Соматический мозаицизм у человека и мыши по данным мультилокусного маркирования ДНК

Бутовская, Полина Руслановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Соматический мозаицизм у человека и мыши по данным мультилокусного маркирования ДНК
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Соматический мозаицизм у человека и мыши по данным мультилокусного маркирования ДНК"

На правах рукописи

БУТОВСКАЯ ПОЛИНА РУСЛАНОВНА

СОМАТИЧЕСКИЙ МОЗАИЦИЗМ У ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ ПО ДАННЫМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО МАРКИРОВАНИЯ ДНК

специальности: 03.02.07 - генетика, 03.01.07- молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 0 СЕН 2010

Москва 2010

004609684

Работа выполнена в лаборатории организации генома и лаборатории нейрогенетики и генетики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Павлова Галина Валериевна,

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крамеров Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Куликов Алексей Михайлович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН.

Ор

Защита диссертации состоится «¿С» [О 2010 г. в / У "часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/: e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Рысков Алексей Петрович

кандидат биологических наук ele0806@vandex.ru

Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии, например, путем участия в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002). Встает вопрос, не играют ли эти последовательности определенную роль в спецификации клеток, в клеточной дифференцировке.

Очевидно, эксперименты в рамках этой концепции направлены на выявление геномных различий между специализированными клетками и их предшественниками. В биологических системах описано такое явление, как соматический мозаицизм, что означает присутствие в одном организме генетически различных популяций соматических клеток. Структурные изменения в ДНК злокачественно трансформированных клеток - наиболее известный пример соматического мозаицизма (1опоу е! а!., 1993). Его причинами могут служить как генетические, так эпигенетические события (\Пк1а е1 а1., 2001). Причиной соматического мозаицизма могут быть потеря гетерозиготности путем митотической рекомбинации, хромосомная нестабильность, изменения в микросателлитных локусах (Сауепее е1 а1., 1983; Ьеп§аиег е1 а!., 1998). В то же время, имеется очень мало данных о соматическом мозаицизме в нормальных тканях.

Таким образом, актуальным является выявление возможных различий в строении ДНК разных органов и тканей на уровне индивидуального организма.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является изучение феномена соматического мозаицизма в нормальных органах и тканях млекопитающих с помощью методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (ЯАРВ-РС11) и мультилокусного ДНК-фингерпринтинга.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать варианты ЯАРО-анализа для получения информативных амплификационных спектров ДНК органов и тканей человека и мыши.

2. Исследовать ДНК, выделенную из органов и тканей эмбрионов человека, методами ДНК-фингерпринтинга и ЯАРВ-РСК с целью выявления соматического мозаицизма на уровне индивидуального организма.

3. Исследовать ДНК органов и тканей взрослых мышей методом RAPD-PCR с целью выявления соматического мозаицизма у индивидов разных линий.

4. Оценить наблюдаемые эффекты геномных изменений на модели длительно пассируемых клеточных культур с помощью RAPD-анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые обнаружена соматическая изменчивость ДНК в нормальных тканях эмбрионов человека и мыши методами RAPD-PCR и ДНК-фингерпринтинга. Показано, что возникновение соматического мозаицизма происходит с довольно высокой частотой и носит случайный характер.

Впервые показана измечивость PARD-спектров клеточных культур при длительном пассировании (мезенхимные прогениторные клетки костного мозга человека, стромальные клетки жировой ткани человека, клетки фибробластов человека).

Эти результаты имеют фундаментальный характер и вносят важный вклад в изучение проблемы соматического мутагенеза.

Практическая значимость результатов связана с разработкой эффективного варианта RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека и выявления генетических изменений при их длительном пассировании (Заявка на патент «Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования» No 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года).

Метод может найти применение в медицине для изучения клеточных аномалий (в том числе онкологических), контроля генетической стабильности клеточных культур, используемых в качестве источника материала для клеточной терапии и регенерации тканей, а также паспортизации клеточных линий с целью их юридического правообладания.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 11-th PhD meeting in evolutionary Biology. Bordeaux. France. 2005; IV International conference Molecular genetics of somatic cells. Zvenigorod. Russia, 2005; 12-th PhD meeting in evolutionary Biology. St.Andrews. Skotland. 2006; 13-th meeting in evolutionary Biology. Lund. Sweden. 2007.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 2, заявка на патент - 1, тезисов докладов и материалов конференций - 3.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 98 страницах, содержит 14 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего в себя 125 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования были использованы следующие животные и материалы:

1. Мыши линий СВА, С57КС и 101 предоставленные И.И. Полетаевой (Биологический факультет МГУ);

2. Образцы ДНК органов и тканей четырех эмбрионов человека предоставленные B.C. Барановым (Институт акушерства и гинекологии им. Отто, Санкт-Петербург);

3. Первичные культуры клеток - мезенхимные прогениторные клетки мозга человека любезно предоставленные Рубинной .

Эксперименты по ДНК-фингерпринтингу выполнены совместно с И.А. Мартиросян (ИБГ РАН, лаб. Организации генома) как это описано ранее (Tokarskaya et al., 2001). Методика включала в себя обработку ДНК рестриктазой Hinf I ,депротенизацию гидролизата смесью фенол-хлороформ, электрофоретическое фракционирование ДНК в 0,8 % агарозном геле, перенос (блоттинг) ДНК из геля на нейлоновую мембрану Hybond N, молекулярную гибридизацию ДНК на мембране с Р32-мечеными олигонуклеотидами, радиоавтографию мембран.

Полимеразную цепную реакцию со случайными праймерами (RAPD) проводили, используя набор Gene Pak PCR Core («Лаборатория Изоген»), В качестве праймеров использовали 10-членные олигонуклеотиды различного состава, по методике производителя. В четырехканальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«Терцию>.

ДНК выделяли из ядер клеток (Mathew, 1984) с добавлением додецилсульфата натрия (до 1%) и протеиназы. К (50-100 млг/мл); делротеинизировали ДНК смесью фенол-хлороформа и осаждали 2 объемами этанола. Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) выделяли из жировой ткани, полученной в ходе полостных операций у неонкологических больных с письменного согласия каждого пациента в соответствии с требованиями этического комитета. СКЖТ мыши были выделены из подкожной жировой клетчатки мышей линий Ыаскб и black-GFP обоих полов в возрасте 8-12 недель. Жировую клетчатку измельчали и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) и диспазы. Инкубировали при 37°С в течение 45 мин. Затем добавляли среду DMEM, 10% ЭБС и центрифугировали при 200g в течение 5 минут. В осадочной фракции эритроциты лизировали деионизированной водой. После добавления 10Х объема DMEM клетки фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм («BD Falcon», США). Клетки высаживали в количестве 5х104/см3 и инкубировали при 37°С, 5% С02. СКЖТ мыши культивировали в среде DMEM, 10% ЭБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина. СКЖТ человека в среде (Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone) +10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone).

Получение культуры фибробластов кожи человека проводили совместно с Е.Ю.Рыбалкиной . Культуру клеток дермальных фибробластов выращивали в

среде роста фибробластов (DMEM / 10% ЭТС /10 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco) в одноразовых пластиковых флаконах (Corning Costar) в стерильных условиях культурального бокса в инкубаторе при 37°С при 5% концентрации С02. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки пассировали. Для этого монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА (Gibco). Суспензию открепившихся от подложки клеток рассаживали в соотношении 1:3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление соматического мозаицизма у человека 1.1. Использование мулыпилокусного ДНК-фингерпринтинга Одним из методов выявления соматического мозаицизма является мультилокусный ДНК-фингерпринтинг органов и тканей индивидов. Впервые этот подход был использован для выявления микросателлитных мутаций в ДНК раковых тканей (Armour et al., 1990).

В настоящей работе с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга впервые выявлены случаи соматического мозаицизма у эмбрионов человека. В экспериментах с применением ДНК-фингерпринтинга было использовано четыре олигонуклеотидных зонда (GATA)4, (GACA)4, (САС)5, (GGCA)4 в сочетании с рестриктазой Hinfl. Анализировали суммарную ДНК, выделенную из частей органов, тканей и органов четырех эмбрионов человека (14 недель). Фингерпринтные спектры были одинаковы у всех исследованных образцов ДНК при использовании зондов (GATA)4 и (GGCA)4. Однако определенные различия в спектрах были выявлены при использовании (GACA)4 и (CAC)j. На рис. 1А приведены результаты ДНК-фингерпринтного анализа органов и тканей эмбрионов человека с использованием зонда (САС)5. Изменения были обнаружены в образцах ДНК, выделенных из зачатка позвоночника (эмбрион I, 4) и зачатка глаза (эмбрион III, 18). При использовании олигонуклеотидной пробы (GACA)4 изменение ДНК-фингерпринтного спектра было обнаружено у эмбриона I в образце ДНК, выделенном из хориона (рис. 1Б, 6).

