Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам"
На правах рукописи
ШУПЛЕЦОВА Ольга Наумовна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ТКАНИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ, УСТОЙЧИВЫХ К КИСЛЫМ ПОЧВАМ
Специальность: 03.00.23—биотехнология 06.01.05 — селекция и семеноводство
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2003
Работа выполнена в лаборатории генетики Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока им. Н В Рудницкого
Научные руководители доктор биологических наук, академик РАСХН профессор B.C. Шевелуха, доктор сельскохозяйственных наук, член-корреспондент РАСХН Н.А. Родина.
Официальные оппоненты доктор биологических наук Н.ВЗагос-кина, кандидат сельскохозяйственных наук В.А. Михкельман
Ведущая организация— Научно-исследовательский институт сельского хозяйства центральных районов Нечерноземной зоны Российской Федерации
Защита диссертации состоится « /С' » ¿¿/с /Се < 2003 г. в _/if часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, И-550, ул Тимирязевская, 49, отдел зашиты диссертаций
С диссертацией м хно о и'-комиться в ЦНБ N Автореферат рая,v. . » (-1- (/is* ^ 2003 г
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
Г.И. Карлов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одним из неблагоприятных факторов в Нечерноземной зоне является повышенная кислотность почв, негативное влияние которой на урожай сельскохозяйственных культур усиливается наличием в этих почвах подвижного алюминия, дефицитом азотного и фосфорного питания, а также низким уровнем естественного плодородия. Площадь кислых почв в этой зоне России составляет 40 млн. га сельскохозяйственных угодий или 80 % от общей площади пашни. Из всех основных зерновых культур ячмень больше всего подвержен алюмокислому стрессу.
Отрицательное действие алюминия сказывается на важнейших процессах жизнедеятельности ра. ^й: нарушается корневое питание растений, на клеточном уровне алюминий вытесняет кальций, нарушая тем самым целостность клеточных мембран, подавляется митотическая активность клеток корня, снижается интенсивность дыхания и т. д.
Одним из рациональных путей снижения негативного влияния токсичности кислых почв является создание толерантных сортов, способных противостоять стрессовым факторам. Перспективным путем создания сортов, устойчивых к ионам Н* и А13+ является клеточная селекция, благодаря повышенной чувствительности изолированных тканей к указанным факторам и резкому повышению уровня наследственной изменчивости.
В настоящее время разработаны эффективные методы получения и культивирования каллусных линий с последующей регенерацией растений для многих сельскохозяйственных культур, имеющих хозяйственно-ценные признаки. Однако зерновые культуры, среди них особенно ячмень, трудно поддаются культивированию и регенерации in vitro.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание исходных форм ярового ячменя, устойчивых к алюмокислому стрессу методом клеточной селекции и использование их в классической селекции.
Для достижения пос-задачи:
пенной цели необходимо былс ЦНБМСХА
решить следующие
- оптимизировать условия культивирования каллусных культур и получения регенерантов ячменя in vitro,
- определить летальные и сублетальные концентрации ионов водорода и алюминия на каждом из этапов развития каллусной культуры,
- разработать метод отбора устойчивых к алюмокислому стрессу каллусных линий ячменя,
- оценить адаптивную и регенерационную способность каллусных линий различных генотипов в селективных условиях;
- получить алюмотолерантные регенеранты и оценить их в лабораторных, вегетационных и полевых опытах,
- использовать алюмотолерантные регенераты ячменя в селекции этой культуры;
Научная новизна. Разработаны и предложены методы оценки адаптивной и регенерационной способности каллусных линий различных генотипов ячменя. Установлены летальные и сублетальные концентрации ионов Н* и Al'* на всех этапах развития каллусной культуры Предложена оптимальная схема для отбора алюмотолерантных каллусных линий и получения растений-регенерантов в массовом количестве Изучено влияние различных концентраций и кратности внесения ионов алюминия в культуре in vitro на количественные признаки полученных регенерантов Выявлено, что повторная регенерация ячменя из каллусной ткани на селективной алюмокислой среде обеспечивает существенное повышение устойчивости регенерантов к ионам водрода и алюминия. Показано преимущество регенерантов in vivo по степени адаптирован-ности к неблагоприятным условиям по сравнению с растениями исходных сортов и гибридов.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработан метод отбора агаомоустойчивых катусных линий ячменя Получены в массовом количестве устойчивые к ионам Н* и Al3* регенеранты ярового ячменя как исходный материал для последующей селекции Предложены кис пользованию различные схемы отбора калтусней к\ тьтуры в зависимости от
особенностей генотипа и дальнейших селекционных задач. Выявлено влияние жестких схем клеточной селекции на хозяйственно-ценные признаки регене-рантов. Выделены и переданы селекционерам Северовосточного НИИСХ перспективные по устойчивости к ионам Н+ и А13+ регенерантные линии ячменя.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию НПО "Татарстан" (Казань, 1995), на 3-м Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995), на научно-практической конференции "Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы" (Киров, 2001), на международной научно практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.В. Рудницкого (Киров, 2002).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, а также из пяти глав экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, включая 27 таблиц и 17 рисунков и фотографий. Список использованной литературы включает 204 наименования, из которых 117 зарубежной литературы.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились с 1989 по 2002 год в ЗНИИСХ Северо-Востока (г. Киров). В качестве исходного материала для исследований были использованы сорта и гибриды ячменя, предоставленные лабораторией селекции и первичного семеноводства ячменя. Выбор объектов происходил с учетом рекомендаций селекционеров и определялся перспективностью в селекционном отношении. Использовались как устойчивые, так и неустойчивые формы, обладающие комплексом хозяйственно-ценных признаков, но снижающих продуктивность в условиях повышенного содержания в почве ионов водорода и алюминия. В работе было использовано около 50 гибридов и сортов ярового ячменя отечественной и зарубежной селекции. Эксплантами для получения каллусов
служили незрелые зародыши, изолированные на 12-16 день после опыления Культивирование каллусов проводили поэтапно на четырех средах, имеющих общую минеральную основу по прописи Мурасиге и Скуга (МБ), но различающихся фитогормональным составом Индукцию первичной каллусной ткани осуществляли в течение 2-4 недель на среде МБ с добавлением 2,4-Д в концентрации 2-8 мг/л Для увеличения общей биомассы каллусную ткань пассировали на свежую среду Мй со сниженным содержанием 2,4-Д до I мг/л Для регенерации растений каплусные культуры в возрасте 5-7 недель переносили на среду того же минерального состава, но содержащей следующие фитогормоны 1 мг/л кинетина или зеатина, 0,5 мг/ч р-индочилуксуснои кистоты, 0,1 мг'т гиб-берелловой кислоты Посте достижения регенерантами высоты 2-3 см, растения переносили на среду с 0,5 нормы минеральных солей и не содержащую фитогормоны В фазе 2-3 листьев регенеранты высаживали в сосуды с почвос\"есью и помещали в климакамеру с заданным режимом
Для создания фона, имитирующего токсические условия кислых почв, в среду с низким уровнем рН дополнительно вводил и, на различных этапах развития кал1>сных линий, сульфат алюминия - АЬСБОл)} х 18 НгО в заданных концентрациях Уровень кислотности варьировал в пределах от 3,0 до 6,0 рН Плотную или желеобразную среду получали, испочьзуя смесь агара и желатина (6 г и 12 г соответственно), которая желировалась в кислых устовиях При отборе устойчивых клеточных линий на алюмотолерантность применяли различные схемы (табл 1)
Оценка полученных регенерантов на устойчивость к ионам Н и А1 проводилась в водной культуре, в вегетационных и полевых опытах, в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории селекции и первичного семеноводства ячменя ЗНИИСХ Северо-Востока (Родина, 1995, Родина, Сотодянкина, 1999)
Таблица 1
Условные обозначения схем отбора алюмотолерантных каллусных линий
Схема селективного отбора Концентрация ионов AlJf на питательных средах, мг/л
MS 1 MS 2 MS 3
мг/л мМ мг/л мМ
К-20-К без селективного агента 20 0,74 0 0
К-40-К 40 1,48 0 0
К-К-40 0 0 40 1,48
К-40-40 40 1,48 40 1,48
К-40-20 40 1,48 20 0,74
К-20-40 20 0,74 40 1,48
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ^Оптимизация условий культивирования каллусных линий и получения рсгенерантов ячменя in vitro
Из литературных источников известно, что на процессы каллусогенеза и морфогенеза влияет размер, возраст, генотип первичного экспланта; условия культивирования каллусных культур и регенерантов. На начальном этапе проведенных исследований выявлен оптимальный размер эксплантируемых зародышей (1-1,5 мм), что соответствует 12-16 дню после их оплодотворения; установлена сортоспецифичность реакции изученных генотипов на изменение гормонального состава среды; сокращена на 15-38 дней продолжительность вегетационного периода регенерантов ячменя в зависимости от скороспелости до-норных растений.
2.Выявление зависимости показателен выживаемости и регенераци-онных процессов каллуса ячменя от концентраций ионов Н* и А13+ на селективных средах
Клеточную селекцию начинали с определения летальных и сублетальных концентраций селективного агента в среде. Учитывая биологию каллусной культуры были выделены 3 этапа ее развития: 1) индукция; 2) пролиферация; 3) морфогенез. На каждом из этапов была экспериментально определена летальная и сублетальная концентрация ионов Н* и А13+.
Исследования 18 генотипов показали, что при культивировании изолированных зародышей непосредственно на селективной среде наблюдалось формирование каллусной ткани с сильной оводненностью клеток Данная капчус-ная ткань характеризовалась в среднем низким уровнем выживаемости (9,27%) и морфогенеза (13,95%) даже в щадящих селективных условиях (А13~ 20 мг'т, рН 4,5), Учитывая трудность получения морфогенного каллуса при зкстанти-ровании зародышей сразу на селективную среду - целесообразно создавать стрессовые условия тишь на среде М8 2, предварительно накопив определенную катусную биомассу А инициацию первичного кал "уса следует проводить на питатетьных средах с нейтральным уровнем рН при отсутствие ионов А!'
Существенное повышение горога чувствительности к А1-кислому стрессу набпюдалось на втором этапе развития тканевой культуры уже при наличии индуцированного калтуса
Изучение кислотности среды на развитие калтусных клеток ячменя проводилось аа сорте Эколог, который является самым распространенным но Кировской области (табт 2) Не обнаружена прямая ¡ависимость регенерационнои способности выживших каллусов от кислотности среды при нагимии в ней ионов А13*.
Габпица 2
Влияние кислотности среды и различной концентрации ионов А1" на
_жизнеспособность каллусов и регенерацию побегов сорта Эколог__
,, I Аг | Пассировано ' Выживаемость, < Регенерация,
I _' мг/л мМ каллусов, щт % 1 %
Г 60 0 0 | 103 I 60,3 | 25 0 _
■ I 20 ) 0,74 68 | 43,8 | 41,6 ~__1
_30 I 1.11 I 69 38.8 24 5 _1
[ ; 40 I 1,48 ~ 95 , 36,8 ' 23 2____
| 20 ' 0 74 | 90 41 * | ¿8 4
' 30 ' 1.11 I 79 1 22,0 , 50.0
I 40 1,48 90 J_13,2 I 24 7
' 1 I о 74_< 50 7,1 I__4 8
3.7-3,3 30 1.11 ; 77 _ ___1 •? __Ьо_
__I 40 I Ы8 | ___0 { ___0 _ ,
I 20 0,74 I 58 ~ 0 "О
I °'2инижег-зо---ПТП--54 ~ -1--о---— 0
При постепенном понижении pH от нейтральных значений до 3,3 в присутствии 20-40 мг/л ионов А13+, гибель каллусов возрастала от 39,7 до 100%. Несмотря на то, что в диапазоне кислотности 3,7-3,3 выживали отдельные кал-лусные линии (1,3-7,1%), этот уровень кислотности нельзя считать допустимым для отбора, т. к. в этом случае выживало недостаточное для дальнейшего проведения селекции количество каллусных линий..
