Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка управляемого биосинтеза целлобиазы и ксиланазы грибами рода ASPERGILLUS

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка управляемого биосинтеза целлобиазы и ксиланазы грибами рода ASPERGILLUS"

|0 0 3$8

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

уж 577.152.321; 582.282.123.4.017.01

РАЗРАБОТКА УПРАВЛЯЕМОГО БИОСИНТЕЗА ЦЕШЮБИАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ ГРИБАМИ РОДА АБРигсилди

специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЦИНС - 1992 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.Л. Головлев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.Н. Позмогова кандидат биологических наук В.П. Желифонова

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет

Защита диссертации состоится ".1992 г.

в .....часов на заседании Специализированного совета Д002.69.01

при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пупдано, пр-кт Науки - 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан "____"..........1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В.М. Вагабов

■ ,).-(! 1 • Введение

tejyjjbHocTb проблемы.

осор^ЙЧйЙРНверсия целлюлозного сырья в полезные продукты привлека-з¥ вТтоследнее время большое внимание вследствие растущих потребностей в энергии, пище и различных химических веществах. Задача Ьерментативной переработки целлюлозы рассматривается в настоящее зремя в глобальном масштабе и связывается с необходимостью защиты жружаодей среды от загрязнения целлюлозосодержащими отходами.

В основе биоконверсии растительного сырья лежит его ферментативный гидролиз под действием целлюлаз и гемицеллюлаз, представля-ощих собой мультиферментные комплексы, важными компонентами которых являются целлобиаза и ксиланаза. Основным лимитирующим фактором в организации рентабельного крупномасштабного производства деллюлаз и ксиланаз является невысокий уровень ферментативной активности используемых■для этих целей культур микроорганизмов.

Существует ряд подходов к решению проблемы экономичности по-яучения целлюлаз и ксиланаз: I) поиск природных штаммов с высоким уровнем биосинтеза целлюлаз и ксиланаз,- 2) оптимизация процесса культивирования (состава среды, режима аэрации, перемешивания,. рН, и др.); 3) генетико-селекционная работа по получению высокопродуктивных мутантов. Эффективность микробных процессов возрастает при переходе от неуправляемых процессов к управляемым. Задача оптимизации управляемого процесса сложна и решение ее эмпирическими методами неэффективно. Наиболее перспективным для решения этой проблемы является подход, при котором основой для совершенствования процессов управляемого биосинтеза является изучение закономерностей микробного метаболизма. Знание механизмов регуляции синтеза ферментов позволяет разрабатывать стратегию управления биосинтезом исходя из потребностей культуры с целью реализации ее максимальных возможностей. Данная работа является попыткой использования данного подхода для создания процесса управляемого биосинтеза целлоби-азы И ксиланазяДЛЯ грибов рода Aspergillus.

Задачи исследований: Целью работы являлась разработка процесса управляемого биосинтеза целлобиазы и ксиланазы.Для решения этой задачи необходимо провести отбор активных продуцентов целлобиазы и ксиланазы, а также изучить регуляторные механизмы синтеза и секреции этих ферментов.

Научная новизна. Разработан процесс управляемого биосинтеза целлобиазы у выделенныых штаммов Aspergillus heteromorphus ЗОЮ И

A.japonicus 2092. Показано, что синтез данного фермента является конститутивным и репрессируется глюкозой. Исходя из этого разработан алгоритм управления, определяющий скорость подачи глюкозы в ферментер в зависимости от концентрации ее в среде. Синтез ксила-назы у штамма A.heteromorphus зою является индуцируемым и также репрессируется глюкозой. На основании этого разработан оптимальны! процесс для биосинтеза ксиланазы.

Практическое значение работы. Реализован процесс управляемого биосинтеза целлобиазы для двух штаммов рода Aspergillus. Разработан алгоритм управления ЭТИМ процессом. Для штамма A.heteromorphus зою реализован оптимальный процесс биосинтеза ксиланазы. Оба процесса могут быть использованы в промышленности для получения целлобиазы и ксиланазы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Конференции молодых ученых ИБФМ АН СССР (Пущино, апрель 1987 г.), на советско-финском семинаре по биоконверсии растительного сырья микроорганизмами (Рига, сентябрЫ988 г.), на семинарах лаборатории физиологии микроорганизмов.

