Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование гена SRY при некоторых нарушениях детерминации пола (XY "чистой" форме дисгенезии гонад, синдроме Шерешевского-Тернера, XX инверсии пола)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование гена SRY при некоторых нарушениях детерминации пола (XY "чистой" форме дисгенезии гонад, синдроме Шерешевского-Тернера, XX инверсии пола)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ

Г Г 5 о л НАУК

- МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 576.316.74 +616.056.7 Осипова Галина Романовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА БЯУ ПРИ НЕКОТОРЫХ НАРУШЕНИЯХ ДЕТЕРМИНАЦИИ ПОЛА (ХУ "ЧИСТОЙ" ФОРМЕ ДИСГЕНЕЗИИ ГОНАД, СИНДРОМЕ ШЕРЕШЕВСКОГО-ТЕРНЕРА, XX ИНВЕРСИИ ПОЛА)

03.00.15 - "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997 г.

Работа выполнена на кафедре медицинской генетики Российской медицинской академии последипломного образования и в лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор С.И.Козлова доктор биологических наук, профессор О.В.Евграфов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило доктор медицинских наук, профессор В.А.Бахарев

Ведущее учреждение:

Институт молекулярной генетики РАН, Москва.

Зашита состоится " /¿> " 1997 года

в_часов на заседании Диссертационного совета

Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва, 115478, ул.Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_ ^МШЛ/ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук,

Н.АЛяпунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование генетических основ детерминации пола у человека является одним из перспективных направлений современной генетики. Широкий интерес к изучению детерминации пола на уровне генов продиктован не только стремлением понять генетическую регуляцию этих явлений, но и желанием улучшить лечебно-диагностическую помощь больным с различными формами нарушений полового развития, а также консультативно-диагностическую помощь семьям, имеющим подобных больных.

Нарушения полового развития представляют собой обширную ipynny заболеваний с высокой клинической вариабельностью и генетической гетерогенностью. Наследственные заболевания, обусловленные нарушением генетической детерминаций пола имеют большой удельный вес в структуре нарушений полового развития. Характерными признаками этой группы заболеваний являются количественные и структурные аберрации половых хромосом, а также несоответствие фенотипа генетическому полу (набору половых хромосом) индивида. Наиболее распространенными среди нарушений генетической детерминации пола являются три нозологические формы: синдром Шерешевского-Тернера, XX инверсия пЪла'и "XY "чистая" форма дисгенезии гонад. Частота рождения больных детей составляет 1:1500 девочек при синдроме Шерешевского-Тернера (Connor & Loughlin, 1988), 1:20000 мальчиков при XX инверсии пола (de la Chapelle, 1981) и 1:100000 девочек при XY "чистой" форме дисгенезии гонад (Дежур с соавт., 1993).

Изучение этиологических причин этих заболеваний на уровне исследования структуры ДНК обусловлено, прежде всего, ограниченностью информации, получаемой при анализе дифференциально окрашенных хромосом. Результаты этого анализа являются необходимыми, но, в некоторых случаях, недостаточными для проведения дифференциальной диагностики, выбора пола, выбора оптимальных методов лечения больных и проведения медико-генетического консультирования их семей (Saenger, 1993; Кирпатовский и Голубева, 1992; Окулов и Негмаджанов, 1993).

' Несомненные доказательства ведущей роли хромосомы Y в детерминации пола послужили поводом для активного изучения ее структуры и картирования Y-специфических генов (Affara et al., 1994; 1996). Ключевую роль в детерминации мужского пола связывают с функцией гена SRY (Sex-determining region Y chromosome) (Sinclair et al.,

1990). Подтверждением этого являются несколько наиболее убедительных доказательств. Время экспрессии гена Sry в клетках полового валика совпадает с периодом эмбриональной дифференцировки семенников у мыши (Gubbay et al., 1990). Трансдукция гена Sry. мыши приводит к рождению XX самцов (Koopman et al., 1990). Мутации в гене SRY являются причиной развития XY "чистой" формы дисгенезии гонад (Hawkins, 1993) у человека. Присутствие гена SRY в геномной ДНК больных с XX инверсией пола ассоциируется с полным развитием мужского фенотипа (Lopez et al., 1995), а у больных с синдромом Шерешевского-Тернера - с проявлениями гермафродитизма (Saenger, 1993). Таким образом, исследование гена SRY у больных с различными нарушениями детерминации пола позволит лучше понять этиопатогенез этих состояний, разработать методы дифференциальной диагностики, дополнить критерии выбора паспортного пола и оптимизировать сроки хирургической и терапевтической коррекции признаков пола для лучшей социальной адаптации больных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли гена SRY в этиологии XY ^'чистой" формы дисгенезии гонад и в развитии признаков мужского пола у больных с синдромом Шерешевского-Тернера и XX инверсией пола/

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Проанализировать спектр мутаций в гене SRY при XY "чистой" форме дисгенезии гонад.

