Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов иммунологической диагностики ротавирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов иммунологической диагностики ротавирусной инфекции"

■""^„^ВДВИСТЕКЗВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии '..•'-»'■^ и инфекционных болезней

На правах рукописи ЧУБОЗА Наталия Ъ'.'ш то ровна

УДК 578.823.91.083.33

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЩШШШЧЕСКОЙ ДЙАГНОСШИ РОТАВИГ/СпОЛ ЙШЕКЦЙИ

03;00.06 - вирусология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Алма-Ата - 1993

Работа выполнена в глучно-исследовательском институте эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук

У.А.АБЕНСВА,

доктор медицинских наук

в.д .шшарлин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор

Б.В.КАРАЛЪНИК,

доктор биологических наук, профессор Ы.Х.САЯТШ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Российский государственный НИЛ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов ям.Л.а.Т&расевича.

Запета состоится "Г?" марта 1993 г. в 14-00 часов на заседании специализированного совета К.079.05.01 при ИЛИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней, МЗ Республики Казахстан (480002, г.Алыа-Ата, ул.М. Макатаева ,34!

Автореферат разослан "_* Февраля 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат мед иди неких наук

Н.МЛуркина

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальноегь проблемы. В общей структуре острых кишечных аболезанла одно аз первых мест занимают гастроэнтериты ротави-усной этиологии. Вэтаварусная инфекция имеет повсеместное рас-ространение, поражает людей всех возрастных групп, но дреямуцес-зенао детей раннего возраста (Л.Г.Грунтовская и др., 1981; A.C. щупова и др., 1985).

Do данным ЬОЗ, в 50-6С$ случаев кишечных расстройств у детей возрасте от 6 месяцев до 2-х лет основной этиологической лричи->й являются ротавирусы.

Спорадические случаи и вспышки ротавлрусного гастроэнтерита сто остаются этиологически не расшифрованными и регастраруют-| аод диагнозам ОКИ неясной этиологии. Поэтому своевременная ди-•ностика данной инфекции необходима для целенаправленного лече-я больного, исключения необоснованного применения антибиотя-в, а гакге для организации своевременных противоэпидемических роприятлй.

Применение вирусологических методов диагностики ротавирусноа Секции, базирующихся ш выделения вирусов от больных в культу-клеток и электронной микроскопии," связано с рядом проблем. Видение ротавирусов в культуре клеток - трудоемкая процедура и збует от персонала определенных навыков. Известно критическое ютение и к электронной млкроскопии, использование которой со-шено со многими ошибками, ведущими к галер- и гдлодаагностике, с как до сих пор нет четких стандартов интерпретации лолучен-: данных, я эффективность метода зависит от уровня подготовки щаалястов. Кроме того, необходимость в специальном оборудова-: (электронном микроскопе) и реагентах высокого качества затру-[ет широкое внедрение вирусологических методов в практику. Пому наряду с вирусологическими методами диагностика получили витие иммунологические методы, способные выявлять ротавирусы, итела к ним л иммунные комплексы.

В последнее десятилетие разработан достаточно разнообразный ор иммунологических методов диагностики ротавирусной инфекции, цый из них имеет свои особенности и диагностическую ценность, елом иммунологические методы от вирусологических отличает сле-дая совокупность положительных качеств: возможность получения ультатов в более короткий срок, достаточно высокая чувсгвятель-

ность и специфичность, возможность обнаружения ротавяруса в дативном материале без предварительного выделения и концентрароьа шя вируса (С.Г.Дроздов и соавт., 1982; Л.Б.Хазенсон, Ь.А.Чайка, 1987; А.Г.Букранская и соавт., 1989 и др.).

Однако иммунологические методы такке имеют определенные недостатки, а проблема иммунологической диагностики роза вирусной инфекция остается нерешенной. Одна метода остаются недоступнымя широкой практике (ишуноэлектронная микроскопия, радаодммуноло-гические методы) ввиду сложности технического исполнения, другие - из-за отсутствия коммерческих препаратов (латекс-агглюти нация,: Ко-агглютинация и др.), третьи - громоздки в постановке и малоэффективны при обследовании детей раннего возраста (реакция связывания комплемента) и т.д.

В связи с этим нате внимание привлекли методы, основанные а феномене агглютинации, широко применяемые при других инфекциях, достаточно чувствительные и простые в исполнении. Следует отметить, что коммерческий выпуск препаратов для этих методов, напр. мер ротавирусных эритродатарних и стафилококковых диагностику-мов, к началу наших разработок отсутствовал. Поэтому изыскание надеаных и чувствительных методов получения эритроцитарных и си фалококковых диагностдкумов и совершенствование иммунологачески: методов диагностики ротавирусноц инфекции - важная задача.

Цель к основные задача исследования-. Целью работы являлось соверзонстЕОьание иммунодиагностика ротаварусной инфекция на основе разработки коеых высокочувствительных эрптроцитарных и стафилококковых реагентов и внедрение их в практику здравоохранение

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- изучить оптимальные условия приготовления антительного эр;-!троци тарного ротавирусного даагностикума;

- усовершенствовать способ определения ротавирусного антигена с использованием взвеси клеток стафилококка штамма Кован-1;

-> разработать новые приемы, повышающие эффективность диагностических методов, направленных на выявление ротавирусного антигена в исследуемом материале;

- оценить диагностическую значимость разработанных и усовершенствованных методов и приемов при исследовании на ротавлрусы;

- изучить еозмошюсть использования разработанных иммунолог

гпческлх методов в эпидемиологической практике для наблюдения за ротавлруской инфекцией.

