавляя л не» после автогла-а'/роааиия £узорлез>о кислоту »: «.ерчамы, простерилизовзнные Тмль-трозанлем через са.стериагьныи Х.'льхр с диа-.етром пор 0,2 и км. Клеточные суспензионные культуры высевали На секечтлзные среды методом плейтинга. С целью проверки стабильности полученных 1ло-нений л отбора наоге„уеиих мутащм клеточные лмййл последовательно пассировали Но оелективноЛ и осыччой (контрольлол) средах, лаждый цикл селекции включал 2-5 Писдазка ьа селективной и 2-3 пас сл«а на контрольно« средах. Вшившие в конце каждого цикла колонии клеток переносили на свежею среду. Отооранные линии помещали на среду для морфогеьеза. Регенерацию осуществляли лз клеток, спосооных развиваться на среде с суолетзлыюИ концентрацией -океанов .

для изучения .(сто^чивости растений - регенератов «I йгоарло-зу использовали чистые культуры Наиболее патогенных птамыов следующих видов фузириев: Р. охузрогша, Р. ауепасегш, К. си1тогша, Ж. -;атоис1пит, Р. гес1о1епз, Р. Л^ап1сит, р. ао1ат, Р. егат!-пеагиш. Инокулеы для создиния искусственного .посекционного фона гоювлли путем разчноаеши чистой культуры фузлшез на зернах овса; культура льны< ц-ильтрот получали при глублинои ВЫраиИШаНИИ фу-аир> сб в хидчоЛ ореде Чагека. Споровую с^спеьзию плтогенвых итам-ысл готолил/ по ь-^тсД1, описанного а Методах эксгер/уентальной

микологии (1982).

Устойчивость растений-регеиерантов в поколениях HQ к Е^ оценивали методом увядания-изолированных частей растения, в наивном ■■ фильтрате культуральной жидкости патогена и по степени мацерации тканей' корня под действием пекто- и целлюлолитичесних ферментов. . ^

; Сравнительную характеристику.полученного признака у расте-■ ний-регенерэнтов люцерны, исходного клона Р54 и сорта Северная гибридная проводили при хроматогрэфическсы анализе ыетанольных экстрактов стеблей и корней растений.

Окончательнув оценку полученных форм проводили в вегетационных сосудах я в полевых условиях на яестком искусственном'инфекционном фоне; Контролем.служили неинокулированные растения,а такие растения-регенеранты,, полученные без предварительного отбора в селективных условиях на уровне клеток и каллусов..

•• Сомаклокальную вариабельность признаков растений-регенеран-тов люцерны И'пшеницы изучали в условиях теплицн. На протяжении всего периода вегетации учитывались следующие.показатели: у растений люцерны - высота.растений, число стеблей,. количество и форма листочков в листе,:морфологря цветка,„тип корневой системы, наличие-граней .на стебле,- сырая и сухая'масса растений; у пшени- . цы - высота .растений, число стеблей, в том числе продуктивных, ' -.число и. длина мендоузлий,: длина и форма колоса'., длина флагового . ' листа, число колосков.в колосе, число и,масса зерен в колосе,. . мосса 1000 зерен. • t : .,*%'''.; ■ w

*V РЗЗУЛШТЬ! И обсуждише-/'.,; "

-• •>. ... Регекерялия растений люцерны и пшеницы,- Листовые .экспланты чтацернкГпомецешше-на;среду для: каллусогенеза,. з течение первой

недели оохранпизь леленыш1, j j£.ïeu "рлоорзт^г/ о^тло-лрлр.л" итханок, чю cm i жо с да^тр/кциоi хю^сп -.астов. Через 3 ч» д KHK>CjU'.5»1 че JthCO С3/ Л/CTGLHX ОКСЛЛЛЛОВ ОСГ^ЗОЗл"." «ufiij^I со средне.' ыассол oi.ono 500 мг.

Все получь?h je перз-<чп.с чаялусы ¡и.ели -»ельоб; jji jîo iiuit-. с-тенцш, дает их -зары'ровал от еветяо-\елтого .5 оттого «о свет^ о-салзтового. В Дслг-леллен, прл неоднекр^тнел п-сс/роваьли '-ллуоов обнаружилась их д^.еренциацич по морц-ологичешим пр.знаК^л на ¿ типа: каллусы ^е^еоо^азьо« !онсистенции, ^ллы-о оозодньнньл., в 0i,>iûb40îj депого цвета л Оо^е^ плотные: аенее оово^ьеньые, от светло-салатового до те! но-зегечого цвета.