' - 2. Проанализировать гено-фенотипические корреляции в группе больных с XY "чистой формой" дисгенезии гонад.

3. Провести скрий'инг ДНК больных с XX инверсией пола на наличие гена SRY и оценить роль этого гена в развитии признаков мужского пола на данной группе больных. .,Sp , ;,

4. Провести скрининг ДНК больных с синдромом Шерешевского-Тернера на наличие, гена SRY и оценить роль этого гена в развитии признаков мужского пола на данной группе больных.

Научная новизна. Впервые проанализирован спектр мутаций в гене SRY на выборке больных с XY "чистой" формой дисгенезии гонад российской популяции. Обнаружены два различных типа мутаций -делении и нуклеотидные замены. Впервые показано существование клинического полиморфизма и генетической гетерогенности в группе больных с XY "чистой" формой дисгенезии гонад. Доказана возможность существования скрытого мозаипизма по Y хромосоме в различных тканях у больных с синдромом Шерешевского-Тернера. Установлена зависимость развития тестикулярной ткани от наличия гена SRY в ..геномной ДНК клеток крови и/или гонад. Существование

значительного клинического полиморфизма в группе больных с XX инверсией пола обосновано выявленной генетической гетерогенностью-.

Практическая значимость. Разработана и предложена для практического использования высокочувствительная методика выявления скрытого мозаидизма по Y хромосоме у больных с синдромом Шерешевского-Тернера и XX инверсией пола на основе полимеразной цепной реакции. Методика также может быть использована для идентификации маркерной хромосомы, являющейся дериватом Y, и для определения скрытой транслокации части Y хромосомы, содержащей ген SRY. Результаты скрининга ДНК больных с XX инверсией пола и синдромом Шерешевского-Тернера могут быть использованы в практической работе врачей по диагностике носительства Y-хромосомных последовательностей у больных с XX инверсией пола и синдромом Шерешевского-Тернера, а также для проведения дифференциальной диагностики внутри этих групп больных. Данные, полученные в результате работы, позволяют обоснованно подойти к выбору методов хирургической и терапевтической коррекции признаков пола.

Положения, выносимые в защиту

1. Разработаны методики исследования1 гена SRY при различных нарушениях детерминации пола (XY "чистой" форме дисгенезии гонад, Синдроме Шерешевского-Тернера и XX инверсии пола).

2. Выделены клинические фенотипы и типы генетических изменений при XY "чистой" форме дисгенезии гонад.

3. Детекция гена SRY при синдроме Шерешевского-Тернера позволяет прогнозировать наличие тестикулярной ткани, расположенной внугрибрюшинно.

4. Выделены варианты изменений генотипа при XX инверсии пола на основе исследования гена SRY.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит таблиц, 1 схему и рисунков. Библиографический указатель содержит источников.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании кафедры медицинской генетики РМАПО (октябрь 1996), на совместном семинаре лаборатории ДНК-диагностики и лаборатории.

клинической цитогснетики МГНЦ РАМН (декабрь 1996), на семинаре поликлинического отделения МГНЦ РАМН (май 1996), на конференции "Геном человека-96" (Москва, январь 1997). Диссертация обсуждена на заседании апробационной комиссии при Ученом Совете МГНЦ РАМН 6 .мая 1997 года. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

Отбор и обследование больных с синдром Шерешевского-Тернера, XX инверсией пола, XY '"чистой'" формой дисгензии гонад проводили в следующих клиниках г. Москвы - Тушинской ДГБ; Республиканской ДКБ; НЦАГиП РАМН; МГНЦ РАМН; ЭНЦ РАМН. Выборки больных формировали исходя из облигатных клинических признаков, характерных для этих заболеваний. .

Клиническое обслёдование больных проводилось . путем биотипологического анализа, а также использования данных УЗИ внутренних половых органов, лапароскопии и лапаротомии. Обследование больных с XY '"чистой" формой дисгензии гонад проводили совместно со старшим научным сотрудником лаборатории клинической генетики НЦАГиП РАМН д.м.н. Дзенис И.Г.. Степень половой зрелости оценивали по Таннеру (Tanner & Whitehouse, 1976). Вирилизацию наружных половых органов оценивали в соответствии с классификацией Прадера (Хертл, 1990). Морфологическое исследование гонад проводили с помощью световой микроскопии, совместно с патоморфологическими лабораториями ЭНЦ РАМН и НЦАГиП РАМН.

Цитогенетическое исследование (анализ G- и С-дифференциально окрашенных хромосом) проводили совместно с доцентом кафедры медицинской генетики к.б.н. Леликовой Г.П., а также часть больных была обследована в лаборатории цитогснетики МГНЦ РАМН (зав., проф. Кулешов Н.П.).

Для молекулярно-генетичсского обследования было отобрано 37 больных с синдромом Шерешевского-Тернера, 5 больных с XX инверсией пола и 26 больных с XY "'чистой" формой дисгенезии гонад.

Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК. выделенные из венозной крови и ткани удаленных гонад. ДНК из крови выделялй; методом, предложенным Lindblom & Holmlund (1988). ДНК из ткани гонад выделяли по методике, описанной Jackson et al., (1993) с' небольшими изменениями. Концентрацию. ДНК в пробе определяли спектрофотометрически.

Поли.v,eразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при помощи программно} е.мсго термоциклерг МС2 фирмы "ДНК технологии'" с использованием термофильной ДНК полимеразы Tennus aquaticus производства фирмы "Pharmacia".

В работе использован метод ПЦР с одной парой праймеров, фланкирующих открытую рамку считывания гена БИУ (Вегкоукг е{ а!/, 1992), и мультиплексная амплификация (МПА) с двумя парами праймеров, одна из которых аналогична использованной для ПЦР,' Другая - выбрана по выравненным последовательностям X и У хромосом - АМО и АМвЬ, соответственно (ЫакаЪоп е1 а1., 1991). '

Результаты ПЦР и МПА оценивали с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмиды рВЯ322, рестрицированную эндонуклеазой НаеШ. ;

Чувствительность МПА для определения скрытого мозаицизма по У хромосоме в тканях, определяли путем серии амплификации различных разведений мужской/женской ДНК.

Для поиска точковых мутаций в гене БИУ использовали метод регистрации конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (ББСР анализ), предложенный Огка е1 а1. (1989), с некоторыми изменениями! Модификация заключалась в проведении одновременного ББСР анализа набора фрагментов гена БЯУ, полученных после обработки ферментами рестрикции. Использовали различные вариации параметров ББСР для увеличения разрешающей способности метода.'Анализ проводили в ПААГ "с последующим окрашиванием серебром по методу В1шп й а1 (1982).

Для рестрикции использовали эндонуклеазы Руи П и Муа I производства фирм "АтегзЬат" и "Рготе$а".

Результаты молекулярно-цитогенетического анализа использовали для проведения гено-фенотипических корреляций.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Детекция траислокаций и делеций гена БЯУ.

Ген БИУ расположен в непосредственной близости к району гомологичного спаривания X и У хромосом. В процессе мейотического обмена между X и У хромосомами участок У хромосомы, содержащий ген БЯУ, может быть транспонирован на X хромосому. Подобное генетическое изменение обусловливает возможность возникновения гамет двух типов: гаметы с У хромосомой, утратившей ген БКУ, и гаметы с X хромосомой, несущей ген БЯУ. Яйцеклетка с равной вероятностью может быть оплодотворена каждой из этих гамет. В результате можно ожидать рождение ХУ женщин с делецией гена БИУ, либо рождение XX мужчин с транслокацией гена БИУ.

Методом МПА исследована ДНК, выделенная из крови 26 больных с ХУ "чистой" формой дисгенезии гонад и 5 больных с XX инверсией пола. Деления гена БЯУ обнаружена у трех больных с ХУ "чистой" формой дисгенезии гонад (11,5%) (Рисунок 1), у двух из них деления обнаружена в ДНК, выделенной из крови и в ДНК, выделенной из ткани удаленных гонад, что свидетельствует о гаметическом происхождении мутации. .,, V •

1 2 3 _.4. и<6 7 8 9

Рисунок 1. Результаты электрофореза в ПААГ образцов ДНК больных с ХУ "чистой" формой дисгенезии гонад и здоровых доноров после проведения МПА. Дорожки 1-6 - ДНК больных с ХУ "чистой" формой дисгенезии гонад; 7 - маркер молекулярного веса (рВ11 322 ;' Нае III); 8 - ДНК-здорового муж-чины; 9 - ДНК-здоровой женщины. Справа указана длина фрагментов. В дорожках 4, 5 .и 6 отсутствует полоса длиной 600 н.п..

Транслокация гена 5КУ обнаружена у трех больных с XX инверсией пола ¡60° о). Повышенная частота рождения XX мужчин с транслокацией гена 5ЯУ, по сравнению с частотой рождения ХУ женщин с дглгцией гена 5ЯУ также отмечена другими исследователями (Регаи^оп-ЗгппЬ & Ооос1Ге11о\\-, 1995).

Выявление транслокации гена БКУ у XX мужчин и делении гена \ ХУ женщин подтверждает ключевую роль гена 5ЯУ в детерминации

мужского пола и показывает, что одно», из причин, инверсий пола является рекомбинация между X и. Y хромосомами в области локализации гена SRY.