паучновизна. Разработан комплекс приемов, повышающий репродуктивную и инфекционную активность ротавируса обезьян за-и с целью получе;шя высокоактивного антигена.

/совершенствована схема приготовления, эффективного актательного эрнтроиптарного ротавлрусного диагностикума с использованием агллдола на основе активированных периодатом калия эритроцитов я иммуноглобулинов анхиротавируснои сыворотки.

1азработан новый вариант использования стафилококка штамма лован I для экспресс-индикации ротавируса при. трехкапельной постановке реакции агглютинации (ТРА). Усовершенствованы условия приготовления Ко-даагностикума, поЕштщие чувствительность и срок хранения препарата.

Разработан эффективный метод очистки и концентрирования ротавируса на основе выделения иммунного комплекса с последующей денатурацией антител и освобождением антигена. Разработаны два новых приема обработки исследуемых проб фекалий о целью устранения ложнополокательных результатов.

Рекомендован новый комплексный подход в диагностика ротави-русной инфекции, на основе изучения диагностической пригодности новых и. усовершенствованных препаратов и методов.

Практическая значимость работы» Разработанный комплекс методов индикации ротавируса о помощью эритроцитарных и стафилококковых препаратов <РП15\ и ТРА) повышает возможность эффективной ранней диагностики ротаварусной инфекции. " .

Разработана норматпвно-техндческая документация (НТД) а фармакопейная статья ва производство и использование ротавлрусного антительнохо эратроцатарного диагностакума (техническое задание утверждено Министерством здравоохранения бывшего ссср от 31.01.91 г.; фармакопейная статья, экспериментально-производственный. регламент и инструкция по применению утверздеаы Министерством здравоохранения Республики Казахстан ¿Я.02.1992 г.).

Усовершенствование условий культивирования ротавируса обезьян БА-И позволило повысить выход инфекционного вируса с 4-5 до 6-7 1е ТЦД50 (рационализаторские предложения, удостоверения £ 330 и 35^).-

Разработанные приемы устранения доанополонитзльных результатов при индикация ротавлрусного антягзна позволяют повысить ре-

зультатавиость методов от 20 до 70у», в завасаиостл от ьозрисга обслодуешх (рационализаторское предложение, удостоверение И Ш).

С целью внедрения разработанных методов диагностики ротави-pycHOii инфекции в практику работы органов здравоохранения ьрсве-денк республиканские семинары для враФй-вирусологов (Ал.\<а-Ата ISS8, 1939, ±99ü) и врачей-бактериологов (Алл-а-Ата, 1937).

изданы метод»!ческие рекомендации "Ускоренные кегоды лабораторной диагностика и клинические особенности течения ротавирус-ного гастроэнтерна" (1939), информационный листок "9кслресс-1,'.е-кда вуявлешш ротавирусного антигена" (1989), информационный бюллетень "Шигеллезы и другие кишечные инфекции" (1939). получено Ц актов внедрения от практических учреждений здравоохранения.

Основное положения, выносимые на зазщту:

I. Предварительная обработка периодатом калл эритроцитов •л иммуноглобулинов дозволяет ира сенсйбалазацаи эритроцитов с гомо-дью амидола повисать чувствительность антительного эрнтроци-тапиою ротавирусного даагностакуш в '¿-4 раза.

¿. ¿ГспольсоЕание- взвеси клеток стафилококка шташа Кован I в лачествз индикаторных при трехкапельнои постановке реакции аг-TjiKiïuKdц.iu fia стекле является эффективным методе:,! оксдресс-инди-кацли ротавируса с результативностью до 96,2$, что подтверждено лгнрусологлчзстм методады исследования.

/совершенствованные условия приготовления антлтельннх Ко-,V'.aru0CTUKyiiCB позволяют увеличить срок хранения тмунореагента' и поыаслть эффективность асполлзовшшя препарата в реакцаа коаг-г.чт.'Тлшции и итунозлзктронаои шкросхохшй.

4, Рекокендуачий нами ксашлекс. ноеых методов пригоден и доступен органам практического здравоохранения для сероздидешоло-г^ческого шбдвдеяия за .ротаьируонои. инфекцией.

J.-::4i:x:ü вклад автора. Все основные разделы представленной ра-йоту в^п;>днены лично автором. Электрофорез вирионной ИК в ПААГе t-uoi;^.SH со-^днаком лаборатории кишечных инфекций Р.А.Кусыу-Xiu'ÄÜS-rObOÜ. : . .'' '•'•'■""'.'

Ап/х-баг^.я гдботы. Оснонше положения дассертацаа долокены 17 л S съездах ; глгаешееоз, зпаде.мюлоюз, макробаологов, па-^зихедегов и инуекагонастов Казахстана (Ал','л-Ата, 1989, 1991), из. .нбйдуькродяда схадогаунз по.аллертологга а. клинической шшу-

ологил (Алма-Ата, 19 9¿), на семинарах для практических врачей-::русологов (Алма-Ата, 1983, 1990), на научной конференции моло-•IX ученых Казахскою Ьм ветеринара (Алма-Ата, l¿'9ü),

h .у б л.акации. По теме диссертации опубликовано 13 научных ра~

зт.