Таким образом, соматический мозаицизм по ДНК-фингерпринтным спектрам был выявлен у двух из четырех исследованных эмбрионов человека, причем для одного из них он детектировался обоими зондами, но в ДНК разных органов. В целом, данные свидетельствуют о высокой стабильности фингерпринтных спектров и отсутствии повышенной их изменчивости в каких-либо конкретных органах. Можно предположить, что с помощью других зондов будут обнаруживаться изменения фингерпринтных спектров в ДНК многих органов и тканей. Следует также отметить, что электрофорез в 1% агарозном геле не выявляет сравнительно небольшие (< 250 п.н) различия в размерах рестрикционных фрагментов. Это означает, что частота соматической изменчивости фингерпринтных спектров может быть значительно выше.

Hinfl - (CAC)s Hinfl - (GACA)i

I II 111 IV I II

Рис. 1. Фингерпринтный анализ ДНК, выделенной из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека (14 недель)

В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК фага А,, гидролизованную рестриктазами Hind III и Eco RI. I - IV - отдельные индивиды; измененные фрагменты показаны стрелками.

А. Сочетание рестриктазы Hinfl и зонда (САС)5; зачатки: 1-печени, 2-желудка, 3-руки, 4- позвоночника, 5-хорион, 6-сердца, 7-легких, 8-печени, 9-надпочечников, 10-хорион, 11-легкого, 12-хорион, 13-надпочечников, 14- пуповина, 15-толстого кишечника, 16-почек, 17-тонкого кишечника, 18-глаза, 19-глаза, 20-хорион;

Б. Сочетание рестриктазы Hinfl и зонда (GACA)4: зачатки: 1-печени, 2-желудка, 3-руки, 4-позвоночника, 5-мозга, 6-хорион, 7-сердца, 8-легких, 9-печени, 10-надпочечников, 11-хорион, 12-почек.

Информации о соматическом мозаицизме в нормальных тканях в литературе явно недостаточно. С помощью ДНК-фингерпринтинга случаи соматического мозаицизма были выявлены у мышей и ящериц (Tokarskaya et al., 2004, Рысков и др., 2004). Наши данные находятся в соответствии с результатами этих работ. Молекулярная природа соматической изменчивости остается неясной. Метод ДНК-фингерпринтинга выявляет различия в электрофоретической подвижности рестрикционных фрагментов ДНК, детектируемых микросателлитными зондами. Однако различия в размерах самих микросателлитных кластеров, которые обычно невелики (в среднем 60 п.н.), не будет заметно влиять на подвижность крупных рестрикционных фрагментов в агарозном геле. Это означает, что наблюдаемые изменения в фингерпринтных спектрах связаны с точковыми мутациями или модификациями в сайтах рестрикции ДНК, приводящими к полиморфизму длины рестрикционных фрагментов, либо к крупным реорганизациям, делециям, инсерциям в локусах, содержащих микросателлитный кластер. В настоящее время получены данные о том, что в прилежащих к

микросателлитам зонах ДНК часто обнаруживаются однонуклеотидные замены (КогсЬа§т е1.а1„ 2007; Рысков и др., 2009).

1.2 Использование полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (КАРБ-РСИ)

С помощью ИАРБ-РСЯ проводили изучение тех же образцов ДНК эмбрионов человека (за исключением индивидуума I). В предварительных экспериментах было протестировано 27 олигонуклеотидных праймеров, различающихся содержанием вС-пар. В результате были отобраны 8 праймеров со стабильным, хорошо воспроизводимым в повторных экспериментах, спектром амплификации. Шесть из них (ОРА1, ОРАН, ОРА17, 8В2, Р29, Р92) на исследуемых образцах ДНК давали мономорфные спектры в ЛАРВ-анализе. Профили амплификации, полученные при использовании этих праймеров, приведены на рис. 2. Как можно видеть, некоторые праймеры (ОРА1, Р29, Р92) дают достаточно большой набор амплификантов размером от 200-2000 п.н., другие продуцируют меньшее число фрагментов примерно в том же интервале размеров. Важно отметить, что в повторных экспериментах эти праймеры давали хорошо воспроизводимые спектры амплификации, и это свидетельствует о надежности метода и достоверности результатов.

Различия в спектрах амплификации ДНК разных органов были получены при использовании праймеров Я45 и 447 и были обнаружены только у эмбриона II (рис. 3).

В результате амплификации с использованием праймера Я45 в области электрофоретической подвижности 380 п.н. в ЯАРБ-спектре ДНК, выделенной из зачатка глаза, обнаруживается мажорная дополнительная полоса, отсутствующая в спектрах других образцов. В случае ЯАРО-РСК этих же образцов ДНК с праймером 447 в амплификационных профилях зачатков хориона, пуповины и глаза (дорожки 1, 4 и 8) можно видеть появление дополнительной четкой полосы размером примерно 300 п.н. (показано стрелкой). Следует отметить, что в обоих случаях дополнительные амшшфиканты в повторных экспериментах на тех же образцах ДНК хорошо воспроизводились, что может отражать реальные вариации в структуре исследованных ДНК.

OPA 1

II! IV

M2 mi ,—

OPA 11

III IV

OPA 17

3 5 7 9 11 13 15

1 3 5 7 9 II 13 15

1 3 5 7 9 11 13 15

SB 2

ui " m iv .„

Ml I-1—--1-1 M2

-V «

гзиаг-а-ваавзЕвш!

~ У к —:

: - v , -

^'^ЯНЯИИИЩнШИИИИЯЮИивИШш

1 3 5 7 9 11 13 15

Рис. 2. RAPD-анализ образцов ДНК выделенных из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека. 1-15 дорожки с образцами ДНК.

Индивидуум II: зачатки: 1-сердца, 2-легких, 3-печени, 4-надпочечников, 5-хорион. Индивидуум III: зачатки: 6-легкого, 7-тонкого кишечника, 8-хорион, 9-надпочечников, 10-пуповина, 11-толстого кишечника, 12-почек, 13-глаза.

Индивидуум IV: зачатки: 14-хорион, 15-глаза. Ml и М2 - молекулярные маркеры массы 100 bp Ladder+ и 1 kb Ladder ("Fermentas").

P 29 P 92

Л_hi iv ,„ „,, и ш iv

-1-1-1 -i-'. Ml i-1-1-1 M2

* V»

- ií ■ . w - w .. .. p

ь м м ц щ tin e ifettüftii ÍÍ p

*ffifi|fw

I 3 5 7 9 11 13 15 I 3 5 7 9 II 13 15

Сравнение результатов, полученных с использованием двух различных методов - мультилокусного ДНК-фингерпринтинга и КАРБ-РСЯ анализа, показывает, что оба метода детектируют соматическую изменчивость в анонимных участках генома с высокой частотой (у трёх из четырёх исследованных эмбрионов). Можно предположить, что соматический мозаицизм на уровне ДНК присущ каждому индивиду, носит случайный характер и для его обнаружения требуется лишь повысить эффективность анализа, например, увеличением количества исследованных локусов или использованием крупноблочного секвенирования ДНК. Неясным остается вопрос, связаны ли соматические изменения ДНК нормальных тканей со специфическими структурными особенностями организации конкретных участков генома или они распределены случайным образом в ДНК.

Природа таких вариаций остается неясной. Изменение подвижности или появление/утрачивание фрагментов ДНК в КАРБ-спектрах может быть связано с геномными перестройками или мутациями, затрагивающими участки комплементарного связывания ДНК с олигонуклеотидными праймерами.

Мутации также могут влиять на эффективность амплификации ДНК, что будет изменять представленность амплификанта в НАРБ-спектре, и выражаться в утрате или уменьшении интенсивности конкретной полосы в спектре. Аналогичный эффект может возникать при амплификации участков ДНК, различающихся по копийности в разных органах и тканях одного индивида, а также при амплификации дивергированных копий повторов одного семейства. Очевидно, для определения молекулярной природы соматической изменчивости ЯАРБ-спектров необходима расшифровка первичной структуры соответствующих фрагментов ДНК.

447 II

12 3 4 5 6 7 8

.«у

-в"*«

¡0- т>

П.Н.

2000 1500

250

R45 II

1 2 3 4 5 6 7

1 П.Н.

Г i-iíS ..„,»: ф^, Щ» i- тщ ■«•* т» К • ; j¡ alii ! - aw * • у* Т ^ \ |Ш|. |||. Щ (S 51 mm

« • •. t f,. Ш Ф ■ IS

2000 1500

1000

750

500

250

Рис. 3. RAPD-анализ образцов ДНК выделенных из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека.

А. (индивид II, праймер 447): зачатки: 1-хорион, 2-надпочечников, 3-легкого, 4-пуповина, 5-тонкого кишечника, 6-толстого кишечника, 7-почек, 8-глаза.

