Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ полиморфизма некоторых коротких тандемных повторов в трех популяциях человека и их использование для генетической идентификации личности

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скакун, Владимир Николаевич, Санкт-Петербург

/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

СКАКУН ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА НЕКОТОРЫХ КОРОТКИХ

ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ В ТРЕХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ

03. 00. 15 - ГЕНЕТИКА

ДИССЕРТАЦИЯ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научные руководители:

д. м. н., профессор В. С. Баранов

д. б. н., профессор Л. 3. Кайданов

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ------------------------------------------------------------------------------------2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ-----------------------------------------------4

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ-------------------------------------------------------------------------------6

1.1. Актуальность исследований--------6

1.1. Цель и задачи исследований--------------------------------------------------------12

1.3. Научная новизна---------------------------------------13

1.4. Научно-практическая значимость работы--------------------14

1.5. Положения, выносимые на защиту-------------------------------------------------15

1.6. Апробация работы-------------------------------------16

1.7. Структура и объем диссертации---------------------17

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ-------------------------------------------------------------18

2.1. Основные элементы генома, повторяющиеся последовательности хромосомной ДНК человека 18

2.2. Мини- и микросателлиты---------------25

2.3. Короткие тандемные повторы (КТП)--------------35

2.4. Полиморфные ДНК маркеры и способы их детекции. Геномная дактилоскопия в исследованиях генома человека.------------------------------------------------------38

2.4.1. Полиморфные ДНК маркеры и способы их детекции.--------------------------------------------------------38

2.4.2. Геномная "дактилоскопия" в исследованиях генома человека.-----------------------------------------45

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ--------------------------------49

3.1. Использованные материалы, реактивы и оборудование--------49

3.1.1. Материалы-------------------------------------------------------------------------------------------------------------49

3.1.2. Реактивы-------------------------------------------------------------------------------------------------------------—49

3.1.3. Список растворов и их сокращенных названий------------------------------------------------------------50

3. 2. Подготовка проб-------------51

3.2. 1. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови-------------------------------------------------51

3. 2. 2. Выделение ДНК с использованием носителя Insta Gene4"1-------------------------------------------------51

3. 3. Гидролиз ДНК ферментами рестрикции--52

3.4. Мечение ДНК-зондов 32Р-------------52

3. 5. Генотипирование образцов ДНК-53

3. 6. Выделение плазмидной ДНК--54

3. 7. Очистка плазмидной ДНК в градиенте CsCI---55

3.8. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)---------------------55

3. 9. Электрофорез в нативном ПААГ--------------------------------------------57

3.10. Методы окраски гелей и учет результатов------------------------------57

3.10.1. Окрашивание серебром--------------------------------------------------------------------------------------------58

3.11. Выделение фрагментов ДНК для секвенирования-------------------------58

3.12. Секвенирование ДНК----------------------------------------------------59

3.13. Секвенирующий электрофорез и получение автографов--------------------59

3.14. Математические методы анализа----------------------------------60

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ------------------------------------------------------------------------63

4.1. Наследование и соматическая стабильность КТП; сравнительный анализ ДНК-фингерпринта * при использовании ПЦР и блот-гибридизашга---------------------------------------------63

4. 2. Популяционный анализ коротких тандемных повторов генов АК, НРКТ, БТКХ 1 и уХУГ^ю в трех этнических группах: русские, грузины, узбеки------------------------------------------------70

4.2.1. Идентификация аллелей локусов НшпАЫА, НитБТЮП, НитНР1ШЗ, Ншт^Р9.1о-------------70

%гФ2.2. Частоты аллелей четырех маркерных локусов в исследованных популяциях--------------------------74

4.2.3. Частоты генотипов по четырем маркерным локусам в исследованных популяциях------------------77

4.2.4. Ожидаемые и реальные частоты встречаемости гетерозигот(НЬ), потенциал индивидуализации (И) для каждого КТП--------------------------------------------------------------------------------------------------------85

4.2.5. Сравнение исследованных популяций между собой с использованием модифицированного критерия Колмогорова -Смирнова-----------------------------------------------------------------------------------------87

4.3. Разработка и оптимизация варианта геномной "дактилоскопии" на основе КТП с использованием ПЦР и ТСС "Люмен"------------------------88

4.3.1. Определение оптимальных условий амплификации-----------------------------------------------------------88

4.3.2. Использование ТСС "Люмен" для документирования результатов электрофореза ДНК в ПААГ с окраской бромистым этидием----------------------------------------------------------------------------------------------90

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ--------------------------------------------------------------------------95

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ-----------------------------------------------------------------------109

ГЛАВА 7.