Структур и объем диссертации. ./уюсертация состоит из вве-обзора л_:тера 1'уры, 5 глав собственных исследований, заключая, выводов и списка использованной литературы, включающего ¡3 отечественных л иностранных источника. Текст диссертация из-i¿:gh на странице маапнописн, иллюстрирован 20 таблицами, рпсункакл, Z фотографиям.

ССБ'ЛЕЕНЬЫЗ КCCjIEUZOjiA f¿íЯ ..лтерзала л методы исследования

Ь работе использован ротавярус обезьян штагл.а sл-Ii , полу-пккй лз музея глвнх культур li/f/j полиомиелита л вирусных акцептов. Вирус репродуцировали в перевиваемых линиях клеток почек азьян (4647, ¿¿-104, Ул-г, Vero ).

Очистку и концентрации ротавируса проводили по методам, опишем А.Г.Букршскоа и др. (1986), и с помощью разработанного и метод! пммуноадсорбцли.

Для приготовления нммунореагентов в качестве носителя антител юльзоЕали эритропиты барана, фориалинизированные по методу L'einbach (1952). В качестве сенситинов слукила ишуноглобулины, полученные аз ераммунной сыворотки кроликов, иммунизированных очищенным я центрированным препаратом ротавкруса sa-ii. Для получения антительных эритроцитарных дкагностикумов были ользоьаны следуюдае методы сенсибилизации эритроцитов: с по-ью хлорида хрома ( J.H.Jandl et R.L.Simons ,1957), аллза-ового синего индикатора (Б.А.йамардия, Б.В.Каральник, 1978), тарового альдегида (Б.А.Намардкя и др., IS8¿). 3 процессе работы использованы стафилококковый реагент пропз-зтва Санкт-Петербургского КЗМ им.Пастера и суспензии кяеток Ьнлококка итаммов Кован I и Вуд-46 собственного приготовления. Й3£й, ЮГА, îKOA, ИФА, РОК, ЭФ в ПААГе ставили но общелряия-методлке.

При статистической обработке результатов применяли метода on-

ределения относительных величин, коэффициента корреляция рангов по Спирлэпу. Определение достоверности статистических результатов проводила путем расчета сродней ошиоки, коэффициента достоверности Стьэдента (Ь.С.Бессмертный, ¿.ш.Ткачева, ÍD61).

определение титра вируса проводила путем установления доза в;:руса, вызывающей штопатическае изменения в за¿икенакх пробирок (ТЦД.50) в расчете ш i мл. йсчет проводила по Риду а ».ен-чу.

Ооацй объем исследований. последовало 52Ü6 боаьнах а 30 здоровых детей. Ароме того исследовано 60 проб фекалии oí kuecthkx с диарейным синдромом.

Ьсего выполнено 10'¿¿5 анализов, аз нах в РИГА - 4341, 1FA -3190, K0A - 1739, Ш - 300, РОК - ЗЗЭ, Эл. - 133, - 70, сф в ПААГе - 63.

Результаты исследований

Изучение опталальных условай приготовленая антательного эрнтроцитараого ротаварусного диагностик ума

á началу нашх исследований проазводство актительного эрат-. роцатарного ротаварусного даагностакут в стране отсутствовало. Ъ связа с этим нама проведены экспераментк по изучению одтамаль-нш: услоьай праготовленая а к тигельных эр:троцатарных аммунореа-гентов для диагностики ротаварусной инфекции.

для создания эффективных антательных эратроаатарных даагнос-такумов необходимо нелачае высокоэффективной иммунной актасыво-ротка.

Спзцафаческая активность антасыворотки определяется многама обстоятельствами, среда которых большое зкаченае имеют свойства антигена, используемого для её получения. _

С целью получения активного антигена гама изучены оптигаль-ные условия культивирования ротаваруса обезьян sa-ii , который хорошо репродуцируется в клеточных линиях гомологичного вида a nueej обвде антигенные свойства с ротаварусоы человека. При изучении чувствительности 4 клеточных ланий (kK-is, 4647, ^А-104 a Vero) выявлена примерно одинаковая степень ответной реакции испытуемых клеточных систем на одну и ту se дозу вируса. Однако ранее известные способы культивирования не давали возмоаности получать вирус с инфекционной активностью выше 4-5 1еТЦД 50/мл.

С целью повышения инфекционной активности ротавируса были испытаны нЬгые условия культивирования.

известен способ активации ротавирусов при добавлении в ростовую среду o,'¿5% раствора трипсина (С.Г.Дроздов и др., 1982). идлаяо недостатке:.) метода является ранняя неспецифическая деге-::ерац.:я контрольных клеток мснослоя. Ьами испытано культивирование ротавируса с добавлением другого фермента - панкреатина. Сравнение Л-ух. методов показало отсутствие деструктивных изменении в клетках контрольного монослоя с одновременным стимулирую-'-¿■л.: действием на репродукцию вируса яра использования 1,6% раoteo са панкреатина.

Кро,.:е того, для повышения репродуктивной активности ротавируса были использованы сильные биологические стимуляторы - гормоны. úp¡: Енесенип з культуральную ростовую среду инсулина, гидрокортизона или преднизолояа ияфекционность ротавируса была на ¿-3 ig Еыге, че;.-. у вируса, выращенного без добавления стимуляторов. Ори этом цлтопатический эффект проявлялся на 12 ч раньше, чем в контроле. Наиболее эффективные концентрадай используемых гор::оноз в составе культуральяой среды были: для инсулина -0,05-0,¡¿5 ед/.vji, гидрокортизона - 0,0125 мг/мл, предназолона -0,01 мг/мл.