Б. (индивид II, праймер R45): зачатки: 1-хорион, 2-надпочечников, 3-легкого, 4-пуповина, 5-тонкого кишечника, 6-глаза, 7-тонкого кишечника.

М - молекулярный маркер массы I kb Ladder ("Fermentas"). Различия показаны стрелками

2. Выявление соматического мозаицизма у мыши с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (КАРБ-РСК)

С помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами проводили изучение образцов ДНК органов и тканей взрослых мышей. Было проанализировано 99 образцов ДНК органов 18 особей линий С57КС, СВА и 101.

На рисунке 4 в качестве примера представлены результаты RAPD-анализа ДНК разных органов четырех мышей линии С57КС, с праймерами ОРАЮ, ОРА17, Р29 и Р92, дающими мономорфные амплификационные спектры.

Спектры амплификации, полученные с помощью этих праймеров, содержали 6-8 фрагментов ДНК размером 2000-2500 п.н. Они были одинаковыми для всех исследованных ДНК независимо от типа спектра. Отличия некоторых спектров на рис. 4, например, дорожки 3 и 6 особи I (OPA 17) или дорожки 5 и 6 особи IV (OPA ¡7), носили технический характер, и при повторных экспериментах они не отличались от большинства спектров. В целом, получаемые картины RAPD-спектров были хорошо воспроизводимы. Аналогичные эксперименты с этими праймерами были проведены на ДНК, выделенной из разных органов мышей линий СВА и 101, соматической изменчивости RAPD-спектров выявлено не было (данные не приведены).

ОРАЮ OPA 17

I И III IV Г~-!-1-Г-1

М1 3 51 3 5 13 5 Т 35

... „ ^ ' m ~ ^ Р29

I II III IV

I-1-1-1-1

M13S135 13513S

5-*á»bjií>j|t#§#«f>f ém»l|4fc¿»« -

-W

Щ .iSSÍVÍ

I II III IV

I-1-i-1-——I

M13 5 135135135

•fMflfiftfl!5?»?!!'^

^•■*«t»i>liiaaiM«iiiai.-

P92

i и ni IV

м1 3 5 1 3 5 Г1 3 5 r¡ 3 5 '

Рис. 4. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных органов взрослых мышей линии С57КС (особи I, II, III, IV), с использованием праймеров: ОРАЮ, ОРА17, Р29, Р92. 1-кожа, 2-легкие , 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6-сердце. М - маркер молекулярной массы 100 Ьр Ladder+ («Fermentas»).

На рисунке 5 представлены результаты ЯАРО-анализа ДНК разных органов мышей линий 101, СВА и С57КС с праймером Р45. Соматические изменения спектра амплификации были обнаружены у ряда особей этих линий (показано стрелками). Среди 10 особей линии 101 (51 образец ДНК разных органов) изменение спектра амплификации выявлено у трех особей (V , VII , IX, показано стрелками.) У особи V (3) в ДНК, выделенной из сердца,

наблюдалось появление дополнительной полосы размером примерно 550 п.н. У особи 101 VII (1) наблюдалось появление дополнительной полосы размером примерно 1200 п.н. в ДНК, выделенной из легких. У особи IX (3 и 6) в образцах ДНК, выделенных из сердца и гонад, было выявлено появление дополнительных полос размером примерно 1500 п.н. У мышей линии СВА (4 особи, 24 образца ДНК разных органов) изменения спектра амплификации было обнаружено у особей I и III. У особи I (14) наблюдалось появление дополнительной полосы размером около 450 п.н., а также изменения в подвижности нескольких полос, размером около 900 - 1200 п.н.

А Б

.. 101, ГУ 101. V 101. УД 101, К 101. УШ CBA.I

I , . „ ..

' ¿й .. • № ' ■ т - -

1 3 5 1 3 5 1 3 5 13579 11 13 15

CBA.I СВА, Ш СВА, ГУ C57KC.I С57КС.П С57 КС, Ж М|-1-1-1 Ml-1-1-1

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 1 3 5 1 3 5 1 3 5

Рис. 5. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных тканей и органов взрослых мышей, с использованием праймера R45.

A. Линия 101 (особи IV, V, VII). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4-мозг, 5-почки, 6-гонады.

Б. Линия 101 (особи IX, VIII). Линия СВА (особь I). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4-мозг, 5-почки, 6-гонады, 7-легкие, 8-печень, 9-сердце, 10-мозг, 11-почки, 12- легкие, 13-печень, 14- кишечник, 15-сердце, 16-мозг.

B. Линия СВА (особи II, III, IV). 1-кишечник, 2-легкие, 3-печень, 4-сердце, 5-мозг, 6-почки, 7-кожа, 8-кишечник, 9-печень, 10-сердце, 11-мозг, 12-почки, 13-гонады, 14-кишечник, 15-печень, 16-сердце, 17-мозг, 18-почки, 19-кожа.

Г. Линия С57КС (особи I, 11, III). 1-кожа, 2-легкие , 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6-сердце. М - маркер молекулярной массы 100 bp Ladder+ («Fermentas»),

У особи III линии СВА (дорожка 8) изменение амплификационного спектра выражалось в появлении дополнительной мажорной полосы размером около 450 п.н., а также в изменении подвижности одной из полос размером около 1200 п.н. Из 24 проанализированных образцов ДНК разных органов мышей линии С57КС (4 особи) только у особи I линии С57КС (дорожка 1) в образце ДНК, выделенном из кожи, было обнаружено изменение подвижности минорного фрагмента размером около 450 п.н. Во всех перечисленных случаях изменения RAPD-спектров были получены подтверждающие результаты в повторных экспериментах. На рис. б представлены типичные результаты RAPD-анализа ДНК разных органов мышей линий 101, СВА и С57КС с праймером 447, также дающим полиморфные спектры амплификации. У особей линии 101 соматических различий выявлено не было (VIII и IX). Идентичные RAPD-спектры были получены для всех исследованных образцов ДНК. В то же время достоверные изменения спектра амплификации были обнаружены у особей линии С57КС и СВА.

Среди проанализированных образцов ДНК четырех мышей линии СВА (24 образца ДНК разных органов) изменения по мажорным полосам амплификационного спектра обнаружено у особей I и III (показано стрелками). У особи I линии СВА (дорожка 13) наблюдалось появление дополнительной полосы размером около 700 п.н. и изменение подвижности фрагмента размером около 900 п.н. в образце ДНК кишечника. В образце ДНК, выделенной также из кишечника у особи III линии СВА (дорожка 10) наблюдалось появление мажорных фрагментов размером около 550 и 700 п.н. (рис. 6Б, показано стрелками).

На рисунке 6В представлены типичные результаты RAPD-анализа ДНК разных органов четырех мышей линии С57КС. На фоне хорошо воспроизводимого, практически идентичного, RAPD-спектра для большинства изученных образцов ДНК, изменение, выражающееся в появлении дополнительной полосы размером около 250 п.н., было обнаружено только у особи II линии С57КС (дорожка 3) в ДНК, выделенной из мозга (показано стрелкой). В RAPD-спектре этого образца ДНК наблюдается также заметное уменьшение интенсивности полосы размером около 800 п.н.

Следует отметить, что использование праймера 447 позволило выявить соматическую изменчивость RAPD-спектров лишь у 3 особей из 18, однако они касались мажорных фрагментов и были вполне достоверны. При использовании двух праймеров (R45 и 447) соматические различия в ДНК были обнаружены у 7 особей из 18, и они носили случайный характер.

Поскольку данный вариант RAPD-метода позволяет выявлять различия в ДНК отдельных индивидов, то он может быть использован и для геномной паспортизации клеточных культур, для контроля их стабильности и генетической изменчивости при длительном пассировании.

101, VIII 101, IX СВА, I А М|-1-1-

■ i ! v: • • « - л-л> • • l§f

«g jjS JS SS 3B& SS SSt SSk JS» JS5 »«Г tSSf

Б МГ

1 3 5 7 9 11 13 15 СВА, II СВА, III СВА, IV

-- - У

—Jü'

> м ^ Mt ■ 2^"*"*' —»

i SS S ¡5 ■■■ Cw «

■ - ™ ^ :. w ЯМ» M M M ■

«Я V

В Mr

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 C57 КС, II C57 КС, III C57 КС, IV

____х _

1 3 5 1 3 5 1 3 5

Рис. 6. RAPD-анапиз образцов ДНК, выделенных из разных тканей и органов взрослых мышей, с использованием праймера 447.

A. Линия 101 (особи VIII, IX). Линия СВА (особь I). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4-мозг, 5-почки, 6-гонады, 7-печень, 8-сердце, 9-мозг, 10-почки, 11-гонады, 12- легкие, 13-кишечник,14-печень, 15-сердце, 16-мозг

Б. Линия СВА (особи II, III, IV). 1-кишечник, 2-легкие, 3-печень, 4-сердце, 5-мозг, 6-почки, 7-кожа, 8-кишечник, 9-печень, 10-сердце, Il-мозг, 12-почки, 13-гонады, 14-кишечник, 15-печень, 16-сердце, 17-мозг, 18-почки, 19- гонады.