Публикации. По результатам работы опубликовано 6 статей, 4 тезисов, имеется I авторское свидетельство.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая рисунков и таблиц. Список литературы насчитывает источников.

2. Материалы и методы исследований

В работе использованы 32 штамма рода Aspergillus полученных из ВКМ и из коллекции лаборатории физиологии микроорганизмов ИШ1 РАН. Культуры поддерживали на сусло-агаре при температуре 29°С. Культивирование проводили на качалке (220 об/мин, 29°С) в колбах емкостью 750 мл, содержащих 100 мл среды, а тайке в ферментере "АНКУМ-2" при скорости перемешивания 500-800 об/мин и режиме аэрации 1.5 -2.0 л/мин. Fed-batch культивирование осуществляли в ферментере под контролем ПЭВМ "ДВК-2" посредством устройства сопряжения с объектом в стандарте "КАМАК"с программным обеспечением в системе quasic. рН среда поддерживали на постоянном уровне подачей 102 (вес/объем) КОН или 10% (вес/объем) hcl. Концентрацию С02 в выходящем-газе измеряли с помощью газоанализатора "Инфралит-4".

В качестве источников углерода использовали глюкозу, свекло-

зичный жом, пшеничные отруби и солодовые ростки. Для индукции синтеза целлобиазы использовали целлобиозу, гентиобиозу, софорозу, <етил-р-целлобиозид, для индукции синтеза ксиланазы - ксилан, i-ксилозу, арабинозу, р-метил-ю-ксилозид, а таже кислотные гидро-лизаты опилок, солоны и свекловичного жома.Указанные субстраты до-Завляли к отмытому мицелию гриба.

Для выяснения вопроса о репрессирующем или ингибирущем действии глюкозы к отмытому мицелию добавляли циклогексимид (100 «кг/мл), глюкозу (2 г/л) в смеси и отдельно.

Содержание глюкозы в культуральной жидкости и активность целлобиазы определяли глвкозооксидазно-пероксидазным методом (Березин и др., 1977). Активность ксиланазы измеряли по методу Гоша (Ghose et ai., 1984), ферментативную активность по отношению к карбокси-метилцеллюлозе (КИЮ и фильтровальной бумаге по методу Мандельс (Mandéis, 1974), ß-1,3- глшаназы и ß-N-ацетилглюкозаминидазы - по методу Полачека (Poiachek, Rozenberg; 1978).Редуцирупцие сахара определяли ПО методу Нельсона-Сомодаи (Nelson, 1944, Somodgy,

1945).

Для определения общей активности целлобиазы мицелий вместе с культуральной жидкостью замораживали при -20°С, а затем разрушали на прессе ИБ$М. Величину внутриклеточной целлоб^азной активности определяли путем Еычитания значения внеклеточной активности из общей.

Рост культуры на растворимых источниках углерода контролировали по сухому весу мицелия.

С целью изучения локализации целлобиазы мицелий разрушали в гомогенизаторе, надосадочную жидкость (суммарная фракция вдггозоля и периплазмы) использовали для определения ферментативной активности. Осколки клеток после центрифугирования отмывали 0.05М фосфатным буфером (pH 7.0) до тех пор, пока оптическая плотность растворов в области 265 нм не превышала 0.05...0.08. Отмытые клеточные стенки обрабатывали буферами различной ионной силы, Твином-80, а также хитиназой и 0-1,3 глюкназой. Во всех фракциях определяли активность целлобиазы.

3. Результаты исследований 3.1. Выбор продуцента целлобиазы и ксиланазы.

Отбор продуцента целлобиазы проводили на солевой среде с глюкозой без индуктора и на промышленной среде со свекловичным жомом.