Оптимальным для отбора уровнем кислотности для сорта Эколог являлся диапазон pH 3,8-4,0. В этих условиях выживало от 13 до 41% каллусных линий в зависимости от концентрации ионов AI3t в среде.
Аналогичные результаты были получены при изучении других генотипов. Уровень кислотности, при котором выживало приемлемое для отбора количество каллусов, совпадал с выявленной экспериментальной кислотностью для сорта Эколог (pH 3,8-4,0).
После определения летального и сублетального уровней кислотности для проведения дальнейших исследований было необходимо выявить рабочие концентрации ионов А13+ при выявленном pH 3,8-4,0. Была проведена оценка выживаемости и способности к морфогенезу на селективной среде шести контрастных по алюмоустойчивости генотипов ячменя в диапазоне концентраций ионов алюминия от 0 до 42 мг/л при pH 3,8-4,0. Графики зависимости выживания от концентрации в среде ионов алюминия на основе двулетних наблюдений (рис.1) показывали индивидуальный характер реакции на стресс каждого генотипа. С увеличением селективной нагрузки прослеживалась общая тенденция к снижению доли выжившего каллуса. Для большинства генотипов летальная доза ионов алюминия составила 40-42 мг/л. 50%-ная гибель каллусной ткани наблюдалась, где стресс-фактор присутствовал в концентрации от 0 до 36 мг/л.
Каллусные линии алюмоустойчивого генотипа Keystone х 457-69 сохранили высокую выживаемость при селективной нагрузке 36 мг/л AI5*. У генотипов 1357-80 х SV66905, SV66905 х Икар (алюмоустойчивые) и Lulu х Conrad (алюмочувствительный) отмечена 50%-ная гибель клеток при 20-24 мг/л AI3*. У
Рис. Выживаемость каллуса ячменя на селективных средах с различными концентрациями ионов Л15+:
А - Keystone ч 457-69, В - 1357-80 xSv 66905. С - Sv 66905 х Икар,
D - Lulu х Conrad Е - Valeta х Lulu F - Выбор
алюмочувствительных генотипов Valletta х Lulu и Выбор, даже в контрольных условиях, погибало более половины каллусной ткани. При невысоких (10-20 мг/л) дозах ионов AI3* в среде у генотипов Keystone х 457-69 и 1357-80 х SV66905 наблюдался эффект стимуляции: повышение в 1,6-1,9 раза выживаемости каллуса по сравнению с контролем.
Таким образом, каллусные культуры, индуцируемые сортами контрастными по алюмоустойчивости в полевых условиях, сохранили генотипическую реакцию на стресс в культуре in vitro.
Все шесть изученных генотипов обладали способностью к регенерации в селективных условиях (рис. 2). Прямой зависимости регенерационной способности от концентрации в среде AI3* не выявлено. Выжившие в селективных условиях каллусные линии большинства генотипов сохранили эту способность в градиенте концентраций от 0 до 40 мг/л, а генотипы 1357-80 х SV66905 и Выбор от 0 до 30-36 мг/л ионов М3*. Два генотипа проявили резкое усиление мор-фогенетического потенциала при 30 мг/л А13+ по сравнению с контролем: Valetta х Lulu - почти в 10 раз и Lulu х Conrad в 2 раза. Вероятно, в данном случае имеют место геномные изменения мутационного характера в условиях сильного стресса, повлекшие за собой положительные изменения такого признака, как способность к морфогенезу.
Проведение селективного отбора на этапе дифференцированного роста (на среде MS 3) привело к существенному снижению морфогенного потенциала каллусной ткани. Выход регенерантов в зависимости от концентрации в среде ионов AI3* снижался в среднем по сортам на 2,8-10,1% по сравнению с контролем. Даже случаи ризогенеза в селективных условиях отмечены в 7-12 раз реже, а гибель каллуса в сравнении с контролем возросла в 2-10 раз. Проведение селективного отбора на уровне дифференцированного роста каллуса показало, что в присутствие 10-20 мг/л ионов AI3* гибнет 45-49% клеточных популяций, что позволяет считать эту концентрацию ионов А13+ сублетальной на этапе морфогенеза ячменя. Введение в селективную среду более высоких концентраций (30-40 мг/л) ионов А13+ приводило к некротизации каллусных линий и пол-
Рис 2 Регенерационная способность калгуса некоторых генотипов ячменя на селективных питательных средах с различными концентрациями ионов А ]1
А - Keystone х 457-69, В - 1357-80 х Sv 66904, С - Sv 66905 х Икар,
D - Lulu ч Conrad Е - Va'eta к Lulu Ь - Выбор
ностью ингибировало регенерационные процессы в культуре ткани. В результате данного исследования были, подобраны оптимальны« границы концентраций селективного агента, при которых возможно проводить отбор устойчивых кал-лусных линий в достаточном количестве с дальнейшей регенерацией растений на каждом этапе развития каллусных культур:
Первый этап - А15*-20 мг/л, рН 4,5.
Второй этап - А13+-36-40 мг/л, рН 3,8-4,0.
Третий этап - А15*-10-20 мг/л, рН 3,840.
З.Оптнмнзация селективных сред с различными концентрациями ионов Н+ н А1э+ для отбора алюмоусгойчквых каллусных культур при различных схемах отбора
С целью оптимизации схемы отбора алюмоустойчивых каллусных линий изучено 7 различных вариантов селективных сред. Средние значения выживаемости и регенерационной способности в виде диаграммы представлены на рисунке 3 (условные обозначения в таблице 1).
Создание мягких селективных условий на втором этапе (К-20-К) практически не снижало выживаемость при падении регенерационной способности в сравнении с контролем в 1,5 раза.
Повышение концентрации ионов А13+ в среде в два раза (К-40-К) увеличивало гибель каллусных линий в 2 раза при незначительном снижении регенерационной способности тю сравнению с предыдущим вариантом.
Введение на третьем этапе селективного агента высокой концентрации 40 мг/л - (К-К-40) приводило к полной утрате регенерационной способности при невысоком уровне выживаемости.
При двукратном воздействии стресса при постоянном его уровне (К-40-40) выживало чуть менее половины каллусов, количество образовавшихся регенератов не превышало 30% от контроля. В случае ступенчатого понижения селективного давления (К-40-20) уровень выживания вдвое превышал предыдущий вариант при самой высокой регенерационной способности исследуемых
11
вариантов Ступенчатое повышение стресса (К-20-40) приводило к полной утрате регенерационной способности
Фоны по АГ
Рис 3-а Средняя выживаемость капч\сных пиний генотипов ячменя при ра^ тичных фонах по Л!
Рис З-б Средняя регенерационная способность калт>сных линий генотипов ячменя при различных фонах по А1
Таким образом, сравнительная оценка эффективности различных схем селективного отбора для ряда гелотипов показала, что оптимальным вариантом для получения растений-регенерантов является двукратный отбор на средах с
алюминием в сублетальных концентрациях (второй этап- 40мг/л, третий этап -20 мг/1)
4,Оценка адаптивной и регенерационной способностей кэллусных линий, полученных от различных генотипов
Сравнительный анализ развития каллусной культуры сортов, гибридов и вторичных регенерантов родственного происхождения показал, как и преды дущие исследования, решающую роль генотипа в интенсивности адаптационных и морфогенетических процессов Исследования 15 генотипов выявили пре имущество калчусных таний гибридов над сортом по образованию первичного каллуса в 2,5 раз и выживаемости его в сепективных условиях в 60 раз На примере сорта Добрый было показано, что выживаемость и морфогенный потенци ал кхпусной культуры как регенеранта, так и гибрида достоверно превышали соответствующие показатели исходного сорта (рис 4 а, б) Если в контрольных условиях регенерационная способность регенеранта была существенно ниже, чем у гибрида, то яри кестком стрессе (А1'*- 40 мг/т) наблюдалось явное преимущество регенератной формы над гибридом, хотя отличия по выживаемости в этих жестких условиях для всех трех генотипов отсутствовали
В данном случае можно предположить, что относитетьно низкая стабильность геномов гибридных и регенерантнь.х форм по сравнению с сортом приводит, го-видимому, к большей вероятности появления сомаклональной изменчивости адаптивного характера у регенерированных из них растений
С'!едует отметить, что преимущество калчусных кучьтур регенерантов и гибридов над каглусными линиями, индуцированнь ми сортами, обеспечивает, в дальнейшем, их преимущество в потенциальной продуктивности и в потевых устовиях
При сравнении каллусных культур, индуцируемых сортами, контрастными по алюмоустойчивости в почевых условиях наблюдали сохранение геногиниче-ской реакции на стресс в к> "ьтуре ш V иго (рис 5 а, б) Сорта Клмир. Новичок, 044.93 обюдапи <55-100°о-ной выживаемостью и высокой ре"енерационнои
А1 мг/п
Рис. 4-а. Выживаемость каллусных линий различных генотипов ячменя на селективной среде
Рис. 4-6. Регенерационная способность каллусных линий различных генотипов ячменя на селективной среде
способностью в контроле. В селективных условиях каллус неустойчивого сорта Кумир некротизировался на 63,3% и терял способность к регенерации при 10 мг/л А13+, в то время как алюмотолерантные генотипы Новичок, 999-93 сохраняли на уровне каллусной ткани высокую устойчивость к стрессу.
-999 93 -Новичок - Кумир
Рис 5-а Гибечь каппусных линий контрастных по алюмоустойчизо<ггл генотипов ячменя на сетективной среде различной жесткости
-993-93 -Новичок - Кумир
Рис 5-6 Регенерационная способность каллусных чиний контрастных по алю-моустойчивости генотипов ячменя на селективной среде различной жесткости
¿Лабораторная и полевая оценка длюмоустойчивых регенерднтов ячменя на провокационных и опытных фонах 1 ¡отученные в результате щадящего (20 чг/т А13~) и жесткого (40 мг/л А!3*) отборов регенеранты проходили оценку в водной культуре, в вегетационных и полевых опытах (табл 3,4) Установлено, что изученные сорта по-разному реа-
тировали на селективный отбор каллусных линий. Регенеранты, индуцированные алкжочувсгвнтельным генотипом 1245-94, значительно повысили свои адаптационные способности после клеточной селекции в щадящих и жестких условиях (прирост корневой системы в стрессовых условиях увеличился в 3,54,5 раза, общая и продуктивная кустистость в 1,5 раз, количество зерен в колосе на 27%). У устойчивых сортов Новичок и 999-93 при этих условиях отбора значительных сдвигов не наблюдалось, хотя жесткий отбор положительно воздействовал на прирост корневой системы у генотипа 999-93, а шадящий - на продуктивную кустистость обоих сортов. С помощью дисперсионного анализа было выявлено преимущественное влияние генотипа на формирование основных количественных признаков у регенерантов по сравнению с жесткостью отбора каллусных линий.
Таблица 3
Прирост корневой системы регенерантов в водной культуре в зависимости от жесткости отбора каллусных линий (в % от прироста корневой системы исходного генотнпа)-2001 г
Схема селективного отбора каллусных линий ЯА-999-93 ЯА-Ноаичок КА-1245-94
рН6,0 рН 4,0 А13+20МГ/Л рН6,0 рН 4,0 А13+гомг/л рН 6,0 рН4,0 А13+20МГ/Л
жесткий отбор 134,29* 108,20 117,45 77,34* 48,41* 343,75*
щадящий отбор 75,54* 61,48* 59,97* 86,72 114,77* 487,50*
без отбора 67,93* 46,31* 52,18* 79,69 79,25* 100,00
•Достоверно отличается от исходного генотипа при Р > 095
ИА-регенерантная форма
Установлено, что достоверное изменение количественных признаков может происходить в результате проведения селективного отбора различной жесткости.