B. Линия С57КС (особи II, III, IV). 1-кожа, 2-легкие, 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6-сердце. В качестве маркера молекулярной массы использовался 100 bp Ladder+ («Fennentas»).

3. КАРБ-анализ клеточных культур на разных стадиях пассирования

Для исследования использовались клеточные культуры различного происхождения: мезенхимные прогениторные клетки человека, стромальные клетки жировой ткани человека и клетки фибробластов человека. Клетки были взяты у нескольких пациентов, и изучалось влияние длительного пассирования на их генотип. Для этого проводили ЛАРБ-типирование ДНК клеток, взятых на разных стадиях пассирования, с использованием трех РСЛ-праймеров, оказавшихся наиболее эффективными при анализе соматического мозаицизма у человека. В качестве нулевого пассажа считали культуру клеток, не прошедшую смену питательной среды, первым пассажем - первый пересев клеточной культуры. Результаты амплификации образцов ДНК с праймером Р29 представлены на рисунке 7. ЛАРО-спектры представлены в среднем 6-8 фрагментами в пределах от 300 до 1500 п.н. Оказалось, что в абсолютном большинстве случаев ЛАРО-спектры различных культур (№1-23) были одинаковыми (сравнивали между собой пассажи 0 и 1). Отличия на некоторых спектрах (например, №18- дорожка 1, №20- дорожка 1, МСК - дорожка 1) в повторных экспериментах не подтверждались и поэтому не принимались во внимание. При рассмотрении ЛАРБ-спектров различных пассажей одной и той же клеточной культуры также не было обнаружено каких-либо достоверных различий. Уже упомянутые выше вариации (№ 20- дорожки 1, 5, 10) не подтверждались в повторных экспериментах. В частности, следует отметить, что в наших экспериментах смена среды культивирования не влияла на ЛАРБ-спектры (№ 14- дорожки 10*, 10*). Таким образом, с помощью праймераР29 не удавалось выявить достоверных различий в ЛАРБ-спектрах исследованных ДНК.

Результаты ЛАРБ-анализа тех же образцов ДНК с праймером Л45 представлены на рис. 8. Спектры амплификации содержали около 8 фрагментов размером 300-1500 п.н. В большинстве случаев спектры ДНК разных пассажей были сходными. Отдельные отличия - они касались главным образом минорных полос - при повторных экспериментах воспроизводились лишь частично. Это касается двойных полос размером примерно 600 п.н, интенсивность которых менялась, вплоть до исчезновения, и плохо воспроизводилась. Вариации минорных полос в районе более 1000 п.н. в повторных экспериментах также плохо воспроизводились, и мы считали их недостоверными. В целом, можно полагать, что праймер Л45 выявляет небольшой полиморфизм минорных фрагментов, и это может быть связано с полиморфизмом минорных популяций клеток в культуре.

Р29

08 12 16 20 048 12 048 07048 1 48 12 1 5

1500 - -1000 — 750- '

500250-

«-t |М| íl ti 2 -

m M **

4M «* mà <M <M <—

«А «M да™

... «à —

•Ж ir ni

i» IM fas

»*,«< »»<* ■#«# sees»

Щ ft фт #m

• - 3000 ■ - 2000

- 1500

- 1031 -700 -500

-300

- 200

№1

№2 №3 №4 №5 MCK №16

1 3 5 10 20 10 10 1 6 9 1 5 10 0 5 0 5 1 5 10 0 5 16

1500 -

1000750500 -

250-

z g щ щ a ts

,, . «¿pltlSii

* чР 1

I w ш

hi "

- 3000

- 2000

- 1500

- 1031

- 700

- 500

-300 -200

№14 №11 №20 №21 №23 №18 №19

Рис. 7. RAPD-анализ ДНК клеточных культур на разных стадиях пассирования с использованием праймера Р29. В качестве маркеров молекулярной массы использовались 100 bp Ladder+ и 1 kb Ladder ("Fermentas"). №1 - 5 - стромальные клетки жировой ткани; МСК - мезенхимные прогениторные клетки, №16, №14, №11, №20, №21, №23, №18, №19 -культуры клеток фибробластов кожи; 1 - 20 - разные пассажи;

* - обозначена та же линия клеток, но выращенная на другой среде. 1-23 культуры клеток, полученные от разных доноров.

R45

08 12 16 20 048 12 048 07048 1 48 12 1 5

1500 -

1000750 -

500 -250 -

4Я

- 3000

- 2000

- 1500

- 1031

-700

- 500

- 300

- 200

№1

№2 №3 №4 №5 MCK №16

l 3 5 10 20 10 10 1 6 9 1 5 10 0 5 0 5 1 5 10 0 5 16

15001000750500250-

.. , s,.«* > ■ «m

, «» s f Wl Ф4 ^

ш Ш

Я :

M ^È I

•3000 ■2000 • 1500

■ 1031

•700 ■500

■300 ■200

№14 №11 №20 №21 №23 №18 №19

Рис. 8. RAPD-анализ клеточных культур на разных стадиях пассирования с использованием праймера R45. См. обозначения к рисунку 7.

На рисунке 9 представлены результаты амплификации тех же образцов ДНК с праймером 447. ЯАРО-спсктры представлены в среднем 8-9 фрагментами в зоне электрофоретического фракционирования от 250 до 1500 п.н. Видно, что на фоне сходных по электрофоретической подвижности мажорных и минорных полос наблюдаются значительные вариации в ЯАРВ-спектрах как между клеточными культурами, так и между пассажами некоторых культур. В этом отношении наиболее примечательным является амплификант размером около 350 п.н. Он имеется в виде мажорного продукта в спектрах большинства культур клеток, но отсутствует в №16, №14 и присутствует в небольшом количестве в №18, №19. Наблюдаются также воспроизводимые отличия по содержанию этого амплификанта в ЯАРО-спектрах разных пассажей одной и той же культуры клеток. Так, в одних случаях (№ 2, 3, 23) происходило его увеличение на более поздних пассажах, а в других случаях (№5, МСК, №11, №20, №21) - его уменьшение. Причины таких вариаций остаются неясными и могут быть определены при сравнительном анализе организации амплифицируемых участков ДНК. Теоретически они могут быть вызваны геномными перестройками, мутациями, затрагивающими участки комплементарного связывания ДНК с праймерами, инсерциями и делециями ДНК. Различия в спектрах амплификации исходных пассажей клеточных культур, возможно, определяются индивидуальными различиями в ДНК, которые могут быть связаны с мутациями в эмбриогенезе у индивидов-доноров соответствующих клеток. Эти данные говорят о возможности использования метода для геномной паспортизации клеточных культур.

Таким образом, в результате проведенных исследований был найден праймер, использование которого в 11АРО-анализе позволяет выявить соматические различия в ДНК человека и мыши, а также проводить геномную паспортизацию и выявлять геномные различия в клеточных культурах, подвергавшихся длительному культивированию. При использовании клеточной терапии возникает вопрос безопасности применения клеточных материалов. На основании исследований ряда ученых было обнаружено появление геномных нарушений в клеточных культурах при длительном культивировании (Оп§ а1., 1998; 1УПкко1а е! а1., 2006). Такие геномные нарушения несут в себе потенциальную опасность возникновения раковых трансформаций. В различных исследованиях предложены несколько методов, которыми детектируют уже значительные геномные изменения. Метод анализа белкового полиморфизма мог бы претендовать на возможность контроля за изменениями, происходящими в клетках. Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволяет оценивать уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) и дает возможность разработать основные теоретические положения популяционной генетики е! а1., 1987). Однако в ходе исследований выяснились

определенные ограничения в применении этого типа маркеров.

О 8 121620 0 4 8 12 0 4 8 0 7 0 4 8 1 4 8 12 1 3

* *

Рис. 9. НАРБ-анализ образцов ДНК, выделенных из разных клеточных культур человека разных пассажей, с использованием праймера 447. См. подписи к рисунку 7.

Прежде всего, это то, что анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. Если учесть, что у высших эукариот всего около 1% генома составляют белок-кодирующие последовательности, очевидно, что от внимания исследователей ускользает основная часть генома.