солодовыми ростками и пшеничными отрубями. Было отобрано II штаммов, обладавших наиболее высоким уровнем целлобиазной активности на обеих указанных средах. Эти штаммы были исследованы на способность к синтезу других целлюлолитических ферментов, а также ксила-назы. Для дальнейших исследований был выбран штамм под лабораторным номером К 3/1, синтезирувдий максимальное количество целлобиа-ЗЫ И ксиланазы, И идентифицированный как.Aspergillus heteromorphus f-3010 d. Данный штамм использовали в качестве продуцента целлоби-азы и ксиланазы. В качестве продуцента целлобиазы использовали также штамм Aspergillus japonicus 2092 ИЗ КОЛЛвКЦИИ Лаборатории, способный синтезировать внеклеточную целлобиазу на солевой среде с глюкозой без индуктора.

3.2. Тип ферментации у штаммов a.japonicus 2092 и

A. heteromorphus ЗОЮ

Для выяснения вопроса о взаимосвязи биосинтеза фермента с ростом культуры и определения типа ферментационного процесса проводили анализ динамики периодического культивирования.

Образование целлобиазы на среде с глюкозой у обоих штаммов является двухфазным процессом (рис.1). В первой фазе происходит рост культуры и потребление субстрата (глюкозы), а во второй -синтез фермента и выделение его в среду.Изучаемые штаммы различаются тем, что Граница между фазами у a.japonicus 2092 менее четкая, чем у a.heteromorphus зою, уровень общей целлобиазной активности у A. heteromorphus ЗОЮ на ШрЯДОК ВЫШе ТЭКОВОГО у a.japonicus 2092, а процесс выделения целлобиазы в среду у первого штамма характеризуется большей интенсивностью, чем у второго (118 и 21 ед/г/ч соответственно).

Процесс образования ксиланазы у штамма a.heteromorphus при росте на среде с глюкозой также имеет двухфазный характер. Практически вся ксиланазная активность приходится на долю внеклеточного фермента. Величина внеклеточной ксиланазной активности при культивировании на глюкозе является незначительной и достигает 4 ед/мл, в то время как на промышленной среде 48 ед/мл.

Для установления оптимального режима культивирования с целью интенсификации биосинтеза внеклеточных целлобиазы и ксиланазы были поставлены следующие задачи: I) выяснение механизмов, определяющие двухфазность образования целлобиазы и ксиланазы; 2) установление зависимости образования целлобиазы от присутствия в среде индукто-

Рис Л. Динамика основных параметров в условиях периодического культивирования А-Зароп1сиг (а) И А. 1^еготогрЬиз (Ь)

• - концентрация С02 (»), о - концентрация глюкозы в среде (г/л), л - общая активность целлобиазы, (" от максимума), а - концентрация биомассы (г/л)

ра; 3) механизмы высвобождения ферментов из клеток.

3.3. Причины двухфазности образования целлобиазы у А.Зароп1сиз 2092 И A.heteromorphuз ЗОЮ Феномен двухфазности может объясняться катаболитной репрессией или конкуренцией между процессами роста культуры и биосинтеза фермента.

Добавление глюкозы во и фазе приводит к подавлению образования целлобиазы у обоих штаммов (рис.2). В обоих случаях при добавлении глюкозы возрастанию внутриклеточной целлобиазной активности предшествует лаг-период, продолжительность которого зависит от подаваемой концентрации субстрата. Аналогичная зависимость наблюдается для общей и внеклеточной целлобиазной активностей. В экспери-

Рис.2. Влияние глюкозы на образование целлобиазы во второй фазе у

A.japonicus (а) И А.heteromorphus (Ь)

А - КОНТРОЛЬ, Ф - 0,5 Г/Л, Q - I Г/Л, 0-2 Г/Л ГЛЕК031 в импульсе

ментах с добавлением циклогексимида к отмытому мицелию гриба в обоих случаях было показано, что целлобиаза синтезируется de novo и глюкоза вызывает репрессию синтеза фермента. Исследуемые штаммы обладает различной чувствительностью к репрессирувдену действию глюкозы. Концентрация глюкозы, полностью подавляющая образование

[еллобиазы У штамма A.heteromorphus зою, ниже таковой у I. japonlcus 2092 (I И 2 Г/Л СООТВвТСТВеННО).