Таблица 4
Структура урожая регенерантов в вегетационных опытах 2001 года в швисимо-сти от жесткости отбора каллусных линий (в % от уровня исходного генотипа)
I Схема селек- \ КД-999-93 I ЯА-Новичок ! НА-1245-94 I
калтусных танин рН6,0 рН 4,0 А13":омг/я рН 6,0 рН 4,0 А13*Л0«т рН 6,0 1 Р"4'0 К 1 Аг 20МГ/Т
! Общая кустистость
жесткий отбор 89.74 92,45 128,57* 109.84 204,88* 161,76*
( щадящий отбор 102,56 139.62* 157.14* 111,48 104,88 158,82*
| без отбора 8*5,90* 103.77 138,10* 140.98* 87,80 85,29
Продуктивная кустистость |
жесткий отбор 90.48* 87.50 171.43* 87,03 160,00* 148 00* 1
| щадящий отбор 103,17 112,50 135.71* 114.71 ПЗ.ЗЗ 120,00
1 без отбора 96,83 100,00 135.09* 88,00 93.33 88,00 1
Количество зерен в колосе '
, жесткий отбор 91.80* 91,37 86,91* 76 25* 112,40* 126,91*
щадящий отоор 104.28 105,58 108 58 44,12 88,95* 101,83
без отбора 103,15 98.22 100,43 92,29* 95,15 114.07* 1
1 Урожайность с делянки
) жесткий отбор 88,26 91.67 ¡07,83 44,86* 104,80 117 24
щадящий отбор 93.26 78,10* 100 26 82.00* 61 65* 95,45 |
| без отбора 103,42 90.00 124,00* 71,71* 84,42 69,38*
•Достоверно от.-и чается от исходного генотипа при Р > 095
ЯА-регенерантная форма
Выбор схемы калтусного отбора, определяющей проявление того и 1.1 иного признака у регенерантов, должен проходить с учетом конкретных сепек-ционных задач повышение продуктивной кустистости, количества черен в ко-юсе игл Эти выводы подтверждены в палевых опытах на генотипе 994-4^ (табл 5)
Растения, л слученные в резучьтате клеточной селекции, имели значительное преимущество по урожайности на кислых почвах по сравнеш ю с растениями контрольного варианта и исходным сортом (максимальная проективность алюмоустойчивых регенерантов - 210-240 г/дел, тогда как у исходных генотипов 150 г/дел )
Таблица 5
Влияние жесткости отбора на продуктивность линии ЯА-999-93 в условиях полевого опыта 2002 г. (селекционный питомник)
Схема Количество линий Урожай с делянки
селективного изучено, убрано, % средний, % к вг шах
.отбора шт. шт. г/дел. Биос г/дел
известкованный фон (рН 6,0-6,2; А 0 мг/100 г почвы)
жесткий 112 39 34,8 186,2 169,2 240
щадящий 39 13 33,3 177,6 161,5 230
без отбора 21 3 14,2 163,0 148,1 180
сорт 25 11 44,0 180,0 163,6 240
кислый фон (рН 4,1; А11+4,2 мг/100 г почвы)
жесткий 161 40 24,8 143,7 189,1 210
щадящий 51 12 23,5 167,7 216,7 240
без отбора 20 3 15,0 130 171,0 150
сорт 16 3 37,5 135 177,6 150
Изучение группы генотипов родственного происхождения (регенеранты, гибриды, сорта) показало преимущество регенерантов, в большей степени адаптированных к неблагоприятным условиям, перед сортами и гибридами (табл.6). Установлено, что потенциальная продуктивность регенерантов на кислом фоне с алюминием в 1,5 раза выше, чем у линий гибридного происхождения и сортов.
В наших исследованиях было установлено, что в ризосфере некоторых регенерантов отмечается снижение содержания подвижного алюминия в большей степени по сравнению с другими генотипами. Алюмотолерантные сорта, создавая комфортные условия в прикорневой зоне, подщелачивают почвенный раствор до уровня, при котором алюминий становится труднодоступным для растений (рН свыше 4,5): регенеранты 1176-94 (рН 4,9), 889-93 (рН 4,73) (табл.7). У выделенных регенерантов по сравнению с другими генотипами наблюдалось наименьшее количество остаточного алюминия в прикорневой зоне (0,93-0,98 мг/ЮОг почвы), что свидетельствует о наличии у них активного механизма осаждения подвижных форм алюминия.
Таблица 6
Сравнитетьная урожайность различных групп генотипов в условиях __вегетационного опыта. 2000г
Генотипы
I
1_ _
Сорта
I Гибриды Регенераты
I Среднее
Масса зерна с I растения, г
Продуктивность, г/дел
3 -о ?
й °
и -б*
«
НСР„<
| то фактору А (генотип) по фактору В (фон) | вмимод АВ _
известк фон
фон
известк. фон
кислыи фон
0,81 1,15 0,73
0.89
0,59 0,45 0,72 0,59
16,32 27,15 16 27
9,53 7,69 12,57
19,91
Ч 87 I
0,12 0.19
3,00 3,18 4,92
58,34 28,32 77 2Ь 49 ^7
1
Регенеранты оценивались в ЗНИИСХ Северо-Востока на всех этапах селекционного процесса В конкурсных сортоиспытаниях лаборатории сечекции и первичного семеноводства ячменя с 1994 по 19^7 гг. более половины (51,9-62,50/о) изученных линий бычи представлены регенератами.
Таблица 7
ле на
тивность генотипов ячменя в почвенной культуре
Влияние кислотности и содержания А11* в прикорневой зоне на продук
тт*
Продуктивность, .. 1 А1
Генотип 1 / рНсол ,
г/дел _мг/100 г почвы
Биос-1 I 7,60 1 _4,76__1,19
| Новичок 19,16 4,57 __1Л7
Кумир \_5Л8__I 4.70 _1Л9_
ЛА-Эколог 6,10 \ 4.80 | 1.71
ЯА-Добрый !_6.14 4 65 ;_1.44
П 76-94 _19,60 \ 4,^0_;_0,93
889-93 1 18,44 4,73 ____ 0,98
Среднее 11.75 3,90 10.77 НСР 0,22 , 0 22 г (с урожайн-ю)____0,06_|_-0.50
Примечание различия мслД> сортами по изучаемым гризгахам достоверны
Таблица 8
Результаты сортоиспытаний устойчивых к ионам Н* и А13+ регенерантов ячменя на кислых почвах (рН 4,1; А13+ 4,2 мг/100г почвы), 2002 г.
Генотип Происхождение Урожайность
т/га %к st Биос-1
Конкурсное сортоиспытание
889-93 RA Абава х Икар 6,81 106,7
580-98 (Абава х Викинг) х RA Эколог 6,46 121,4
521-98 RA 102-92 (2114-83 х Добрый) 6,00* 112,8
1155-99 RA Эколог х Кредит 6,66* 112,1
Р=3,52%; НСР=0,61 т/га
Контрольный питомник
1021-00 RA 173-85 (Valetta х Lulu) 6,07 121,5
1026-00 RA 173-85 (Valetta x Lulu) 5,63 112,9
895-00 Новичок x (RA Лидер x Вятич) 7,70* 136,2
896-00 Новичок х (RA Лидер х Вятич) • 7,55* 134,2
927-00 ' 889-93 х 981-93 6,96* 130,1
977-00 1245-94 (Риск х Дина) х 889-93 7,30 123,1
983-00 1245-94 (Риск х Дина) 889-93 7,30 123,1
Р=4,19%; НСР=0,24 т/га
•Достоверно отличается от исходного генотипа при Р>095
В настоящее время выделены перспективные регенерантные линии (табл.8). Следует отметить, что кроме самостоятельного использования полученных регенерантов, положительные результаты достигаются при вовлечении регенерантов в скрещивания, например Новичок х (ЯА Лидер х Вятич). Для расширения генетического разнообразия исходных форм перспективно вовлечение в селекционный процесс "двойных" и "тройных" регенерантов, неоднократно прошедших через каллусную культуру.
выводы
1 Выявлены оптимальные условия культивирования каллусных линии и получения регенерантов ячменя установлен оптимальный размер экстата (11,5 мм), при котором образуется максимальное количество морфогенного каллуса, сокращен период созревания ре^енерантов на 15-38 дней
2 Определены субчетальные концентрации ионов FT и Alu на каждом этапе развития каллусной культуры, при которых возможен отбор устойчивых калчусных чиний с дальнейшей регенерацией растений-
первый этап - Alr*-20 мг/л, pH 4,5,
второй этап - Л13^-36-40 мг/л, pH 3,8-4,0,
третий этап - А1,+-10-20 мг/л. pH 3,8-4,0
3 Установлено, что выживаемость каллусных линий при жестких се ick-тивнь х условиях зависит от исходного генотипа растений ячменя
4 Выявлено, что интенсивность регенерационных процессов в селективных условиях достоверно определялась генотипом донорного растения и не и-висе-а от алюмоустойчивости каллусных культур
5 Разработана оптимальная схема отбора каллусных чиний и по ¡учения ре-енерантоп, включающая двукратное введение в среду ионов A1J* в су б тагьных концентрациях, составляющих на этапах недифференцированного роста 40 мг/л, на этапе морфогенеза 20 мг/ч
6 Показано, что в условиях in vitro вторичные регенеранты и гибрн 1Ы превосходят исходные сорта по адаптационным и морфогенетическим параметрам Их преимущество сохраняется в полевых испытаниях и выражается в •толерантности к алюмокислому стрессу и повышении продуктивности растений
7 Установлено, что на формирование количественных признаков регече рантов оказывает влияние генотип и схема отбора каллусных чиний Выявлено преимущественное влияние генотипа
8 Из полученных регенерантов ячменя выдечены перспективные формы устойчивые к ионам Н* и А!н 889-03 (RA Абава х Икар), 1176-94 (RA Экочог х Креди-), 1021-00 (RA Valetta х I u'u). 895 00 (Новичок х (RA Лидер х Вятич)) и
21
другие, сохраняющие высокую потенциальную продуктивность при pH 4,1; концентрации ионов А13+ 4,2 мг/100 г почвы и проходящие оценку на соответствующих этапах селекционного процесса в ЗНИИСХ Северо-Востока.
ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Родина H.A., Родин Е.А., Шуплецова О.Н., Щенникова И.Н. Клеточная селекция ячменя на устойчивость к эдафическому стрессу // Сельскохозяйственная наука Северо-Востока европейской части России. Селекция и семеноводство: Сборник научных трудов к 100-летию Вятской сельскохозяйственной опытной станции.-Киров, 1995.-Т.1.-С.116-123.
2. Родина H.A., Шуплецова О.Н. Создание исходного материала для селекции ячменя на устойчивость к кислым почвам методом культуры ткани // Тез. научно-практической конф. "Теоретические и прикладные проблемы генетики и селекции и семеноводства зерновых культур" 24-27 марта 1998г.- Нем-чиновка 1, Моск. обл.,1998.-С.63.
3. Шуплецова О.Н., Родина НА., Широких И.Г. Способ получения алю-мотолерантных форм ячменя в культуре ткани // Проблемы сельскохозяйственного производства в изменяющихся экономических и экологических условиях. Часть 2 - Агрономия. Раздел 1: Материалы международной научно-практической конф, посвященные 25-летию Смоленского с/х института.- Смоленск, 1999,- С.147-149.
4. Широких И.Г., Худякова Т.В., Шуплецова О.Н. Прикладная биотехнология в селекции зерновых культур на устойчивость к эдафическому стрессу // Материалы 2 международной научной конф. 18-19 октября 2000г. "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии".- М., 2000,- С.163-164.
5. Широких И.Г., Шуплецова О.Н., Худякова Т.В. Оценка различных показателей, тестирующих устойчивость ячменя к токсичности ионов водорода и алюминия //Доклады РАСХН,- 2001.- №1.- С.13-15.