При этом из анализа исключаются такие функционально значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов, часто на значительном расстоянии от кодирующей последовательности. Более перспективными оказались методы, оценивающие изменение на уровне ДНК. Один из них - это мультилокусный ДНК-фингерпринтинг (Ryskov et.al., 1988). Высокая эффективность метода определяется гиперизменчивостью мини- и микросателлитов. Ранее различные варианты ДНК-фингерпринтинга были использованы для целей судебной медицины и криминалистики (Репа, 1994), а также для решения фундаментальных проблем популяционной генетики, этологии, экологии, биоразнообразия (Wetton et al., 1987; Gilbert et al., 1990; Ellegren et al., 1993; Baker et al., 1993; Tegelstrom, Sjoberg, 1995). ДНК-фингерпринтинг также был использован для паспортизации клеточных линий. Однако данный метод крайне трудоемкий, дорогостоящий и требующий больших количеств ДНК. Существует еще один метод определения генетических изменений в клеточных культурах млекопитающих гибридизация in situ: при использовании флуоресцентной метки - FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) и при использовании хромогенной метки - CISH (хромогенная in situ гибридизация) (Jacobs et al., 1999). Оба метода выполняются на фиксированных клетках. Недостатки этих методов связаны с тем, что они чувствительны к условиям фиксации материала. При использовании FISH-метода требуются специализированное дорогостоящее оборудование и наборы реагентов. В нашей работе предложено использование метода RAPD-PCR анализа ДНК как быстрого, простого и достаточно чувствительного. Мы полагаем, что чувствительность данного метода позволяет его использовать его для геномной паспортизации клеточных культур и контроля за геномными изменениями, происходящими в клеточных культурах при пассировании. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) показана видоспецифичность ДНК-паттернов. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, сельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно ценных признаков (Reinoso, 2004; Munoz et al.,

2007; Lee et al., 2007). В данной работе предложено еще одно применение RAPD-PCR анализа, а именно метод раннего контроля геномных изменений при пассировании культур прогениторных клеток млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны праймеры, дающие информативные амплификационные спектры ДНК органов и тканей человека и мыши.

2. Впервые с помощью RAPD-анализа и ДНК-фингерпринтинга обнаружена соматическая изменчивость ДНК у эмбрионов человека. При анализе нормальных органов и тканей соматический мозаицизм выявлен у трех из четырех исследованных эмбрионов.

3. Впервые продемонстрированы случаи соматического мозаицизма при RAPD-анализе ДНК нормальных органов и тканей взрослых мышей линий С57КС, СВА, 101. Различия в RAPD-спектрах обнаружены у 7 из 18 особей, и они связаны с изменением подвижности или появлением/утратой амплифицированных фрагментов спектра.

4. Предложен эффективный вариант RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека (заявка на патент).

5. Впервые показана изменчивость RAPD-спектров ДНК клеточных культур человека (мезенхимные прогениторные клетки, стромальные клетки жировой ткани и клетки фибробластов) на разных стадиях пассирования.

Список работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах соответствующих Перечню ВАК»

1. Бутовская П.Р., Павлова Г.В., Мартиросян И.А., Сухих Г.Т., Рысков А.П. Соматический мозаицизм у мышей, выявляемый методом RAPD-PCR // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 2009. №1.С. 3-7.

2. Бутовская П.Р.. Мартиросян И.А., Баранов В.С, Егорова А.А, Киселев A.B., Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами //Генетика. 2007. Т. 43. №12. С. 1694-1699.

3. Бутовская П.Р.. Мартиросян И.А, Павлова Г,В, Сухих Г.Т, Рысков А.П. Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования. Заявка на патент № 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года.

Тезисы конференций

1. Butovskaya P.R., Martirosyan I.A., Korochkin L.I. Somatic mosaicism in mammals and humans // 12-th PhD meeting in evolutionary biology. 2006. St.Andrews. Scotland. Abstracts. P.41

2. Butovskaya P.R. Somatic mosaicism determination in humans by DNA-fmgerprinting // 11-th PhD meeting in evolutionary biology. 2005. Bordeaux. France. Abstracts. P.14-15.

3. Бутовская П.Р., Мартиросян И.А, Баранов В.С, Павлова Г.В, Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека методом ДНК-фингерпринтинга // IV International conference Molecular genetics of somatic cells. 2005. Звенигород. Россия. Абстракт. С. 26-27.

Заказ № 36-а/09/10 Подписано в печать 07.09.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )) \vw\v. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бутовская, Полина Руслановна

Условные обозначения

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Соматический мозаицизм, причины его возникновения.

1.1.1. Хромосомная нестабильность

1.1.2. Изменения числа повторов в мини - и микросателлитах

1.1.3. Вариации по числу копий крупных (80-180 т.п.н.) хромосомных сегментов

1.1.4. Метилирование ДНК - эпигенетическая модификация функционального 23 состояния генома

2.1. Методы выявления соматического мозаицизма

1.2.1. Мультилокусный ДНК - фингерпринтинг

2.2.2. RAPD- PCR (полимеразная цепная реакция со случайными праймерами)

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Биологический материал

2.2. Выделение ДНК из тканей и органов

2.3. Выделение ДНК из клеточных линий

2.4. Выделение стромальных клеток из жировой ткани

2.5. Получение клеточных культур

2.5.1. Культивирование СКЖТ

2.5.2. Культивирование клеток фибробластов

2.6. RAPD- PCR

5.7. Электрофоретическое фракционирование ПЦР-продуктов

5.8. ДНК-фингерпринтинг 42 5.8.1. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами

5.8.2. Электрофоретическое фракционирование рестрикционных фрагментов ДНК и перенос ДНК из геля на мембранные фильтры

5.8.3. Обработка фильтров перед гибридизацией

5.8.4. Приготовление Р 32- меченных зондов

5.8.5. Блот - гибридизация

5.8.6. Получение радиоавтографов

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Выявление соматического мозаицизма у человека

3.1.1. Использование мулитилокусного ДНК - фингерпринтинга

3.1.2. Использование полимеразной цепной реакции со случайными 50 праймерами(КАРБ- PCR)

3.2. Выявление соматического мозаицизма у мыши с помощью полимеразной 54 цепной реакции со случайными праймерами(КАРО- PCR)

3.3. RAPD-анализ клеточных культур на разных стадиях пассирования 61 Заключение 61 Выводы 75 Благодарности 79 Список литературы

Условные обозначенияЯ LINE (Long Interspersed Elements) — длинные диспергированные повторы LTR (Long Terminal Repeats) - длинные концевые повторы PCR (Polymerase Chain Reaction) - полимеразная цепная реакция (ПЦР) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - метод анализа полиморфизма ДНК с использованием случайных праймеров для амплификации ДНК SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - додецил сульфат натрия SSC (Sodium Saline Citrate) -натрий- цитратный буферный раствор ТХУ - трихлоруксусная кислота

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) — вариабельные тандемные повторы

ТВЕ-буфер - трис-ЭДТА-боратный буфер (ТБЭ-буфер) ТЕ-буфер - трис-ЭДТА буфер (ТЭ-буфер)

ЭДТА (EDTA) - динатриевая соль этиледиаминтетрауксусной кислоты UV- (Ultraviolet) - ультрафиолет (УФ)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Соматический мозаицизм у человека и мыши по данным мультилокусного маркирования ДНК"

Актуальность проблемы

Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии; например, путем участия самой" последовательности в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002). Встает вопрос, не играют ли эти последовательности определенную роль в спецификации клеток, в клеточной дифференцировке.

Очевидно, эксперименты в рамках этой концепции направлены на выявление геномных различий между специализированными клетками и их предшественниками. В биологических системах описано такое явление, как соматический мозаицизм, что означает присутствие в одном организме генетически различных популяций соматических клеток. Структурные изменения в ДНК злокачественно трансформированных клеток - наиболее известный пример соматического мозаицизма (Ionov et al., 1993). Его причинами могут служить как генетические, так и эпигенетические события (Vikki et.al., 2001). Причиной соматического мозаицизма могут быть потеря гетерозиготности путем митотической рекомбинации, хромосомная нестабильность, изменения в микросателлитных локусах (Cavenee et al., 1983; Lengauer et al., 1998). В то же время, имеется очень мало данных о соматическом мозаицизме в нормальных тканях. Цель и задачи исследования.

Целью исследования является изучение феномена соматического мозаицизма в нормальных органах и тканях млекопитающих с помощью методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR) и мультилокусного ДНК-фингерпринтинга.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать варианты RAPD-анализа для получения информативных амплификационных спектров ДНК органов и тканей человека и мыши.

2. Исследовать ДНК, выделенную из нормальных органов и тканей эмбрионов человека, методами RAPD-PCR и ДНК-фингерпринтинга с целью выявления соматического мозаицизма на уровене индивидуального организма.

3. Исследовать ДНК нормальных органов и тканей взрослых мышей с целью выявления соматического мозаицизма у индивидов разных линий.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые показана измечивость PARD-спектров клеточных культур при длительном пассировании (мезенхимные прогениторные клетки человека, стромальные клетки жировой ткани человека, клетки фибробластов человека).