При периодическом культивировании на глюкозе максимальная сдельная скорость роста наблюдаласьв интервале от 8 до 12 часов и ¡оставляла 0.18 и 0.25 ч-1 соответственно у штаммов A.japonicus 2092 и A.heteromorphus зою. Удельная скорость образования фермента у первого штамма имела максимумв интервале iß-I8 ч (36 ед/г/ч), ä у второго - от 32 до 36 ч (219 ед/г/ч). В экспериментах с ис-юльзованием fed-batch режима подачи глюкозы, когда она не накап-пшается в среде и не репрессирует синтез целлобиазы, образование Цермента сопровождает рост культуры. Максимум удельной скорости роста совпадает по времени с максимумом удельной скорости образо-зания фермента у обоих штаммов.

Таким образом, двухфазность образования целлобиазы у штаммов japonicus 2092 и A.heteromorphus зою при росте на глюкозе обуславливается катаболитной репрессией. Следовательно, алгоритм ¡^правления должен определять скорость подачи глюкозы в ферментер с тем, чтобы исключить накопление ее избытка в среде.

3,4. Влияние индукторов на синтез целлобиазы и ксиланазы

Для того чтобы определить, является ли синтез целлобиазы индуцируемым или конститутивным было исследовано влияние экзогенных индукторов на синтез фермента у штаммов A.japonicus' 2092' и A.heteromorphus ЗОЮ (ТЭбЛИЦЫ I И_2).

Таблица I

Влияние индукторов целлюлолитических ферментов на образование целлобиазы Aspergillus japonicus

Индуктор Внутриклеточная акт. Внеклеточная акт.

целлобиазы, ед/мл целлобиазы, ед/мл

часы часы

4 16 24 4 16 24

Гентиобиоза 0 0, 18 0,13 0 0,04 0,06

Софороза 0 0, 16 0,12 0 0,03 0,04

Целлобиоза 0 0,13 0, 10 0 0,03 0,04

Лактоза 0 0,08 0, 12 0 0,07 0,06

Метил-э-о-целлобиозид 0 0,07 0, 18 0 0.05 0,04

Контроль 0 0,12 0,09 0 0,04 0,06

Таблица 2

Влияние индукторов целлюлолитических ферментов на образование целлобиазы А.heteromorphus

Индуктор Внутриклеточная акт. Внеклеточная акт.

целлобиазы, ед/мл целлобиазы, ед/мл

часы часы

4 12 24 4 12 24

Целлобиоза 2, 32 5,9 4,8 0,04 0,14 0,4

Гентиобиоза 0,56 3,4 4, 8 0,05 0,28 0,6

Софороза 0,6 5,3 4,5 0,06 0,24 0,4

э-метил-Б-целлобиозид 1,4 3,0 7,0 0, 1 0,24 0,7

Контроль 1,1 8,2 9,6 0,03 0, 16 0,3

Полученные данные свидетельствуют о том, что у обоих штаммов добавление индукторов к отмытому мицелию не приводило к существенному увеличению внутриклеточной и внеклеточной целлобиазной активностей по сравнению с контролем в течение всего периода индукции (24 часа). Следовательно, синтез целлобиазы является конститутивным и при разработке процесса управляемого биосинтеза данного фермента не требуется добавления индуктора в среду.