Частота кал^усообрелованич у „ксплантов пшеницы з^рыпое^ла по сортам.

Помещение гег алчных ^ллусов люцерны в м'Дь,/Ю плителъную среду л культлвиров^ние в ус.йвиях непрерывного лстряхлэа"ия приводило к образовавю более /ли менее ^грегирозаьчых [легочных оустснзи.!.

Рыхлые каллусы быстро Аезинтегрироваллсь На o*vs ль1*ые клет-t--u л i еболь^ие < геточг'ые агрегаты г yse к t онцу перво i неде и: ьуль? и/рол-ьия ос^зовшили 1еточнур cycnefjii», состоншу* иы bC .J отдельььх ¡-теток и 8—It> клеточных -гре^ааов. От осгее ¡.лохькх ьаллусоз сын получена более агрег. рова! чые суепечз^и, loctc чле на t>5" .л много геточлых, греим^ествечно 16-32 и Солее .•легочных ¿грегатол. [.бразовал^лесл популяци/ с„стро р^акно. ici. л че^-л ¿-3 ге„ьп их ч. ^lOîHOCTb (^отюсть) дом/гада чОО-н&О клеток/.(л ¿¿апе»лии.

"епосре^ствс! » ое no.it, tF :е с г^е^тов ою^ых слеблеГ, в куь -лтательн^ о c,.e~j ^^еотвенно je орало по учете ьючгьа.

-Х-

суспензионных культур (КСК) высокой плотности, причем, они отличались от КСК, полученных традиционным путем, большей жизнеспособностью и меньшей агрегированностыо.

Эти se-культуры более длительное время сохраняли регенераци-Онный потенциал.и были более эффективны для клеточной селекции люцерны на устойчивость к фитопатогенам, КСК, полученные "прямым" . путем, после субкулмивирования в среде-ms с добавлением ЕАП (0,2 ыг/л) и аминокислоты X. -аспарагина (750 мг/л) образовали , в массовом-количестве эмбриогенные структуры - до 250 щт/мл суспензии. ' .. ; ■ ' ; .. . . '

Полученные в суспензионных культурах эмбриоиды при помещении . на среду: для регенерации уже в конце первого пассзяа'(3-4 недели) начинали дифференцироваться. Появлялись темно-зеленые почки, за- ■ тем начинали расти корни,-первый простой и тройчатые листья. При помещении-дифференцированных клеток на среду с добавлением НУК-4 мг/л и кинетика - 2 мг/л начинала образовываться морфогенная ткань, в которой появлялись.меристемные зоны, где формировались стеблевые почки и корневые апексы. При развитии растений по мери-стематическому типу первым появлялся тройчатый лист. : Таким образом,.развитие растений - регенерантов люцерны из клеток суспензионных.культур шло двумя путями: как через образование, эмбриоидов, так и через'образование меристемных зон. Встречались и смешанные -типы развития. , ' ,. . - ( При помещении в жидкую среду первичного каллуса пшеницы,.полученного при 3-4-х кратном пассировании эксплантов-сегыентов незрелых соцветий на! агрегированной среде, через 1-2 месяца образо-выгались-клеточные'культуры плотностью.'150-200 тис. клеток/ил суспензии.-,На интенсивность роста КСК и степень их агрегированнос-• тк. çpabEoè - -влияние оказывали генотипические''особенности зкеплэнтов

(табл. I).

Таблица I

Влияние генотипа на пролиферацию КСл{ пшеницы

Сорта

Агрегирован- Жизнеспо-нооть, % собность,

до 16 16-32 * клеток клеток и более

Средняя плотность КСК в конце первого пассажа тыс.кл/ ил

Продолжительность периода образования КСК плотностью 150 THQX кл/мл____

число субкультивирований (пассажи)

дни

Московская 35 42,2 57,8 79,3 НО 2-3 42-63

Энита 48,9 51,1 82,4 122 2-3 42-63

Академия 58,8 41,2 87,7 116 2-3 42-63

Зыряновка 70,3 29,7 89,3 205 I 21-28

Омская 19 76,5 23,5 85,6 200. I 21-28

Ангара 86 80,1 19,9 88,4 180 I 21-28

Диана 3 69,4 30,6 83,3 160 I 21-28

Highbury 60,3 39,7 74,1 165 I 21-28

Наиболее высокий темпом клеточных делений характеризовались культуры, полученные из каллусов раннеспелых сортов.