БИБЛИОГРАФИЯ

112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.п. - аллельный полиморфизм

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

п.о. - пары оснований

п.н. - пары нуклеотидов

т.п.н. - тысячи пар нуклеотидов

п.с. - полиморфные сайты

STR(КТП) - (short tandem repeats) короткие тандемные повторы

VNTR - (variable number of tandem repeats) варьирующие по числу тандемные повторы

LOM - Low microvariation - низкоизменчивые КТП

INM -Intermediate microvariation - среднеизменчивые

КТП

HIM - High microvariation - высокоизменчивые КТП ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТСС "Люмен" - телевизионная спектральная система "Люмен"

ПДАФ - полиморфизм длины амплификационных фрагментов ДНК

HV - гипервариабельные локусы

ТТП - три- и тетрамерные тандемные повторы

Автор выражает благодарность руководителям диссертационной работы за предоставление диссертационной темы и руководство над ее выполнением: профессору Владиславу Сергеевичу Баранову и профессору

Леониду Зиновьевичу Кайданову

Искренне признателен за доброжелательное отношение, постоянное внимание и помощь в работе научным сотрудникам лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней ИАГ им. Отта РАМН Михаилу Владимировичу Асееву и Татьяне Эдуардовне Иващенко, а также всем остальным сотрудникам этой лаборатории и кафедры Генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного университета им. Д. И. Менделеева.

Автор также выражает благодарность С. Нурбаеву (НМГЦ, г.Москва) за помощь в осуществлении бутстреппин-га (численного ресэмплинга) для проверки на статистическую корректность вычислений %2.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность исследований

Молекулярный анализ структурно-функциональной организации генома эукариот и, в первую очередь, человека - одно из магистральных и быстро развивающихся направлений современной генетики и молекулярной биологии. Решающие успехи последних лет в этой области стали возможны благодаря появлению высокоэффективных и экономичных биотехнологических приемов и методов, основанных на использовании генетических маркеров. В качестве таких маркеров могут выступать устойчиво наследуемые и сохраняющиеся в ряду поколений признаки и свойства организма, которые поддаются количественной или качественной регистрации и способны служить индивидуальными характеристиками как отдельных организмов и разных групп организмов, так и конкретных участков генома. Этот подход, заявивший о себе в 80-е годы, стал альтернативой количественной генетики 20-х годов, опиравшейся на статистический анализ распределения по фенотипам и исследованиям по генетике человека 7 0-х годов, в которых преимущественно использовали биохимические маркеры и маркеры групп крови (Айала Ф. X., 1984). С развитием методов клонирования ДНК и способов идентификации уникальных генов в суммарной ДНК высших организмов с помощью блот-гибридизации стало возможным анализировать генетическую вариабельность непосредственно на уровне геномной ДНК (Маниатис Т. и соавт., 1984). Исследования в данном направлении являются одним из приоритетов Международной научной программы Human Genome Organization (HUGO).

Первоначально маркеры ДНК были связаны с кодирующей (уникальной) фракцией ДНК, а их выявление - с тестированием полиморфизма длин рестрйкционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Впервые ПДРФ, как генетический маркер, был использован в 1974 году при идентификации мутации в геноме аденовируса. Однако постепенно выяснилось, что такие маркеры представляют лишь коллекционный интерес, т.к. обладают низким информационным содержанием (PIC -polymorphic information content - < 0,2) (цит. по Иванов П. Л., 1989; Prokop С., 1990; Сулимова Г., 1993).

В ДНК человека гипервариабельный локус впервые был выявлен в 1980 году (Wyman A., White R.) . Виман и Уайт случайно обнаружили сегмент геномной ДНК человека, содержащий мультиаллельный локус (D14S1) с более 15-тью вариантами длин рестрикционного фрагмента в малой популяции. Полиморфизм также был описан и для ряда других гомологичных генетических локусов (Jeffreys А., 1979) . Это позволило сформулировать универсальный принцип генетического маркирования, основанный на применении в качестве нейтральных генетических маркеров локусов, обладающих свойством структурного полиморфизма (Botstein D. и соавт., 1980).