Практическая значимость результатов связана с разработкой эффективного варианта RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека и выявления генетических изменений при их I длительном пассировании (Заявка на патент «Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования» No 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 11-th PhD meeting in evolutionary Biology. Bordeaux. France. 2005; IV International conference Molecular genetics of somatic cells. Zvenigorod. Russia. 2005; 12-th PhD meeting in evolutionary Biology. St.Andrews. Skotland. 2006; 13-th meeting in evolutionary Biology. Lund. Sweden. 2007.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК — 2, заявка на патент — 1, тезисов докладов и материалов конференций - 3.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 95 страницах, содержит 14 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 125 цитируемых источника.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Бутовская, Полина Руслановна

выводы

1. Подобраны праймеры, дающие информативные амплификационные спектры ДНК органов и тканей человека и мыши.

3. Впервые продемонстрированы случаи соматического мозаицизма при RAPD-анализе образцов ДНК нормальных органов и тканей взрослых мышей линий С57КС, СВА, 101. Различия в RAPD-спектрах обнаружены у 7 из 18 особей, и они связаны с изменением подвижности или появлением/утратой амплифицированных фрагментов спектра. ,

4. Предложен эффективный вариант RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность своим руководителям А.П. Рыскову и Г.В. Павловой за руководство, ценные советы и терпение, И.А. Мартиросян за помощь в проведение некоторых экспериментов. Отдельная благодарность всем тем, кто предоставил биологические образцы для анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель настоящей работы — выявление соматического мозаицизма в нормальных клетках на уровне ДНК у человека и мыши. В биологических системах мозаицизм означает присутствие в индивидуальном организме генетически различных популяций клеток. До настоящего времени явление соматического мозаицизма в основном связывалось с возникновением различных болезней. Раковый патогенез является наиболее известным примером, при котором обнаруживается соматический мозаицизм. В настоящей работе явление соматического мозаицизма мы изучали на нормальных органах и тканях человека и мыши. В качестве основного подхода был выбран метод полимеразной цепной реакции со случайными одиночными олигонуклеотидмыми праймерами (RAPD-PCR). Тестирование <

27 праймеров в полимеразной цепной реакции позволило выявить три праймера (Р92, 447, R45), дающих наиболее информативные спектры амплифицированных ДНК- маркеров и оптимизировать варианты RAPDанализа ДНК человека и мыши. Этим методом, а также с помощью ДНК фингерпринтинга была обнаружена соматическая изменчивость ДНК у трех из четырех исследованных эмбрионов человека. С помощью RAPD- анализа

15 образцов ДНК различных органов и тканей было показано появление дополнительных амплификационных полос размером 300 п.н. в спектрах

ДНК хориона, глаза, и пуповины ( праймер 447) и размером 380 п.н в спектре глаза ( праймер R45). С помощью ДНК - фингерпринтинга при использовании гибридизационных проб (GACA)4 и (CAC)s в сочетании с рестриктазой Hinf I была показана изменчивость фингерпринтных спектров ДНК хориона, глаза и позвоночника. RAPD-методом продемонстрированы случаи соматического мозаицизма при анализе 99 образцов ДНК органов и тканей 18 взрослых мышей линий С57КС, СВА, 101. Различия в RAPD-спектрах были связаны с изменением подвижности или появлением/утратой отдельных фрагментов спектра. При использовании праймера R45 соматические изменения обнаружены у 3-х из 10 особей линии 101, 2-х из 4-х особей линии СВА и 1из 4 особей линии С57КС в образцах ДНК сердца, легких, гонад, кишечника, печени и кожи. При использовании праймера 447 соматические изменения обнаружены у 2-х из 4-х особей линии СВА и 1 из 4-х особей линии С57КС в образцах ДНК кишечника и мозга.

Таким образом, не смотря на небольшую выборку индивидуальных организмов, можно говорить о высокой частоте соматического мозаицизма, выявленных методом RAPD. При этом, нами не обнаружены какой-либо предпочтительности этого явления для конкретных органов и тканей, т.е. изменения в ДНК по-видимому носят случайный характер. Источниками такой изменчивости могут быть мутации в сайтах связывания праймеров с

ДНК, делеции и инсерции в участках между праймерами, альтернативное праймирование в участках сходного строения и вариабельность в числе копий повторяющихся элементов генома. Еще одной задачей настоящей работы было использование RAPD- метода в качестве тест-системы геномных изменений в клеточном материале в ходе пассирования клеточных культур. Было исследовано влияние длительного пассирования на 8 клеточных культур фибробластов человека, 5 клеточных культур стромальных клеток жировой ткани и 1 клеточной культуры эмбриональных клеток костного мозга человека. Различные культуры отличались друг от друга возрастом пациентов. RAPD- спектры различных пассажей сравнивали с таковым 0 или 1-го пассажа. В результате был найден праймер (447), позволяющий обнаруживать значительную изменчивость ДНК при длительном пассировании культур клеток. Предположено, что различия в RAPD- спектрах 0-ых пассажей клеточных культур определяются индивидуальными различиями в ДНК, которые могут быть связаны с мутациями в эмбриогенезе у индивидов-доноров соответствующих клеток, а изменения в ДНК клеточных культур могут определяться 1) структурными изменениями в ДНК в ходе пассирования или 2) изменением соотношения клеточных фракций, несущих структурно различающиеся ДНК, при пассировании. Таким образом, показано, что RAPD- анализ позволяет не только проводить паспортизацию клеточных культур, но и диагностировать возможные геномные изменения в клеточном материале в ходе пассирования клеточных культур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бутовская, Полина Руслановна, Москва

1. Алтухов Ю.П., Саламенкова Е. А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике. // Генетика 2002. Т. 38(9). С. 1174-1195.

2. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. // М.: Наука, 1989.

3. Гречко В. В. Молекулярные маркеры ДНК для изучения филогении и систематики // Генетика. 2002. Т. 38(8). С. 1013-1033.

4. Гришанин А.К., Шехоцов А.К., Бойкова Т.В. и др. Проблема диминуции хроматина на рубеже XX и XXI. // Цитология. 2006. Т. 48. N4. С. 379-397.

5. Евгеньев М.Б., Зеленцова Е. С., Полуэктова Е. В. Инвазия мобильных элементов причина взрывов сальтационного видообразования // Эволюцион. Биология. Томск. ТГУ. 2001. Т. 1. С. 37-48.

6. Корочкин Л. И., Рысков А. П. Был ли прав Август Вейсман? // Генетика. 2003. Т. 39. N. 2. С. 157-163. (Korochkin. L. I., Ryskov. А. P.Was August Weithman right? // Rus. J. Genetics. 2003. V. 39. N. 2. P. 157-163).

7. Малышева Д.Н., Токарская О.Н., Петросян В.Г. и др. Генетическая дифференциация партеногенетических ящериц Darevskia Rostombekowi (Сем. Lacertidae) по данным ядерных и митохондриальных маркеров ДНК // Доклады Академии Наук. 2006. Т.410. С. 560-563.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии «Молекулярное клонирование». М.: Мир, 1984. С. 499.

9. Ю.Никитина Т.В., Назаренко С.А. Микросателлитные последовательности ДНК человека: Мутационный процесс и эволюция. // Генетика. 2004. Т. 40. С. 1301-1318.

10. П.Прохорчук А.В., Рузов А.С. Метилирование генома и его роль в функционировании эукариотического организма // Генетика, 2000. Т. 36, N. 11, С. 1475-1486.

11. Рысков А. П. Информационный бюллетень Геном человека // Академия Наук СССР. 1990. С.38.

12. Рысков А. П. Мультилокусный ДНК фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях разнообразия. // Молекулярная Биология. 1999. Т. 33. N. 6. С. 880-892.

13. Рысков А.П., Мартиросян И.А., Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у взрослых мышей с помощью метода ДНК-фингерпринтинга// ДАН. 2004. Т. 398. N. 4. С. 551-554.

14. Рысков А.П., Мартиросян И.А., Вергун А.А. и др. Молекулярная структура аллельных вариантов миктосателлитных локусов Du281 и

15. Du47 у представителей однополых и двуполых видов ящериц рода Darevskia. Известия РАН, серия биологическая. 2009, 2: С. 201-208.

16. Сулимова Г.Е., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. // Изд-во "Диалог МГУ". Москва. 1999.

17. Токарская О.Н., Даревский И.С., Мартиросян И.А. и др. Генетическая нестабильность (GATA)n микросателлитных повторов ДНК и соматический мозаицизм у однополых ящериц Darevskia unisexualis // ДАН. 2003. Т. 388(6). С. 825 828.

18. Токарская О.Н., Ефремова Д.А., Кан Н. Г. и др. Изменчивость мультилокусных маркеров ДНК в популяциях сибирской (Capreolus pygargus Pall.) и европейской (С. capreolus L.) косуль // Генетика. 2000. Т. 36, №11. С. 1520-1529.

19. Трифонов Е. Н. Сегментативный геном. Элементарные структурные единицы генома // Генетика. 2002. Т. 38. С. 793-798. (E.N. Trifonov Segmented Genome: Elementary Units of Genome Structure // Rus. J. Genetics. 2002. V. 38. N 6. P. 793-798.