Благодаря совершенствованию процесса культивирования ротавируса штамма sa-ix удалось повысить его инфекционную активность до 6-7 lg ТЦДдд. ■

Для яодтЕерадешя наличия ротавируса в полученной культураль-кой вируссодеркащей кидкости провели, исследования препарата методом электронной микроскопия. Кама установлено, что в процессе последовательного пассирования вируса сохраняется типичная морфология вирионов, что свидетельствует о нормальном цикле репродукции.

Ори исследовании влруссодержащей кидкости методом ИЗМ с ис-зользоьанием стандартной кроличьей антиротавирусной сыворотки аод электронным лыкроскопом просматривались характерные вирусные частицы, покрытые "венчиком" антител.

Всестороннее исследование полученной вируссодеркащей культу-ральной жидкости показало всзмояность использования ее для получения ротавнрусной иммуной сыворотки.

Одним из Еакнеиших условий получения высокоспецифичных про-швовирусных сывороток является очистка и концентрирование вири-

оное. Существуют различные метода очистки и концентрирования, среда которых наибольшее распространение получили метод дифференциального ультрацонтрлфугировалия л метод с применением полнэти-ленглкколя (ПЭГ с 6000) (С. Г. дроздов, 193г).

■ Однако метод дифференциального ультрацентрифугироьания требует специального дорогостоящего оборудования - ультрацептрнфу-ги, а при использовании 11ЭГ процесс происходит с потерей определенного количества вируса.

Нами проведена разработка метода одновременной счистки п концентрирования рота вируса, основанного на специфическом выделении Еаруса с помощью антиротавпрусаол сыворотки. Обычно очистку антигенов проводят с псмощью иммуносорбентов, т.е. внтисывороток, переведённых в твердую фазу (Э.Руосдахтд, 1979). Б нащлх г с следованиях была использована антискворотка в нат:шком состоянии. Комплекс рэтавпсус-гштитело осавдалп этиловым спиртом. Для инактивации антительных функций лшувоглобулаяов осадок' прогревали до 100 С в течение 1-2 мин и осаздали центрифугированием. Полученную надосадочную кндкость использовали в качестве очищенною и концентрированного препарата ротавируса.

Сравнительная оценка степени очистки и концентрирована рота-влруса разными катодами в ШГА показала, что наиболее эффективными оказалась разработанный способ выделения имунного комплекса с последующей инантиЕацией антител и метод дифференциального удь-трацентрпфугнрования. Ьазработанный нами метод позволяет провес- -ти очистку и эффективное концентрирование не только целых влснопов, но и лишенных капиадного слоя частиц, не потерявших серологической активности. Ь'.етод не требует специального оборудования к предварительного приготовления иммуносорбента.

Очищенный и концентрированный ротавнруснын антиген был лспо-льзован для получения иммунных сывороток к ротавпрусу щтамьа

БА-И . -

Антительнне ротавпрусные эратроцитарнне диагаостпнумы готовились на основе полученных антиснворотси с титром в КЖ не менее 1:320. Для нагрузки форуалпнизарОЕанных. эритроцитов бит испытаны различные методы конъюгации: с помощью хлорида хрома,глу-тарового альдегида, амидола и ализаринового синего индикатора. Наибольшая эффективность даагностинума при выявлении антигена ротавируса Еиаы>.а бл-и получена при использовании амидола в . качестве связнваищего антигена.

Далее нами были предприняты попытал поаашения чувствительности антлтельных диагностикуыов, полученных с помощью амидола. С этол целью использовали известное свойство периодатов калия активировать С=С-группы полисахаридов. Обработка эритроцитов U.uül ¡vi рас творов периода та калия повыалет активность как антл-тельных, так и антигенных ЭД (Шамардин В,A., IS8I).

Наш изучено влияние обработки перйодатом калия как эритроцитов, так и иммуноглобулинов ротавирусной сыворотки, Отмечена калболыая эффективность комплексной обработки эритроцитов ü,002-0,0u4 Ы и глобулинов - 0,001-0,002 М раствором и перйодата кадия. Такие сочетания позволяли получить ЭД при конъюгации с поморю амидола в 2 раза более чувств;!тельные, чем по оригинальной методике.

Эффективность нагрузки эритроцнтов зависит такхе от способа получения сенсятина. Поэтому нами о ала прозедена оценка гекосен-сибилизирующей активности иммунных сывороток и соответствующих иммуноглобулинов, полученных осанданаем этиловым спиртом, кадк:-ловои кислотой и сульфатом аммония.

Результаты изучения активности дпагностикумоз, приготовленных на основе ротавирусной сыворотки" и ЭД на основе глобулано-зых Фракции, показали, что по чувствительности эритроштарные им-мунореагенты из очищенных иммуноглобулинов в 2-4 раза превосходят препараты иммунных сывороток, При этом чувствительность дпагнос-тикумоз на основе ИГ, выделенных осаадением каприлОЕой кислотой, была в дьа раза выше чувствительности ЭД, приготовленных на основе глобулинов, выделенных другими методами (Р< 0,02).

Диагностику?/., полученный на основе обработанных аерйодатом калия эритроцитов -и ИГ с использованием в качестве коныогирувщз-го агента амидола, обладал высокой специфичностью. При агглютинации Эд с гетерологичными антигенами вирусов ECHO, Коксакя, полиомиелита, а также с антигенами ¡шгелл "Sonae" а этерахий 026 титр в РПГА был не более 1:4. Аналогичные результаты получены с контрольным антигеном (незарааенная культура клеток), Татр FÜI& с гомологичным ротав^русяым антигеном составил 1:256+1,2, что в 64 и боле^ раз выше.