6 Шуплецова О Н Создание алюмоустойчивых форм ячменя методами биотехнологии // Материалы научно-практической конф "Биотехнология на рубеже веков проблемы и перспективы" Администрация Кировской обл , Вятский госуд универ-т, группа "Сарториус", Германия - Киров, 2001 - С 82-83
7 Широких И Г , Шуптецова О Н , Родина Н А Роль генотипа в создании алюмоустойчивых форм ячменя в кутьтуре in vitro // Сепекция, семеноводство и сортовая технология на Северо-Востоке европейской части России Сборник научных трудов Зонального НИИСХ Северо-Востока,- Киров, 2001 -С 8-13
8 Широких И Г, Широких А А , Шуплецова О Н Прикладная биотехнология и ее теоретическое обеспечение в Северо-Восточном селекционном центре // Биотехнология, экология, медицина Материалы 3 и 4 международных научных семинаров 2001-2002 гг - Москва-Киров "Экспресс", 2002 - С 145-147
9 Шутецова О Н , Широких И Г , Родина Н А , Щенникова И Н Оценка алюмоустойчивости регенератов ячменя в провокационных условиях // Здоровье - питание - биологические ресурсы - Т - 1 - Селекция и семеноводство Земледелие Материалы международной научно практической конф, посвященных ^-летию со дня рождения академика Н В Рудницкого - Киров, 2002 С 244-250
Объем 1,5 п. л.
Зак. 222
Тир. 100 экз.
АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шуплецова, Ольга Наумовна
ВВЕДЕНИЕ.
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ф 1.1 .Токсичность алюминия в условиях кислых почв.
1.2.Факторы и механизмы устойчивости растений к алюмокислому стрессу.
1.3.Методы и эффективность клеточной селекции растений.
1.4.Отбор А1-устойчивых сомаклонов.
1.5.Процессы каллусогенеза и органогенеза растений.
1.6.Оценка растениЙ-регенерантов на провокационных фонах. т 2.0БЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1 .Культивирование растений ячменя in vitro.
2.2.Оценка регенерантов ячменя в водной культуре.
2.3.Оценка регенерантов ячменя в вегетационных и полевых опытах
3 .РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1.Оптимизация условий культивирования каллусных линий и получения регенерантов ячменя.
3.2.Выявление зависимости показателей выживаемости и регенера-ционных процессов каллуса ячменя от концентраций ионов водорода и алюминия в селективных средах.
3.3.Оптимизация селективных сред с различными концентрациями ионов К1" и А13+для отбора алюмоустойчивых каллусных культур при разных схемах селекции.
3.3.1.Селективный отбор на первом-втором этапе развития каллусных культур.
3.3.2.Селективный отбор на втором-третьем этапе развития каллусных культур.
3.4.Оценка адаптивной и регенерационной способностей каллусных линий, полученных от различных генотипов.
3.5.Лабораторная и полевая оценка устойчивых к алюмокислому стрессу регенерантов ячменя на провокационных и опытных фонах
ВЫВОДЫ.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам"
Актуальность темы
Возрастающая потребность человечества в продуктах питания влечет за собой необходимость существенного повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Лимитирующим фактором урожайности в Нечерноземной зоне является повышенная кислотность почв, усиленная наличием в ней ионов алюминия и низким уровнем азотного и фосфорного питания (Авдонин, 1971; Климашевский, 1991; Родина, 1995-а).
Неблагоприятные факторы Нечерноземной зоны в сочетании с усиливающимися трудностями организационно-экономического порядка выдвигают на одно из первых мест задачу создания сортов с высокими адаптивными реакциями, обеспечивающих высокую устойчивость к повышенной кислотности почвы, вредным организмам и другим стрессовым факторам (Родина, 1995-6).
Одним из перспективных путей создания сортов, толерантных к ионам водорода и алюминия, является клеточная селекция, благодаря повышенной чувствительности изолированных тканей к указанным факторам и резкому усилению наследственной изменчивости в культуре изолированных тканей и клеток (Бутенко и др., 1986; Внучкова, 1989; Родин, 1986; Шевелуха и др., 1992, 2000, 2001). Использование жестких фонов, позволяющих отобрать клетки с нужными качествами и обеспечивающих возможность повышения приспособленности генотипов, позволяет отнести данное направление клеточной инженерии к методам клеточной селекции. При селекции in vitro существует возможность сопряженного отбора по хозяйственно-ценным признакам и показателям адаптивной способности генотипов к неблагоприятным факторам среды. Однако число признаков, которые можно анализировать в культуре in vitro, ограничено. Слабо изучены экспериментальные концентрации селективного фактора. Не ясно, какой должна быть продолжительность действия стрессового фактора.
В настоящее время выявлена связь реакции клеточных систем ячменя на каллусогенной среде с устойчивостью растений к неблагоприятным условиям, в частности с засухо - и солонцеустойчивостью (Россеев, 1993, 1995).
Наличие клеточных механизмов повышения устойчивости растений к действию стрессов, высокая чувствительность каллусной культуры в сочетании с возможной изменчивостью изолированных клеток, создают реальные предпосылки для получения алюмоустойчивых сомаклонов методом клеточной селекции.
Ячмень - одна из важнейших сельскохозяйственных культур, занимающая четвертое место в мире по величине площадей. Эта культура особенно подвержена алюмокислому стрессу. Зерновые культуры трудно поддаются культивированию in vitro и регенерации. Ячмень среди них по трудности регенерации занимает одно из первых мест.
Трудность массового получения регенерантов ячменя из соматических клеток была серьезным препятствием в их изучении, что являлось главной причиной ограниченных сведений в литературе о количественных и качественных показателях регенерантов ячменя.
В настоящее время разработан способ получения регенерантов ячменя в условиях алюмокислого стресса (Внучкова, 1987,1989,1990; Родин, Долго-аршинных, 1989). Однако исследований этих авторов было недостаточно для полной оценки и проверки устойчивости к алюминию в полевых условиях.
Поэтому возникла необходимость разработки способа стабильного получения массовых количеств алюмоустойчивых регенеранов ячменя, их оценки на провокационном фоне, а также изучения влияния условий in vitro на хозяйственно-ценные признаки полученных регенерантов.
Цель и задачи исследований
Основной целью исследований было: создание исходных форм ярового ячменя, устойчивых к алюмокислому стрессу, методом отбора устойчивых линий в каллусной культуре и использование их в селекции.
Это предполагало решение следующих задач:
1) Определить летальные и сублетальные концентрации ионов водорода и алюминия на каждом из этапов развития каллусной культуры.
2) Разработать метод отбора устойчивых к алюмокислому стрессу кал-лусных линий ячменя.
3) Оценить адаптивную и регенерационную способность генотипов различного происхождения в селективных условиях.
4) Получить алюмотолерантные регенеранты и оценить их в лабораторных, вегетационных и полевых опытах.
5) Использовать алюмоустойчивые регенеранты ячменя в селекции этой культуры.
Научная новизна
Разработаны и использованы методы оценки адаптивной и регенераци-онной способности каллусных линий различных генотипов ячменя. Установлены летальные и сублетальные концентрации ионов FT и A1J+ на всех этапах развития каллусной культуры. Предложена оптимальная схема для отбора алюмотолерантных каллусных линий и получения регенерантов в массовом количестве. Выявлено влияние различных схем селективного отбора в культуре in vitro на количественные признаки полученных регенерантов. Выявлено преимущество вторичных регенерантов и гибридов по их устойчивости к ионам Н+ и А13+ над сортами в селективных условиях in vitro. Показано преимущество регенерантов in vivo по степени адаптированности к неблагоприятным условиям по сравнению с растениями исходных сортов и гибридов.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований разработан метод отбора алю-моустойчивых каллусных линий. Получены в большом количестве устойчивые к ионам Н+ и A1J+ регенеранты ячменя как исходный материал для последующей селекции. Предложены к использованию различные схемы отбора каллусной культуры для получения регенерантов в зависимости от особенностей генотипа и селекционных задач. Выявлено влияние жесткости отбора на формирование хозяйственно-ценных признаков регенерантов. Выделены и переданы селекционерам Северовосточного НИИСХ перспективные по устойчивости к ионам IT" и A1JT регенерантные линии ячменя.
Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям доктору с.-х. наук Н.А. Родиной и доктору биол. наук B.C. Шевелухе; канд. биол. наук И.Г. Широких, коллективу лаборатории селекции и первичного семеноводства ячменя ЗНИИСХ С.-В., доценту, канд. биол. наук Е.А. Калашниковой и всему коллективу кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К.А. Тимирязева за помощь в выполнении диссертационной работы.
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Токсичность алюминия в условиях кислых почв
Важнейшим направлением селекции в Нечерноземье РФ является устойчивость к стрессу, вызванному токсичностью ионов алюминия, в дерново-подзолистых почвах. Площадь кислых почв в этой зоне России составляет 40 мл. га сельскохозяйственных угодий, что составляет около 80% от общей площади пашни. При этом токсичность ионов алюминия может наблюдаться при любой величине рН ниже 5,5. Содержание подвижного алюминия в этих условиях колеблется от 3 до 20 мг/100 г почвы, что составляет 60-400 кг на 1 га пахотного слоя. Такое количество ионов алюминия в сочетании с кислотностью почвы снижает урожай на 20-50% (Авдонин, 1976; Климашевский, 1991; Шевелуха, 1998, 2003; Foy et al, 1978; Oettler et al, 2000).
В настоящее время интенсивно изучаются молекулярный, клеточный и физиологический аспекты алюминевой токсичности в растениях.
Отрицательное действие алюминия сказывается, в первую очередь, на развитии корневой системы, приводящее к снижению продуктивности растения и, нередко, его гибели (Дедов, 1974). Внешние признаки поражения корней выражаются в уменьшении или прекращении роста корней с последующим образованием на них темных пятен (McMeilly, 1982; Aniol, 1999); утолщением и образованием многих боковых корней, рост которых впоследствии тоже замедляется (Мещеряков, 1937). Корни под действием ионов АГ~ становятся хрупкими и ослизняются (Foy et al, 1978); приобретают желтоватую или бурую окраску, сильно угнетены (Reid, 1969); уменьшается общая их масса и длина, ветвление и опушение (Фроловская, 1966).
Поражается и надземная часть растения под воздействием ионов А13+. Появляется некроз краев листа у чувствительных сортов ячменя (Foy, 1996). Уменьшается высота растений у пшеницы, ячменя и других культур. Происходит уменьшение длины колоса, количества колосков и зерен в колосе, снижение массы 1000 зерен (Родина, 1995; Oettler et al, 2000).
Присутствие алюминия в почве сильно нарушает корневое питание растений, подавляя поглощение макроэлементов из почвы, особенно количество доступного растениям фосфора (Климашевский, Вернадская, 1974), на поверхности корня (Clarkson, 1967), свободном пространстве клеточной стенки (Panpach, 1963) и протоплазме клеток (Ганжа, 1941). Алюминий не только нарушает поглощение фосфора, но и подавляет его включение в основные органические соединения (Климашевский, Вернадская, 1974), увеличивает количество свободных нуклеотидов (Вернадская, 1974) вследствие нарушения их функции в синтетических процессах, например торможение синтеза полисахаридов в клеточных стенках (Huck, 1972). При действии алюминия происходит исчезновение высокоэнергетических центров в корнях (Szatanik-Kloc et al, 1996). Подавляется митотическая активность клеток корней, снижается интенсивность дыхания (Foy et al, 1978; Mumford, Jensen, 1966).
Алюминий вытесняет из клетки кальций, необходимый для развития и стабилизации растительных мембран, тем самым вызывая структурные перестройки в плазмалемме. У ячменя транспорт кальция ингибируется алюминием в концентрации выше 25 мкМ (Вернадская, 1974). В результате снижения проницаемости плазмалеммы наряду с кальцием алюминий вызывает недостаточность железа, магния, калия, воды, нитратов (Lance, Pearson, 1969; Kuodzi, 1970).