20. Aaltonen L. A., Peltomaki. P., Leach F. S. et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer// Science. 1993. V. 260. P. 812-816.

21. Ainsworth P. J., Chakraborty P.K. and Weksberg R. Example of somatic mosaicism in a series of de novo neorofibromatosis type 1 cases due to a maternally derived deletion // Hum. Mutat. 1997. V. 9. P. 452-457.

22. Alexandrava S. A., Shvemberg I.N. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPD-PCR-fingerprinting under different conditions of cultivation // Expt. Oncol. 2005 V. 27. N. 2. P. 114119.

23. Allanson J.E, Graham G.E. In: Principles and Practice of Medical Genetics. 4th Edn. (Rimoin D. L., Connor J.M., Pyeritz R.E and Korf B. R. Eds.). Edinburg. Churchill Levingstone. 2002. P. 1184-1201.

24. Anderson S., Bankier A.T., Barel B.G. et al. Sequence and organization of human mitochondrial genome //Nature. 1981. V.290. P. 457-465.

25. Armour J.A., Povey S., Jeremiah S. et al. Systematic cloning of human minisatellites from ordered array charomid libraries // Genomics. 1990. V 8. N3. P. 501-512.

26. Armour J.A., Ptel I., Thein S.L. et al. Anaylsis of somatic mutations at human minisatellite in tumor and cell lines // Genomics. 1989. V. 3. P. 328334.

27. Armstrong L., McGowan-Jordan J., Brierley K. et al. De novo dup(X)(q22.3q26) in a girl with evidence that functional disomy of X material is the cause of her abnormal phenotype // Am. J. Med. Genet. A. 2003. V 1. N 116A(1). P. 71-76.

28. Arnason U., Adegoke J. A., Bodin K. et al. Mammalian mitogwnomic relationships and the root of the eutherian tree. // Proc. Nat. Amer. Sci. 2002. V. 99. N 12. P. 8151-8156.

29. Bailey J.A., Eichler E.E. Primate segmental duplications crucibles of evolution, diversity and disease // Nat. Rev. Genet. 2006. V. 7. P. 552-564.

30. Barinaga M. Cells exchanged during pregnancy live on // Science. 2002 V. 21 N296(5576). P. 2169-2172.

31. Bianchi D.W., Lo Y.M. Fetomaternal cellular and plasma DNA trafficking: the Yin and the Yang // Ann N Y Acad Sci. 2001. V. 945. P. 119-131.

32. Bird A.P., Wolffe A.P. Methylation- induced repression- belts, braces and chromatin // Cell 1999. V. 99. P.451-454.

33. Bois P., Jeffreys A.J. Minisatellite instability and germline mutation // Cell. Mol. Life. Sci. 1999. V. 55. N 12. P. 1636-1648.

34. Bois P., Willianson J., Brown J. et al. // Genomics. 1998. V. 49. P. 122-128.

35. Boveri T. The Orgin of Maligrant Tumors. Williams and Wilkins Eds., Baltimore, Maryland, 1929.

36. Britten R.J., Davidson E.H. Repetitive and nonrepetitive DNA sequences and a speculation on the origins of evolutionary novelty // Quatr. Rev. Biol. 1971. V 46. N2. P. 111-133.

37. Brown W. M. Evolution of genes and proteins. Sinaeur Sunderland Eds. M.A. 1983. P. 62-88.

38. Bruder C.E., Piotrowski A., Gijsbers A.A. et al. Phenotypically concordant and discordant monozygotic twins display different DNA copy-number-variation profiles // Am. J. Hum. Genet. 2008. V. 82. N 763-771.

39. Butovskaya P.R. Somatic mosaicism detection in humans by DNA-fingerprinting // Abstracts 11th PhD Meeting in Evolutionary Biology. Bordeaux. France. 2005. P. 14-15.

40. Caetano-Annoles G., Bassam B. J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting: A strategy for genome analysis // Plant. Mol. Rep. 1991. V. 9. N2. P. 292-305.

41. Calvisi D.F., Ladu S., Conner E.A. et al. Disregulation of E-cadherin in transgenic mouse models of liver cancer // Lab. Invest. 2004. V 84. N 9. P. 1137-1147.

42. Cavenee W.K., Dryja T.P., Phillips R.A. et al. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma // Nature. 1983. V. 305. N 5937. P. 779-784.1 <

43. Chance P.F., Abbas N., Lensch M.W. et al. Two autosomal dominant neuropathies result from reciprocal DNA duplication/deletion of region on chromosome 17 // Hum. Mol. Genet. 1994. V. 3. P. 223-228.

44. Clayton D.A. Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA // Ann. Rev. Cell Biol. 1991. V. 7. P. 453-478.

45. Di Fabio F., Alvarado C., Gologan A. et al. Somatic mosaicism of androgen receptor CAG repeats in colorectal carcinoma epithelial cells from men // J. Surg. Res. 2009. V. 154(1). P. 38-44.

46. Dil-Afroze, Misra A., Sulaiman I. M. et al. Genetic alterations in brain tumors identified by RAPD analysis // Gene. 1998. V 206. P. 45-48.

47. Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution // Nat. Rev. Genet. 2004. V. 5. P. 551-558.

48. Endow S., Gall C. Differential replication of satellite DNA in polyploidy tussues of D. virilis // Chromosoma. 1975. V. 50. P. 175-192.

49. Engerstrom I. W., Kerr A. Workshop on autonomic function in Rett syndrome // Brain Dev. 1988. V. 20. P.323-326.

50. Epplen J.T. On simple repeated GATCA sequences in animal genomes: a critical reappraisal // J. Hered. 1988. V. 79(6). P. 409-417.

51. Erickson R., Somatic gene mutation and human disease other than cancer // Mutation Research. 2003. V. 543. P. 125-136.

52. Ferguson H. L. et al. Mosaicism in pseudoachondroplasia // Am. J. Med. Genet. 1997. V. 70. P. 287-291.

53. Gibbs M., Collick A., Kelly R.G. et al. A tetranucleotide repeat mouse minisatellite displaying substantial somatic instability during early preimplantation development//Genomics. 1993 V. 17(1). P. 121-128.

54. Gilbert D.A., Lehman N., O'Brien, et al. Genetic fingerprinting reflects population differentiation in the California Channel Island fox// Nature. 1990. V. 344. P. 764- 766.

55. Goldstein D.B., Pollock D.D. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic interference // J. Hered. 1997. V. 88(5). P. 335-42.

56. Gollob M.H., Jones D.L., Krahn A.D. et al. Somatic mutations in the connexin 40 gene (GJA5) in atrial fibrillation // N. Engl. J Med. 2006. V. 354(25). P. 2677-88.

57. Gottlieb В., Beitel L.K., Trifiro M.A. Somatic mosaicism and variable expressivity// Trends Genet. 2001. V. 17. N 2. P. 79-82.

58. Gratacos M., Nadal M., Martin-Santos R. et al. A polymorphic genomic duplication on human chromosome 15 is a susceptibility factor for panic and phobic disorders // Cell. 2001. V. 106: P. 367-379.

59. Hall J.G. A bone is not a bone is not a bone //J. Pediatr. 1998. V. 133 (1). P.5.6.

60. Hendrich B. Human genetics: Methylation moves to medicine // Current Biology. 2000 Vol. 10, P. 60-63.

61. Hendrich B. Methylation moves into medicine // Curr Biol. 2000. V. 27. N 10(2). P. 60-63.

62. Jacobs P.A., Brunton M., Court Brown W.M. et al. Change of human chromosome count distribution with age: evidence for a sex differences // Nature. 1963. V. 197. P. 1080-1081.

63. Jeanpierre M., Turleau C., Aurias A. et al. An embryonic-like methylation pattern of classical satellite DNA is observed in ICF syndrome // Hum. Mol. Genet. 1993. V 2. P. 731-735.

64. Jeffreys A. J., Wilson V., Tein S. L. Hypervariable minisatellite regions in human DNA // Nature. 1985. V. 314. P. 67-73.

65. Jones P. A., Gonzalgo M.L. Altered DNA methylation and genome instability: A new pathway to cancer? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2103-2105.

66. Kelly R., Bulfield G., Collick A. et al. Characterization of a highly unstable mouse minisatellite locus: evidence for somatic mutation during early development // Genomics. 1989. V 5. N 4. P. 844-856.

67. Klose R. J., Bird A. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators // Trends in Bioch. 2006. Sciences. V. 31. N. 2. P. 89-97.

68. Korchagin V.I., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N. et al. Molecular characterization of allelic variants of (GATA)n microsatellite loci in parthenogenetic lizards Darevskia unisexualis (Lacertidae) // Gene. 2007. 392. P. 126-133.

69. Kvittingen E.A., Rootwelt H., Berger R. et al. Self-induced correction of the genetic defect in tyrosinemia type I // Clin Invest. 1994. V. 94. P. 16571662.