2. Скрининг ДНК больных с синдромом Шерешевскогй-Тернера на наличие последовательностей Y хромосомы. ■• . --м-г-

В литературе описаны две причины возникновения моносомии X при синдроме Шерешевского-Тернера (СШТ): потеря половой хромосомы в мейозе; потеря одной из половых хромосом в анафазе первого или второго митотического деления зиготы (Либерман, 1966). Таким образом, потеря половой хромосомы в мейозе приводит к рождению индивида с моносомией X во всех клетках, тогда как, потеря одной из половых хромосом в митозе приводит к рождению индивида, имеющего клеточные клоны с разными вариантами сочетания половых хромосом. По данным цитогенетических исследований, в среднем, у 50% больных с СШТ выявляют полную моносомию X, у остальных -различные варианты мозаицизма: 45,X/ 46,XX; 45,X/ 46,XY; 45,X/ 46,Х+таг; 45,X/ 46,Xi(Xq); 45,X/ 46,Xr(Y) и др., встречающиеся с неодинаковой частотой. При наличии клеточного клона, содержащего Y хромосому, у больных развиваются признаки мужского пола и опухоли в дисгенетичных гонадах. На основании значительного удельного веса кариотипа 45,X среди абортусов (95%)/ряд ученых предполагают, что элиминации подвергаются плоды с моносомией X во всех клетках, тогда как, мозаичные формы оказываются жизнеспособными. Таким образом, живорожденные больные с полной моносомией X могут являться носителями скрытого мозаицизма в том числе по клону клеток, содержащих Y хромосому.

В данной работе исследована ДНК, выделенная из крови 37 больных с синдромом Шерешевского-Тернера, имеющих полную или' частичную моносомию X и ДНК, выделенная из ткани удаленных гонад трех из этих больных (Таблица 1). ' ;

Последовательности Y хромосомы (SRY и AMGL) обнаружены у 14 больных (38%), в том числе у 6 из 29 (21%) больных с цитогенетически не выявленной Y хромосомой.

Наиболее часто последовательности Y хромосомы мы обнаруживали у больных, имеющих маркерную хромосому, которая, очевидно, является структурно измененной хромосомой Y. Из 6 больных, 1 из которых был зарегистрирован в мужском поле, последовательности Y хромосомы обнаружены у 3 (50%). Порученный ' результат согласуется с дайными литературы по исследованию маркерных' хромосом у" больных с дисгенезией гонад (Muller et al., 1987; Crolla et al., 1988; Lin et al., 1990; Diekmann et al., 1992; Lindren et al., 1992; Nagafiichi et al., 1992; Petrovic et

al., 1992). При этом, для идентификации маркерных хромосом используют целый арсенал различных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических методов. Большинство авторов подтверждают частую встречаемость маркерной хромосомы, являющейся дериватом Y, особенно если в семье пробанда сегрегации маркерной хромосомы не отмечено. Во всех обследованных нами семьях маркерная хромосома является результатом изменений генома, возникших de novo.

Таблица 1. Результаты скрининга 37 больных с СШТ на наличие последовательностей SRY и AMGL.

Кариотип всего больных SRY AMGL имеют Y хромосому

число больных %

45,X 13 + + 1(2)* 7,7 (15,4)

46,X+mar 3 + 2 66,7

45,X/46,X+mar 3 + + 1 33,3

45,Х/46,ХХ 4 + - 1 25

45,X/46,Xi(Xp) 1 - - 0 0

45,X/46.Xi(Xq) ' 1 - - 0 0

45,X/46,XXql3-- 1 - - 0 0

46,Xi(Xq) 2 - - 0 0

45,X/46,Xr(X) 1 - - 0 0

45,X/46.XY 5 + + 5 100

45,X/46,Xdel(Y) 1 + + 1 100

45,X/46,r(Y) 1 + + 1 100

45,X/46,Xidic (Yq) 1 + + 1 100

Условные обозначения: "+" -наличие признака; "-" -отсутствие признака; * -с учетом больного с гонадным мозаицизмом.

Более редкая частота встречаемости последовательностей У хромосомы нами была получена при исследовании ДНК больных с кариотипом 45,X. Она составила 15,4% (2 больных из 13). При этом, у всех больных были определены обе искомые последовательности У хромосомы, что было расценено как скрытый мозаицизм по клону 46,ХУ. Трудности с выявлением мозаицизма у данных больных при анализе дифференциально окрашенных хромосом, по-видимому, связаны с малым процентным содержанием,, либо полным отсутствием клона 46,ХУ в крови.. Описание наличия разных клонов в различных тканях одного и того же больного с СШТ встречается в литературе в виде

единичных сообщений (Либерман, 1966), что, очевидно, связано с трудоемкостью цитогенетического исследования разных тканей. Появление молекулярных методов, которые имеют ряд важных преимуществ перед традиционным анализом дифференциально окрашенных хромосом, привело к массовому обследованию больных с СИГГ на предмет наличия скрытого мозаицизма по клону клеток, содержащих У хромосому. В литературе имеется несколько сообщений о выявлении скрытого мозаицизма по гену БИТ у больных с кариотипом 45,X. Суммарные данные о результатах подобных исследований приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты исследования больных с 45,X на наличие скрытого мозаицизма по хромосоме У.