Известно, что клеточные оболочки служат ионообменными резервами клеток, сорбируя ионы и освобождая их при изменении рН и поверхностного заряда. Алюминий при взаимодействии с клеточными стенками может быстро блокировать их сорбционные центры, нарушая ионный обмен и, как следствие, поглощение элементов питания. Проникая в свободное пространство корня, он взаимодействует не только с клеточной стенкой, но и с поверхностью протопластов. Плазматические мембраны обладают ярко выраженной сорбционной поверхностью, представленной фиксированными заряженными группами. Связываясь с поверхностью мембраны, алюминий нарушает ее функциональную активность, индуцируя необратимые конформационные преобразования белков. При этом ионами А13+ ингибируется их транспорт через блокирование активных групп переносчиков. Сорбция ионов АГ"1" наружными мембранами меняет проницаемость протопласта клеток корней. Это сказывается на поглощение растениями элементов минерального питания (Климашевский, 1964; Климашевский, Березовский, 1973; Климашевский, Дедов, 1975, 1977; Clarkson, 1967; Taylor, Foy, 1985 (a,b); Wagatsuma et al, 1987).
Если основной мишенью стрессового действия ионов АГ~ на клеточном уровне являются клеточные мембраны, то на молекулярном - комплексы белков и липидов, входящих в химический состав мембраны. При клеточно-мембранной нестабильности в корнях растений, вызванной присутствием
-v . алюминия, ионы АГ~ образуют комплексы с различными биомолекулами, находящимися в живых клетках. Так лимонная кислота образует хелаты алюминия, которые остаются стабильными при рН 5,5-8. Участие ионов А13+ в изменении белков клеток является причиной различных эффектов алюми-невой токсичности, проявляющихся при делении клеток, а также в процессах фотосинтеза, деформации корней, общего замедления роста и развития растений (Жученко, 2001).
Роль алюминия для растений еще далеко не ясна. Этот элемент обнаружен в высокоочищенных препаратах РНК, ДНК и фитохроме. Это указывает на возможность участия алюминия в сохранении необходимой конфигурации молекул нуклеиновых кислот (Mumford, Jensen, 1966). Опубликованы сведения о генотоксическом действие алюминия с образованием структурных мутаций различных видов: геномных, хроматидных и хромосомных аберраций (Wood, 1995; Hamel, 1997; Keith et al, 1998; Сынзыныс и др., 2002). Для алюминия как и для солей тяжелых металлов характерен феномен образования двуядерных клеток (Довгалюк и др., 2001). У некоторых видов растений отмечена индукция в цитоплазме клеток корневой меристемы специфических "А1-структур" под действием солей алюминия и его ионов. Эти структуры иногда контактируют с ядром. Таким образом, избыток ионов алюминия может считаться сильным природным мутагеном, нарушающим метаболизм корневых клеток (Fiskesjo, 1989).
По мнению некоторых авторов низкие концентрации ионов А13+ оказывают стимулирующее действие, в частности, на развитие корневой системы, а при возрастании их концентрации возникают четкие симптомы отравления, после чего наступает гибель организма. Критические концентрации А13~ сильно варьируют для разных видов растений (Климашевский, 1991; Драгав-цев и др., 1995).
Токсичность алюминия для растений зависит от того, в виде каких соединений он присутствует в почвах. Алюминий может находиться в составе аквакомплекса А1 (НчО^ (в более простом выражении А1°"), в составе мономерных и полимерных гидрокомплексов и комплексов с другими неорганическими и органическими лигандами (Амельянчик, Воробьева, 1999). Наиболее сильными кислотными свойствами обладают аквакомплекс алюминия и его мономерные гидрокомплексы. Эти соединения и наиболее токсичны (Blarney et al, 1983). Алюминий, связанный в органических и фторидных комплексах, гораздо менее токсичен для большинства живых объектов (Bartlett, Riego, 1972). Что касается полимерных гидрокомплексов алюминия, то их токсичность по отношению к различным видам живых организмов сильно различается. На высшие растения они оказывают менее вредное воздействие, чем аквакомплексы (Kerven et al, 1989; Noble et al, 1988). В то же время известна чрезвычайная чувствительность (при рН ниже 6,0) к токсичности полимерных гидрокомплексов низших организмов, таких как почвенные бактерии R. trifolii (Wood, Cooper, 1984; Wood, 1995).
Установлено, что токсичность ионов А13+ в почве суммируется с токсичностью Н"-ионов, при этом вместе они обуславливают обменную кислотность. Переходя в водорастворимое состояние, алюминий становится легкодоступным для растений. Считается, что кислые почвы непригодны для растений в основном из-за присутствия подвижного алюминия. (Авдонин, 1976). Токсический эффект действия почвенной кислотности, обусловленный ионами Н+, гораздо меньше по сравнению с действием подвижных форм ионов АГ" (Климов, 1984; Родина, Солодянкина, 1999; Tamas L., Huttova J., 2000).
Однако по мнению многих авторов реакция почвы является важнейшим фактором внешней среды, влияющим на все биологические процессы как высших растений, так и микроорганизмов. Любые ферментативные процессы протекают лишь в оптимальных для них интервалах концентрации водородных ионов. Не существует какой-то универсальной оптимальной концентрации этих ионов для жизнедеятельности растений и микроорганизмов, различающихся по своей физиологической природе. В условиях сильнокислой реакции почв кристаллическая решетка почвенных коллоидных минералов становится неустойчивой. Она начинает распадаться с образованием ионов железа, алюминия, магния и марганца, которые переходят в обменное состояние (Гейдройц, 1930; Кедров-Зихман, 1937; Пейве, 1961). Вследствие этого алю-миневой токсичности кислых почв сопутствует и марганцевая токсичность. Прямая корреляция между чувствительностью растений к ионам АГ , Mrf""" и рН почвы не обнаружена (Косарева и др., 1998; Zhang et al, 1999).
В последние годы в ряде стран широко развернуты программы исследований по селекции зерновых культур на выносливость к повышенной кислотности почвы.
Среди хлебных злаков особенно чувствителен к алюмокислому стрессу яровой ячмень, урожай которого по этой причине резко снижается. Наибольший недобор зерна в связи с этим имеет место в хозяйствах Нечерноземного центра.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шуплецова, Ольга Наумовна
ВЫВОДЫ
1. Выявлены оптимальные условия культивирования каллусных линий и получения регенерантов ячменя: установлен размер экспланта (1,0-1,5 мм), при котором образуется максимальное количество морфогенного каллуса; сокращен период созревания регенерантов на 15-38 дней путем круглосуточного освещения.
2. Определены сублетальные концентрации ионов Н* и А13+ на каждом этапе развития каллусной культуры, при которых возможен отбор устойчивых каллусных линий с дальнейшей регенерацией растений: первый этап - АГ+-20 мг/л, рН 4,5; второй этап - А13+-36-40 мг/л, рН 3,8-4,0; третий этап - А13+-10-20 мг/л, рН 3,8-4,0.
3. Установлено, что выживаемость каллусных линий при жестких селективных условиях зависит от исходного генотипа растений ячменя.
4. Выявлено, что интенсивность регенерационных процессов в селективных условиях достоверно определялась генотипом донорного растения и не зависела от алюмоустойчивости каллусных культур.
5. Разработана оптимальная схема отбора каллусных линий и получения регенерантов, включающая двукратное введение в среду ионов алюминия в сублетальных концентрациях: на этапе недифференцированного роста 40 мг/л, на этапе морфогенеза 20 мг/л.
6. Показано, что в условиях in vitro "вторичные" регенеранты и гибриды превосходят исходные сорта по адаптационным и морфогенетическим параметрам. Их преимущество сохраняется в полевых испытаниях и выражается в толерантности к алюмокислому стрессу и повышении продуктивности растений.
7. Установлено, что на формирование количественных признаков регенерантов существенное влияние оказывает генотип и схема отбора каллусных линий. Выявлено преимущественное влияние генотипа.
8. Из полученных регенерантов ячменя выделены перспективные формы, устойчивые к ионам НГ и А13+: 889-93 (RA Абава х Икар), 1176-94 (RA Эколог х Кредит), 1021-00 (RA Valetta х Lulu), 895-00 (Новичок х RA Лидер х
О N ВЫСОКУЮ
Вятич) и др., сохраняющих потенциальную продуктивность при рН 4,1, концентрации ионов A1J+ 4,2 мг/л и проходящих оценку на соответствующих этапах селекционного процесса во ЗНИИСХ Северо-Востока.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
1. На основании проведенных исследований предложен новый метод создания исходного материала ярового ячменя для селекции на устойчивость к токсичности алюминия на кислых почвах, заключающийся в следующем:
- получение каллусной культуры ячменя из незрелых зародышей (размером 1-1,5 мм) на модифицированной среде Мурасиге и Скуга;
- выявление сублетальных концентраций ионов РГ и А13+, необходимых для создания селективных сред на этапе недифференцированного роста и морфогенеза каллусных культур конкретных генотипов;
- проведение селективных отборов в каллусной культуре по схеме, которая включает двукратное введение в среду ионов А13+ в сублетальных концентрациях, составляющих на этапах недифференцированного роста и морфогенеза 40 и 20 мг/л (при рН 3,8) соответственно;
- тестирование на устойчивость к алюмокислому стрессу семенного потомства полученных регенерантов ячменя и оценка их продуктивности в провокационных условиях вегетацинных и полевых опытов.
2. С использованием данного метода созданы и переданы в дальнейший селекционный процесс новые алюмоустойчивые формы ярового ячменя (RA Valetta х Lulu, Ra Эколог, RA Эколог х Кредит, RA Абава х Икар, 580-89,52198, 895-00, 927-00, 977-00 и др.), превосходящие стандарт по урожайности на 12,8-36,2% в провокационных условиях кислых почв.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шуплецова, Ольга Наумовна, Киров
1. Авдонин Н.С. Алюминий в дерново-подзолистых почвах // Агрохимия.-1971. №7. - С.94-103.
2. Авдонин Н.С. Известкование кислых почв М., - 1976. - 303 с.
3. Амельянчик О.А., Воробьева Л.А. Алюминий в водных и солевых вытяжках из подзолистых почв // Почвоведение. 1999. - №9. - С. 1096-1106.
4. Банникова В.П., Сидорова Н.В., Колючая Г.С., Сытник К.М. Регенерация растений из каллусных тканей гибридных зародышей пшеницы // Докл. АН УССР, сер.бил.- 1985.- №3.- С.62-64.
5. Белоусов А.А., Замбриборщ Н.С., Игнатова С.А. Изменение частоты соматического эмбриогенеза путем рекуррентного отбора в популяциях кукурузы // Цитология и генетика. 1998. - №4. - Т.32. - С. 16-20.
6. Вернадская М.Л. Генотипическая специфика фосфорного обмена растений гороха в связи с токсичностью алюминия: Автореферат диссертации канд. биол. наук-М.: МГУ,- 1974. -21с.
7. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.- М., 1964. - 272с.
8. Бутенко Р.Г., Шамина З.Б., Фролова Л.В. Индуцированный органогенез и характеристика растений, полученных в культуре тканей табака // Генетика.- 1967.- №3. С.29-39.
9. Бутенко Р.Г., Джардемалиев Ж.К., Гаврилова Н.Ф. Каллусообразующая способность эксплантов из разных органов озимой пшеницы // Физиология растений.- 1986-а.-Т.З.-Вып.5.- С.350-355.
10. Бутенко Р.Г., Джардемалиев Ж.К., Гаврилова Н.Ф. Регенерация растений из каллусной ткани, полученных из разных органов озимой пшеницы // физиология растений.- 1986-6.-Т.З. Вып.5. - С.837-842.
11. Бутенко Р.Г. Основы сельскохозяйственной биотехнологии.- М.,- 1990.-С. 154-234.
12. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе.-М.: ФБК. Пресс,-1999.-159 с.
13. Бахтин Ю.Б. Получение гаплоидов из пыльников тритикале и их цитологическая характеристика // Докл. ВАСХНИЛ.-1979.- №10,- С.8-10.
14. Внучкова В.А. Методические указания по индукции каллуса и расте-ний-регенерантов зерновых злаков при культивировании незрелых зерновок.-М.,-1987,- 22 с.