Таким образом, в результате исследований нами были разработаны оптимальные условия получения эритроцитарного ротазирусного даагностикума. Полученный ЭД обеспечивает высокую специфичность и чувствительность РПГА для диагностика ротавлруско:, инфекций-.

Использование янтакишх клеток стафилококка штамма Кован I для диагностики ротаварусной инфекции

Ка феномене агглютинации, наряду с Н1ГА, основан другой перспективный метод обнаружения ротавйруса с помощью взвеси клёток стафилококка штамма Кован I - реакция коагглютанацаа. Однако недостатком ЕСОА является отсутствие производственного выпуска Ко-диагностикумов и небольшой срок хранения аадкнх аммунораагентов (не более двух месяцев).

Нами била предприняты'попытки совершенствования условий пра-готоЕления антательного Ко-даагностакума.

Один из недостатков связан со свойством белка А стафилококка штамма Кован I избирательно привязывать аш:уноглобулины класса j>g , что является непреодолимым препятствием для антасыЕороток с преимущественной активностью igH -антател. Нами показано, что предварительная обработка взвеси стафилококку штамма КоЕан I равным объемом 0,002 M раствора перйодата калая позволяет в 2 раза повысить чувствительность ШОА. Это связано, предоолокательно, с активацией периодатом калия полисахаридов клеток стафилококка по отношению к белку и связыванию иммуноглобулинов других классов.

Специфичность нашего даагностакума была аналогична контрольному, полученному по известному методу (¡U.A.Белая и др., IS85).

для увеличения срока хранения приготовленный антателвный Ко-дааглостикуи обрабатывала 0,1%-аш раствором глютарового альдегида. Такая обработка- позволила повысить срок хранения диагностику-f.iOB в дьа xjasa. '

йолученный антателышй Ко-даагностикум был использован, наряду с ШОА, в иммуноэлектронной микроскопии. Нагла модифицирован способ обнаружения ротаварусов в ИЗМ: при приготоЕлении препаратов для оМ мы наносили исследуемую суспензию фекалий и Ко-дааг-ностикум непосредственно на опорную сетку.. Разработанный метод оказался.на kQyô чувствательнее стандартной методики (ф.С.Носков,

ус. -.) " .

В дальн'з..г:ам нами была изучена анал возможность применения взвеси стафилококка атамма Ковач I: не в качестве корпускулярной основы для Кс-даагностакуш, а а качестве своеобразного индикатора,. указывающего на осуществление процесса взаимодействия ротав-рус-антитело.

Принцип метода разработан в лаборатории дизентерии и прочих Otii 1йИ ШУЯ h\3 Ре сп у б л;: ки Казахстан (Шамардин В. А. и др., A.C. Jr I53ÜS83, 1>39) для эк с п ре с с-иядик& ции антигена эшерахий. При изучении возможности применения этого метода для выявления рота-вирусного антигена нами установлены новые оптимальные режимы, связанные с особенностями данной модели, -характеризующиеся в целом невысокой иммуногениой и серологической активностью. Изменениям подвергнуты концентрация взвеси стафилококка, разведения антискворотки, способы получения суспензии фекалий, применение неокрашенной взвеси стафилококка и др. Неизменным остался принцип постановки трехкапельной реакции агглютинация (ТРА) без предварительного приготовления Ко-диагностикуыа.

Б процессе апробации ЖОА и ТРА был отмечен достаточно высокий процент лохнополоаительных реакций в обоих методах, особенно в пробах фекалий детей до I года. В связи с этим нами проведен ряд экспериментов по обработке исследуемых суспензий фекалий для устранения неспецифпческих реакций. Суспензия фекалий была подвергнуты обработке различными способами: прогреванию при различных температурных параметрах, истощению взвесями стафилококков штаммов Вуд-46 и Кован I. Сравнительный анализ показал наибольшую эффективность прогревания экстракта фекалий при 100°С в течение 1-2 мин. Более низкие тешературы прогревания исследуемых копроэкстрактов не устраняли неспецифаческие реакции, а более длительное прогревание сникало чувствительность самих реакций, нацеленных на выявление ротавирусного антигена.

Применение взвеси стафилококка штамма Вуд-46 также полностью не устраняло неспецифических реакций в контроле, ло-йидамому, за счет разницы в антигенной структуре клеток штампа Буд-46 а штамма Кован I. Адсорбция копроэкстрактов клетками стафилококка штамма Кован I с неактивным белком а вполне соответствует логике иммунологических взаимодействий: устранению в исследуемо'.; материале неспецифических агентов и последующему использованию микробных клеток с аналогичной антигенной структурой для выявления специфических агентов.

Сравнительная оценка чувствительности и специфичности методов с применением клеток стафилококка штамма Кован I показала наибольшую эффективность трехкапельной реакции агглютинации и РКОА в нашей модификации, в два саза превышающей чувствительность общепринятой реакция коагглют^нацаи. Специфичность методов

была примерно одинаковая и достаточно высокая.

С целью апробации разработанного нами метода ТРА исследованы 300 проб фекалий больных ОКИ детей. Эффективность методов выявления ротавирусного антигена следующая: IKQA модифицированная -2СЧ2,6;5, РПГА - '¿7,6+2,6%', к'Лк - 21,3+2,4%. Кроме того, 40'положительных на ротавирусный антиген проб, по данным трехкапельной реакции агглютинации, просмотрены под электронным микроскопом. В 39 из ши: (97,5+2,5^) обнаружен ротавирус.