При субкультивировании клеточных суспензий в среде о увеличенный вдвое содержанием 2,4-Д и добавлении кинетика - 0,2 иг/л в отдельных вариантах через 4-6 недель начинали образовываться оваль-' ные белые глобулярные структуры (эмбриоиды) размером 1-1,5 ьи в диаметре, исходные экспланты-каллусы разбивались на более иелкие агрегаты удлиненной, овальной или сферической формы. Часть из них - с бурыми включениями, другая часть - с белыми побегообразными отростками длиной 3-4 им. При пересадке этих ыорфогенных структур

о

-¿О-

на агаризованную среду (Maddock et al., 1983) в большинстве случаев на разросшихся каллусах наблюдался риэогенез, и лишь j четырех сортов (Зыряновка, Омская 19, Диана 3 и Ангара 86) на крупных светлых каллусах появлялись мелкие зеленые участки - проэмбриоиды, часть из которых в дальнейшем на среде без гормонов образовывала побеги, другая часть не была способна к дальнейшему росту или развивалась в уродливые нежизнеспособные структуры (сильно закрученные, спиральные или белые побеги и листья). ~ , Наиболее плотные клеточные суспензии, состоящие преимущественно (на 60-80% у; всех генотипов) из единичных каллусного типа клеток были получены при помещении сегментов незрелых соцветий непосредственно в жидкую среду.

* .Через 6-8 недель плотность клеточной суспензии в отдельных вариантах достигала 300-500 тыс. кл/мл 'среды. Сами эксплаизсы разрастались и начинали сильно наллусировать. Через 3-4- недели появ- -лялись мелкие белого цвета глобулярные структуры диаметром от 0,10,2 ММ ДО 0,5 ММ.- ^ . ••' f'.'V.- ■.■.-."-•*'--"■ ,> Г-' \

Клеточная селекция люцерны на устойчивость;; фузариозу. В первой 'селективной системе испытывалось шесть различных концентраций фузариевой кислоты (2,4,6,8,10 и 12 мг/л среды). В контрольном варианте токсин в среду не добавляли. Клеточные суспензионные ;культзфы высевали на селективные среды методом плейтинга. Через 3-4 недели начинали образовываться колонии клеток и можно было проследить четкие различия в ингибировании их роста.; •

< Ох' 80 до; I0QJ& клеток погибало при концентрации IÖ-I2 мг/л или 0,05-0,06.мМ. Выжившие единичные.клетки образовывали колонии диаметром 0,5-1,0 мм * не способные к нормальному росту в обычных

jC/oüiihx. Очевидно, j^-oi ие дозы .(Того токсина необратимо наруша-ы сиохиыические процессы в <слетке. При досавздиш токсина в чон-ценграции 8 нг/л ali) удалось отобрать отдельные j-олонип .сле-

док, способные к pot,ry при неоднократном пассировали на токсической среде.

Концентрация б иг/л (0,03 ьМ) вызывала гибель оолее половины клеток, а концентрация 0,01-0,02 мМ не оказывала существенного ллгнбируклцего возде 'ствия ьа рост .! развитие популяции клеток в сравнении с ьонтролем (табг. 2).

Регенерации ристенил осуществляли из клеток, спосоолых развиваться на среде с суолетальной концентрацией токсина (0,04 uil).

С целью прохерки стабильности полученных изменений и отбора наследуемых муициД клеточные линии люцерны последовательно пассировали на селективюЯ » об-члои (для каллусогенеза) средах.

¡Саьдыл цикл селекции включал 2-3 пасс-ка на селективной, 2-3 nsccjsa на контрольной и вноьь 2-3 пассажа на селективной среде. Отобранные линии поисл^лл н-з среду для морфогенеза (с уменьшенным

гормонов л добавлением EMI и Ь-^слараП'на). На этой с^еде через 3-4 ьеделл образовывались эыбриогды, зачатки побегов и юрчел.

Всего было получено 8 линий люцерны, устойчивых к токсину -ФуйарлевоЛ кислоте.