Число Выявлено Метод Чувстви Ссылка

больных случаев тельность

мозаицизма

14 1 ПЦР не Ме<3^ ег а1., 1992

4 1 ПЦР не Косоуа й а1., 1993

4 4 гибриди- 1:100000 Косоуа й а1., 1993

зация

15' " 2 ПЦР 1:100000 СоЮ е{ а1„ 1995

7 1 ПЦР не ТЬое1а1„ 1990

13 2 ПЦР 1:1000 Собственное

исследование

Условные обозначения: не - нет сведений

Метод ПЦР имеет большую разрешающую способность по сравнению с анализом дифференциально окрашенных хромосом. Разработанная нами методика МПА позволяет выявить скрытый мозаицизм по клону 46,ХУ, если на 1 ООО клеток крови не содержащих У хромосомы приходится 1, содержащая У хромосому. Однако, при использовании любых методов исследования, определение мозаицизма ограничивается числом осмотренных клеток и тканей. В настоящее время разработаны сравнительно простые методы, позволяющие выделять ДНК практически из любых тканей и клеток организма, доступных для исследования.

В данной работе исследована ДНК, выделенная из ткани гонад трех больных с СШТ. При этом, у больного с кариотипом 45,X, обнаружено наличие мозаицизма по клону 46,ХУ в ткани одной из гонад. Гонадный мозаицизм по клонам 45,X и 46,ХУ также обнаружен при исследовании

ДНК больного с кариотнпом 45,X/46,XY. Полученные результаты : и литературные данные подтверждают неравномерное распределение клонов 45,X и 46,XY в тканях больных с СШТ.

3. Поиск точковых мутаций в гене SRY при XY "чистой" форме дисгенезии гонад.

Для обнаружения точковых мутаций и малых структурных перестроек используют целый арсенал различных методов. К сожалению, ни один из них не позволяет выявлять 100% всех малых мутаций и имеет свои недостатки и преимущества. Одним из наиболее используемых методов для выявления новых мутаций является SSCP анализ, основанный на изменении электрофоретической подвижности коротких (100-400 н.п.) одноцепочечных фрагментов ДНК, в условиях неденатурирующего гель-элекгрофореза.

В данной работе был применен метод одновременного SSCP анализа набора фрагментов гена SRY, получаемых после обработки ферментами рестрикции. При этом длина самого короткого фрагмента в смеси была 62 п.н., самого длинного - 317 п.н.. Для повышения информативности SSCP анализа мы применяли разные рестрикгазы, что позволяло менять длины анализируемых фрагментов, а также варьировали ряд параметров, влияющих на разрешающую способность метода.

Методом SSCP анализа исследована ДНК, выделенная'из крови 23 больных с XY "чистой" формой дисгенезии гонад, и ДНК, выделенная из гонад 8 из этих больных. В трех образцах ДНК больных с XY "чистой" формой дисгенезии гонад было обнаружено изменение электрофоретической подвижности одного из набора исследуемых фрагментов гена SRY.

4. Скрининг ДНК больных с XX инверсией пола на наличие последовательностей Y хромосомы.

Возможность рекомбинации между X и Y хромосомами в процессе мейоза была предположена еще Ferguson-Smith в 1966 году. В последующие годы было не только доказано наличие подобных обменов между половыми хромосомами, но и выявлено, что 80% всех больных с XX инверсией пола имеют в своем геноме небольшую часть Y хромосомы, не видимую при световой микроскопии. В большинстве исследований показано, что последовательности Y хромосомы у больных с XX инверсией пола транслоцированы, как правило, на X хромосому, полученную от отца.

Нами исследована ДНК, выделенная из крови 5 больных с XX инверсией^ пола. Последовательности Y хромосомы обнаружены у 4 больных (80%), причем, в . трех случаях обнаружена только

последовательность гена БИУ, что было расценено как траислокацпя небольшого участка У хромосомы; а в одном случае - обе искомые последовательности (БЯУ и АМОЬ), что свидетельствовало о наличии скрытого мозаицизма по клону 46,ХУ (Рисунок 2). ■

Рисунок 2. Результаты электрофореза в ПААГ образцов ДНК больных с XX инверсией пола и здоровых доноров после проведения МПА. Дорожка 1 - ДНК- здоровой женщины; 2 - ДНК- здорового мужчины; 3 - маркер молекулярного веса (pBR 322 / Нае III); 4 - ДНК здорового сноса; 5 - ДНК больного П.И.; 6 - ДНК больного Л.С.; 7 - ДНК больного М.Л.; 8 - ДНК больного К.Е.; 9 - ДНК больного Н.В.; 10 - ДНК здорового отца. Слева указана длина фрагментов.

5. Гено-фенотипические корреляции при ХУ "чистой" Форме дисгенезии гонад.