Таким образом, трехкапельщя реакция агглютинации является достаточно высокочувствительным и результативным методой, что подтверждено сравнительным анализом с друпши известными методами. Большим преимуществом этой реакции является простота постановки, быстрый учет результатов в течение 2-3 мин, отсутствие этапа приготовления Ко-дпагностикума. Коммерческий выпуск взвеси стафилококка Кован I, именуемого "стафилококковый реагент" производства IIBC им.Л.Пастера г-.Саякт-Петербурга, мохет стать залогом успешного распространения трехкапельной реакции агглюхина-ции среди практических лабораторий, для выявления ротавирусного антигена, a возмокно, и других Еирусов и микробных антигенов кишечной группы, к которым имеются серийные антисыворотки.

Сравнение диагностической эффективности разработанных методов иммунологической диагностики ротавлруснои инфекции

:;амп проведены широкие клнннко-лабораторные испытания разра-ботапних методов и иммунореагентов. Среда 133 проб фекалий, со-дер^щнх ротавирус, по данным электронной микроскопии, положи-гелънлш в трехкапельной. реакции агглютинации были 128 проб (9&,*г+1,бД), в ГПЕА - 133 пробы (100%) и В ШОА. - 126 проб (94,7+

исследования 63 проб, долоаительных на ротавирус, методш Енделония вирионной РиК электрофорезом $ доляакриламидном геле лека зало аналогичную картину распределения, результативности методов: ТгА - 92,1+3,4$,РИГА - .95,2+2,7$,РК0А - 90,4+3,7£.

/Параллельное исследование 130 проб фекалий детей, больных ü;ü, в .возрасте до I года в зимний период года тремя методами пазило слздующую результативность: в РИГА' - 53,5+4,3%' долока-;-6Xb.-iX н'гдодок на ротавирус, в ТРА.-.55,4+4,3$, в ЭФ в ПААГв -

48,5+4,4. Процент совладения положительных результатов, по дан-Hüi.i разработанных нагл:: реакций, с электронной микроскопией больше, чем с Э2 в аААГе. Это связано с те«, что Э:л нацелена на обнаружение как целнх вирнонов, так и вирионов с разорванным кап-cHSHiü слоем пустых (безгеномных) вирусных частиц, а ЭФ в ЬААГе выявляет только вирусспецяфлческую РнК.

при о::е-и<е совпадения отрицательных результатов в сравнении с методом ЭЗ з ЦААГе получены следующие данные: для РИГА - 38, £"2+ +4,2, ХРА - 5и,7+4,4/i.

Полученные результаты указывают на достаточно высокую эффективность разработанной нами трехкапелькой реакции агглютинация, срлблл^^-цуася к так.л! классическим методам, как РОГА, ШОА и электронная микроскопия.

Пш исследовании 50 проб фзяагиц от яра.-,тлческл здоровых детей в возрасте от 1,5 года до 6 лат яологлтельязе результата не отмечены ни в одном из случаев ярл лсдользоЕанлл все?: л зу чаема;: нам.: методов.

¿ля подтверждения диагностическое зллчлмссгл кгволкгслаарт:* в работе методоз гиглуяоднагяостлкл роталлруспол л::;.елц;а на.'.::: проведены исследования парных сывороток крови больных aiA,

С псмодьз Кл бнлл лсследоваш 33 парных сывороток кровл детей л 339 Езрослнх, при сяорадлческса уровне заболеваемости з г.Алма-Ате. Получены следулше результаты: прирост злруссдегифл-ческлх антител в 4 а более раз обнаружен з 22 пробах (22,2+4,2;i) от детей л в 54 пробах (I3,S/i+I,7) от взрослых.

В Д2льйе:л:ем проведет сравнительная с-ценза рззулмаЕаваос-тл методов определения антлтел к рогазлсуеу л сбларуменля алтл-гена. Были параллельно* исследованы сяворсткл крови и r.reüiä i-s.-cc— лил £3 дзтей, больных СЕ®. Антитела определяли с псмодю .реакция сэязнгг-гля комллеиенза. Антиген с вскодьэ KITA и iTA сбл^ругея ¿4,5+4,3;5 л 25,4+4,4^3 соответственно. .Процент совладения составил 75+4,3/i до" отногениэ к 22 долокательный гарями еигорояса«.

Та-слл сбрззсм, наш соказанз высокая чувстЕлтелько-сть л специфичность разработанных методов как в эксперименте, sc к л при. апробации на клиническом материале.

Ьсзлглване результаты кллнлчгскок океана шгодоэ «¡иусодлая-носгиял рогаглрусной ан$екцад вебудала пас сцеоагь й& злачекле в эпидемиологической практике. Оценку дроводллл по газяза эалде-

миологическим критериям: сезонность, территориальность, возраст-нив особенности a др. Наш не выявлено значительных колебаний заболеваемости ротавнрусшм гастроэнтеритом за период исследований о 1988-1991 гг.

В процессе исследований установлена характерная замне-Еесен-няя сезонность заболеваемости ротавирусной инфекцией: процент обнарукеная ротавирусного антигена в этот период года е РйГА составил 3¡¿,6+l,4^ a ü5,l+l,3>ü, по данным IPA - 34,¿+i/о а ¿5,8+ +I,3jS соответственно. Летом процент обнаружения ротавирусного антигена, по данным обеих реакций, сникается в 5-8 раз.