Было исследовано также влияние экзогенных индукторов на синтез ксиланазы (таблица 3). Наибольшим индуцируицим эффектом на

Таблица 3

Влияние индукторов на образование ксиланазы

у Aspergillus heteromorphus

Индуктор Внеклеточная активность ксиланазы, ед/мл

часы

2 6 10 12 24

КСИЛЭН(S erva) 0 0 0 1,95 47,0

КсилащSigma) ОЧИЦеННЫЙ 0 0 0 0 10,5

Ксилансsigma) неочищенный 0 0 0 0 41,0

АраСиноза 0 0 0 0 0

D-Ксилоза 1,05 4,75 4, 5 3,35 3,75

Метил-р-о-ксилозид 0 . 0 0 0 0

Гидролизат соломы 0 0,95 .1,35 1,4 2,0

Гидролизат опилок 0 12 16 18 14

Контроль 0 0 0 0 0

синтез ксиланазы обладал ксилан, который не был подвергнут кислотно-щелочной обработке с целью удаления низкомолекулярных примесей. Внеклеточная ксиланазная активность достигала 41-47 ед/мл, что в 4 разы выше, чем при добавлении обработанного ксилана. Установлено, что индуцирующим действием на синтез ксиланазы, сравнимым с таковым ксилана, обладали также кислотные гидролизаты растительных отходов (березовые опилки, пшеничная солома). Синтез ксиланазы индуцировался также б-ксилозой, однако уровень ксиланазной активности был примерно в 10 раз ниже, чем при добавлении ксилана. Следовательно, синтез ксиланазы У гриба А.1^еготогрЬиз зою является индуцируемым и для получения высоких выходов фермента необходимо добавление индуктора в среду.

3.5. Разработка управляемого биосинтеза целлобиазы

у ГрибОВ А^ароп1сиз 2092 И А.1^еготогрЬиз ЗОЮ

Выше было показано, что синтез целлобиазы у А.зароШсиз 2092 и а. Ье1егоп!огрЬиз зоюявляется конститутивным и репрессируется глюкозой. Следовательно, концентрация глюкозы в среде является важным параметром при разработке процесса управляемого биосинтеза целлобиазы. Зависимость удельной скорости синтеза целлобиазы (V) от концентрации поданной глюкозы (Б) имеет следующий вид:

i - область лимитирования синтеза и - область максимального синтеза hi- область репрессирования синтеза

Следовательно, оптимальным для биосинтеза целлобиазы является процесс, в котором концентрация глюкозы в среде поддерживается на оптимальном фиксированном уровне. Это условие BalTCJIKIiMO при ведении управляемого fed-batch процесса с регулированием скорости подачи глюкозы в ферментер. На основании этого была предложена следующая схема управляемого fed-batch культивирования:

Алгоритм управления определяет скорость подачи глюкозы в зависимости от концентрации ее в среде, которая оценивается косвенным методом по измерению концентрации С02в выходящем газе. Интенсивное падение концентрации С02 коррелирует с исчерпанием глюкозы в среде (см. рис.1). Поскольку определить концентрацию глюкозы, при которой скорость синтеза целлобиазы является максимальной сложно, то был использован импульсный алгоритм подачи глюкозы в ферментер, позволяющий,сканировать область максимального синтеза фермента. Количество глюкозы в импульсе задавалось по расходу щелочного титранта, обеспечивающего постоянство рН в культуре. Такой 4 алгоритм при правильно подобранном стехиометрическом соотношении глюкозы и титранта позволяет вести процесс с лимитом по источнику углерода, репрессирующему биосинтез целлобиазы.

Реализованные в экспериментах fed-batch режимы по динамике С02 подразделяются на 2 типа: I) fed-batch, при котором поддерживается на постоянном уровне нижний предел колеблющейся концентрации С02, вследствие чего глюкоза подается с постоянной скоростью (такой тип процесса определялся термином "умеренный fed-batch") (рИС. За), 2) fed-batch. При КОТОРОМ раЗНИЦЭ Между величинами соседних пиков колеблющейся концентрации С02 должна быть не меньше определенного заданного уровня, в результате чего происходит нарастание концентрации С02 и скорость подачи глюкозы экспоненциально возрастает ("интенсивный fed-batch") (рис. 36). Остаточная концентрация глюкозы в среде при этом больше, чем в случае умеренного fed-batch.