а"я отбора клеточных ллнкл с комплексной устойчивостью к <*у-jdpt'03y испытывались ри.зличнье селективнье среды, содерг^цье фуза-

кислоту в сочетанлл с ^ерментсми пектгназои "t'aeerosyme Н-10" Я целлюлазо! "Onoauka 4-1О" фирмы Sigma . з Гичестве салеки'вной было забрано Такое сочетание концентраций этих токсических компонентов, rpi котором погибало около 80J5 клеточных ли-M'i. ¿ьдлэсае кого л'• клехок последовательно пассировали на се-

Таблица 2

ВЛ1 ЯННЕ ФУЗШ1ЕВ0.1 КИСЛОТЫ НА РОСТ И РлоВИТ! Е ¿ЛЕТОК Г KAL УСОВ ЛВД1Ш ЛГОпА Р

Концентрация 1изнеспоообность клеточных Прирост Массы каллусов в % от ьонтрочя

1узариевой лить», % (100"»)

ьислот, мМ --------------------------------------------------------------------

I цикл II цш:л III цикл 1У цикл I ЦРКЛ II цикл III ц1ьл 1У цикл

0 (контроль) 95,5 90,6 92,4 96,0 100 100 100 100

0,01 85,0 81,7 79,9 75,5 96,6 97,0 95,2 86,6

0,02 67,8 63,8 60,6 59,4 81,7 50,4 73,8 65,7

0,03 51,8 46,6 40,2 37,1 63,1 t'2,4 £0,5 55,2

30,2 ¿5,4 21,о 11,0 3s, 8 37,6 25,ч

0,ij 23,0 13, > 15,2 С IV,5 Ь,0 -

0,06 13,6 0 0 0 14,6 - - -

1С?, с •,,? 1,Б 3,1 1,9 1,2 1,0 1,6 3,5

лективной и обычной средах (для каллусогенеза) с целью выбраковки, эпигенетических изменений: В результате использования комплексной селективной среды были отобраны две наиболее устойчивые клеточные линии, из которых получены два клона растений-регенерантов.

При использовании в среде меньших концентраций ферментов и фузариевой кислоты отобранные линии несли эпигенетические изменения, а линии, отселектированные при оптимальных сублетальных концентрациях, обладали наследственно закрепленной устойчивостью. ''■-.

Высокие концентрации ферментов и фузариевой кислоты вызывали снижение жизнеспособности отобранных линий или полное отсутствие • их роста. При испытании линий, отобранных-только на сублетальных концентрациях фузариевой кислоты,•полученные.регенеранты обладали УСТОЙЧИВОСТЬЮ ТОЛЬКО К одному ВИДУ фуЗврИвВ - •' • ахуврохяж^ В;не : были устойчивы К другому - г. avenaceum. " . - . S - t

Клеточная селекция на устойчивость к фузариозу только с. использованием пекто- и целлшолитических.ферментов также,позволила *''выделить устойчивые генотипы, однако их степень устойчивости была ниже, чем при использовании комплексной селективной среды (фуза- • ■ риевая кислота + ферменты).- - ;-V-'/ ■''...

. Отбор in vitro" устойчивых к фузариозу линий пшеницы. Испы-тывались две селективные системы отбора. В.первой токсическим агентом слукила фузариевая кислота,, во втором - фузариевая кислота сов-; местно с пекто- и целшололитическими ферментами. '..'. ... • ".:■.

Изучение каллусогенеза на селективных средах с различна! со- •■■„держанием фузариевой кислоты (от 0,01 до 0,4;мк) показало; что , ; . 50% клеточных линий пшеницы погибало при 0;1 мМ токсина в среде, • а при О А "М выживало менее I0J5 (табл. 3), причем в сильной степе-

' Таблица 3

Влияние фузариевой киблоты на рои и яизнеспособность каллусов пшеницы

1изнеслособность каллусов пшеницы Масса каллусов в % к контролю (% вшивших на селективной среде) ___________