С помощью методов РГШ и TFA проведен анализ распространенности ротавирусной инфекции среда больных разных возрастных групп по г. Ama-А те за 3 года. Процент выявления ротавирусного актиге-' на обошла методами был приблизительно одинаковый: ¿0,9+0,7;^ в РОГА и ¿¿,4+0,7;* в ТРА. Ьанболее часто отмечена заболеваемость ротавирусной инфекцией у детей в возрасте до 1 г - ¿3,7+0,б F0I& и ¿¡5,3+0,9^ в ТРА и с I года до трех лет - Ü0,3¿I,7>¿ а ¡¿¡¿,7+1,8$ соответственно. Среда детей старее 3-х лет ротавирус-ный антиген выявлялся значительно pese - в 13,8+¡¿,3>j в РиГА и 11,3±¿,'¿% в ТРА. У обследованных взрослых уровень обнарунения ротавирусного антигена составил по данным ГОШ а ТРА - 4,5+¿,i> и 6,7+¡¿,6/0 соответственно.

Нами выявлена характерная территориальная зависимость распределения заболеваемости ротавирусной инфекции: в регионах с каркам кламатоы уровень выявления ротавирусного антигена нике, чем в регионах с более прохладным климатом. Так, процент выявления ротавирусного антигена в зимне-весенний период года от больных Otto аз Карагандинской области составил 36,2+3,3/í, а из Чимкентской области - 11,4+1,2^.

По форме течения ротавирусная инфекция распределялась примерно одинаково. Ира сопоставлении результатов РПЕЬ. а данных бактериологического обследования, моноротаваруская инфекция от общего количества составила 49,9+1,0$, смешанная - 50,I+I,Cfé. Цра микстанфекциа наиболее часто встречалась следующие условно патогенные бактераа: протей, энтеробактер, гемолитическая килечная палочка, золотистый стафалококк, санегнойная палочка, цитробактер, клебсаелла. Нередко высевались две и более условно патогенные бактерии, что можно расценить как проявление дасбак-

теркоза кишечника. Ьти исследования имеют большое значение и ■ свидетельствуют о то;/., что довольно значительный процент случаев ротавирусной инфекции проходит под диагнозом других инфекций.

ирн анализе распределения формы инфекции по возрастным группам оту.ечеьо следующее: у новорожденных моноротавирусная инфекция встречается з 69,7+ и,Э/о от общего числа больных, смешанная :ор/л .:Н7- у 30,3+0,9^, от I года до 3-х лет - 60,1+0,9/5

соответственно, старше 3-х лет процент моноротаварус-ноц и ротазпрусно-бактзриальной гяфекцгш примерно одинаковый -5¿,¿±1,0/: и 47,9+х,С>.

'¿ах;. выявлена следующая закономерность формы течения ротави-руснои инфекция и времени года: осенью преобладает моноротавирус-ная фор/а инфекции (£1,к±1,0% от общего числа больных), в остальные пероды года процент обеих форм примерно одинаковый (зимой: ¡¡оноротавнрусная инфекция - 49,6+1,0$, ротавирусно-бактерналь-ная - ¿0,4+1,0^, весной: 45,5+1,0 и 54,5+1,0$, летом: 59,3+1,0$ г 40,7+1,05 соответственно.

В дальнейшем разработанные нами методы иммунодиагностики ро-гавпрусной инфекции у людей были использоезны для обследования х;:еогных с дпареанкм синдромом. При обследовании £0 таких кавот-¿кх (овцы, телята, свиньи) методом РОГА с приготовленным антн-гельнкм ротавирусным ЭД у 13 (¿1,6+5,3/«), а при использовании ГРА у 9 (15+4, 6$) ёиеотшх был обяарунен ротавирусный антиген.

Таким образом, разработанные наш методы экспресс-диагностики ротавирусной инфекция мокяо успешно использовать не только уш диагностики заболеваний у людей и нивотных, но а для сероэли-¡емнологическпх- шблюдений за различным контингентом населения.

ВЫВОДЫ

I. Разработаны оптимальные условия культивирования ротазнру-:а обезьян шт. ба-и путем добавления в культуральную среду ¡иологнческих стимуляторов - гормонов и фермента - панкреатина, вменение разработанного комплекса методов повышает ннфакцлоч-шй титр вируса на ¿¡-3 1е 1111150.

Предлонен ноеый эффективный способ приготовления антитзль-;ого ротавирусного диагиостикума с использованием в качестве юнъюгата амлдола. Установлено, что сочетанная обработка фикси-хэванных эритроцитов и антиротавирусннх иммуноглобулинов пор-

8одатом калия повышает чувствительность ртавирусного эритроцита рного препарата в два раза.

3. Р&зработан эффективный метод очистки и концентрирования ротавируса, основанный на выделении иммунного комплекса с последующей инактивацией и удалением денатурлрошшшх антител.

4. Разработан новый тртехкапельный ускоренней метод выявления ротавнрусного антигена с использованием в качестве индюкатороз взвеси клеток стафилококка штамма Кован I.

5. Предложен метод устранения неспоц;;ф.:ческ::х результатов при постановке PKQA и TFA путем прогревания исследуемых :<снро-гкетрактов при 100°С в течение 1—ü i.uiн и обработки взвесью клеток стафилококка штамма Кован I с пнактивирова-шкм белком А.