Мутации в гене SRY должны приводить к нарушению развития гонад по мужскому типу у плодов, имеющих мужской набор половых хромосом (Haukins. 199?). По данным литературы мутации гена SRY обнаруживают у 10-15°о больных с XY "чистой'" формой дисгенезии гонгд. Большинство из них являются мутациями de novo, однако, выявлены и семейные случаи сегрегации мугантного гена среди индивидов мужского и женского пола в нескольких поколениях. Эти данные в сочетании с описанием семейных случаев "чистой" формы

23 456789 10

<-600 н.п. <-539 н.п. <-365 н.п.

дисгенезии гонад указывают на возможное участие Х-сцепленных или аутосомных генов в развитии данной патологии.

Полное обследование, включая подробный гистологический анализ ткани удаленных гонад, проведено 15 больным с XY "чистой" формой дисгенезии гонад. При проведении гистологического исследования гонад обнаружены два различных типа строения гонад. Один из них характеризуется наличием овариальной стромы без каких-либо герминативных элементов, другой - наличием семенных канальцев, окруженных клетками Лейдига. При проведении биотипологического обследования отмечено, что у больных с тестикулярным типом строения гонад имеются некоторые черты, присущие синдрому тестикулярной феминазации (СТФ): самостоятельное развитие молочных желез, слепо заканчивающееся влагалище, повышенный уровень тестостерона крови! Наряду с этим у всех больных обнаружены гипопластичные матка и фаллопиевы трубы, что противоречит диагнозу СТФ.

Делеции гена SRY и малые мутации в гене SRY обнаружены у 23% больных, что согласуется с результатами, полученными в других лабораториях. Так по данным Berta et al. (1990) больные с мутацией в гене SRY составили 18,1% (2 из 11); Jager et aï. (1990) - 8,3% (1/12); Hawkins et al. (1992) - 22,7% (5/22); Affara et al. (1993) - 22,7% (5/22); Iida et al. (1994) - 13,6% (3/22); Schmitt et al. (1995) - 66% (2/30). Частота встречаемости мутаций может зависеть от клинического полиморфизма внутри группы больных с XY "чистой" формой дисгенезии гонад. При пересчете доли мутаций приходящихся на больных, имеющих различные типы строения гонад, получены следующие данные: среди больных, имеющих овариальноподобную структуру гонад, доля мутаций составляет 37% (4 из 11), а среди больных с тестикулярным типом строения гонад - 0%. Таким образом, мутации гена SRY приводят к нарушению развития яичка на самых ранних этапах его дифференцировки.

Нами зафиксировано 6 случаев развития гонадобластомы в дисгенетичных гонадах. Причем гонадобластома обнаружена только в гонадах, имеющих овариальноподобную или соединительнотканную структуру. Мутации гена SRY в 50% случаев коррелируют с наличием гонадобластомы. Таким образом, нарушение функции гена SRY не только препятствует нормальной дифференцировке яичка, но и может сопровождаться развитием опухолевого процесса е недифференцированной гонаде.

6. Роль гена БЯУ в развитии признаков мужского пола у больных с XX инверсией пола и больных с СШТ. :

Развитие признаков мужского пола (строение внутренних и наружных половых органов, морфология гонад, развитие вторичных половых признаков) было проанализировано у 5 больных с XX инверсией пола и у 16 больных с синдромом Шерешевского-Тернера.

В группе больных с XX инверсией пола выделены три клинических типа: I тип - нормально сформированные мужчины с азооспермией; II тип - смешанная форма дисгенезии яичек; III - агенезия гонад у больного с мужским фенотипом.

Отличительными фенотипическими чертами больных I типа являлись: правильное развитие наружных гениталий по мужскому типу; развитие вторичных половых признаков (оволосение, мутация голоса, уровень тестостерона) по мужскому типу; двухстороннее развитие яичек; наличие производных вольфовых структур; отсутствие производных мюллеровых структур; азооспермия. Наряду с фенотипическим сходством у всех больных был обнаружен сходный характер изменения генотипа - транслокация гена ЗЛУ. Таким образом, результаты нашего исследования и литературные данные свидетельствует о том, что для полного развития мужского фенотипа достаточно наличия в геноме гена БИУ, а не целой У хромосомы (Епскзоп ег а1., 1995; Ьорег е1 а1., 1995) При этом необходимым условием является сохранность действия всех остальных генетических детерминант пола. К нарушению действия гена БЯУ, а следовательно, к клиническому полиморфизму у больных с подобной транслокацией может привести избирательная инактивация X хромосомы, несушей ген БЯУ (РссЬлег е1 а1., 1994).

