Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецептор-зависимая регуляция Na, K - АТФазной активности в гладких мышщах подвздошной кишки собаки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецептор-зависимая регуляция Na, K - АТФазной активности в гладких мышщах подвздошной кишки собаки"

МИНИСТЕРСТВО НАРОДНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАЗАХСКОЙ СОР КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ О.М. КИРОВА

На правах рукопиои

Смагулова Зухра Шайхиевна

РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ На,К -АТВазНой АКТИВНОСТИ В ГЛАДКИХ ШШЦАХ ПОДВЗДОШНОЙ КИШКИ СОБАКИ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических Наук

Алма-Ата 1991

Работа выполнена в лаборатория физиологии мембран Института физиологии АН КазССР

Научный руководитель - доктор биологических наук,

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение -

Защита состоится "

профеосор О.В.Бсырев

доктор биологических наук, прсфеосор З.С.Сеитов

доктор медицинских наук, црофеааор БД".Скипина

Киевский ордена Ленина и ордена Октябрьской революции государственный университет им.Т,Г.Шевченко, НИИ физиологии

С>о

Гчаоов

на заседании специализированного оовета К №8.01,16 при биологическом факультете Казахского государственного университета им. С.НЖиройа» г* Алма-Ате, 480121, улица Тимирязева, 46.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казахского государственного университета.

Автореферат разоалан г.

Ученый оекратарь специализированного оовета кандидат биологических наук

Ж.АЛакенов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На+,к+ -активируемая -ЧФаза С На,к-АТ&аза, К.Ф. 3.6.1.37) являетоя интегральным компонентом На,к-наооса, который поддерживает специфический иг-'щШ ооотав среда •щетки, способствует передаче внутриклеточных и межклеточных сигналов я утаотвует в регуляции ряда клеточных процессов.

Во многих гладких мышцах шгекопи' зющих алектрогенный На.К-наоос служит важным фактором, определяющие величину мембранного потенциала и регулирующим сократительную активность гладкомы-шечной клетки. Неясно, как в гладких мышцах регулируется работа На,К -насоса. В плазматической мембране мышечных клеток и клеток других типов он является объе-том физиологической регуляции агонисташ ядрено-, холин-, серотонин- и дсфаминерги'шоких ре-пепто,ров. Молекулярный механизм модуляции На.к-АТФазно.; активности , знными не"ротрансшттерами остается неизвестным. Поскольку указанные рецепторы- принадлежат к семейству рецепторов, ко • торые участвуют в активации различных йигналпроводшцих путей через их взаимодействие с мембранными ПФ-связыващими белками ( о-белками),''можно предположить, что Иа,к-АТМза является клеточным эффектором, сош тженным о рецепторами черег о -белки. Сведения об участии этих белков в сопряжении рагличных рецепторов с ка,к -АТФазэй в гладких мышцах отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью работы было: исследовать рецептор-зависимую регуляцию ацетилхолином и серотонином Иа,к-АТФаэной активности сарколеммы гладких мышц продольного и циркулярного слоя подвздошной кишки собаки. Анализ состояния исследуемой проблемы позволил сформулировать следующие задачи:

I) исследовать участие На,к -насоса в сократительных отв°тг1» гладких мппщ продольной полоски подвздошной кишки ообяки ииду-

цируемцх ацетилхолином, оаротонином, норадреналином и уабаином;

2) разработать метод получения препаратов сарколеммы из гомо-генатов продольной и циркулярной гладких мышц подвздошной кишки собаки, обогащенных На,к~А1Фазной активностью, исследовать кинетические параметры На,к -А®азы препаратов сарколеммы обоих гладкоыышачных слоев}

3) выявить возможность укаотия регутторного ПФ-овязываще-го белка в функциональном взаимодействии между ацатилхолиновым и оеротониновым рецепторами и На.к-АТФазой в сарколемме продольной и циркулярной мышц|подвздошной кишки ообаки.

Научная новизна. Установлено, что возникновение сократительных ответов гладких мышц подвздошной кишки собаки под влиянием уабаина обусловлено как опосредованным выделением нейротрансмит-теров из нервных окончаний, так и прямым ингибированием Не,К -А®азы шадкомышзчных клеток, что указывает на участие Иа,к -насоса в регуляции сокращения этих мышц.

Разработаны методы получения'препаратов сарколеммы, обогащенных На,к-АИазной активностью из гладких мышц продольного а циркулярного олоев подвздошной кишки ообаки. Представлены биохи-мичеокие характеристики На,К-А1Фазы препаратов сарколеммы двух олоав гладкой мускулатуры.

Обнаружено, что регуляция "»»К-АТФазной активнооти оарколем-мы при активации рецепторов ацетилхолином и оаротонином зависит от типа мембранных препаратов ( невеэикулярнае, везикулярные и смешанные). Б везикулярных препаратах активация муокариновых хошшорецепторов ацетилхолином вызывает стимуляцию йа.к -АИаз-ной активности, опосредованную ионами натрия, входящими внутрь правильно ориентированны* везикул по ионному каналу, связанному о рецепторш.