G. Разработанный комплекс методов индикации ротав.'-русов с ьомощыо эратроцнтарных и стафилококковых препаратов распр:ет возможность выполнения программы научных исследовали но контролю эппдслтуащи в отношении ротавнрусной инфекции. Удельный вес n-iuo^ инфекции по результатам РИГА составил ¿3,7+0,7;-;, в том "..¡еле моносотазпрусная инфекция - 49,9+1, С;'.!, ротавирусно-бактермальная - 50,1+1,0;».

СПИСОК ОПУБЛйОБАЫШ РАБОГ

I. Соколова H.H., Чубова Н.Б., Елнкаренко Л.Ь. Применение реакции коагглитинации для диагностики ротавирусной диареи у детей // Проблемы охраны здоровья матери и ребенка. - Алма-Ата,' 1937. - C.oi;-54.

с. Абенош У.А., Кусмухамбетова P.A., ЧубОЕа Н.В., Асадова Ф.Г., Налимов Р.1». Ускоренные методы диагностики ротавирусной инфекции // Здравоохранение Казахстана. - 1932. - Jt- 3.- - С.58- • 5S. '

3. Абенова У.А., Соколова H.H., ЧубОЕа'Н.В., Кусмухумбето-ва P.A. Ротавпрусный гастроэнтерит // Информационно-методический бюллетень "Шигеллезы и другие кишечные инфекции".- Алма-Ата, iajy. - C.Ü7-33.

4. Чубова Н.В., Кусмухамбетова P.A., АбеноЕа У.А. Экспресс-методы выявления ротавнрусного антигена // Информационный листок, ХазНЖШ. - 1989. - с с. "

5. Абенош У.А., Канагбаева А.Б., Соколова H.H., ЧубОЕа К.В., кусмухамбетова P.A., Асадова Р.Г., Шлимов Р.Ф. Ускоренные мето-

да лабораторной диагностики и клинические особенности течения ротавпрусного гатроэнтерата // Методические рекомендации. -Ал/л-Атэ, 1939. - ас.

6. Абенова У.А., Дюскаллева Г.У., Чубова H.H., Кусмухамбето-за P.A., Пахмутова P.E. Заболеваемость ротавируснои инфекцией у детей в 1387-1990 гг. в г.Алма-Ате // Материалы У объединенного съезда гагаеаистов, эпидемиологов, макробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. - Алма-Ата, 1991. - Т.5. - C.III-112.

7. Чубова Н.Б., дюскалиева Г.У., Тустакбаева А.И. Совераэнст-EOBaiaie метода получения ротаварусного зратроцитарного антительного даагностикума // Там ае. - Т.У1. - С. С&-69.

3. Чубова п.В., Кусмухумбетова P.A. Применение реакции аггл»-танацаа с использованием стафилококка шт. Коган I для диагностика poTdвирусного гастроэнтерита // Сборник научных трудов "Эпидемиология, диагностика и профилактика кишечных инфекций'.' - Алма-Ата. - Т.ХШ. - Д.: 21792 от 3.10.91 г. - С.87-89.

9. Кусмухамбетова P.A., Чубова й.В. Электрофоретипы штаммов ротаварусов, выделенных от больных детей в Казахской ССР // Там se. - С.48-50.

10. Соколова H.H., Чубова Н.В., Асадова Ф.Г., Абенова У.А. Способ получения ротаварусного антительного эритроцлтарного ди-агностакума // Здравоохранение Казахстана. - 1991. - Ji 4. -

С.28-30.

11. Чубова Н.В., Абенова У.А. Экспресс-метод андикацаа ротаварусного антигена // Тезисы докладов ¡¿еждународаого симпозиума по аллергологии и.клинической иммунологии. - Алма-Ата, 1992. -Т.2. - С.331.

12. АбеноБа У.А., Чубова К.Б., Дюскалиева Г.У. Иммунологические методы диагностики ротавируснои инфекции // Там se. - Т.а. -С.9.

13. Чубова Ь.В., Абенова У.А. Экспресс-метод пнданацаи рота-вирусного антигена // Лабораторное дело. - IS92, - £ 11-12. -

С.64-66.

аЩОНШЗАТОРСКЙЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. Способ повышения инфекционноети ротаваруса. - Удостоверение ^ 330. - BRIS ШИ лйИБ. - 1986 (Чубова d.h., Соколова u.U.).

2. Способ увеличения репродукции рота- а полиовлрусов в культуре клеток. - Удостоверение & 359. - БР/!3 хиШ З.'.^Б. -1937 (Чубова h.Li., Соколова H.H., ЛбеноЕа У.А.).

3. Способ повышения чувствительности .метода .и,1:.;уноэл:;ктронной микроскопии. - Удостоверение Ji 421, - ERiS Lliii э;.ГЛБ.-1990 (Чубова H.l. , Соколова H.H., Асадова Ф.Г., Абеиова У.А.).

4. Способ устранения неспецифака при постановке ШОА. - Удостоверение Я 422. - БРИЗ гЖ ЗлИБ. - 1990 (Чубова ix.В., Кусму-хаыбетоЕа P.A., Иаыардан В.А., Абенова У.А.).

5. Способ применения коммерческого препарата антнротавлрус-ных- иммуноглобулинов для экспресс-диагностика ротавируснои инфекции с использованием стафилококка шт.Кован I. - Удостоверение К 423. - БИЗ hffij ЭШ>. - 1990 (Чубова Н.В., Кусмухамбетова P.A., Шашрдая В.А., Абенога У.А.).