II тип характеризуется клиническими проявлениями' смешанной формы дисгенезии гонад: односторонним развитием яичка; развитием производных мюллеровых протоков со стороны соединительнотканной гонады; двойственностью строения наружных гениталий. Чаще всего больные со смешанной дисгенезией гонад имеют кариотип 45,Х'46,ХУ, либо 46.ХУ (Ауиэо м а1., 1984; Ме'шЗег ег а1'., Т993).;Т1одобно'е состояние встречается и при кариотипе 45.X, причем у таких бйльных находят скрытый мозаицизм по клону 46.ХУ (УоНгаШ ет а!.. 1^2). В данном исследовании у больного с таким фенотипом были обнаружены гён:'ЖУ и агнтромерный регион У хромосомы, что позволяет утверждать о наличии у него химеризма ХХ/ХУ со значительным преобладанием клона 46,XX. Таким образом, развитие у него ' мужского фенотипа обусловлено действием У хромосомы. ' ' ,

Больной с ПГ'Клиническим типом представляет собой уникальный случай развития мужского фенотипа в отсутствии хромосомы У. Фенотипически у него отмечено правильно сформированные наружные

половые органы по мужскому типу; крипторхизм; агенезия матки; гипопластичные фаллопиевы трубы; развитые вольфовы структуры и овариальноподобный стромальный тип строения гонад, расположенных высоко в малом тазу. При применении МПА, последовательности, У хромосомы у больного не обнаружены. В соответствии с существующими на сегодняшний день классификациями половых нарушений, данный больной не может быть отнесен к какой-либо из нозологических единиц. В литературе встречаются единичные описания подобных случаев. При этом некоторые ученые считают, что причиной может быть измененная экспресия генов, регулируемых тестостероном (Беауег й а1., 1994). Другие полагают, что к подобному фенотипу приводит мутация аутосомных или Х-сцепленных генов, детерминирующих развитие яичка (Воисеккше С. й а1., 1994; МсЕ1геауеу К. с1 а!., 1993). Описание семейных случаев указывает на возможность повреждения генов, не сцепленных с У хромосомой.

У больных с синдромом Шерешевского-Тернера могут встречаться следующие признаки мужского пола: двойственное строение наружных гениталий в виде гипертрофии и/или вирилизации клитора, урогенитального синуса; маскулинизация фенотипа в пубертате; повышение уровня андрогенов. ... - ..

Развитие признаков мужского пола у больных с СШТ связывают с наличием в их геноме У хромосомы: Однако, обнаружить ее при анализе дифференциально окрашенных хромосом удается только у 6% больных (Бае^ег, 1993). Причина развития признаков мужского пола у остальных больных остается не вполне ясна. Кроме того, возникновение опухолей в дисгенетичных гонадах больных с СШТ также связывают с присутствием У хромосомы.

Примененная в данной работе методика МПА позволила обнаружить несколько случаев скрытого мозаицизма по У хромосоме как в крови, так и в гонадах больных с СШТ, а также идентифицировать маркерные хромосомы.

Мы провели сравнительный анализ между строением наружных половых органов и наличием или отсутствием гена БКУ в геноме 37 больных с СШТ. Двойственное строение наружных половых органов выявлено у 13 больных. У 12 из них (92,3%) обнаружен ген БЯУ. Особый интерес представляет больной М.Т.86. По данным исследования ДНК крови этого больного следует отнести в группу БИУ-негативных больных с умеренно выраженной вирилизацией наружных гениталий. Однако, исследование ДНК, выделенной из ткани гонад, показало наличие гена БИУ в геномной ДНК левой гонады. Этот случай показывает, что двойственное строение наружных гениталий. может быть обусловлено гонадным мозаицизмом по У хромосоме. Обнаружение мозаицизма в

крови может лишь косвенно указывать на существование его в гонадах. Последнее утверждение демонстрирует случай Н.С.179. У этой больной обнаружено отсутствие гена БЯУ в ткани правой гонады при наличии его в крови и ткани левой гонады.

В таблице 3 показано, что зависимость между двойственным строением наружных половых органов и наличием хромосомы ..У, определенной анализом дифференциально окрашенных хромосом, менее специфична, чем при проведении МПА.

Таблица 3. Результаты цитогенетического и молекулярного обследования у больных с двойственным строением наружных, половых органов.

Двойственное строение наружных половых органов (13 больных)

БЫУ "+' > БЯУ "- У хромосома "+" У хромосома "-"

число % число % число % число %

больных больных больных больных

12 92 1 8 7 54 6 46

. У больных с вирилизацией наружных половых органов У Хромосома определена лишь в половине случаев, а ген БЯУ во всех случаях, за исключением одного. При этом выраженность вирилизации не зависит от того, каким методом обнаружен мозаицизм по У хромосоме, а также от процентного содержания клона 46,ХУ и сохранности структуры У хромосомы.

Одной из возможных причин двойственности строения наружных половых органов у исследуемых больных могла явиться гормональная активность тестикулярной ткани в период эмбриогенеза. Лапароскопия с последующим изучением морфологии гонад проведена 14;. больным с СШТ, 13 из которых имели ген . БЯУ. ,, .

Дисгенетичная ткань яичка обнаружена у 11 БИУ-позитивных больных. У большинства больных она., была представлена разнокалиберными семенными канальцами без просвета, выстланными клетками Сертоли. В части гонад обнаружены скопления интерспщиальньгх клеток. Герминативные клетки обнаружены лишь у 2 больных. У 7 больных тестикулярная ткань обнаружена с одной стороны, преимущественно слева, у 4 - с двух сторон. Примечательно, что 3 их 4 больных с билатеральным расположением яичка были воспитаны в мужском поле, так как имели выраженную вирилизацию наружных половых органов.