При реализации выбранной стратегии управления для штаммов с различной чувствительностью к катаболитной репрессии было показано, что различия в критической концентрации репрессора требуют применения fed-batch режимов разной интенсивности. Для менее чувствительного К репрессии ГЛЮКОЗОЙ штамма A.Japonicus 2092 оптимальным является интенсивный fed-batch режим (рис.4), а для более чувствительного а.heteromorphus зою эффективней умеренный режим подачи источника углерода (рис.5). В обоих случаях создаются условия для синтеза целлобиазы одновременно с ростом культуры.

ч

/

/

■'V /2

Л / /

2

Рис.3. Типы £ей-ьа!сь процессов: умеренный (а) и интенсивный (ь) I - концентрация С02; 2 - количество поданной глюкозы

Рис.4. Динамика общей и удельной активностей целлобиазы у. А^ароп1счз при подаче гжозы в режиме интенсивного £е<1-ьа1сь: л- биомасса (г/л), ф- общая (ед/мл) и о- удельная (ед/г) целлобиазная активность, - глюкоза в среде (г/л).

■Рис.5. Динамика общей и внеклеточной целлобиазной активности у а . ье!егошогрьиз при подаче гжозы в режиме умеренного гесьъа^ь: о- биомасса (г/л), общая и ф- внеклеточная целлобиазная активность (ед/мл). д- глюкоза в среде (г/л)

3.6. Локализация ЦеЛЛОбИЭЗЫ У ШТаММОВ А.;|ароп1сиз и А.ье1егошогЬиз и механизм выделения ее в среду С целью создания .оптимальных условий получения максимального уровня внеклеточного фермента исследовали локализацию целлобиазы и механизм выделения ее в среду.

У обоих исследовашихся штаммов целлобиаза накапливается в ци-тозоле или периплазме, после чего выделяется в среду. У штамма а. 11е1егопюгр1шз зою интенсивное выделение целлобиазы в среду начинается раньше, чем у А.^арохисиз 2092. В первом случае к 30 ч культивирования в культуральной жидкости находится треть от общего количества фермента, в то время как во втором - только 8%. Содержание целлобиазы в клеточной стенке обоих штаммов остается достаточно стабильным на протяжении всего процесса культивирования и составляет 10 и 202 от общего количества фермента у а.зароп!сиз к а.ье1еготогрЬиз соответственно. Возможно, что перед выделением в среду фермент предварительно связывается с клеточной стенкой.

Очевидно, выделение целлобиазы в среду происходит в процессе

лизиса мицелия под действием автолитических ферментов, поскольку для обоих штаммов обнаружена положительная корреляция между появлением целлобиазы в культуральной жидкости и накоплением в среде (¡-1,3-глюканазы и р-и-ацетилглюкозаминидазы. У штамма А.1^еготогр1н1з зою высвобождение целлобиазы из клеточных стенок происходит под действием ПАВ и буферов различной ионной силы, а у А^ароп1сиз 2092 они не влияют на этот процесс. Очевидно, целлоби-аза у данного штамма прочно связана с компонентами клеточной стенки, поскольку фермент полностью высвобождается в среду только при обработке ее хитйтназой и р-1,3-глюканазой. Возможно, что менее Прочная СВЯЗЬ целлобиазы С КЛеТОЧНОЙ СТеНКОЙ У А.Ье1еготог1шз зою является причиной более раннего и интенсивного выделения фермента в среду.

Что касается ксиланазы, то как уже отмечалось выше (см. п.3.2), практически вся активность приходится на долю внеклеточного фермента.

3.7. Способы повышения скорости выхода целлобиазы В среду у А.Ке1еготогрЬиа ЗОЮ Установлено, что скорость выхода целлобиазы в среду у штамма а.ье1еготогрЬиз зависит от условий культивирования. Оптимальным для процесса высвобождения фермента был рН 4.5, а повышение температуры культивирования приводило к увеличению скорости выхода целлобиазы в среду. При температуре 50°С уровень внеклеточной целлобиазы увеличивался в 2 раза по сравнению с таковым при 29°С, 'а скорость выхода фермента в 3 раза. Исходя из этого, был проведен процесс, в котором после достижения максимального уровня внутриклеточной целлобиазной активности в ферментере повышали температуру до 50°С (рис.6). При этом уровень внеклеточной целлобиазной активности возрос на 30% по сравнению с таковым при 29°С, а время достижения ее максимума сократилось на 24 ч.