15. Внучкова В.А., Неттевич Э.Д., Чеботарева Т.М., Хитрова Л.М., Молчанова Л.М. Использование методов in vitro в селекции ячменя на устойчивость к токсичности кислых почв // Доклады ВАСХНИЛ.- 1989.- №7.- С.2-5.
16. Гапоненко А.К. Успехи современной генетики,- М.,- 1987.- Вып. 14,-С.64-74.
17. Гапоненко А.К., Мунтян М.А., Маликова Н.И., Созинов А.А. Регенерация растений Triticum aestivum in vitro II Цитология и генетика. 1985.-Т.19.- №5. С.335-342.
18. Ганжа Б.А. К вопросу о действии алюминия на растения // Почвоведение,- 1941.- №1.-С.22.
19. Гейдройц К.К. К вопросу об обменном водороде и обменном алюминии // Бюллетень почвоведа.- 1930,- № 4,- С.12-17.
20. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений.- Киев, 1984,- 290 с.
21. Гулько Е.А., Кравченко А.Н., Палий А.Ф. Соматический эмбриогенез у восковидной кукурузы // Изв. АН Респ. Молдова. Биол. и хим. н. 1995. - №3.- С.25-31.
22. Давоян Э.И. Мутагенез в культуре ткани риса и получение на его основе нового исходного материала // Генетика. 1983. - Т.ХГХ. - №10. - С. 17141719.
23. Давоян Э.И Генетическая детерминированность процессов каллусооб-разования и индукции регенерантов в культуре тканей риса // Генетика.- 1987 Т.23.- №2.- С.303-309.
24. Дедов В.М. Влияние А1-ионов на скорость роста корней гороха // Сорт и удобрение.- Иркутск, 1974 С 235.
25. Дейнеко Е.В., Цевелева О.Н., Пельтек С.Е., Бабенко В.Н., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Сомаклональная изменчивость морфологических и биохимических признаков у растений-регенерантов люцерны // Физиол. раст.-1997.- Т.44.- №5.- С.775-781.
26. Дмитриева Н.Н. Проблемы регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.-С.113-123.
27. Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Цитогенетические эффекты солей токсичных металлов в клетках апикальной меристемы корней проростков Allium сера L // Цитология и генетика.- 2001.- Т.35.- №2.- С.3-10.
28. Драгавцев В.А., Удовенко В.А., Батыгин Н.Ф. и др. Физиологические основы селекции растений.- СПб.: ВИР, 1995.- Т.2.- Ч.2.- 291 с.
29. Жученко А.А. Адаптивная система селекции растений (Эколого-генетические основы).- М., 2001.- Т.2.- 780 с.
30. Исаева Н.А. Изучение особенностей каллусогенеза и органогенеза в культуре тканей генетически различных форм ячменя: Автореферат диссертации канд.биол.наук.- Новосибирск, 1983.-20 с.
31. Исаева Н.А., Першина JI.A., Шумный В.К. Образование побегов и кор-необразных структур в каллусной ткани межвидовых гибридов ячменя и исгодных сортов и видов. Культура клеток растений и биотехнология.-М.:Наука, 1986,-С.178-181.
32. Исаева Н.А., Бородько А.В. Изучение морфологических нарушений у регенерантов ячменя // Цитология и генетика.- 1988.- Т.22.- №2.- С.27-32.
33. Искаков А.Р. Генотипическая изменчивость растений ячменя Hordeum vulgare L., полученных из культуры соматических клеток // Диссертация канд.биол.наук.-М., 1988.- 176 с.
34. Картель Н.А., Манешина Т.В. Каллусообразование у разных по гнетипу форм ячменя {Hordeum vulgare L.) II Цитология и генетика.- 1977.- Т. 11.-№6,- С.486-490.
35. Кедров-Зихман O.K. Почвенный поглощающий комплекс и вопросы земледелия. М.: ВАСХНИЛ, 1937.- 344 с.
36. Кильчевский А.В., Хотылева Л.В. Экологическая селекция растений. Мн.:Тэхналопя, 1997.- 372 с.
37. Климашевский ЭЛ. Питание кукурузы на дерново-подзолистых почвах. М.: Наука, 1964,- С.112.
38. Климашевский Э.Л., Березовский К.К. О генотипической устойчивости растений к ионной токсичности в зоне корней // Физиол. раст.- 1973.- Т.20.-№1.- С.66.
39. Климашевский ЭЛ., Бернадская М.Л. Генотипические особенности фосфорного обмена растений в связи с токсичностью А1 // Сорт и удобрение.-Иркутск, 1974.- С.248.
40. Климашевский Э.Л., Дедов В.М. О локализации механизма ингиби-рующего рост действия А1 в растягивающихся стенках // Физиол. раст.-1975.- Т.22.-№6.- С.1183.
41. Климашевский ЭЛ., Дедов В.М. Осаждение тканями корней одна из причин генотипической специфики устойчивости растений к его токсичности // Докл. ВАСХНИЛ - 1977.- №4,- С.7.
42. Климашевский ЭЛ. Генетический аспект минерального питания растений. М.: Агропромиздат, 1991.- 415 с.
43. Климов С.В., Рыбакова М.И. Метод оценки устойчивости зерновых злаков к токсичности кислых почв // Прогрессивные технологии земледелия и растениеводства в Нечерноземной зоне: Сб. науч. тр.- М.- 1984.- С. 163-176.
44. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Горемыкин В.В., Кудряшова И.Б., Ванюшин Б.Ф. Структурная и функциональная организация метилирования реплицирующегося генома растений // Молекулярная биология.- 1995.-Т.29.- С.1242-1257.
45. Ковалева О.Н. Цитологические аспекты регенерации сортов ячменя: Автореферат диссертации канд.биол.наук.- М.: ВИР, 2000.- 19с.
46. Копертех JI. Г. Бутенко Р.Г. Селекция пшеницы in vitro на устойчивость к хлоридному засолению // Межд. конф.посвящ. памяти акад. Баева.-М., 1996.-С.34,218.
47. Косарева И.А., Давыдова Г.В., Семенова Е.В., Груздева Е.В. Скриннинг с/х культур с целью обеспечения стабильности растиневодства: Тезисы конф,-С-Петербург,- 1998.- С.13-15.
48. Косулина Л.Г. Особенности процесса регенерации в каллуной культуре незрелых зародышей пшеницы // Сельхоз. биология. 1995. - №1. - С.78-84.
49. Кравченко А.Ю. Сомаклональные вариации количественных признаков ярового рапса // Докл. РАСХН 1999,- №3.- С.17-18.
50. Кунах В.А., Алпатова Л.К. Роль фитогормонов в изменчивости числа хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis // Докл.Ан СССР.- 1979.-Т.245.- №4.- С.967-969.
51. Кунах В.А., Чеченева Т.Н., Моргун В.В. Получение каллусных тканей от разных по генотипу растений кукурузы // Физиология растений.- 1980.-Т.27.- №2.- С.399-403.
52. Литовкин К.В., Игнатова С.А., Бондарь Г.П. Морфогенез в культуре Незрелых зародышей изогенных линий ячменя // Цитология и генетика.-1999. Т.33.- №5.- С.14-18.
53. Максютова Н.Н. Белковый обмен растений при стрессе: Автореферат диссертации д-ра биол.наук.- М., 1998.- 38 с.
54. Мещеряков A.M. Влияние кислотности и алюминия на рост растений // Труды ВИУА,- М., 1937,- Вып. 16.- Т.4.- С. 166-182.
55. Муромцев Р.Г., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., 1990.- 350 с.
56. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования элисторами системной устойчивости растений к болезням // Физиология растений.- 1994.-Т.41.- №4. С.626-633.
57. Омельянчук Н.А., Шумный В.К. Изучение особенностей культивирования in vitro у различных видов овса // Изв.СО АН СССР, сер.биол. 1986.-№6/1.- С.71-76.
58. Омельянчук Н.А., Добровольская О.В. Способность к регенерации растений каллусов изогенных линий // Изогенные линии и генетические коллекции: Материалы Второго совещания.- Новосибирск, 1993.- С.109-111.
59. Папазян Н.Д. Культура зародышей и стеблевых узлов некоторых сортов ячменя {Hordeum vulgare L.) II Апомиксис и цитоэмбриология растений,-Саратов: СГУ, 1983.- Вып. 5.- С.141-152.
60. Папазян Н.Д. Влияние клеточного отбора in vitro на изменчивость популяции in vivo // Новые методы биотехнологии растений.- Пущино, 1993.-С.163.
61. Пейве Я.В. Биохимия почв. М., 1961.-421 с.
62. Сидоров В.А. Биотехнология растений; клеточная селекция. Киев: Наукова думка, 1990.- 280 с.
63. Способ получения растений-регенерантов Hordeum vulgare, устойчивых к токсическому действию А13+ в кислой среде // А.с. 1546483 СССР, МКИ4
64. C12N5/00 / Внучкова В.А., Хитров Н.Б. (СССР). Заявл.20.10.88. Опубл.28.02.90.-4 с.
65. Сынзыныс Б.И., Буланова Н.В. Козьмин Г.В. О фито- и генотоксиче-ском действии алюминия на проростки пшеницы // Сельхоз. биология.-2002.-№1.- С. 104-109.
66. Ригин Б.В., Яковлева О.В., Камешинский A.M. Генетический потенциал устойчивости ячменя к повышенной концентрации токсичных ионов алюминия // 2 съезд ВОГиС.- СПб.,2000.- Т.1.- С.125-126.
67. Родин Е.А. Некоторые результаты освоения культуры клеток и тканей озимой ржи, ячменя в целях селекции // Селекция зерновых культур на устойчивость к болезням и неблагоприятным условиям среды в Волго-Вятском регионе: Труды НИИСХ С-В.-Киров, 1986.- С.3-7.
68. Родин Е.А., Долгоаршинных М.Г. Клеточная селекция ячменя на выносливость к кислым почвам в Северо-Восточном селекцентре // Генетика и селекция: Тр.НИИСХ.- Киров, 1989.- С.45-52.
69. Родина Н.А. Особенности селекции ячменя в Нечерноземной зоне России // Матер, совещ. по проблемам селекции зерновых культур в Нечерноземной зоне России 3-4 июля 1992 года.- Киров,- 1995.- С.3-13.
70. Родина Н.А. Метод оценки сортов ячменя по устойчивости к кислым почвам в вегетационных опытах // Матер, совещ. по проблемам селекции зерновых культур в Нечерноземной зоне России 3-4 июля 1992 года.- Киров,-1995.- С.41-44.
71. Родина Н.А., Солодянкина М М. Скрининг генотипов ячменя толерантных к А13+ в условиях водной культуры // Научные основы стратегии адаптивного растиневодства Северо-Востока Европейской части Росси: Матер. науч. практ. конф.-Киров, 1999.- С.31-39.
72. Россеев В.М. Изучение культуры ткани ячменя // Теоретические основы селекции и семеноводства с-х культур в Западной Сибири. Новосибирск, 1985.-С.105-108.
73. Россеев В.М. Способ оценки и отбора in vitro форм растений, устойчивых к неблагоприятным факторам среды // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология: Тез. докл.- Алматы, 1993.- С. 120.
74. Россеев В.М. Новый способ оценки растений на устойчивость к неблагоприятным факторам // Селекция и семеноводство.- 1995.- Т.5.- С.31-32.
75. Фроловская Т.П. Влияние подвижных форм алюминия на урожай и качество с.-х. растений // Влияние свойств и удобрений на качество растений.-М,МГУ, 1966.- С.157-167.
76. Шамина З.Б. Методические указания по клеточной селекции. М., 1984.194 с.
77. Шевелуха B.C., Рогинская В.А., Хижняк С.В. Перспективы использования токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых в клеточной селекции // Сельскохозяйственная биология.- 1992.- №3.- С.45-51.
78. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. М.: Колос, 1998.-308 с.
79. Шевелуха B.C. Проблемы, приоритеты и масштабы сельскохозяйственной биотехнологии в 21 веке // Сельскохозяйственная биотехнология.- М., 2000.- Т.1.-С.З-14.