Позже был идентифицирован ряд других гипервариабельных локусов (HV) : в инсулиновом гене, онкогене Haras, псевдогене $-глобина и гене миоглобина (цит. по Nakamura Y., 1987). Во всех случаях HV локусы были представлены повторами коротких тандемных последовательностей (11-60 п.н.), названными "минисателлитами" (Jeffreys А., 1986) .

Генетический смысл полиморфных (HV) локусов и механизм их образования до сих пор остаются неясными. Известно лишь, что большая часть вариаций в последова-

тельности геномной ДНК вызвана точковыми нуклеотидными заменами, транспозициями или проскальзыванием ДНК-поли-меразы в области репликативной вилки (slippage) (Блис-ковский В. В., 1992). Важным представляется то, что они мультиаллельны и, следовательно, высокоинформативны, обладают соматической стабильностью и наследуются как простые менделевские кодоминантные признаки.

В составе сателлитной ДНК человека различают два больших класса полиморфных последовательностей: мини-сателлиты и микросателлиты (Као F.-T., 1985). Они представляют собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относительно коротких тандемных повторов разной степени гомологии, различающихся числом повторенных единиц и образующих отдельные локусы. (Неагпе С. et al., 1992; Sertedaki A., Lindsay S., 1996; Горбунова

B.H., Баранов В. С., 1997). Длина повторяющихся единиц (мотивов) первого класса HV последовательностей ДНК (минисателлитов) варьирует от 3 до 7 0 п.о., в зависимости от которой они и получили свои обозначения: STR (short tandem repeats) - короткие тандемные повторы (КТП) с размером мотива от 3 до 7 нуклеотидов (Sprecher

C. et al., 1996). и VNTR (variable number of tandem repeats) - варьирующие по числу тандемные повторы, отличающиеся друг от друга на 8-70 пар оснований. (Decorte R. et al., 1990; Budowle В. et al., 1991; Deka R. et al., 1992)-. Второй класс HV (микросателлиты) состоит из динуклеотидных повторов. Однако, четко классифицировать современный набор полиморфных ДНК маркеров сложно, и связано это как с принадлежностью к определенным фракциям хромосомной ДНК, так и с методами их детекции (Litt M. and Luty J.A. , 1989; Neibergs H. et al., 1993; Levin I. et al., 1994; Мельникова H. и др., 1996).

В настоящее время изучение полиморфизма ДНК по различным гипервариабельным локусспецифическим последовательностям ДНК ядерного генома проводится для многих популяций мира. (Jorde L., 1980; Jeffreys A. et al., / 1985; Roychoudhary A. and Nei M., 1988; Balazs J. et al., 1989; Boerwinkle E. et al., 1986, 1990; Bowcock A. et al., 1991; 1994; Burocer N. et al., 1991; Chak-raborty R. et al., 1991; Deka R. et al., 1991; 1995; Kidd J. et al., 1991; Edwards A. et al., 1992; Kadasi L. et al., 1994; Watkins W. et al., 1995 ). Наиболее информативными ДНК-маркерами для этих целей принято считать минисателлитные последовательности ДНК, имеющие участки гомологии во многих местах генома, так называемые, мультилокусные маркеры (Jeffreys A. et al., 1985; Vassart G. et al., 1987; Рысков А. и соавт., 1988). Их можно рассматривать в качестве инструмента, позволяющего описать общую картину, отражающую состояние большого количества локусов, расположенных на разных хромосомах, облегчить поиск локусспецифических маркеров (Jeffreys A. et al. , 1986). Однако, мультилокусная проба имеет ряд недостатков. Во-первых, отсутствует генетическая интерпретация происхождения фрагментов гибридизации. Неизвестное число локусов не позволяет работать непосредственно с отдельными аллелями, использовать стандартные методы популяционной генетики при анализе данных. Во-вторых, для успешного проведения исследования требуется значительное количество высокомолекулярной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию) , что часто накладывает ограничения при проведении популяци-онных исследований и абсолютно неприемлемо при генетической идентификации небольших пятен крови, спермы или луковиц волос. В-третьих, для геномной гибридизации,

как правило, необходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной активностью, работа с которыми требует соблюдения необходимой техники безопасности и наличия специального изотопного блока (Чистяков Д. и соавт., 1993; Гыскэ Л. И., Иванов П. Л. , 1995; М. В. Заяц , Иванов П. Л. , 1997; Горбунова В.Н., Баранов В. С., 1997).