На препаратах обработанных агентами» повышающими проницаемость мембраны, активация мускарнновых и серотониновых рецепторов приводит к ингибированию фердентативной активности. Ингибирование Эта, к -АТФазной активности обеспечивается включением связи-рецепторов с ферментом через й -белок. Установленная корреляция между содержанием в мембране рецепторов, о -белков и глубиной ингибирования на»К-АТ5азной активности более выражена в препаратах сарколеммы гладких мышц продольного слоя подвздошной кишки собаки.

Обнаруженные активирующий и ингибиругаций механизмы модуляции На,к -АТЬазной активности нейротрансмиттерами вносят вклад в понимание биохимической регуляции данного транспортного фермента плазматической мембраны.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработанные 'модели активирующего и ингибирующего механизмов действия ацетил-холина и серотонина на Нв,к -АТФазную активность сарколешы гладких мышц открывают новые направления исследований действия биологически активных ¿веществ на данный фермент. Разработанные способы выделения препаратов сарколешы гладкой мускулатуры тонкого кишечника собаки могут быть использованы в лабораторной практике.

Результаты работы могут представлять интерес для специалистов, занимающихся проблемами мембранного транспорта, и могут найти применение в клинической и экспериментальной медицине.

Апробация работа. Результаты работы были представлены на IV Всесоюзно:! конференции "Физиология и .биохимия медпаторных процессов" (Москва, 1985), Х.и XI Всесоюзных совещаниях по трале-портным АТ5азам (Алма-Ата, 1983, Ташкент, 1985), У Всесоюзном бпохимщрсш! съезде (Киев, 1986), I съезде физиологов Казатетч-

ui (Алма-Ата, IS08), IX Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Тбилиси, 19S0), Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1990), на конференциях молодых ученых АН КазССР и КазГУ им. С.М.Кирова (Алма-Ата, 1982, 1984, 1ЭЯ6).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Сшей литературы включает зс-/ источника. Работа изложена на Iíf страницах, содержит 4 таблицы и 25 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЗТСЙЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использовались гладкие мышцы подвздегшой кишки собак массой 6-8 кг. Сократительную активность гладкомышечной полоски регистрировали в изометрическом решше при помощи меха-нотрона 6MXIC, в растворе Кребса следующего состава ( мМ ): NaCl -118, KCl -5,7, CaOlg -1,26, ИаНС03 -25, NaH2P04 -1,17, Mgci2 -1,2, глюкоза II, pH - 7,2 при 37°C.

Препараты сарколеммы из грмогената гладких мышц кишечника и раздельно из гомогенатов продольного и циркулярного слоев кишечника i деляли методом (Метод I), разработанным нами на основе работ Grover А,к. и соавт.(1980) и Maeda т. и соавт.(1983), центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Для получения везикул сарколеммы гладких мышц кишечника был разработан метод (Мекд II) на осн ве работ M.J.Jaqua-Stev .rt и ооавт. Ц979), B.J.R. Pitta (1979) и J.р.Reevers и j.L.Sutko J980). Препарат Na,к -ATIазы i:.< солевой железы утки выделяй по методу, описанному в.в,Hopkins и ооавт. (1967). Конц!1:трацшо белка в мь. бранных препаратах определяли биуретовым методом (Gornal е.а., lr'4'J) р присутствии 1% дезоксихолата натрия. Активность А®аз

регистрировали по количеству неорганического фосфата (Фн), высвобождающегося в ходе ферментативной реакции а определяемого методом vv.B.Rathbun, u.V.Betlach (1969). Общую А©азную активность определяли в среде следующего соотава(мМ): Трис-HCI 50, pH - 7,2-7,4, NaCl - 100, KCl - 20, ATS - 3, MgCl2- 3, ЭДТА -0,1, ЭГТА - 0,5, НаНэ - 5 при 37 °С, Mg-АТФазную активность определяли в той же среде, лишенной KCl и содержащей 120 мМ NaCi . Na,К -АТФазную активнооть расочитывали по разнице между общей и Mg-Атаазными активностями. Уабаин-чувствительнуга Na,к -диезную активнооть рассчитывали по разнице мевду общей и активностью, измеренной в той же ореде в присутотвии I0"4 М уабаина. Для определения полной каталитической активности Na,K-ATSa3H препараты обрабатывали додецилсульфатом Na или аламетицином. Сук-цинатдегидрогеназную активность определяли методом, описанным "Н.Д.Ещенко и Г.Г.Вольским (1982), Са^-гранспортирующую активность - с помощью Са^-селективного электрода (тип 20-15 "Сгу-tur ", ЧССР). Na,Ca. -обмен регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции хлрртетрациклша (ХТЦ) на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 650-60 (Япония). Специфическое связывание антагониста м-холинорецепторов %-хшуклидинилбензилата (3Н-ХНБ) с препаратами сарколеммы определяли по методу l.R. Jones и соавт. (1981). Электрофорез проводили по методу и.K.Laemüi (1970). Ультратонкие срезы препаратов сарколеммы исследовали с помощью электронного микроокопа ЭМВ-ЮО (СССР). АДФ-рибозилиро-вание ГИ-свпзывающих белков проводили, как описано в работе M.P.Daniienko и соавт. (1990).

РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Роль натриевого насоса в регуляции оократительной активности ВаДШЕ-МИЯ продольной полооки подвздошной кишки собаки. Изоли-

ъ.

роъошше полоски подвздошной кишки обладали спонтанной ритмической активностью (фазные сокращения). Стимулирующие эффекты аце-•гилхшшна (АХ) на амплитуду и частоту фазных сокращений устранялись м-холинолитическим агентом атропином ЦСГ^-Ю"8 М). Мети-аергид(5«10~11-1»Ю~1^ М) - специфический блокатор серотонино-вых рецепторов, и пирроксан(10~® М), обладающий оС-адреноблоки-рующей активностью, предотвращали сократительные ответы изолированной полоски на оеротонин (СТ) и норадреналин (НА), соответственно. Специфический ингибитор На,к -АТФазы уабаин (Ю-И-Ю"8 М) увеличивал амплитуду и частоту ритмических сокращений (рис.1). По характеру сократительные ответы на уабаин были подобна сокращениям, вызываемым нейромедиаторами.

Вызванное уабаином увеличение сократительных ответов гладких мышц снижалооь на 30-35$ каждым из использованных в отдельности антагониотов рецепторов. Атропин, пирроксал и мстисергвд при одновременном их действии снижали амплитуду сокращений, вызванных уабаином, до уровня фоновых, однако, частота сокращений при этом снижалась в среднем на 20-25%, но оотавалась увеличенной по от- '

Рис. I. Угнетение оокра-тительных ответов гладко-* мышечной, полоски подвздошной кишки, вызванных уабаином, совместным действием атропина, метиоер-гида и пиррокоана. Стрелки - внесение уебайка (10~9 М); атропин(IО"9 М) + метисергид (Ю""10 М) + пирроксан (10~10 М).

ношении к контрольному значению на 50-60/? (рис. I). Индуцируемое уабаинем (I•10""® М) увеличение амплитуды и частоты фазных сокращений полностью снималось после внесения в камеру блокатора фосфоинозитидного обмела неомицина в концентрации 0,5 мМ. Более того при совместном действии уабаина и неомицина эти парамитри были ниже контрольных. Неомицин сникал также и сократительные ответы, вызываемые нейротрансмиттерами. После непродолжительной инкубации мышечной полоски с неомицином ответы на АХ (8.10~*® М) отсутствовали. Кроме того, при совместном дейотвии АХ и неомицина амплитуда фазных сокращений была.'несколько ниже контрольных значений. Сократительные ответы, вызванные СТ и НА, также предотвращались неомицином.

Найденное сходство между действием уабаина и нейротрансмитте-ров на развитие сократительной активности гладкомышечного препарата, по всей видимости, обусловленное стимуляцией фосфоинозитидного обмена, дало нам основание дагя предположения, что в действии медиаторов на ритмические сокращения гладких мышц подвздошной кишки собаки присутствует элемент ингибирования шли На,к-насоса (активности На^к-Атаазы) сарколеммы гладкомышечных клетск.

Характеристика препаратов сарколеммы гладких мышц подвздошной кишки собаки. Препараты сарколеммы гладкой мускулатуры подвздошной кишки собаки получали разработанным наш способом (Метод I). При центрифугировании в отупенчатом градиенте плотности сахарозы исходный материал разделялся на фракции, локализованные на границах гомогенат-15^ (Фг), 15-3(7,2 (Ф2), 30-35$ (Фд), 35-41?» (Ф4) растворов сахарозы. В качестве маркера плазматических мембран служила активность На,к-А1Фазы. При анализе ее величины по фракциям было выявлено, что наибольшей 1Га,к-А1Фазной активностью обладала фракция Ф3 , составившая 7,В±1,8 мкмоль Фн/мг белка.

•8 i

чао. В присутствии уабаина в концентрации U, вызывающей полное торможение данного фермента в различных тканях (Болдырев, 1981), активность Ма,к-А1Фазы в Ф3 ооотавила 2,9¿0,5 мкмоль Фц/мг белка«чао. На основании этого было сделано предпо-

Л

ло*ение, что фд содержит везикулярные мембранные структуры, Na,к -АТФазная активность которых может не выявляться. С целью повышения проницаемости мембраны и облегчения доступа субстрата« ионов-активаторов и уабаина к реакционным цейтрам На,к_Атаазы препараты сарколеммы предварительно инкубировали о анионным детергентом додецилсульфатом натрия (ДОН), Такая обработка приводила к возрастанию ферментативной активности более чем в 4 раза и полному тормояаниа этой активности уабаином М). Анализ влияния уабаина на активность На,к-А1Фазы в обработанных и необработанных детергентом препаратах показал, что они содержали правильно ориентированных (ПОВ), неправильно ориентированных везикул (НОВ) и незамкнутых фрагментов оарколеммы (®С), соответственно 70,3$, 14,6$, 15,1/о, Отсутствие окоалат-отимулируе-мого поглощения Са5^ и низкая активность азид-чувствительной Mg -АИазы свидетельствует о том, что фд была достаточно очищена и не содержала примесей внутриклеточных мембран. .

Зависимость На,к -АТЭазной активнооти от соотношения Na+ и к+ в ореде инкубации была выявлена в препаратах сарколеммы, обработанных ДОН. Эта зависимость имела аосиматричный максимум при 100 мМ NaCi и 20 f«í«) KCi , При стандартной концентрации АТ£ 3 мМ оптимальное молярное отношение Mgci2/A® составило I. Кривая рН-зависимости активности На,К -АТ&азы Имела максимум при значении рН - 7,1. При оптимальных условиях Максимальная активность На,к -АИазы препаратов сарколеммы, обработанных ДОН,, ооотавила 30,5 мкмоль Ф/мг белка«чао.

Характеристика везикулярного препарата сарколеммы гладких мышц подвздошной кишки и регистрация в нем на.са-обмена* Для получения препарата сарколеммы с бол^им содержанием везикулярных структур нами был разработан метод (Метод II). Везикулярные препараты имели низкую активность На,г.--А©азы (I»8+0,5 мкмоль Фн/мг белка«час), примерно на 10-15% ингибируемую уабаином. Инкубирование препаратов о ДСН приводило к резкому увеличения этой активности, в среднем до 30,5 мкмоль ч>п/мг белка.час и полному подавлению ее уабаином. Мембранные препараты практически целиком состояли из ПОВ (97,252), лишь незначительная его часть состояла из НОВ (1,4$). Тшсэ ке количество составляли ®С.

Активность Иа,Са-обмена регистрироватась по скогхти поглощения Са2+ везикулами, предварительно нагруженными ионами натрия. При изучении На+-зависимого поступления Са2+ был выявлен 'ряд специфических характеристик антипорта: I)- нагруженные Яа+ везикулы накапливали Са2<" в отсутствии АТС; 2)- обработа .ше детергентом везикулы теряли способность накапливать Са2+; 3)-нагруженные К1" везикулы не поглощали ионы кальция. Лишь незначительное поглощение этих катионов обмечалось в препаратах предварительно нагруженных Ьл.+ ; 4)- аккумуляция Са2^ везикула!":, нагруженными Ма* отсутствовала, если среда для регистрации Ка,са -обмена содержала НаС1 вместо КС1; 5)- введение ЭГТА в среду на фоне стационарного уровня флуоресценции ХТЦ, доотигну-того в ходе реакции, Еызывало прогрессивное снижение его, обусловленное выходом из везикул Са2*, поглощенного в результате работа Иа.Са-обменника, п^ градиенту концентрации.

Характеристика препаратов сарколеммы гладких мышц продольно-¡^и^щкулярного слоев подвздошной кишки, собаки. Для одновременного выделения мембранных фракций из гомогената продольной

циркулярной мускулатуры кишечника был использован Метод I. В таблице суммированы результаты определения выхода белка и активности некоторых маркерных ферментов в. мембранных фракциях гомо-генатов (Ф-^-Ф^, - осадок полученный после центрифугирования гомогенатов в градиенте плотности сахарозы) продольной и циркулярной мышц. Как видно из таблицы, преинкубация мембран с ДСН приводила, в среднем, к 3-кратному возрастанию Иа.к-дзфазной активности, наивысшее значение которой наблюдалось во фракции Фд. В необработанных детергентом препаратах уабаин лишь частично (в среднем, на 40-50/2) ингибировал активность фермента. Это указывает на присутствие преимущественно везикулярных структур сарколеммы в полученных препаратах. Наличие везикулярных структур в препаратах сарколеммы подтверждается также результатами электронной микроскопии тонких срезов осадков фракции Фд продольных и циркулярных мышц. Фракции Фд содержали незначительные примеси митохондриалъных мембран и не содержали оинаптосом. Во фракциях Ф2-Ф4 Мв-АТФазная активность значительно превышала На,к -АТФазную (табл. I). Обработка мембранных препаратов детергентом вызывала инактивации ' Нв-А1Фазы. Активность маркера ми-тохондриальных мембран - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в фд весьма незначительна (табл. I). Кроме того, в Фд обоих мышечных слоев не было обнаружено оксалат-стимулируемого поглощения Са2*, характерного для фрагментов оаркоплазматического ретикулума.

Анализ зависимостей На.к-дт&азной активности ДСН-обработан-ных препаратов сарколеммы (Ф3) от концентраций На+> к+, Мвг+и • рН среды инкубации при стандартной концентрации АИ 3 мМ показал, что оптимальные условия для данной активности мембран как продольных, так и циркулярных мышц были одинаковыми. В обоих случа->гх Ыа.к-АИа^ная активность полностью подавлялась в присутствии

• Тя^щча

Бшсс„ белка (мг/г ткаш), ЛТФазная (мкмоль Фя/мг белка.чао) а оукцияатдегидроге назная (нмоль аукщшата/мг'белка»мин) активности мембранных фракц.,2 гомогенатов продольной и циркулярной мышц подвздошной кишки собаки ( п » 16)

Мышцы

Продольная

Циркулярная

1 {Фракция 1 Выход ' белка ! Т1а.к -АОФаоа ! Мк -А®£. а | ОДГ

| Контроль ■ +ДСН | Контроль +ДСН !

Ф1 ' 0,31±0,04 0,62±0,П 2,44±0,12 0,5110,07 0 0

ф2 0,5^0,10 ^3,23^0,2.0 12,0710,26 25,43±2,68 1,85±0,69 37,4±0,5

ф3 1,.^0,21 6,65^0,60 24,11±1,13 37,60^4,71 2,90±0,02 48,4„3,3

Ф4 1,16±0,22- 5,24±Р,29 П,62£0,85 39,20±3,77 2,9б±0,08 147,1*.,7

8I.60id.5I 2,44±С,06 8,86+0,57 2,1Гй,05 0 459,2155,4

0,47±0,06 1,02±0,05 4,26*0,28 0,51+0,01 0 0

ф2 0,76±0,15 7,83^0,36 22.82il.03 12,33^,45 -,.6210,28 ?.7,4±0,6

Ф3' 1,94±0,36 14,37±0,21 39.85il.34 32.8IiI.37 3.9710 36 32,3^2,5

• ®4 1,27±0,74 13,66£0,45 30,24±0.Л7 37,43*3,76 2,61±0,07 Я,8±5,5

ф5 73,30±Г,27 4,84±0,05 7,54±0,49 5,57±0,37 0 528,0±28,3

¡.О"4 Ы уабаина. Максимальная велич: ia активнооти На,к-А®азы в сарколемма циркулярных мышц более, чем в 1,5 раза была выше чей в препаратах из продольных мышц (табл.).

При анализе содержания белка На.к-АИазы во фракциях методом электрофореза в полиакриламидном геле ,i качестве маркера попользовали очищенную Na.K-АИазу солевой железы утки. При электрофореза препарата Ь-.к-АТФазы из солевой железы выявились две f лковые полосы о м.м. 94 и 60 кДа, соответствующие оС иyà-оубъединицам фермента ( Cantley , 1981).

Наибольшее количество белка 94 кДа отмечалось во фракции Фд обоих мышечных слоев. Распределениз этого белка по фракциям Фг $3 и коррелировало с активностью На,к-АТЬазы после ^бработк.. препаратов ДОН, Не было существенной разницы в содержании белка 94 иДа мг-цу фракциями ф£ и фз ДВУ* мышечных слоев, тогда как фракция Ф^ циркулярного слоя содержала ртого белки больше, чем Ф^ продольного слоя, г поставляя данные по фракциям о содержании белка 94 кДа, активности На,к-А1Фазы и Мв-А1Фазы, можно сделать вывод о неоднородности белкового пика 94 кДа, который, по всей видимооти, кроме ^ -оубъедчницы На,к-АТФазы содержит и другой белок j близкой молекулярной массой. Таким белком может быть белок Mg-АЙаза (около 100 кДа) по данным для сердечной и скелетных мышц ( Sabbadini, Dahma , 1989), активность которой была выше во фракциях продольного мышечного слоя, где более низкая активность На,к -АИаз Таким образом, фракци. Ф3 продольного и циркулярного слоев подвздошной кишки ообаки, обогащенные белком 94 КДа можно использовать для исследования свойств и особенностей регуляции Na,к • -А1Фазы, вычленяя ее активность путем ингибирова-№ уаоаином или вычитая активность «g -АТ5азы из общей активнооти. Кинетические параметры На,К-А1Фазн в препаратах фа обоих

О

мышечных олс ;в были одинакоь м между собой и параметрами фермента фракция Ф3, полученной из гомогената не. разделение1» на олои мышечной отенки кишечника. По-видимому, разница двух олоев обусловлена не различием в овойьтвах ¿»ряанта, а неодинаковым содержанием его молекул в мембране.

Влияние ацегалхсшфа на На.К-АТФазную активность препаратов сарколеммы гладких мышц подвздошной кшдки ообаки. В присутствии АХ отмечалось ингибированиэ Na,к-казной активнос ти препаратов сарколеммы, щделенных методом I. При этом угяаталаоь только уабаинчувствительная Иа,к-АИазная активность, т.е. активного ШС. kjtотчальное торможение наблюдалось при концентрации АХ,

равной 10""^ Ы. Атропин (Ю-' М) полностью предотвращал р звитиь

* •

инп0ирования АХ На.к-АТФазной активности. Эффекты АХ на препаратах, сарколеммы, обработанных ДСН, были нестабильные. Как выяснилось по нашим, а также по литературным даннйм ( Jones е.а., 1980), ДСН оказывает повреждающее действие на гемдранные ферменты. В дальнейших экспериментах по исследованию механизма ш.^и-бирующего действия АХ на активность Na.K-АТФазы нами использовался порообразующий полипептид алаыетицин, который повышаят проницаемость мембраны для ионов и небольших органических молекул и является мягким агенте i для мембранных белков ( ^akker , 1979). Сравнительный анализ показал, что кинетика На,к -АТ5аз-ной а-тивности при обработке мембранных препаратов как ДСН, так и аламетицином, была идентичной.

На везикулярных препаратах, выде^. иных методом II, при воздействии АХ, Na,к -АТЬазная активность стимулировалась. И этот эффект АХ предотвращался атропином. Преинкубация о ¿л-метицаном в таких препаратах приводила к обращению действия -тониота, когда активация фермента сменят-сь его резким ингибированием Сна 55.2),

В гчязи с этам возникло предположение, что активирующий эффект АХ связан с увеличением под его влиянием проницаемости мембраны для одновалентных катионов. С цс чью проверки этого т: модельных экспериментах мы исследовали влияние на активирующий аффект АХ агР"тов, специфически изменяющих про^цаемость мембраны для одновалентных йог в. В работе использовали калиевый и натриевый ионофоры чалиномицин и грамицидин Д, соответственно.

Валиномицин (1-5 мкМ) незначительно повышал активность На,к -АЗФазы. Добавление АХ на фоне ионофора приводило к дополнительному стимулированию фермента. Грамицидин Д (1-5 мкМ) увеличивал активность фермента исследованных препаратов, в среднем, на 20($» При этом аффект АХ был не ' тгько неадативным, но, как и в экспериментах о аламг""ицином, состоял в ингибировании ионофоршщуци-руемой активнооти На.к-АИазы и устранялся атропином. Уабаин 10""^ М устранял активацию Иа.к-АТФазы ацетилхолином, вали..оми-щ.лом и грамицидином Д.

Атропин (1<Г7 М) блокировал тормозящий эффект нейротраномит-тера в обработанных аламетицином препаратах сарколеммы гладкомы-шечных клеток. Это указывает на то, что ин чбирование на,К-АИ-азы АХ'обусловлено активацией м-холинорецепторов (м-ХР). Возможно предположение о существовании, в мембране функциональной связи между м-Г? и Иа.к-АЗФазой. На реальность существования такой связи указывает и высокая плотнооть м-ХР в препаратах оарколеммы гладких мышц по~вздошНой кишки собаки, обнаруженная нами по связыванию меченного антагониста м-ХР (3Н)-хинуклвдинглбеязилата. Наши данные указывают на то, что механизмы активирующего и инги-бирующего действия АХ на фермент различны. Но в том и другом случае они обусловлены стимуляцией нейротрансмиттером специфического рецептора, на что указывает предотвращение атропином, и

того, и другого эффектов. Эти эксперименты свидетельствуют о возможном существовании физиологической регуляции активности Na,K • насоса АХ. Активация на.К-АИазы АХ в везикулярных препаратах оарколеммы рассматривается, как опосредованная, за счет увеличения проницаемости мембраны для ионов натрия, при стимуляции м-Xi

Основным MOMwHTOM ингибирующего механизма, как и активирующего, является непременная стимуляция м-ХР. Естественно в связи о этим предположение, что глубина ингибирования На,к -АТ5азной активности может зависеть от плотности молекул м-ХР в мембране. Известно, что плотность м-ХР в продольной мышце подвздошной кишки млекопитающих, наивысшая, по сравнению о другим периферическими тканями ( Ladinaky е.а. , 1989). Кроме того, плотность м-ХР в продольном слое подвздошной кишки разных животных значительно выше, чем в целой мышце, в пересчете на I г ткани ( Youhida е.а.t 1979). Учитывая выше сказанное, представило интерес исследовать ингибирующее действие АХ на препаратах саркслеюлы, выделенных из гомогенатов продольного, и циркулярного мышечных слоев подвздошной кишки' собаки.

Влияние ацетилхолана и серотонина на активность на,к-А*КБазь препаратов сарколеммы гладких мышц продольного и циркулярного слоев подвздошной кишки собаки. АХ (Ю'^-Ю-4 М) вызывал концент--рационнозависимое снижение активности На,к -АИази в препаратах сарколеммы гладких мышц продольного и циркулярного слоев, преин-кубированных о аламетицином (рис. 2 а, б). Снижение активности фермента было более выражено в препаратах продольного мышечного слоя, чем в препаратах циркулярного слоя. Ингибироьание ферментативной активности в первом случае было на 55%, во втором - на 40% (рис. 2 а, б). СТ оказывал на активность Na,K-ATia3u также, как и АХ, ингибирующее действие. И в данном случае, фермпнтатив-

[Ацетилхолин], (М)

Рио. 2. Эффокты холинергических агентов, ГТ5^й и н -этил-малеимида на Кг.к-АИазную активнооть препаратов оарколеммы продельной (а) и циркулярной (б) мышц подвздошной кишки собаки.

I - АХ; 2 - ь присутствии ИФ^ я (50 мкМ); 3 - атропина (Ю~7М); 4 - и -этилмалеимида (0,1 мМ).

100 Г*" -А-

--А _ _

80

е

о о 60 - N

V

1 40 • \

20

-А 4 3

-А--ж 3

\

9876 9876

[С е р о Т О н и я] , -1&(М)

Рио. 3. аффекты серотонияергическлх агентов, ГО л 8 и п-этилмаленмида на На.к-АИазную активность препаратов сарколеммы продольной (а) и циркулярной чб) мышц подвздошной киикп ообаки.

7 в присутствии то- я (50 мкМ); 3 - мптсергила ии ¡и); 4 - н-зтилмалелмида (0,1 мм).

ная активность в большей степени ингибировалаоь в препаратах продольного (в среднем, на 50$), чем циркулярного слоя (в среднем, на 30$) (рис. 3 а, б). Чувствительность к ингибирующему дейотвша АХ в препаратах из обоих слоев оказалась на два порядка ниже чувствительности к СТ Срио. 2, 3). ^.к-АИазная активность обоих мышечных слоеь достоверно не изменялась нейротрансмиттерами. Эффекты АХ и СТ полностью устранялись, соответственно, атропином (Ю-*7 М) и метисергвдом (Ю-8 М) (рис. 2, 3), что свидетельствует о функциональном сопряжении рецепторов для данных нейротранс-миттеров а На,к-АТЬазой в сарколемме гладкой мускулатуры. Инги-бирование На, к-А® азы сарколеммы АХ и ОТ, возможно происходит о участием о-белков. С целью проверки этого предположения исследовалась зависимость степени ингибирования активности фермента от присутствия в среде аналога Г® ГН^з , который является активатором в -белков и на расщипляется ГТ&азой этих белков ( (5Ишап, 1987). Как видно из рис. 2 и 3, Ш^з в микромолярной концентрации углублял действие нейротрансмиттеров в препаратах сарколеммы обоих мышечных слоев. Этот эффект гуаниловых нук-леотидов предотвращался тиоловым реагентом Я -этолмалеимидоы ( N -ЭМ), который известен своим модифицирующим влиянием на сопряжение рецепторов с а -белком (рис. 2, 3), причем в данной концентрации тиоловый агент сам не модулировал активнооть фермента, ГЕВ^э в отсутствие нейротрансмиттерсв способен сам вызывать тороможение активности На.к-АТФазы, в отличие от ГД^оа (рис. 4). В этом случае также выявлялась большая степень ингибирования в препаратах сарколеммы продольного слоя,

Известный активатор о -белков ЛаР в наш« экспериментах приводил к ингибированиы на.к-АТБазной активности сарколеммы гладких мышц обоих слоев подвздошной кишки ообаки, причем инги-

л ь о о

аз

н К С

50

т—т

8 7 6 5 4 Гуаниловые нуклеотиды, (М)

Рио. 4. Зависимость ак-тивнооти Ма,к-Д1Фазц препаратов сарколеммы продольной (I, 4) и циркулярной'(2,3) мышц подвздошной кишки собаки от концентрации гуанило-вых нуклеотидов.

1,2-0 ; 3, 4 -

с ЭД^ .

Жирование в препаратах продольного слоя было более выражено. Эффект фторида натрия снимался также как и в экспериментах с влиянием гуаниловых нуклеотидов на эффект нейротраясмиттеров N -ЭМ. Следует однако отметить, что ы-чЭД не восстанавливал активность На,к~АТФазы до исходного уровня, что свидетельствует о том, что в ингибировании На,к-А1Фазы представлено действие ИаР как через о -белки, так и непосредственно на фермент. Отмеченная большая степень ингибирования активности На,к-АТЪазы в препаратах сарколеммы продольного олоя мышц АХ, СТ ГТ1>^ 3 и иаР дает основание предположить возможность неодинакового содержания с -белков в мембране, участвующих в передаче сигнала от рецепторов к Па, к -АТФазе гладких мышц продольного и циркулярного слоев кишечника. Электрсфоретичеокий анализ содержания о -белков по АДФ-рибозилировании коклюшным токсином показал присутствие на форег-рамме << -субъединицы о -белка с м.м. 40-41 кДа. Эти данные свидетельотвуют о том, что с -белка в мембранных препаратах продольного слоя значительно больше. Мы считаем, что именно этот белок, по аналогии о в —белком в аденилатциклэзной системе ( аптап , 1987), обеопечивает функциональное сопряжение м-ХР и

серотониновых рецепторов о Ма.к-АТФазой, что приводит к инги-бированию ферментативной активности.

Ингибирование На.к-АТЬазиой активнооти оарколеммы гладких мышц обоих слоев подвздошной кишки АХ и СТ имеет, видимо, физиологическое значение, поскольку наибольший эффект нейротрансмит-теров приходится I оаркодемму продольного слоя, играющего ведущую роль в синхронизации сократительной активнооти мышц кишечника.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что оократителыще ответы гладких мышц, вызванные уабаином, обусловлены как выбросом ацетилхолина, норадреналина и серотонина из нервных окончаний под его влиянием, так и ингибиро-ванием На, к-насоса гладкомышечных клеток. Эти данные указывают на то, что подавление электрогенной активности Ла,к-насоса вносит свой вклад в регуляцию сократительной активности подвздошной кишки собаки.

2. Разработаны два метода получения препаратов оарколеммы из гладких мышц подвздошной кишки собаки о различным содержанием везикулярных структур. Один из них удобен для одновременного выделения мембранных фракций сарколеммы из продольного и циркулярного слоев гладкой муокулатуры кишечника и исследования в этих фракциях регуляции активнооти На,к-А1Фазы. Вторым методом можно получать препараты о высоким содержанием везикулярных структур, что позволяет последовать ионный транспорт, в том числе На,к-насоо, Иа,Са-обмен и ионные каналы*

3. Представлена характеристика препаратов сарколеммы гладких мышц продольного и циркулярного слоев подвздошной кишки собаки по степени везикулярноати и чистоты. Определена полная каталитическая активность Иа.к-АЗФазы с использованием агентов, повышающих проницаемость мембраны.

4. Стимуляция На,к -АИгазной активности везикулярных препаратов сарколеммы гладких мышц подвздошной кишки собаки ацетил-холином, обусловлена входом ионов натрия по ионному каналу, сопряженному с мускариновым холинорецептором.

5. Ингибирующее действие ацетилхолина и серотонина на активность на,к -Айазы в гладких мышцах подвздошной кишки собаки обуславливается включением овязи мембранных рецепторов с ферментом через -белок.

6. Найдено, что На, к -АН? аз а сарколеммы продольной и циркулярной мускулатуры подвздошной кишки собаки характеризуется одинаковыми кинетическими параметрами, однако отличается чувствительностью к ингибирующему действию ацетилхолина и серотонина и модулирующему влиянию активаторов о-белков. Показано большее содержание белка о^ 40-41 кДа в препаратах сарколеммы гладких мышц продольного по сравнению с препаратами циркулярного слоя,

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Даниленко М.П., Есырев О.В., Омарова РД., Смагулова 3.111., Турмухамбетова В.К. Опосредованное м-холинорецептором ингибиро-вание на,к -АТФазной активнооти оарколеммы миокарда и гладких мышц кишечника ацетилхолином// Бюлл.экспер.биол. и мед. 1984. №9.0.259-261.

2. Смагулова З.Ш. Свойства На,к-А1Фазы сарколеммы гладкой мускулатуры тонкого кишечника// Изв. АН КазССР, сер.биол. 1984. № 6. С. 45-50.

3. Смагулова З.Ш., Даниленко М.П. Действие ацетилхолина на АТФазную активность препаратов сарколеммы гладких мышц кишечника ообаки// Труды 1У научн.конф.молодых ученых Ин-та физиологии АН КазССР, Алма-Ата, 1984. Рукоп.деп. в ВИНИТИ. Деп. № 86167085. С. 98-105.

4. Даниленко М.П., Есырев О.В., Омарова Р.Д., Смагулова З.Ш.,

Турмухамбетова В.К. Функциональное, взаимодействие на.к-АТФагы с рецепторами нейромедиаторов в миокарде и гладкой мускулатуре//Тез,

IV Всесоюз.конф."Физиология и биохимия медиаторных процессов". М, 1985. С.98. •

5. Есырев О.В.« Ващенко В.И., Смагулова З.Ш. Влияние биологически активных веществ на активность транспортных ферментов сарколеммы и саркоплазматического ретикулума различи . : мышц// Тез.

V Воесоюз.биохим.съезда. Киев. 1986. Х.2. С.381-382.

6. Ващенко В.К., Дшшленко М.П., Смагулова З.Ш. Регуляция активного транспорта ионов в мышцах// Тез.докл.конф.молодых ученых АН-КазССР "Молодежь и технический прогресс". Ал\ч5-Ата.1.36.0,1

7. Даниленко М.П., Смагулова З.Ш., Турмухамбетова В.К., Омаго-ва Р.Д., Есырев О.В. М-холинергическая регуляция активности А1Ф-азы в везикулярных препаратах сарколеммы миокарда и гладких мышц кишечника// кр.биохим.ж, 1988. Т.60. С.55-59.

8. Смагулова З.Ш,, Омарова Р.Д. Влияние нейромедиаторов на Иа,к -АТФазную а: явность сарколеммы гладких мышц тонкого кишечника собаки// Тез.докл. I съезда физиологов Казахстана. Алма-Ата. 1988. Т.2. С.92.

9. Смагулова З.Ш., Даниленко М.П., Ван, шо В.И., Лучинин Ю.С., Есырев О.В. Р ль натриевого насоса в регуляции сократительной активности гладких мышц// Тез.докл.симпоз."Биофизика и биохимия биологической подвижности". Тбилиси. 1990, 0.94.

Ю.Смагулова З.Ш., Даниленко М.П., Есырев О.В., Зумеров Е.Л. Характеристика А1Фаз"ой активности сарколеммы продольной и циркулярка мускулатуры подвздошной кишки собаки// Бю.:л.экспер.биол. и мед. 1990. № 10. 0.341-о43.

II.Есырев 9.В., Смагулова З.Ш., Даниленко М.П., Ьащенко В.И. Ингибирование натриевого насоса гладких мышц кишечника -.(етилхо-лином и серотоннном и значение ингибирования в сокг цении мшц// Цитология. 1990. й 9. с.929.