Таким образом, обнаружение гена SRY в геноме больных с СШТ с большой степенью вероятности может указывать на наличие у них тестикулярнбй-ткани. Такая ткань, расположенная внутрибрюшинно, способна к опухолевому перерождению. Поэтому поиск гена SRY в геноме больных с СШТ позволяет расширить показания к оперативной тактике'лечения и выявлять группу риска по развитию опухолей в гонадах. В данном исследовании был обнаружен лишь один случай развития гонадобластомы у больной с СШТ, обследованной нами в возрасте 18 лет. По данным Бронштейн (1978), доля развития опухолей в дисгенетичных яичках увеличивается с возрастом (от 17% в допубертатном периоде до 72% - в постпубертатном). Позднее возникновение опухолей дает возможность не спешить с гонадэктомией и тщательно продумать тактику ведения больного с целью правильного развития фенотипа в пубертате.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики исследования гена SRY при различных нарушениях детерминации пола: методика детекции гена SRY в составе мультиплексной полимерезной цепной реакции с амплификацией гомологичных фрагментов X и Y хромосом (чувствительность выявления Y хромосомы -1 на 1000 клеток); методика выявления точковых мутаций в гене SRY путем одновременного SSCP анализа набора фрагментов гена, получаемых после обработки ферментами рестрикции.

2. При XY "чистой" форме дисгенезии гонад выявлены два типа генетических изменений в области гена SRY: делеции гена и точковые мутаций в HMG-боксе, которые обнаружены у 23% больных, из них делеции гена SRY - в половинб случаев.

3. Выделены два клинических фенотипа XY "чистой" формь: дисгенезии гонад, отличающиеся морфологией дисгенетичных гонад Для одного фенотипа характерно наличие овариальной стромы, которая i 54% случаев сочетается с гонадобластомой, для другого фенотап; характерно наличие семенных канальцев без герминативных элементов Мутации, гена. SRY в 100% случаев коррелируют с наличием овариалъно( ткани и в 50% случаев - с наличием гонадобластомы.

4. При проведении скрининга на наличие гена SRY при синдром! Шерешевского-Тернера, у больных с числовыми и структурным! изменениями Y хромосомы в кариотипе ген SRY был обнаружен во все: случаях, тестикулярная ткань выявлена только у 87% обследованных

Среди больных с не выявленной Y хромосомой в кариотипе ген SRY был обнаружен у 21%, у них тестикулярная ткань выявлена в 83% случаев. Детекция гена SRY позволяет прогнозировать развитие тестикулярной ткани в дисгенетичных гонадах, расположенных в брюшной полости.

5. Анализ частоты выявления гена SR Y в цитогенетически однородных группах больных с синдромом Шерешевского-Тернера показал, что среди больных с числовыми и структурными изменениями Y хромосомы ген SRY выявляется в 100% случаев, среди больных с маркерной хромосомой в кариотипе - в 50% случаев, среди больных с регулярной моносомией X - в 15% случаев, среди больных со структурными аберрациями X хромосомы ген SRY не выявляется. Показана необходимость детекции гена SRY у больных с регулярной моносомией X и больных с маркерной хромосомой в кариотипе.

6. При проведении скрининга у больных с XX инверсией пола, ген SRY выявлен у 80% больных. Обнаружено два варианта изменений генотипа лежащих в основе клинического полиморфизма XX инверсии пола: транслокация гена SRY (75%); низкий процент мозаицизма по клону 46,XY (25%). У всех больных, имеющих ген SRY, обнаружена тестикулярная ткань.

СШСОЮРАБСГГ; ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ОсиповаГ.Р. Генетика развития пола и его нарушения. //Генетика, 1996, Т.32, N 2, С.184-191.

2. Осипова Г.Р. Молекулярно-генетические методы обследования пациентов с нарушениями полового развития. //Тез. Материалов I научной сессии Российской медицинской академии последипломного образования. Москва, 1995, С.57.

3. Осипова Г.Р. Исследование гена, ответственного за развитие мужского пола, при различных нарушениях полового развития. //Бюллетень межрегионального общества медицинских генетиков. Москва, 1995, N2 С. 6-7.

4. Osipova G.R., Dzenis I.G., Bogdanova Е.А., Kondrikov N.I., Kisileva I.A. Clinical and genotypical polymorphism in patients with 46 XY kariotype. //Abstract 7th European Congress on Pediatric and Adolescent Gynecology, Vienna-Austria, 12-15 March 1997, C.171.

5. Осипова Г.Р., Леликова Г.П., Евграфов O.B. Исследование больных с XX инверсией пола. //Репродукция человека, 1997, Т.З, N 3.