70. Langauer. С., Kinzler К. W., Vogelstein В. DNA methylation and genetic instability in colorectal cancer cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2545-2550.

71. Lee Y.C., Shan Y.S., Lin P.W. Surgical decompression in the patients of pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasm // Hepatogastroenterology. 2007. V 54(80). P. 2395-2397.

72. Lengauer C., Kinzer K.W., Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancer // Nature. 1998. V. 396. N 6712. P. 643-649.

73. Li E., Bestor T.H, Jaenisch R. Targeted mutation of DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality // Cell. 1992. V 69. P. 915-926.

74. Limborska S.A., Prosnyak M.I., Bocharova T.N. et al. The properties of human DNA fingerprints produced by polymeric monocore probes (PMS probes) // Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 1999. V. 15(1). P. 19-24.

75. Locke D.P., Sharp A.J., McCarroll et al. Linkage disequilibrium and heritability of copy-number polymorphisms within duplicated regions of the human genome // Am. J. Hun. Genet. 2006. V. 79. P. 275-290.

76. Loeb L.A. Cancer cells exhibit a mutator phenotype // Adv. Cancer Res. 1998. V. 72. P. 25-56.

77. Luceri C., De Filippo C., Caderni G. et al. Detection of somatic DNA alterations in azoxymethane-induced F344 rat colon tumors by random amplified polymorphic DNA analysis // Carcinogenesis. 2000. V 21. N 9. P. 1753-1756.

78. М. Kayser., L. Roewer., M. Hedman., et al. Characteristics and frequency of germline mutations at microsatellite loci from the human Y chromosome, as revealed by direct observation in father/son pairs // Hum. Mol.Genet. 1995. V.4.P. 1193-1199.

79. Maraschio P., Zuffardi O., Dalla Fior T. et al. Immunodeficiency, centromeric heterochromatin instability of chromosomes 1, 9, and 16, and facial anomalies: the ICF syndrome // J. Med Genet. 1988. V. 25. N 3. P. 173-80.

80. Mitani K., Sato Y., Tojo A. et al. Philadelphia chromosome positive B-cell type malignant lymphoma expressing an aberrant 190 kDa bcr-abl protein // Br. J. Haematol. 1990. V. 76. N2. P. 221-225.

81. Monica K., Galili N., Nourse J. et al. PBX2 and PBX3, new homeobox genes with extensive homology to the human proto-oncogene PBX1 // Mol. Cell Biol. 1991. V 11. N 12. P. 6149-6157.

82. Muller F., Tobler H. Chromatin diminution in the parasitic nematodes Ascaris suum and Parascaris univalens // Int. J. Parasitol. 2000. V. 30. P. 391-399.

83. Munoz M.A., Saunders D.N., Henderson M.J. et al. The E3 ubiquitin ligase EDD regulates S-phase and G (2)/M DNA damage checkpoints // Cell Cycle. 2007. V 6 (24). P. 3070-3077.

84. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P. et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. V.235. P. 1616-1622.

85. Pena and Chakraborty. Paternity testing in the DNA era // Trends Genet. 1994. V 10(6). P. 204-209.

86. Pentao L., Lewis R.A., Ledbetter D.H. et al. Maternal uniparental isodisomy of chromosome 14: association with autosomal recessive rod monochromacy // Am. J. Hum. Genet. 1992 V. 50(4). P. 690-699.

87. Piotrowski A., Bruder C.E.G., Andersson R. et al. Somatic Mosaicism for copy number variation in different human tissues // Human mutation. 2008. V. 29(9). P. 1118-1124.

88. Rehen S.K., McConnell M.J., Kaushal D. et al. Chromosomal variation in neurons of the developing and adult mammalian nervous system // Proc Natl

89. Acad Sci USA. 2001. V. 98(23). P. 1361-1362.

90. Reinoso E.B. Analisis epidemiologico у molecular de cepas de Staphylococcus aureus de distintos origenes. Tese de Doutorado, Instituto de Microbiologia, Universidad Nacional de Rio Cuarto, Argentina. 2004. 199 pp.

91. Russo C.A.M., Takezaki N., Nei M. Efficiencies of different genes and different tree-buildings methods in recovering a known vertebrate phylogeny // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13(3). P. 525-537.

92. Ryskov A.P., Dzhincharadze A.G., Prosnik M.I. et al. Genomic fingerprints of organisms from different taxonomic groups: the use of phage M13 DNA as a hybridization probe // Genetika. 1988.

93. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. V. 239(2). P. 487-491.

94. Sebat J. Major changes in our DNA lead to major changes in our thinking //Nat Genet. 2007 V. 39 (7 Suppl). P. 3-5.

95. Sebat J., Lakshmi В., Troge J. et al. Large-scale copy number polymorphism in the human genome // Science. 2004. V 305(5683). P. 525528.

96. Shaw C.J., Lupski J.R. Implications of human genome architecture for rearrangement-based disorders: the genomic basis of disease // Hum Mol Genet. 2004 Apr 1; 13 Spec N 1. P. 57-64. E-pub 2004 Feb 5.

97. Sparkes R. et al. The validation of a 7-locus multiplex STR test for use in forensic casework.I. Mixtures, ageing degradation and species studies // Int. J. Legal Med. 1996. V. 109. P. 186-194.

98. Tegelstrom, H., Sjoberg G. Introduced Swedish Canada geese (Branta canadensis) have low levels of genetic variation as revealed by DNA fingerprinting // J. Evol. Biol. 1995. V. 8. P. 195-207.

99. Thein S.L., Jeffreys A.J., Gooi H.C. et al. Detection of somatic changes in human cancer DNA by DNA fingerprint analysis // Br. J. Cancer. 1987. V 55. P. 353-356.

100. Tokarskaya O. N., Martirosyan I. A., Badaeva T. N. et al. Instability of (GATA)n microsatellite loci in parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia unisexualis (Lacertidae) // Molecular Genetics and Genomics. 2004. V. 270. P. 509-513.

101. Tolmie J.L. Principles and Practice of Medical Genetics. 4th Edn (Eds. Rimoin D. L., Connor J.M., Pyeritz R.E and Korf B. R.). Churchill Levingstone, Edinburg. 2002. P. 1129-1182.

102. Turner В. J., Elder J. F., Laughlin Т. H. et al. Genetic variation in clonal vertebrates detected by simple sequence DNA fingerprinting // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1990. V. 87. P. 5653-5657.

103. Van Dijk B.A., Boomsma D.I., de Man A.J. Blood group chimerism in human multiple births is not rare // Am. J. Med. Genet. 1996. V 61(3). P. 264-268.

104. Vassart G., Georgies M., Monsieur R. et al. Sequences in M13 Phage Detects Hypervariable Minisatellites in Human and Animal DNA // Science. 1987. V. 235. P. 683-684.

105. Vikki S., Tsao J-L., Loukola A. et .al. Extensive somatic microsatellite mutations in normal human tissue // Cancer. Research. 2001. V. 61. N. 11. P. 4541-4544.

106. Wallace D.C., Lott M. In: Principles and Ptactice of Medical Genetics 4th Edn. (Eds. Rimoin D. L., Connor J.M., Pyeritz R.E and Korf B. R: Churchill Levingstone, Edinburg // 2002. P. 299-409.

107. Wang D. G., Fan J. В., Sian J. C. et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome // Science. 1998. V. 280. P. 1077-1082.

108. Wells R. D. Molecular basis of genetic instability of triplet repeats // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. N. 6. P. 2875-2878.

109. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers//Nucl. Acid Res. 1990. V. 18(24). P. 7213-7218.

110. Wetton J.H., Carter R.E., Parkin D.T. et al. Demographic study of a wild house sparrow population by DNA fingerprinting // Nature. 1987. V. 327(6118). P. 147-149.

111. Xu G-L, Bestor Т. H, Bourchis D. et al. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in DNA methyltransferase gene // Nature. 1999. V. 402. P. 187-191.

112. Youssoufian H. Natural gene therapy and the Darwinian legacy // Nat Genet. 1996. V. 13(3). P. 255-256.

113. Youssoufian H., Pyeritz R.E. Mechanisms and consequences of somatic mosaicism in humans // Nat. Rev Genet. 2002. V. 3. N. 10. P. 748-758.

114. Yurov Y.B., Iourov I.Y., Vorsanova S.G. et al. Aneuploidy and confined chromosomal mosaicism in the developing human brain // PLoS One. 2007. V. 27(6). E 558.

115. Zaragoza M.V., Jacobs P.A., James R.S. et al. Nondisjunction of human acrocentric chromosomes. Studies of 432 fetueses and liveborns // Hum. Genet. 1994. V. 94. P. 411-417.

Информация о работе

Бутовская, Полина Руслановна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Соматический мозаицизм у человека и мыши по данным мультилокусного маркирования ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы