Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ГТФ-связывающего белка в сопряжении мускаринового холинорецептора и NA,K-АТФазы в сарколеммме миокарда

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль ГТФ-связывающего белка в сопряжении мускаринового холинорецептора и NA,K-АТФазы в сарколеммме миокарда"

' АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

ТУРМУХАМБЕТОВА Вера Константиновна

РОЛЬ IТФ-СШЗЬЮАЩЕГО БЕЖА В СОПРЯКШШ! МУСКАРШЮВОГО ХОЛШОРЕЦЕПТОРА И Иа.к-АТФазы. • В САРКОЛЕММЕ МИОКАРДА

03.00,13 - физиология человека и животных 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой'степени кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1993

Работа выполнена в 'лаборатории физиологии мембран Института физиологии АН Республики Казахстан

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор О.В.Есырев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук;

-■ профессор Е.Г.Скипина

доктор биологических наук, профессор Бейсенбаева Р.У,.

Ведущее учреждение - Институт молекулярной биологии и

биохимии, им, М.АДйтхожина АН Республики Казахстан

Защита состоится "_" &e{f/£€t:td<£> 199$-

на заседании спещ1ализировашогосовета К 008,21.01 при Институте физиологии АН Республики Казахстан по адресу: 40G032, г.Алма-Ата, Академгородок, Институт физиологии

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке АН PK ""[г. Алма-Ата. ул.Шевченко. 28).

Автореферат разослан " " Л'/CQ'lZ /сЛ:; 1993 г

Учений секретарь ' епещгалиеировашюро севера кандадаг биологических паук К.Базаралдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ Актуальность прблемн. 1,гп,К-А®аза (1Га -насос) (К.§.3.6. 1.3.)является объектом интенсивного изучения и играет (Тундамен-тачьную роль в клеточной физиологии, а также в развитии различных заболеваний, в том числе сердечной недостаточности. Несмотря на важность понимания для клеточной биологии нормальной регуляции и патологии ;;п-насоса, мало известно о его регуляции на мембранном уровне. Имеются указания на то, что ингибирование На,К -АТФ-азной активности миокарда ацетилхолиноы, возможно, связано со стимуляцией мускариновых холшюрецепторов (н-ХР). В силу того, что мускариновые холинорецепторы функционально сопряжены в плазматической мембране с регуляторнымг ГТШ-связывающиш белкаш (G-белками), могло предполагать участие этих белков в опосредовании модуляции Na, к-АТФазной активности агонистами мускариновых. холинорецепторов. В этой связи,' исследование роли ГЙ-связываще-го белка в регуляции ио.к-АТЬазноЙ активности сарколеммы миокарда, опосредованной активацией мускаринового холинорецептора, представляется актуальной проблемой. Для решения этого вопроса плодотворным будет использование мембранных препаратов сарколеммы, представляющих собой физиологическую модель процессов возбудимости клетки миокарда.

Цель и задачи исследования. Целью работы было: исследовать мембранный механизм ингибирования Ип,к-АТ<5азной активности сарколеммы миокарда кролика и собаки холинёргическими агонистами через ГГФ-связывайщий белок» Исходя из поставленной цели, бы- ' ли сформулированы следующие задачи:

I) исследовать влияние холинергических агонистов на актив-«>сть иа,к-АИазы и-ее Частной реакции, уабаин-чувствительной ^-активируемой 4-нитрофенилфосфатазной активности (К-п-НФФази) грепаратов сарколеммы желудочков сердца собаки и кпогиия „

вить зависимость их эффекта от гуаниловых нуклеотидов ; .

2) выяснить влияние различим модуляторов ГТФ-связывающих белков (гуаниловых нуклеотидов, и-этилмалеимида, Л1 и коклюшного токсина) на активность Иа,К-АТФазы и К-л-ШФазы сарколеммы миокарда ;

3) провести иммунохнмическую идентификацию о^-субъединицц ингибиторного ГТФ-связыващего белка ( с^белка) в препаратах сарколеммы микарда ;

4) доказать существование в мембране функционального сопряжения между м-ХР, ГТФ-свяэывающим белкой и 1:а,К-АТФазой путем реконструкции этой систеш из отдельных компонентов сарколеммы микарда.

Научная новизна. Установлено, что активация мускариновых холинорецепторов в везикулярных препаратах сарколеммы миокарда собаки и кролика, с нарушенной аламетицином проницаемостью мембраны, вызывает ингибирование активности Ка,К-АТФазы в результате функционального сопряжения в мембране фермента с ГТФ-сназывающим белком, йнгибирущий эффект ацетилхолина проявляется только в присутствии ГТф или его стабильных аналогов. Снижение Иа.к-АТФазной активности может быть вызвано стабильным аналогом ГШ даже в отсутствие ацетилхолина. С помощью коклюшного токсина, специфических аитисшзороток и метода реконструкции функционального сопряжения между Иа,к-АТФазой и ПФ-связываю-щим белком с использованием очищенных белковых препаратов из сарколеммы миокарда, показано участие ГГ$-связывающего белка в передаче сигнала от муёкаринового холинорецептора на На.к-АТФа:

Разработана система подходов для регистрации ингибмрущего и активирующего эффектов холщергических агонистов на На,к-АТ£азную активность препаратов сарколеммы миокарда желудочков.

Разработан методический подход для анализа агонист-стиму-

лируемого связывания гуаниловых нуклеотидов с ПГФ-связывающгш белком по изменению активности НаД-АТФазн в условиях нативного мембранного окружения.

.Теоретическое и практическое значение работы. Р езультаты проведенных исследований дают новые представления о регулящш активности натриевого насоса в миокарде. Сочетание различных методических подходов, использованных в данной работе, макет найти применение при исследовании регуляции других мембранных ферментов. Поникание молекулярных механизмов, лежащих в основе рецептор-сопряженной системы, включающей мускариновый холиноре-цептор, ПФ-связывающий белок- и Но,к-АТЗазу, будет способствовать развитию терапевтических стратегий для лечения ряда заболеваний сердца..

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Проведена идентификация ГТФ-связывакщего белка, осуществляющего передачу сигнала от ыускаринового холинорецептора на На,к -АТШазу.

2. Доказано существование в мембране функционального сопряжения ыускаринового холинорецептора, ГТФ-связывающего белка и и»,х -АТФазы.

Апробация работы. Результаты работы'были доложены на III и 1У Всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия кедиатор-ных процессов" (Москва, 1980, 1985), III и ГУ конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 198Г; Ашхабад, 1986), I и II Съездах физиологов Казахстана (Алма-Ата,1988 ; Караганда, 1992), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси,1989),

Публикации. По теме диссертации опубликовано II научных работ, полный перечень которых приведен з конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 308 источников. Работа изложена fia страницах, содержит 3 таблицы и 24 рисунка,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В исследованиях использовались препараты плазматических мембран (сарколеммы) из сердечной мышцы собаки и кролика. Про-' параты сарколеммы желудочков сердца получал:, методами м. J.'Jaqua--Stewart и соавт. (1979), J.Р.Reeree и J.b.Sutko (IS80), B.J.R Pitts (1979), M.P.Penchenko и V.A.Tkachuk(I984), Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом (Кочетов, 1971). ЛТФ-азную активность определяли по накоплению неорганического фосфата, высвобожденного в ходе реакции (Rathtun,Betlach,1969)(ме-тод I) и по окислению НАД.Н в сопряженной ферментной системе (метод 2) ( НогЪу ,1988).Уабаин-чувствительную Na,к -АТФазную активность рассчитывали по разности между общей АТФазной активностью и Mg-АТФазной активностью, измеренной в тех же средах в присутствии 10"^ M уабаина. Для определения полной каталитическс активности г/а, к --АТШазьг препараты сарколеммы обрабатывала доде-цилсульфатом натрия (ДСН) и аламетицином. :

К-п-Н®азную активность определяли путем непрерывной регистрации превращения п-нитрофенилфосфата в п-нитрофенол при 400 Ны ( Horgan,Киурега^Эб?) на спектрофотометре ShimadEu UV-260 (Япония). lia/Ce -обмен регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции хлортетрациклина на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 650-60 (Япония). Специфическое связывание антагониста -м-холинорецепторов %-хинунлндинилбензилата с препарата!ш сарколеммы определяли по методу L.R. Jônes

Мембраны сарколеммы солюбилизировали детергентом ckaps методом '.i.iiorochaaiii и соавт. (1988) с небольшими модификациями. Гель-фильтрацию солюбилизированной сарколеммы проводили на колонке с сефарозой cl -6В, заполненной буфером, состоящим из ZW глицерина, 5 мМ сплрз, 50 мМ трис-ПИ (РН 7,5 ; 4°С), 200 мМ ifaci, 50 мМ КС1, I мМ ЭДТА, 2 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ФМСФ. АДФ-рибозилирование G-белков коклюшным токсином проводили методом, описанным п.Daniionko и соавт. (1990). Для определения эффекта коклюшного токсина на ферментативную активность и идентификации ПК-связывающих белков, чувствительных к коклюшному токсину, мембранный препарат или белковые фракции послз гель-фильтрации инкубировали в среде инкубации в присутствии и в отсутствие (контроль) 20 мкг/мл ноюшшного токсина. Электрофорез проводили по методу U.K.Laemmli (1970), иммуноблог-тинг - методом H Towbin (1979). Ультратонкие срезы препаратов сарколеммы исследовали с помощью электронного микроскопа ЭМВ--100 (СССР).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУДЦЕШЕ .

Характеристика препаратов сарколеммы желудочков сердца собаки.Препараты сарколеммы миокарда желудочков сердца собаки, выделенные методом п.J. Jaqua-Stcv/art и соавт. (1979) обладали активностью На,к-АТФазы, ингибируемой специфическим ингибитором Па,к-АТФазы - уабаином» в концентрации зывающей полное торможение данного фермента в различных тканях. Данная активность составила 14 шшоль Ф„/мг белка-час.

H

Уабаин на 100$ подавлял эту ферментативную активность. Активность На,к-АТФаэы в мембранных препаратах, выделенных методом п.J.-Jaqua-stev/art и соавт. (1979) не изменялась ДСН. Это позволяет считать, что они представляют собой незамкнутые <*ра-

гменты сарколеммы. Препараты сарколеммы миокарда, вццеленные методом J.r.Roove3 и J.L.Sutko (1980) имели низкую активность Иа,к-АТ2>азы. Обработка препаратов ДСН (0,3 мг/мг белка), с целью повышения проницаемости мембраны и, тем самым, облегчения доступа субстрата, ионов и уабаина к реакционным центрам АТФазы, приводила к резкому увеличению этой активности от 2,9 до 66,5 мкмоль §н/мг белка^час. Результаты экспериментов позволяют заключить, что препараты сарколеммы, в.деленные методом J.P.Reeves и J.L.Sutko (1980) в основном состоят из замкнутых. мембранных везикул. Анализ эффектов ДСН и уабаина показал, что везикулы в наших препаратах имеют,, главным образом, правильную ориентацию. Наличие везикулярных структур в препаратах сарко-' леммы желудочков сердца собаки подтверждается данными электрон-■ ной микроскопии тонких срезов осадков фракции сарколеммы. Доказательством высокой степени везикулярности наших препаратов сарколеммы является также выявление в них Па/Са -обмена.

Наивысшая активность фермента в препаратах сарколеммы, выделенных методом J.P.Reeves и J.L.Sutko (Г980) и обработанных ДСН, наблюдалась при соотношении ионов натрия и калия в среде инкубации равном' 100/20 мМ и эквимолярных концентрациях LigCi^ и АТФ равных 3 мМ. рН оптимум для На,к-АТФазной активности сарколеммы миокарда лриходился на 7,4. Основные характеристики везикулярных препаратов сарколеммы желудочков сердца собаки и кролика, выделанных методами В."J.E.Pitts (1979), M.P.Panchen-ko и V.A.Tkachuk "(1984) и свойства 11а,К-АТФазы были аналогичны вышеописанным для везикулярных препаратов сарколеммы, выделенных методом J.P.ReevesH J.L.Sutko (1980).

Влияние холинергических агонистов на На.к-АТФаз-ную и К-п-Н'Мазную активности сарколеммы миокарда

Изменение :Ja,K-AT3? азной активности незамкнутых фрагмент

тов сарколеммы желудочков сердца собаки под влиянием ацетилхо-

—7

лина (АХ). Ацетилхолин в концентрациях 10" -10" М тормозил активность Иа.к-АТФазы везикулярных фрагментов сарколеммы же- , лудочков сердца собаки, выделенных методом м.j.jaqua-stewart и соавт. (IS79). Антагонист мускариновых холинорецепторов ат-

п

ропин в концентрации, 10 i'.l блокировал ингибирующее действие АХ. сто дало основание предположить, что ингибирование Ыа,К-АТФаз'ы ацетилхолином обусловлено активацией м-ХР. В наших препаратах сарколеммы, желудочков сердца собаки действительно присутствуют м-ХР, что доказывается связыванием специфического антагониста Н-хинуклидинилбензилага ("л-ХНЕ).

В настоящее время хорошо известно, что м-ХР сопряжены с различными клеточными эффекторньми системами через семейство мембранных ГТФ~связыва:ощих белков и для передачи сигнала от рецептора к эффектору требуются микро;*олярнда концентрации (порядка 50 мкМ) ГТФ. Поскольку в этих экспериментах в реакционную среду не добавляли ГТ5, то есть основание предполагать, что ингибирующий эффект АХ на ^а,К-АТФазу, в нашем случае, вероятно, обусловлен участием с-белков, активация которых достигается за. счет И®, присутствующего в качестве примеси в коммерческих препаратах АТФ, полученных из биологических объектов..

Стимуляция ацетилхолином Иа,к:-АТФазной активности в везикулярных препаратах сатжолеьйлз желудочков сердца собаки. Активность 11а,к-АТЭ?азы везикулярных препаратов сарколеммы желудочков сердца собаки, выделенных методом J.Р.Reeves и J.L.Gutко (1980) стимулировалась в присутствии ацетилхолина.

В результате действия порообразующего антибиотика алам.е-тицина активность фермента тормозилась в присутствии нейротран-

смиттера. Его чувствительность при это к АХ была такой же, как В препаратах, содержащих незамкнутые фрагменты сарколеммы, выделенных из данного источника. Результаты опытов с аламетици-ном указывают на то, что необходимым условием проявления стимулирующего эффекта АХ-на 1Та,к-АТФазу является наличие в препаратах веэинул сарколеммы с ненарушенной проницаемостью мем-

п

бран. Эффекты АХ предотвращались атропином (10 М). Поскольку обработка препарата аламетицином, способств; щая повышению проницаемости мембран, приводила к устранению активирующего действия АХ, а атропин также снимал это действие, то правомерно предположение, что данный эффект АХ связан с увеличением проницаемости для одновалентных натионов, активаторов '¡а,К-АТФазы, т.е. эффект АХ связан с функционированием каналов, контролируемых рецепторами,

В модельных экспериментах роль натрия и калия в исследуемом процессе была выяснена с помощью ионофоров для одновалентных катионов. Специфический калиевый ионофор валиномицин (1-5 мкМ) незначительно повышал активность йа,к-АТФазы и не изменял эффект АХ, что указывает на непричастность К1- к активации фермента ацетилхолином. Натриевый ионофор грамицидин Д (1-5 мкМ) имитировал действие нейротрайсмиттера, вызывая активацию фермента, При этом, эффект АХ состоял в ингибировании ионофорин-дуцируемой АТФазной активности. Результаты этих модельных опытов указывают на то, что стимуляция фермента агонистом м-ХР обусловлена ионами натрия, входящими в правильно ориентированные везикулы сарколеммы.

Таким образом, в присутствии грамицидина Д, везикулы становятся, в некоторой степени, подобными незамкнутым фрагментам сарколеммы, в которых На,к-АТФаза ингибируется нейротрансмитте-

ром. Следовательно, нужно считать, что холинергическая регуля-идя Ка,Х-АТФазы сарколеммы миокарда осуществляется, по крайней мере, двумя способами: а) активацией фермента путем повышения, под влиянием АХ, проницаемости мембраны для ионов натрия, стимулирующих фермент и б) ингибированием ферлента в результате взаимодействия в мембране комплексов м-ХР и На,к-АТФазы.

Кнгибирозаиие карбахолином ÇKX) иа.к-АТФазной и К-п-Ш>-аз но Г: активностей сарколеммы желудочков сердца собаки и кролика. Как показали результаты экспориметов с ионофорами, для исследования ингибирующих эффектов АХ на Па,к-АТФазу могут быть пригодны везикулярное препараты с. искусственно вызванной проницаемостью мембраны. Увеличение проницаемости мембран можно вызвать, кроме ионофоров, обработкой' мембран детергентами или аламетицином, вызывающим высокую неспецифическую проницаемость мембран. Учитывая вышеизложенное, в последующей работе мы отказались от использования мембранных препаратов, выделенных по методу п.J.Jaqua-ste\7art и соавт. (1979), а исследования проводили ка везикулярных препаратах, проницаемость которых увеличивалась обработкой детергентами или аламетицином. Метод J.P.Reeves и j.i.Sutko(1980) в принципе был пригоден для этого, однако, с целью получения более очищенных препаратов с большей активностью lia,К-АТШазы мы заменили данный метод на методы 3.J.R.Pitta (1979) и Î.Î.P.PanehenkoM V.Л.Ïkach.uk (1984). Чтобы исключить влияние мембранной ацетилхолинестеразй, в опытах использовали негидролизуемый аналог ацетилхолина - карбахолин. В работе использовался аламетицин,. который является мягким аге-гом для мембранных белков.

На рис Л представлена запись АТФазной реакции в условиях эегенерации АТФ (метод 2). При внесении в среду аламетицина от-

мечалась лаг-фаза продолжительностью 2-4 минуты (кривая I), после чего скорость АТФазной реакции оставалась линейной в течение, как минимум, Ю минут. Кинетика К-п-ШФазной активности .(парциальной реакции На,К-АТФазы) была подобной АТФазной и на рис.2 (кривая I) показано, что в этом случае аламетицин также действовал с лаг^фазой, после чего устанавливалась линейность реакции. В последующих экспериментах определение обеих ферментативных активностей проводили в средах, со держащих аламетицин (20 мкг/мл). На фоне аламетицина уабаин, в концентрациях 0,2 мЫ и 1,0 ыМ вызывал полное ингибирование АТФазной и К-п-ШЯ>-азной активностей, соответственно (рис. 1,2),

-В отсутствие гуаниловых нуклеотидов ни Иа,к-АТШазная (рис1 кривая 2), ни К-п-БЁ§азная (рис.2, кривая 2) активности не изменялись при воздействии 10-100 мкМ КХ. Однако, добавление в среду 50 ыкМ ГТФ (рис.1,2, кривые 5) приводило к проявлению достоверного ингибирования холиноииметиком данных ферментативных активностей. Картина развития ингибирующего действия КХ в присутствии негидролизуемого аналога ГШ - ГТФ-yS (рис.1, кривая б, рис.2, кривая 7) была аналогичной, однако, требовалась значительно меньшая концентрация этого нуклеотида. Эффекты КХ били достоверны и концентрационно зазисимы. В присутствии ГТФ^з максимальное ингибирование карбахолином активности На,к-АТФазы в мембранных препаратах миокарда собаки составляло 40$, а концентрация КХ, вызывающая 5094-ное торможение (Kq g) составила .' 0,5 мкМ. Аналогичные значения максимального ингибирования и -KQ^g были получены в опытах с ¡Га,к-АТФазной активностью мембран сердца кролика, .В случае с К-п-НФФазной активностью сарколеммы миокарда кролика величины.максимального ингибирования и Kqj5 были равны, соответственно, 45^ и 0,3 мкМ.

1

2

Рис Л. Влияние аламетицина, гуаниловых нуклеотйдоНт-кар-бахол!ша и уабаина на кинетику Иа.к-АТФаэНой активности препаратов сарколеммы миокарда кролика. Реакцию стартовали добавлением мембранного препарата (МП)- в среду инкубации, не содержащую (I) или содержащую (2-7) аламетицин (АЛ). Стрелками указано внесение добавок. У-уабаин, 0,2 мМ.

лх

'I 2 3 -5 6 .7

Рис.2. Влияние аламетнцияа, гуаншговых яуклеоткдов, карбахолкпа и уабаляа на скорость гидролиза п-НМ препаратаж сарколеделы лшокарда кролика. Реакцию стартовали добавлением мембранного препарата (МП) в среду инкубации не содержащую (I) и содержащую (2-7) аламетицин (АЛ). Стрелками обозначено внесение добавок. У-угбаин, I мМ. Даяние по 10. препаратам.

Стабильный аналог ГДФ - ГДФ^ , в концентрации 10 мкМ не промо-тировал эффект КХ на К-п-НФФазу (рис.2, кривая 4) и На,К-АТФ-азу (рис.1, кривая 3). Атропин предотвращал индуцированное КХ торможение обеих ферментативных активностей.

йтфекты гуаниловых нуклестидов на 1:а,к-АТФазную и К-п-НШ-азную активности сарколеммы миокарда.

> Стабильный аналог ГТФ - ГТФ^ э сам вызывал снижение На,К-АТФаэной и К-п-ВИ>азной активностей препаратов сарколеммы и в отсутствие КХ (рис.1, кривая 7, рис.2, кривая 6), тогда как ГДФр з , далее в концентрации 100 мкМ, практически не влиял на данные ферментативные активности (рис.1, кривая 4, рис.2, кривая 3). Ингибирующий эффект ГШ^ был концентрационно зависимым, максимальное ингибирование составляло 45% (на рис. не показано). КХ вызывал 10-кратное увеличение в кажущемся сродстве мембранного препарата к ГТФц 3 без изменения максимального ин-гибигорного эффекта этого нуклеотида.

На рис.2 видно, что эффект нуклеотида на К-п-Н<М>азу развивался с лаг-фазой продолжительностью около 3 минут, которая исчезала в присутствии КХ (рис.2, кривые 6,7). Подобная лаг-фаза была отмечена и в действии этого аналога ГТФ на Иа,к-АТФазную активность (рисЛ).

Изменение холинергических эффектов на На.к-АП>азу и К-п-НФФазу в присутствии -этилмалеимида (н-ЗМ). фторида натрия и при обработке мембранных препаратов коклюшным токсином.

Предварительная инкубация препаратов сарколеммы с бактериальным коклкшлш токсином (20 мкг/мл) в присутствии 100 мкМ НАД приводила к потере способности На, к-АТФазы и К-п-ШФазы ■ отвечать на воздействие КХ, хотя эффект РТФу эсохранялся (рис. 3 А,Б)

1 ей

4 ё

л Ф

Ч "О

0

1 &

т о

КХ, , .100 мкМ|

2 мин / / 90

ГТЩз / , / ^

1мкм / / 1 ' /

1 Шгу ^60

/I мкМ' о

/ о

/ / аз

' / ■ И 30

/ 13

/ ^

у к

0

X

1

I

X

Рис.3. ГТФ^З -зависимый эффект КХ на К-п-НФФазную (А) и Иа,к-АТФаэную (Б) активности мембранных препаратов, преинкуби-рованных в присутствии (I) ив отсутствие (2) коклюшного токсина. В опытах использована сарколемма миокарда кролика (А) и собаки (Б), а - контроль ; б - ГП>^3 , 0,1 мкМ ; в - ГТФ^э + 100 мкМ КХ. Стрелками обозначено внесение добавок.

В дашмх условиях коклюшный токсин катализировал АДФ-рибози-лирование сС -субъединицы й-белка с 1,1.м. 40-41 кДа. С целью идентификации -субъединиц с,-белка, чувствительного к коклюшному токсину» мембранные белки- анализировали методом им-муноблоттинга с использованием специфических антисывороток к синтетическим пептидам, аналогичным пептидам,' входящим в состав аминокислотной последовательности двух изоформ о^-субъе-диниц ингибнторного а-белка -белка): о^ 2 ноС* 3, а также

-субъединшу gq-белка, также чувствительного к коклюшному токсину. Показано, что в сарколемме миокарда кролика представлены oil 2 и с^З-субъеданицы, в то время как оС0 не обнаруживается. Подобная картина наблюдалась и в случае сердца собаки.

Известный активатор о-белков комплекс MaP + aici3 (aif^"} в наших экспериментах приводил к концентрационно зависимому ингибированию Ыа,к-АТФазной активности препаратов сарколеммы сердца собаки. Специфичность действия этого комплекса подтверждается тем, что эффект одного фторида натрия в отсутствие алюминия был значительно ниже. Картина ингибирования Ка,К-АИаз-ной активности комплексом aif^"изменялась в присутствии тио-лового реагента и-ЭМ. В концентрации 0,1 мМ, когда в среднем на 30-40% снижается активность фермента, н-ЭМ ингибировал активность 1Га,К-АТФазы препаратов сарколеммы миокарда, практически не изменял эффекта ГТФ^З m активность фермента, но достоверно блокировал эффекты КХ в присутствии ГТФ^з на Иа,К--АТФазу.

Функциональное сопряжение Па.к-АТФазц с С-белком в сарколемме миокарда; разделение и реконструкция.

Обработка препаратов сарколеммы желудочков миокарда кролика детергентом CHAPS (10 мМ) приводила к солюбилизации белка, выявляющего почти 50% общей уабаин-чувствительной активности. Эта энзиматическая активность экстракта была чувствительна н ингибиторному действию ГТФ подобно тому, что отмечалось на мембраносвязанной АТФазе. Гель-фильграция данного экстракта на колонке сефарозы приводила к элюации На,к-АТФазы . ввиде симметричного пика (рис.4, пик А). Более 95% белка, чувствительного к коклюшному токсину (G-белка), элюировалось отдельно от Иа,к-АТФазы (рис.4, пикС), тогда как только следо-

вые количества его элюировались вместе с На,к-АТФазой в пике А (рис. 46).

v Номера фракций

2 4 6 8 10 12 "16 22 28 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54

Рис.4. Гель-фильтрация солюбилизировашого снлрз препарата сарколеммы кролика, а - определение Па,к-АТФазной активности ; б - определение активности G -белка (см."Материалы и методы"). Данные представлены по трем препаратам. •

Смесь фракций 9-12 (пик А) и 40-44 (пик G), обладающие наибольшей *''й,К-дтФазной активностью и активностью G-белка, соответственно, использовались в экспериментах по реконструкции.

-а, -АТуазнак активность пика А была нечувствительна ко ■ всем добавленным гуакпловым нуклеотидаы. При смешивании проб пиков А к а появлялось значительное ингибирование энзиматичес-

кой активности ГТФ^з и Г1Ф(ПН)Ф, тогда как ГСФ, ГДФ, ГДФрЗ и также стабильный аналог АТФ - АФФ(ПН)3> были неэффективны. Следует отметить, что в реконструированной к+о пробе контрольная активность уабаин-чувствительной АТФазы была приблизительно в 4 раза выше, чем активность фракций пика А. Подобные высокие величины ферментативной активности (290±21 мкмоль §н/мг белка«час) обнаруживалась при смешивании фракций пика А с экзогенным фосфатидилхолином при соотношении белок/липид равном 1:10.. Это означает, что 1!в,к-АТ§аза частично делипидировалась в процессе гель-фильтрации. Однако, релипидация фракций 9-12 (пик А) не промогировала эффектов гуаниловых нуклеотидов на Па,1С-АТФазу. Ингибирующее действие аналогов' ГТФ на активность фермента, обогал;енного липидом, восстанавливалась только после его реконструкции с фракциями пика с. Высокая активность смешанной пробы обусловлена, вероятно, содержащимися во фракциях пика а фосфолипидами. •

Реконструкция функционального сопряжения 1га,к-АТЗ?азы с б-белком возможна также с фракцией пика б , повторно хроматогра-фированной гель-фильтрацией на ультрогеле АсА-34 с последующим концентрированием в диализном мешке против полиэтиленгликоля. Смешивание препарата На.к-АТФазы с данной фракцией б-белка приводило к резкому падению Ка,к-АТФазной активности. Вероятной причиной этого является то, что повторная очистка с-белка приводила к делипидации этой фракции, а при реконструкции фосфоли-пиды, содержащиеся во фракциях пика А, разбавлялись во всем объеме смеси, что и приводило к снижению АТФазной активности. Иа,к-АТФазная активность, в этом случае, была таюке чувствительна к гуаниловым нуклеотидам. Холинергический агонист КХ снижал активность, а атропин предотвращал этот аффект, что указывает

на наличие в рекоструированном препарате м-ХР.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ингибирование Иа,к-АТФазы сарколеммы желудочков сердца млекопитающих холинергическими агонистаыи проявляется на нативньсх высокоочищенных везикулярных препарат тах сарколеммы с высокой активностью Па.п-АТФазн и с высокой проницаемостью мембраны, вызванной обработкой каналоформирую-щим ангибиотиком^ламетицинои.

2. Ингибирующий эффект холинергических агонистов на На,к-АТФазу препаратов сарколеммы миокарда желудочков сердца млекопитающих проявляется исключительно в присутствии микромолнрных концентраций ГТФ и его аналогов.

3. Установлено, что холинергический агонист увеличивает сродство мембранного препарата сарколеммы желудочков сердца к гуаниловым нуклеотидам, что указывает на активацию а-белка и возникновение передачи ингибирующего сигнала от мускаринового

' холинорецепторэ на 11а,к-АТ£азу.

4* Подобраны оптимальные условия для гель-фильтрации на колонке с сефарозой сь -6В экстракта сарколеммы миокарда желудочков сердца цвиттерионным детергентом З-(З-холамидопропил)-диметилашоний-пропансульфонатом (снарз ) с раздельной элтацией ЫаПС-А'Шазы и й-белка, чувствительного к коклюшному токсину (<%). Выполнена реконструкция функционально активного комплекса из хроматографически разделенных препаратов 1Та,;:-АТФазы и в-белка, в котором АТФазная активность проявляла чувствительность к ин-гибирузощему действию микромолярных концентраций гуаниловых нук-леотндов.

5. Ингибиторный С-А-белок осуществляет функциональное сопряжение мусхариногого холинорецептора с Ка,К-АТ$азой в сарко-

лемме желудочков сердца млекопитающих, на что указывают эксперименты с использованием антагониста м-ХР атропина, негидроли-зуемых аналогов гуаниловых нуклеотидор, ll-этилмалеимида, фторида алюминия, бактериального коклюшного токсина, а также данные иммунохимического анализа и реконструкции функционального сопряжения На, К-АИ?азц с с-белком.

СПИССК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Есырев О.В., Даниленко М.П., Ким Э.А., Турмухамбетова В.К. О чувствительности На,к-АТФазы н ацетилхолину // Тез. III Всесоюзн. конф. "Физиология и биохимия медиаторных процессов". М. 1980. С.76.

2. Даниленко М.П,, Есырев О.В., Омарова Р.Д., Смагулова З.Ш., ТУрмухамбетова В.К, Опосредованное м-холинорецептором ингибирование 1Та,к-АТФазной активности сарколеммы миокарда и гладких мышц кишечника ацетилхолином // Бюлл. экспер. биол, и мед. 1984. №9. С.259-261.'

3. Мустафин A.M., Есырев О,В., Даниленко М.П., Турмухам-бетова В.К., Смагулова З.Ш. Исследование холинергической регуляции активности Иа,К-АТФазы из почки свиньи // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1984. №11. С.

4. Даниленко М.П., Есырев О.В., Шарова Р.Д., Смагулова З.Ш., Турмухамбетова В.К. Функциональное взаимодействие На,к-АТШазы с рецепторами нейромедиаторов в миокарде и гладкой мускулатуре // Тез. 1У Всесоюзн. конф. "Физиология и биохимия медиаторных процессов". М. 1985. С.98.

5. Даниленко И.П., Турмухамбетова В.К. Холинергическая

и серотонинергическая регуляция Иа,к-АТФазной активности миокарда // Тез. 1У конф. биохимиков Ср.Азии и Казахстана. Ашхабад.. 1986. С.201.

6. Даннленко М. П., Смагулова 3. Ш. , Турмухамбетова В. К. , Омарова Р. Д. , Есырев 0. В.' М--холинергпческая регуляция активности Ма, К-АТФазы в везикулярных щзепаратах сарколеммы шюкарда и гладких мышц кишечника // Укр. биохим. ж. 1988. Т. 60. С. 5559.

1

7. Турмухамбетова В. К. , Даржуманова Г.К. Действие холинер-гических агонпстов и NaF на Ма,К-АТФазную и г1-нитрофенш1фосфа-тазную активности // Тез. 1 съезда физиологов Казахстана. Алма-Ата. 1988.

8. ■ Даннленко М. П., Панченко М. П. , Ткачук В. А. , Есырев 0.В. , Турмухамбетова В. К. Роль ГТФ-связываюшдх белков в регуляции активности На,К-АТФазы // Тез. Мевдунар. симп. "Транспорт ионов и механизмы его регуляции". Тбилиси. 1989.

• 9. Турмухамбетова В. К., Даннленко Ы. П. , Панченко М. П. , Ри-тов В. В. , Есырев 0.В. ,Ткачук В.А., Роль ГТФ-связывающего белка в сопряжении мускаринового холинорецептора и На,К-АТФазы в сарколемме миокарда // Биохимия. 1992. Т. 57. С. 163-173.

10. Tkachuk V. А. , Danilenko М. Р. , Panchenko М. Р., Turrnu-khambetova V. С., Yeslrev 0. V. Muscarinic acetylcholine receptor is coupled to Na,K-ATPase via G^-protein in cardiac sarcolemma // Abstr.IV Int. Syrnp. 1 "Metabol. Hyocard. Struct. Funct. Kaunas, 1990.

11. Danilenko HP., Turmukhambetova V. C. , Yesirev 0. V. ,. Tkachuk V.A. , Panchenko MP. Na,K-ATPase - G-protein coupling in myocardial sarcolemma: separation and reconstitution // Amer. J. Physiol. 1991. V. 261. P. 87-91.