Для некоторых гипервариабельных тандемно организованных локусов класса VNTR D1S111 (Jeffreys A. et al., 1990; 1991), 3' Аро В (Boerwinkle Е. et al., 1986;1990), D17S30 (Horn G. et al., 1989), D1S80 ( Ka-sai К. et al., 1990), 5' IGJH (Decorte R. et al., 1990; 1993) удалось частично преодолеть указанные ограничения (например, радиоактивное мечение). Тем не менее, при использовании их для типирования ДНК с помощью ПЦР либо блот-гибридизации по Саузерну встречаются серьезные методические трудности(Odelberg S. et al.,1988). Это касается как самого процесса амплификации, так и интерпретации результатов. Во-первых, аллели размером более 1,5 Kb нередко амплифицируются с трудом. Во-вторых, поскольку шаг мотива повторов этих ДНК-маркеров может достигать 70 n.o.(D17S5 или D17S30), то при проведении ПЦР некоторые аллели амплифицируются предпочтительнее других, что ведет к искажению реальной картины - не учитываются некоторые аллели у гетерози-гот (Deka R. et al., 1992). Кроме того, часто невозможно определить точный размер аллелей и, следовательно, неизвестными остаются истинные частоты их встречаемости в популяции, т.е. становится крайне сложно проводить популяционно-генетические исследования или генетическую "паспортизацию" личности (Levontin R. and Hartl D.,

1991; Chakraborty R. et al., 1991.; Sullivan К. et al.., 1992) .

Короткие тандемные повторы (КТП) как высокополиморфные маркерные системы ДНК лишены большинства недостатков, указанных выше. Именно поэтому они нашли применение в качестве удобных молекулярных маркеров при картировании генома, для диагностики моногенных болезней, в исследованиях по изучению особенностей генетики популяций, для идентификации личности (Edwards A. et al., 1991., 1992; Wall W. et al., 1993; Alford R. et al., 1993; Bates G. and Lehrach H., 1994; Brinkmann В. et al., 1996; Sprecher С. et al., 1996). Важными преимуществами КТП в подобных исследованиях, наряду с высокой гетерозиготностью, менделевским типом наследования и соматической стабильностью, является легкость их анализа при помощи nu,P(Saiki R. et al., 1985; Дейвис К., 1990). Сущность такого исследования сводится к анализу полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК (ПДАФ-анализ) , получаемых на матрице того или иного тестируемого генетического локуса. Это позволяет быстро, просто и относительно безопасно проводить скрининг большого количества образцов геномной ДНК в популяцион-но-генетических исследованиях и анализировать малые количества ДНК (в том числе и частично деградированную), что до последнего времени нередко было лимитирующим фактором при генетической идентификации личности.

Известные к настоящему времени весьма ограниченные данные о частоте и распределении аллелей КТП в высокополиморфных локусах показали как значимые отличия, так и сходство показателей информативности в различных популяциях мира (Edwards A. et al., 1991., 1992; Wall W.

et al., 1993; Alford R. et al. , 1993; Brinkmann B. et al., 1996;1998).

Популяционно-генетический анализ КТП в популяциях бывшего СССР до сих пор не проводился, между тем подобные исследования представляются весьма интересными в силу неоднородности этнических групп стран СНГ. Необходимо получить значительный объем генетических данных для выявления сходства или различий как внутри одной, так и между различными популяциями.

Эти исследования актуальны и для решения теоретических и практических проблем популяционной генетики человека. В частности, это относится к проблеме генетического разнообразия популяций при изучении полиморфизма на уровне двух подклассов ДНК-маркеров - VNTR и STR(КТП).

Они имеют непосредственное отношение и к созданию удобной технологии для генетической идентификации личности с помощью набора нейтральных ДНК-маркеров типа КТП.

Все вышесказанное предопределило направление данного исследования, связанного с поиском, отбором и изучением надежных генетических маркеров для популяционно-генетического анализа, и разработкой на их основе эффективной системы, пригодной для генетической идентификации личности.

1.1. Цель и задачи исследований

Целью работы является изучение полиморфизма три- и тетрамерных тандемных повторов (ТТП) ряда структурных генов человека в трех популяциях СНГ, оценка возможности его применения для популяционно-генетических исследований и создания коллекции монолокусных полиморфных

маркеров для нерадиоактивного варианта метода геномной дактилоскопии.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Осу