Концентрация 4узариевой к-ты, Ш Концентрация $узариевой к-ты, ыЦ

о" о'оГ 0,05 0,1 0,2 0,4 0,01 0,05 0,1 0,2 0,4

^ооновская 35 85,4 73,1 63,7 48,7 18,9 • 0,3 92,6 81,6 60,5 33,1 7,6

Падения 96,2 89,3 70,6 51,0 20,3 0,9 91,4 83,8 61,4 30,2 9,6

94,5 85,6 68,3 46,3 21,2 1.0 90,7 77,1 59,2 33,1 7,8

Зсряновка 89,6 80,0 71,8 50,2 19,6 0,7 95,8 85,6 65,0 34,0 6,3

Омская 19 90,9 78,0 60,4 4,8 17,4 0,6 90,6 79,5 60,5 38,5 6,8

ана на 3 91,5 77,1 61,6 46,0 13,5 0 92,3 80,2 66,8 38,1 -

Ангара 86 90,2 81,8 57,9 38,1 13,3 0 92,1 73,8 63,6 32,9 -

Н18ЬЪигу 82,2 70,7 54,9 37,4 16,1 0 89,6 70,5 59,7 30,4 -

«СР05 10,8 9,6 6,7 5,2 3,7 0,5 И.4 8,1 5,8 7,4 1,1

нк кнгибировался их дальнейший рост.-

В качестве рабочей былз выбрана сублетальная концентрация £узариевой кислоты (0,2 кМ), при которой погибало около 80$ кле--точных линий, но болыяая часть.выкивших сохраняла морфогенетичес-. кий потенциал. В этих условиях удялось отобрать восемь клеточных линий сорта Диана-3, шесть линий сорта Зыряновка и. три линии сор-. та Омская 19. При дальнейшем культивировании способность к эмбриогенезу проявили только по одной линии каждого сорта. В результате' получено 18 клонов растений-регеьерантов сорта Зыряновка15 -сорта"Омская 19 и 9 - сорта Диана - 3. } '

Для'отбора растений, устойчивых к нескольким видам 'фузариев,^ клеточные линии культивировали,в.среде, содержащей комплекс инги-бирующих-рост веществ (фузараевап - кислота + пекто- а цетшололити- -ческие ферменты). В качестве селективной концентрации использовали такое сочетание этих компонентов, прп котором погибало,около 8052 ' клеточных линий. Единичные жизнеспособные каллусы.можно.было-ото- . 'брать во втором цикле селекции при концентрации пектиназы— 0,25 ед/мл, целлюлазы - 1,5 ед/мл и 0,05 аЫ фузариевой кислоты. Полу-< ченные в этих условиях линии пшеницы, при пересадке в контрольные (неселективные) условия, сохраняли цорфогенетический потенциал, образовывали эмбриоиды и побеги. Всего таким способом было ото— ■ брано 2 линии .сорта Зыряновка и одна, линия сорта Омская 19* -.

.. Из них получено,18 клонов-растений-регенерантов сорта Зыря- < •'новка,и' 23 клона - сорта Омская 19.. . V.-

"Оценка растений-регенерантов па устойчивость к фуаариозу. При помещении растений-регекерантоэ в еосудыс заракенной иноку-люыом фузариев: почвой наблшдд.'шсь значительно большая их.' устойчи-

ьозть по с^.внечио г р^стош ли . " 0«]и1ч/ i 1)1и. „ ь.^ ...г ^ н|

з^ кт ь ево I < ютемц покиЗзЛ. , ь< у I ,.С<.1[- чс 1, 1 . ,

•311 *я ир.'изи рл.тен.' ->е , и > < и„ < т^и. н

¡1ор_*ешосп' 'ПоТеч.ь! и^л I и .¡.и.

1ест р^стеи.ь(.11 .ло < I Jutu па! и> ¿с >

чиессть к др..г.;«' элдзи уз^.. <■ , .< ч^з. ) т.- к СГсч/епасеигги)

го с-13 . 10 в0с1 р.'.л i. - 'и г.тогсом "о с 1 н

с рЧаКЦИей yCIOJ4l.joc.tu е е 1! ол, , ч )|| 05

средах о чомппвчсс.! токе лчси ( . . ч).

т-I. 0 . 1 , •+

■ом-швостъ ристенг - и 1 > И о V . С> ■к. 0

кг о 4 4 Л J^> Г-

Образцы Р. охузрошп 1СОШ& Р. схулр >гия * я/еплсоич!

р % Н Я п аТ ✓•3 Н % Г % ч ;

V 61,0 ¿5,6 0 1С0 Су

а<Л 58,0 19.1 '->Ь , 1- ¿8,0 7о,3 31.1

Н«Л С0,0 #1.7 30,7 ' 2,1

100 50,0 1Г0 100 £1,7

5,0 н-.и 5,У с.О

«спыззш'1, гроведеннье 1 . ло ьл' ¡рол ^ ья! : а

ц.оге, пок~,з <~ц 1.ЛПЧ1Ш усхо ч.а.л о 1. pJJl л о ^ VII»о

¡ЬхОНс! ,с I „СКОЛЫШЛ 11,1 ( 2*. С суэрогил, Р. ДГ^Ча-

сехш, Р. БатЬисЗлит, Р. си1аох-ит, У. Р. ,]

уап1сич).

. При помещения листьев растеш-и-регенерантов и исходных сортов пвспицы в фильтрат ватавной культуральной »идкости фузагкзр ухе через 2-4 часа наблюдались существенные различия по степени их увядания. Наибольшей устойчивостью к действию культурэльной жидкости ^.охуврогиш характеризовались линии, полученные во второй системе отбора. Они зке отличались повышенной устойчивостью к 1\йгат1п9агит и-совместному зоздеИствию обоих патогенов (табл.5).

Таблица 5

Сравнительная оценка растений-регенерантов:пшеницы и исходных сортов по среднему Салз:у увядания листьев в культуральном фильтрате фузариев

«'сходный ■ Ли- Вариант ^.охузрогша: Р.егат1леагит Р.охузрогим + сорт . нии ■ г.бгат1пеаги1п

2ч 4ч 8 ч 2ч 4ч 8ч 2ч , 4ч 6ч

_ 2~~~~"з ~ 5 б"~ 7~ 8~ ~9 ~~10~~~11 " 12~

(Он ска я 19 Ь 13 Отбор 0 1,2 3,8 0 1,6 2,5 О 2,0 4,5 ..'.

Контроль 0 ■ 3,1 5,$ 2,1 3,3 6,0 2,0 5,0 7,8 ,

Исх.сорт 2,2 4,5 7,6 4,0 6,1 8,1 5,5 9 9 .

Зыряновка Ь15 Отбор .0 • 1,6 3,2 0 1,7 4,0 0- 3,0 5,3 .

■ Контроль 3,9 6,4 8,1 3,2.6,3: 9 5.1:7,7.; 9: ; Ь17 Отбор 1,0 2,2 А,6 1,9 2,8 4,3 1,1 3,5 5,2. . Контроль 2,1 6,6 8,2 .3,4-5,8 '8,0 4,5 9 9' Исх.сорт 3,5 7,1 9 4,2 6,9 9 - 5,8 - 9 ; 9 Диэка 3 Ы9 Отбор. . 3,1 >,7 ? 3,8 4,3 9 4,7 7,3 . 9; - • Контроль 3,3 5,7 5 4,0 6,2 9- 5,2'7,7 9 Псх.сорт 3,6 7,9" 9 . 4,9-7,о". 9 6,0 9 9

КС^з 0,3 1.2,0,3 1,0 1,2 0,9 1,6 1,1 .1,0

- /я-

Предварительная селекция на клеточном уровне повысила степень устойчивости растений среди регенератов линии Ь15 в 1,52 раза, линии M 5 в 2-2,5 раза и линии Ы? в 2-3 раза. Растения, полученные из клеточной линии 1/19 сорта Диана 3 оказались полностью неустойчивы к патогену. Но-видиаоыу, устойчивость клеточных культур к токсическим во^естваи и, соответственно, регенерированных из них растений не была генетически обусловленной, а определялась физиологической адаптацией клеток к селективным условиям. . ' '.

... При оценке методом увядания накболызуи устойчивость показа- ' ла линия ЫЗ сорта Омская 19. Существенное превышение уровня устойчивости контрольных растений над растениями исходного генотипа свидетельствует о спонтанном появлении устойчивых растений в процессе культивирования in. vitro . Однако балл восприимчивости этих растений к фузаркозу был существенно выше, чем у регенератов, полученньйс в селективной системе отбора.

■■ Соиаклональная вариабельность растений-регенерантов люцерны и пшеницы, растения-регеперанты люцерны, полученные из клеток суспензионных культуротличались от исходного клока больней (на 24-45 см) высотой, более быстрым (в 1,2-1,8 раза) отрастанп-ен после укосов, большим количеством стеблей на растение и, соответственно, большим значением сырой и сухой массы растений. Наибольшие различия по высоте ¿¡езду регенерантаыи и исходный клоном наблюдались на'2-Й год аизни полученных ia vitro растений.: ' ■ • "■■.,•'" ''.■•.-■■■■'' Устойчивые к фузариозу растекия-регснерапты люцерны имели более мощную,, сильно развитую корневую систему, по типу стерхне-мочковатую и более четко выракенныв грани стебля.