80. Шевелуха B.C. Биотехнология: в 2 т.- М., Воскресенье 2001.- 593 с.
81. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология.- М.: Высшая школа,- 2003.- 469 с.
82. Шинкарева И.К., Шамина З.Б., Сарычев Ю.Ф., Загорская Н.А., Краевой С.Я. Анеуплоидия в семенном потомстве регенерантов, полученных в культуре тканей табака // Генетика.- 1973.- Т.9.- №2.- С.21-28.
83. Широких И.Г., Шуплецова О.Н., Худякова Т.В. Оценка различных показателей, тестирующих устойчивость ячменя к токсичности ионов водорода и алюминия //Доклады РАСХН.- 2001.- Т.1.- С. 13-15.
84. Юркова Г.Л., Левенко Б.А., Новожилов О.В. Уровень плоидности клеток каллусной ткани пшеницы-однозернянки // Цитология и генетика.- 1985.-Т.19.- №3.- С.202-206.
85. Ahloowalia B.S. Cromosomal changes in parasecsually produced rey grass // Current chromosome reseach (ed. Jones, Brandham P.E.).-Elsevier, Amsterdam, 1976.- P.l 15-122.
86. Ahloowalia B.S. Plant regeneration from callus culture in wheat // Crop Sci.-1982.-V.22.-P.405-410.
87. Ahloowalia B.S., Sheringston J. Transmission of somaclonal variation in wheat // Euphytica. -1985.- V.34.- N2.- P.525-537.
88. Aniol A. The aluminium tolerence in wheat // Plant breeding: theories, achievements and problems. Dotnuva. Akademija. Lithunia. 14-16 July.- 1999.-P.14-22.
89. Arihara A., Kumagai R., Koyama H., Ojima K. Aluminum-tolerance of carrot (Daucus carota L.) plants regenerated from selected callus cultures // Soil Sci. Plant Nutr.-1991.- V.37.- P.699-705.
90. Barakat M.N., Abdel Latif Т.Н. In vitro selektion of wheat callus tolerant to high Jevels of salf and plant regeneration // Euphytica.- 1996.- №2.- P. 127-140.
91. Bartkowiak E. Tissue culture of maize. IV. Hormonal, environmental and genotypic influences on plant regeneration // Genet.Polon.- 1983.- V.24.- N4.-P.299-304.
92. Bartlett R.J., Riego D.L. Effect of chelation on the toxicity of aluminum // Plant Soil.- 1972.- V.37.- P.419-423.
93. Bayliss M.W. Chromosomal variation in plant tissue culture // Int. Rev. Cy-tol.- 1980.-V.11A-P.113-144.
94. Blarney F.P.C., Edwards D.G., Asher C.J. Effects of aluminum, OH:Al and P:A1 molar ratios, and ionic strength on syobean root elongation in soil culture // Soil. Sci. 1983. - V.136. - P.197-207.
95. Borrero J., Pandey S., Ceballos H., Magnavaca R., Bahia Filho A.F.C. Genetic variances for tolerance to soil acidity in a tropical maize population // May-dica.- 1995.- V.40.- №3.- P.283-288.
96. Breimann A. Plant regeneration from Hordeum spontaneum and Hordeum bulbosum immature embryo derived calli // Plant Cell Rep.- 1985 V.4.- N2.-P. 70-73.
97. Caligary P.D.C.,Powell W., Goodal V. The in vitrogenetics of barley {Hordeum vulare L.): Genetical analysis ofimmature emdryo response to 2,4-dichlorphenoxyacetic acid // Heredity.-1987.-V.59.-№2.-P.285-292.
98. Cattior-Reynaerts A., Jacobs M. "In vitro" culture of barley // Barley Genet. Newslett. 1978. - N8. - P.23-26.
99. Charmet G., Bernard S. Diallel analysis of androgenetic plant prodaction in hexaploid triticale (x Triticosecale. Witmarck) // Theor. Ahhl.Genet. 1984. -V.69. - N1. - P.55-61.
100. Chrzasted M., Mastowski J., Miazga D. Хромосомное картирование генов, контролирующих толерантность ржи к алюминию // Biul. Inst, hod i ak-linn. rosl.-1995.- №195-196.- P.313-316.
101. Clarkson D.T. Ineraction beetween A3 and P on root surface and cell wall material // Plant and soil. 1967. - V.22. - №3. - P.347.
102. Conner A.J., Meredith C.P. Simulating the mineral environment of aluminium toxic soils in plant cell culture // J.Exp.Bot. 1985a. - №36. - P.870-880.
103. Conner A J., Meredith C.P. Harde scale selection of aluminum-resistans mutants from plant cell culture expression and inheritence in seedlings // Teor. Appl. Genet. 1985b.- V.71.-№2.- P.159-165.
104. Conner A.J., Meredith C.P. Strategies for the selection and characterization of aluminum-resistant variants from cell cultures of Nicotiana plumbaginifolia // Planta.- 1985c.-V.166.- P.466-473.
105. Conner A.J. and Meredith C.P. Large scale selection of aluminum-resistant mutants from plant cell culture: expression and inheritance in seedlings // Theor. Appl. Genet.- 1985d.-№71.- P.159-165.
106. Cummings D.P., Green C.E., Stathman D.D. Callus indaction and plant regeneration from oats // Crop Sci. 1976. - V.16. - N4. - P.465-470.
107. Dale P.J., Deambrogio E. A cjmparisionof callus induction and plant regeneration from different explants of Hordeum vulgare // Z.Planzenphysiol. 1979. -V.94. - N1. - P.67-77.
108. Davies P.A., Pallota M.A., Ryan S.A. et al. samoclonal variation in wheat: genetic and cytogenetic characterisation of alcoholdehydrogenase 1 mutants // Ntor. Appl.Genet. 1986. - V.72. - N5. - P.644-653.
109. Deambrogio E., Dale P.J. Effects of 2.4-D on the frequency of regenerated plants in barley and on genetic variability between them // Cereal Res. Commun. -1980. V.8. - N2.- P.417-423.
110. Dunwell J.M., Innes J. Influence of genotipe and enveronment on growth of barley embryos in vitro // Ann.Bot.(London). 1981. - V.48. - N4. - P.535-542.
111. Donato C.P., Fontes L.A.N. Alguns aspectos sorbe a capacidade de troca cational radicular // Seiva.- 1983,- V.43.- №92.- P.16.
112. Fiskesjo J. Cytological effect of aluminium in plant nooots // Environ. Mol. Mutagenesis.- 1989.- V.14.- P. 6-61.
113. Foy C.D., Chaney R.L., Parberry D.G. Aluminium toxicity for plants // Annu. Rev. Plant Physiol.- 1978.- V.29.- P.511-566.
114. Foy C.D. Tolerance of barley cultivars to an acid aluminum-toxic subsoil relative to mineral element concentration in their shoots // Journal of plant nutrition.- 1996.- 19 (10&11).- P.1361-1380.
115. Green C.E., Philips R.L. Plant regeneration from tissue cultures of maize // Crop Sci. 1975. - V. 15. - N3. - P.417-421.
116. Haug A. Molecular aspects of aluminum toxicity // C.R.C. Crit. Rev. Plant Sci. 1984. -№l.-P.345-373.
117. Hairiah K., van Noordwijk M., Stulen I. and Kuiper P.J.C. Aluminium avoidance by Mucuna pruriens // Physiol. Plant.- 1992.- №86.- P. 17-24.
118. Hamel F. Aluminum toxicity: a relationship between the physiologial and molecular responses: Abstr. Plant Biol: 97. Vancouver, Ang. 2-6, 1997 // Plant Physiol. 1997.- V.114.- №3.- Suppl.- P.251.
119. Hecht-Buchholz C.H., Foy C.D. Effect of Al toxicity on root morphology of barley//Plant a. Soil.- 1981.-V.63.-№1.- P.93.
120. Huck M.G. Impairment of sucrose utilization for cell wall formation in the root Al damaged cotton seedings // Plant Physiol.Cell.- 1972.- V.13 P.7.
121. Jelaska S., Rengel Z., Cesar V. Plant regeneration from mesocotyl callus of Hordeum vulgare L. //Plant Cell Rep. 1984. - V.3. - N4. - P.125-129.
122. Jordan M.C., barter E.N. Somaclonal variation in triticale (x Triticosecale. Wittmarck) cv. Carmen// CanJ.Genet.Cytol. 1985. - V.27. -N2. - P. 151-157.
123. Kar D.K., Sen S. Effect of hormon on chromosome behaviour in callus of Asparagus racemosus // Biol.Plant. 1985. - V.27. - N1. - P.6-9.
124. Karp A., Maddock S.E. Chromosome variation in wheat plants regenerated from cultured immature embryos // Theor. Appl. Genet. 1984.- V.67.- P.249-255.
125. Keith R.D., Schott E.J., Sharma Y.K., Keith D.R., Gardner R.C. Aluminium enduces oxidative stress genes in Arabidopsis thaliana 11 Plant Physiol.- 1998.-V.l 16.- №1.- P.409-418.
126. Kinraide T.B. and Parker D.R. Apparent rhytotoxicity of mononuclear hy-droxy-aluminum to four dicotyledonous species // Physiologia plantarum.- 1990.-№79.- P.283-288.
127. Kinraide T.B., Ryan P.R., Kochian L.V. Interactive effects of Al3+, ЕГ and other cations on root elongation considered in terms of cell-surface electrical potential //Plant Phisiol.- 1992.-№99.- P. 1461-1468.
128. Kinraide T.B. Use of a Gouy-Chapman-Stern model for membrane-surface electrical potential to interpret some features of mineral rhizotoxicity // Plant Physiol.- 1994.- №106.- P.1583-1592.
129. Komatsuda Т., Enomoto S., Nakajima K. Genetics of callus proliferation and shoot differentiation in barley // J.Heredity.- 1989.- V.80.- №5.- P.345-350.
130. Komatsuda Т., Annaka Т., Oka S. Genetic mapping of aquantitative trait locus (QTL) that enhances the shootdifferentiation rate in Hordeum vulgare L. H Theor. Appl. Genet.- 1993.- V.86.- P.713-720.
131. Komatsuda Т., Taguchi-Shiobara F., Oka S. et al. Transfer and mapping of the shoot-diffrentiation locus Shd 1 in barley chromosome 2 // Genome.- 1995.-V.38.- №5.- P.1009-1014.
132. Koornneef M., Hanhart C.J., Martinelli L. // Theor. Appl. Genet.- 1987.-V.74.- №5.- P.633-641.
133. Kott L.S., Kasha KJ. Initiation and morphological development of somatic embryoids from barley cell cultures // Can. J. Bot.- 1984.- V.62.- №6.- РЛ245-1249.
134. Koyama H.,Okawara R., Ojima K., Yamaya T. Re-evaluation of characteristics of carrot cell line previously selected as aluminum-tolerans cells // Physiol. Plant.- 1988.-V.74.- P.683-687.
135. Koyama H., Ojima K., Yamaya T. Utilization of anhydroys aluminum phosphate as a sole source of phosphorus de a selected carrot cell line // Plant Cell Physiol.- 1990.- V.31.- P.173-177.
136. Rue C.D. Growth and regeneration of maize in culture // Amer. J. Bot. -1947. N34. - P.585.1.potto E. Callus induction and plant regeneration from barley mature embryos // Annals of botany. 1984. - V.54. - P.523-529.
137. Maddock S.E. Somaclonal variation in wheat // . Somaclonal variations and crop improvement (ed. Semal J.). Martinus Nijhoff publishers. Dordrecht (Boston) Lancaster. 1986. - P.l27-135.
138. McCoy T.J., Phillips R.L., Rines H.W. Cytogenetic analysis of plants regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures: high frequency of partial chromo-som loss // Can. J. Gen. Cytol. 1982. - V.24. - N1. - P.37-50.
139. McCoy T.J., Phillips R.L. Chromosome stability in maize (Zea mays) tissue culture and sectoring in some regenerated plants // Can.J.Genet. Cytol.- 1982.-V.24.- P.559-565.
140. McCoy T J., Phillips R.L., Rines H.W. Cytogenetic analysis of plants regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures: high frequency of partial chromosome loss // Can.J.Genet. Cytol.- 1982.- V.24.- P.37-50.
141. McMeilly T. A rapid method for screening barley for aluminum tolerance // Euphytica.-1982.- V.31.- P.237-239.
142. Meins F. Heritable variation in plant cell culture // Arm. Rev. Plant Physiol.-1983.-V.34.- P.327-346.
143. Meredith C.P. Response of cultivated tomato cells to aluminum // Plant Sci. Lett. 1978.-№.12.-P. 17-24.
144. Miyasaka S., Buta J., Howell R., Foy C. Mechanism of aluminum tolerance in snapbeans. Root exudation of citric acid // Plant Physiol.- 1991.- №96.- P.737-743.
145. Mumford F.E., Jensen E.L. Purification and characterization of phytochrome from oat seedlings // Biochem.- 1966.- V.5.- №11.- P.36-57.
146. Murachige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue //Physiol. Plant.-1962.- V.15.- P.473-497.
147. Nabors M.W., Heyser J.W., Dykes T.A. et al. Long-duration, high-frequency plant regeneration from cereal tissue cultures // Planta. 1983. - V.157. -P.385-391.
148. Nakamura C., Keller W.A. Callus proliferation and plant regeneration from immatura ambryos of hexaploid triticale // Z.Pflanzenzuchtg. 1982. - V.88. - N2. - РЛ 37-160.
149. Nesticky M., Novak F.I., Piovarci A. Dolezelova M. Al-induced, 51-kilodalton, membrane-bound proteins are associated with resistance to Al in asogregating population of wheat // Z.Pflanzenzuchtung.- 1983.-V.91.- №4.-P.265-344.
150. Noble A.D., Sumner M.E., Alba A.K. Comparison of aluminon and 8-hydroxyquinoline methods in the presence of fluorde for phytotoxic aluminum // Soil Sci.Soc.of Amer.J. 1988.- V.52.- P.1059-1063.
151. Oettler G., Wietholter S., Horst W.J. Genetic parameters for agronomic traits of triticale and other small-grain cereals grown on aluminium-toxic soil in southern Braziliy//Plant Breed.-2000.-l 19, №3.-P .227-231.
152. Ogihara Y. Tissue culture in Haworthia. Part 4:Genetic characterization of plant regenerated from callus // Theor. Appl. Genet.- 1981.- V.60.- P.353-363.
153. Ojima K., Koyama H., Suzuki R., Yamaya T. Characterization of two tobacco cell lines selected to grow in the presence of either ionic Al or insoluble Al-phosphate // Soil Sci. Plant Nutr.- 1989.- V.35.- P.545-551.
154. Orton T.J. A quantitative analysis of growth and regeneration from tissue cultures of Hordeum vulgare, Hordeum jubatum and their interspecific hybrid // Environm. Exp. Bot.- 1979. V. 19. - P.319-335.
155. Orton T.J. Spontaneous electrophoretic and chromosomal variability in callus cultures and regenerated plants of celery // Theor. Appl. Genet.-1983.- V.67.-P. 17-24.
156. Panpach M. Solubility of simple Al compaund expected in soil //Austr.J.Soil Res.-1963.-V.1.-P.46.
157. Peterson C.A. Exodermal Casparian bands: their significance for ion uptake by root // Physiol. Plant- 1988.- №72.- P.204-208.
158. Potrykus I. The old problem of protoplast culture cereals // Advances in protoplast research, proceedings of the V Internationale Protoplast Symp. Szed. 1979. Budarest. 1980. - P.243-254.
159. Reid D.A. Genetical control of reaction to aluminum in winter barley // Proceeding of second international barley genetics symposium. -1969.- P.409-413.
160. Rengel Z. Disturbance of cell Ca homeostasis as a primary trigger of Al toxicity syndrome // Plant Cell Environ.- 1992.- №15.- P.931-938.
161. Rincon M., Gonzales R.A. Aluminum partitioning in intact roots of aluminum-tolerant and aluminum-sensitive wheat (Triticum aestivum L.) cultivars // Plant Physiol.- 1992.-V.99.-P.1021-1028.
162. Ryan P.R., DiTomaso J.M., Kochian L.V. Aluminium toxicity in roots: an investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap // J. Exp. Bot.-1993.- V.44.-P.437-446.
163. Scheunert E.U., Shamina Z.B., Koblits H. Studies on barley callusses cultured in vitro. I. Establishment, maintenance and growth of two different tissue strains//Plant Sci. Lett. 1977. - V.10. - P.313-318.
164. Scoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro in SYM // Expl. Biol. 1957. - V. 11. - P. 118.
165. Shimada Т., Ymada Y. Wheat plants regeneranted from embryo cell cultares // Jap.J.Genet. 1979. - V.54. - N5. - P.379-385.
166. Shuman G.M., Wilson D.O., Duncan R.R. Screening wheat and sorghum cultivars for aluminum sensitivity at low aluminum levels // J.Plant Nutr.- 1993.-V.16.- №12- P.2383-2395.
167. Sing RJ. Chromosomal variation in immature embryo-derived callussed of barley (Hordeum vulgare L.) // Teor. Apll. Genet. 1986. - V.72. - N5. - P.710-716.
168. Somers D.J., Briggs K.G., Butles E., Gustafson J.P. The search for molecular markers linked to aluminium tilerance in cereals // Induced Mutat. and Mol. Techn. Grop Improv : Proc. Int. Symp. Vienna, 19-23 June.- 1995.- P.335-345.
169. Somers D.J., Gustafson J.P. Экспрессия индуцируемых алюминиевым стрессом полипептидов в популяции Triticum aestivum, выщепляющая признак толерантности к алюминию // Genome.- 1995.- V.38.- №6.- Р. 1213-1220.
170. Subba Rao M.V., Notzsche W. Cenotypic difference in callus growth and organogenesis of eight peal millet lines //Euphytica. 1984. - V.33. - N3. - P.923-928.
171. Tamas L., Huttova J. Effect of pH and some metals (Al, Cu, Cd and Co) on root growth of barley // Pol'nohospodarstvo 46.- 2000.-№10.-P.725-732.
172. Taniguchi M., Enomoto S., Komatsuda T. et al. Varietal differences in the ability of callus formation and plant regeneration from mature embryos in barley {Hordeum vulgare L.) // JapJ.Breed. -1991.- №41.- P.571-579.
173. Taylor J. Mechanisms of aluminum in Triticum aestivum L.(wheat). V.Nitrogen nutrition, plan-induced pH, and tolerance to aluminum; correlation without causality? // Can.J.Bot. 1988.- №66.- P.694-699.
174. Taylor J. 1.Current views of the aluminum stress response; the physiological basis of tolerance. In Current Topics in Plant Biochemistry and Physiology. 2.Ultraviolet-B Radiation Stress, Aluminum Stress, Toxicity and Tolerance, Boron
175. Requirements, Stress and Toxicity // Interdisciplinary Plant Biochemistry and Physiology Program, University of Missouri-Columbia, US.- 1991- V.lO.Eds. D.D. Randall, D.G. Blevins and C.D. Miles.- P.57-93.
176. Taylor G.J., Foy C.D. Mechanisms of aluminum tolerance in Triticum aesti-vum L. (wheat) I. Differential pH induced by winter cultivars in nutrient solutions //Am. J.Bot. 1985a.- №72.- P.695-701.
177. Taylor G.J., Foy C.D. Mechanisms of aluminum tolerance in Triticum aesti-vum L. (wheat) 2. Differential pH induced by spring cultivars in nutrient solutions // Am. J.Bot. 1985b.- №72.- P.702-706.
178. Taylor G.J. Overcoming barriers to understanding the cellular basis of aluminium resistance // Plant and Soil.- 1995.- V.171.- №1.- P.89-103.
179. Tomas M.R., King P.J., Potiycus I. Shoot and embryolike structure formation from cultured tissues of Sorghum bicolor // Naturwiss. 1977. - Bd.64. - N9. -P.587.
180. Tomas M.R., Scoot K.J. Plant regeneration by somatic embriogenesis from callus initiated by immature embryos and immature inflorescences of Hordeum vulgare//J. Plant Phisiol. 1985. - V. 121. - N 2. - P. 159-169.
181. Van Sint jan Veroniguc, Costade Macedo Cristiam, Kimt Jean-Marie, Bou-harmont Jales. Selecton of Al-resisnant plant from a sentive rice cultivars, using somaclonal variation, in vitro and hydroponic cultures // Eupytica. 1997. - V.97. -N3. - P,303-310.
182. Vasil I.K., Vasil V., Lu C. et al. Somatic embryogenesis in cereals and grasses // Variability in plants regenerated from tissue culture (eds. Earle E., De-marly Y.). Praeger, New York. 1982. - P.21.
183. Vasil I.K. Somatic embryogenesis and its consequences in the Grameneae //Tissue Cult. Fcest and Agr. Proc. 3rd. Tenn. Symp. Plant tissue and cell culture. Knoxville. Tenn. 9-13 Sept. 1984. - New York, London, 1985. - P.31-47.
184. Vasil I.K. Developing Cell and Tissue Culture System for the Improvement of Cereal and Grass Crops // J.Plant Physiol.- 1987,- P.193-218.
185. Wagatsuma Т., T.Kynuda., A.Sakuraba. Aluminium accumulation characteristics of aluminum-tolerant plant // Bulleten of the Yamagata University Agricultural Science.- 1987,- V.10.- №2.- P.355-359.
186. Wagatsuma Т., Kawashima Т., Tawaraya K. Comparative stainability of plant root cell with basic gye (methylene blue) in association with aluminum tolerance // Cominum in Soil Sci Plant Anal. 1988.- V.19.- №7-12,- P. 1207-1215.
187. Wagatsuma T. and Akiba Rie. Low surface negativity of root protoplasts from aluminum-tolerant plant species // Soil Sci. Plant Nutr. 1989 - V.35 - N°3 -P.443-452.
188. Wagatsuma Т., Ishikawa S., Obata H., Tawaraya K. and Katohda S. Plasma membrane of younger and outer cells is the primary specific site for aluminium toxicity in roots // Plant and Soil.- 1995.- V. 171.- P. 105-112.
189. Wernike W., Brettell R. Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor leaves // Nature. 1980. - V.287. - N5778. - P.138-139.
190. Wood M., Cooper J.E. Aluminium toxicity and multiplication of Rhizobium trifolii in a defined growth medium // Soil, and Biochem. 1984.- V.16.- №6.-P.571-576.
191. Wood M. A mechanism of aluminum toxicity to soil bacteria and possible ecological implication. //Plant and SoiL-1995.-V. 171.-№ l.-P. 63-69.
192. Zhuqing L., Ming Wei. Gao. Реакция различных генотипов пшеницы при культивировании соматических тканей // Sci. Agr. Sin.-1986.-V.2.-P.42-48.
193. Zhang X., Jessor Robin S., Ellison F. Differential genotipic tolerance re-sponce to manganese stress in triticale // Commun. Soil Sci. and Plant Anal.-1999.-V.30.-№ 17-18,-P.2399-2408.
-
Шуплецова, Ольга Наумовна
-
кандидата биологических наук
-
Киров, 2003
-
ВАК 03.00.23
- Исходный материал для селекции ярового ячменя в условиях Европейского Севера РФ
- Изучение исходного материала ярового ячменя на устойчивость к стрессовым факторам среды
- Влияние различных чередований способов и глубины основной обработки в зернопропашном севообороте на плодородие типичного чернозема и урожайность ярового ячменя
- Оптимизация элементов технологии возделывания ярового ячменя в условиях лесостепной зоны Ингушетии
- Влияние мелиорантов и минеральных удобрений на продуктивность ярового ячменя на черноземе обыкновенном Саратовского Правобережья