Поскольку высвобождение целлобиазы в среду у штамма А^ароп1сиз 2092 определяется автолитическими процессами (см. п.3.6,), то после достижения максимального уровня внутриклеточной целлобиазы необходимо стимулировать лизис клеток в условиях лимита по углероду.

3.8. Разработка оптимального процесса биосинтеза ксиланазы Выше было показано (см. п.3.2), что образование ксиланазы яв-

Рис.6. Влияние температуры на выделение целлобиазы в среду у

А.1^еготогрЬиз: О - бИОМЭССа (Г/Л), ф - Общая

целлобиазная активность, внеклеточная целлобиазная

активность (ед/мл) й - при 29 и о - 50°С

ляется двухфазным процессом. Известно, что синтез ксиланазы репрессируется ГЛЮКОЗОЙ аази1, Иакап1!Ы, 1984 И Др.). ТЭКИМ Образом, двухфазность образования ксиланазы скорее всего обусловлена репрессирующим эффектом глюкозы. Для снятия этого эффекта, а также с целью совместного получения в одном процессе целлобиазы и ксиланазы проводили культивирование в режиме умеренного £е<1-ъа1;сь (оптимального ДЛЯ бИОСИНТеза ЦеЛЛОбИаЗЫ У Штамма АЛ^еготогрЬиэ) с добавлением в среду ксилана. При этом максимальная ксиланазная активность была в 3 раза ниже, чем в периодическом процессе с добавлением ксилана в среду. После повышения температуры культивирования до 50°С наблюдалось резкое снижение уровня ксиланазной активности. Следовательно, процесс, оптимальный для биосинтеза целлобиазы и выделения ее в среду, не является таковым для ксиланазы и совместное получение высоких выходов целлобиазы и ксиланазы неэффективно. Для максимизации выхода ксиланазы необходимо создавать другие условия. Оптимальным для биосинтеза ксиланазы оказался процесс в котором биомассу, выращенную на глюкозе, индуцировали путем

повторных добавок ксилана (рис.7). Данный процесс можно рассматри-

ксилдн;

Шг

й А А й А<

14

12

10

—■о

1204

20

40

60

80

100

Рис.7. Динамика ксиланазнсй активности у А.Ье+_еготт>огрЬиз в £еа-ьа^1> процессе с добавлением индуктора о - биомасса (г/л), л - ксиланаза (ед/мл)

вать как £еа-ъа-Ьсь с добавлением индуктора. Подобный прием позво лил увеличить ксиланазную активность до ПО ед/мл, что в 2 раза выше, чем при периодическом культивировании с одноразовой добавкой ксилана-и в 5 раз вше, чем в £еа-ьа^ь процессе с подпиткой глюкозой.

Выводы

1) Отобранные штаммы А.Заро^сиз 2092 и А.Ье1еготогрЬиз зою конститутивно синтезируют целлобиазу на солевой среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Синтез ксиланазы является индуцируемым. Наибольшая активность ксиланазы наблюдается в присутствии ксилана и кислотных гидролизатов растительных отходов (березовых опилок и пшеничной соломы).

2) Образование целлобиазы у штамма д^ароп1счз 2092, а также образование целлобиазы и ксиланазы у штамма А.Ье1егошогрЬиз зою при культивировании на глюкозе является двухфазным процессом. В первой фазе наблюдается рост культуры и потребление субстрата, а во вто-

рой фазе синтезируется фермент и происходит его накопление в среде. Причиной двухфазности является катаболитная репрессия биосинтеза ферментов глюкозой.