Растенмя-регенеранты" пшеницы, отличались от исходных форм нъ-

а.ой высотой, но большим числом стеблей на растение и: большей (в 1,5-' 2 раза) длиной флагового листа. .

П Ы Е О Д II ■

I . Клеточная. селекция растений на устойчивость к фузариозу наиболее з' loKTKEiia на комплексной селективной среде, включающей фузариевую кислоту совместно с пекто- и целлшшитпческими ферментам. Отбор, в • агих условиях позволяет выявить генотипы, устойчивые к различным-гидам фузариев. .-"■•■

2. Показано, что непосредственное культивирование эксплантов в яяд— Kci питательной среде с повышенным■ содержанием.ауксинов позволяет4' .' бьстро получать гетерогенные клеточные суспензионные культуры, наиболее пригодные для. клаточной солекцяк.

3, Разработан метод ускоренной оценки растений на устойчивость к пузариозу, позволяющий отбирать наиболее устойчивые формы на ранних 1 этапах селекции. - : '■■.■;- V 4'1 Выявлена связь интенсЕвности каллусогенеза эксплантов пшеницы с признаком раннеспелости исходного генотипа. • : . *

5. Признак устойчивости к фузариозу,в процессе; селекции клеток и тканей in vitro можетг иметь как: генетическую, так и эпигенетическую природу. Эпигенетические изменения, устраняются; при чередовании: условий культивирования.

б. Результаты, полевых п лабораторных: методов оценки растений-регене- ; рантов и их потомства показали, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, экспрессигуется на:уровне целого растения и ' , передается, по наследству, что доказывает генетическую обусловленность ,' признака устойчивости к фузариозу,у отселектированных линий.

7. Неточная солоди*. .та ^ ш човиа -.ла степень /сто''" гзис. • pacTinn:it-pcrr.iopai¡xoB в '2-4 paja о ертггашю с !сходи:."' л1 v.1 ; пиелит - в ^-3 раза, по epaj »«л, ) с л-исчег- устойтгвсст t гсхсл-кых сортов.

8. ."ор^а^изиологичесхЕо отлп'тч 7^тсшШ-регеш рол тог m'- i-mi к ппеницк от исходных jopf обусловлю!! ro!№T::\.ei оЛ "Tjpo-r01 -ностью клеточных популяций.

9. Использование культуры „ютог i .. анс? в ссю ".къ растение на усто"чгтость к <£узариозу гоэполлет бистро «» с ¡"' i • -алшн-ш затратам труда и средств получать р зистентпко *ор--и.

список palot, опгашкоз ucair lo :чт ¿м.хг jkcjpt um;

1. Мезенцева O.jD. Использование тчачевых и »леточтге иу i-ь-тур в селекции на устойчивость i: ('-топатогенам// Сегехтя i семеноводство. - 1990. - J4. - С. 59-G2.

2. "!езенцова О.Ю* Способ оцени; растснп^ ка усто'Млвоо'П. и О&узариозу// Бюллетень ГККТ СССР 0гкритпл г пзоорьтсн.чя/ A.C.

К 1598920. - 1990. - JS 38. - С. 1Г.

3. '..'езенцэва О.Ю. Способ ускоренно!1 оцьчга* растешч» на устойчивость к фузариозу// Доклады 313:3-31. - 1991. - l'¿. - C.CI-G3.

4. Незенцова О.Ю. Получение »-етодо" i-лоточной селепцяк рас-тешш-регеперантов люцерны, устойчивых г. Fusarium oxysporum // Тезисы докладов Всесоюзной научно" .соьфер'чщс: • »„одах уче*плс

и аспирантов по актуальным проблеем.» ^орадпролз-

водетва,- - 1991. - Ч.: ВАСГВН, ЖИЖ. - С. 88-89.

5. Кезенцева О.Ю. Выявление оптямалипк ерлеьтгвных услозлй для отбора клеточных линей пшеницы и лпцер.ы на устс^швость к

. Сузариозу// Тезисы выступленгЧ Гатзриалы ЗсесоюзноР научноЧ чон-ферекпли по сельскохозяйствен1*;!1* 'гот^хно юг"-:.-Цй;г'гот^г.д.-тС_1 .С. 50-51. ~~ '

Объем V/г п л

Заказ 1201

Тираж 100

Типография Московской с х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И 550, Тимирязевская ул. д 44