3) Изучаемые штаммы различаются по чувствительности к репрессирующему действию ГЛЮКОЗЫ. Для штамма A.heteromorphus ЗОЮ концентра ция репрессора, полностью подавлящая синтез целлобиазы, вдвое ниже таковой у A.japonicus 2092.

4) Ксиланаза штаммов A.japonicus 2092 И A.heteromorphus ЗОЮ ЯВЛЯется внеклеточным ферментом. Целлобиаза вначале накапливается в цитозоле или периплазме, а выделение ее в среду происходит в процессе лизиса мицелия под действием автолитических ферментов. Исследуемые штаммы имеют различный тип связи целлобиазы с клеточной стенкой: ионная у A.heteromorphus И более ПрОЧНЭЯ, ВОЗМОЖНО КОВЭ-лентная, У A.japonicus.

5) Оптимальным для биосинтеза целлобиазы у более чувствительного к репрессией глкозой штамма A.heteromorphus зою является умеренный fed-batch, а для a.japonicus 2092 - интенсивный fed-batch. Применение данных режимов культивирования позволили увеличить активность целлобиазы у обоих штаммов в 3 раза по сравнению с периодическим процессом и совместить в одной фазе рост культуры и биосинтез фермента.

6) Для интенсификации процесса выделения целлобиазы в среду после достижения максимального уровня внутриклеточной активности у штамма a.japonicus 2092 необходимо стимулировать автолиз путем культивирования в условиях лимита по источнику углерода, а у A.heteromorphus зою повышать температуру культивирования до 50°С.

7) Оптимальным ДЛЯ биосинтеза ксиланазы у A.heteromorphus ЗОЮ ЯВляется fed-batch процесс с подпиткой ксиланом. При этом ксиланазная активность возрастает в 2 раза по сравнению с периодическим культивированием в присутствии ксилана и в 5 раз по сравнению с fed-batch процессами с подпиткой глюкозой и одноразовой добавкой ксилана.

8) Реализован процесс управляемого биосинтеза целлобиазы у штаммов

A. japonicus 2092 И A.heteromorphus ЗОЮ, ОСНОВаННЫЙ НЭ ДВОЙНОМ

алгоритме подачи глюкозы, представляпций собой поддержание определенных концентраций С02 в выходящем газе, с одной стороны, и поддержание скорости добавления глюкозы пропорционально скорости подтитровки - с другой.

По теме диссертации опубликованы следущие работы:

1. Соловьева И.В.-, Комков A.C., Ловля Д.И., Боев A.B., Ананьин В.М., Окунев О.Н. 1988. Биосинтез целлобиазы грибом Aspergillus niger В УСЛОВИЯХ управляемого fed-batch культивирования. Тезисы докл. iv Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Ташкент, с. 138-139.

2. Соловьева И.В., Михалева Н.И., Окунев О.Н., Шульга A.B. 1989. Некоторые регуляторные механизмы, детерминирующие двухфазность образования целлобиазы Aspergillus japonicus. Микробиология, Т. 58, с. 909-913.

3..Ананьин В.М., Боев A.B., Соловьева И.В., Окунев О.Н. 1991. Адаптивное управление биосинтезом ферментов с различным уровнем чувствительности к катаболитной репрессии. Прикл. биохим. и микробиол., т. 27, с. 862-865.

4. Okunev O.N., Solovyeva I.V., Golovlev E.L.. 1988. Increasing of the cellobiase productivity in the fungus Aspergillus niger and some regulatory mechanisms controlling production of the enzyme. Second Int. Symp., Abstracts, Ceske Budejovice, Chechoslovakia.

5. Okunev O.N., Ananjin V.M., Solovieva I.V.. 1989. Regulation of cellobiase formation by Aspergillus straifts for its use in controlled commercial production. Beijing International Conference on Biotechnology, Abstracts, Beijing, China, p. 200.

G. Solovieva I.V., Mikhaleva N.A., Okunev O.N., Golovlev E.L. 1989. Study on the regulation of cellobiase formation by Aspergillus japonic.us to develop its controlled commercial production. Soviet-Finish seminar on bioconversion of plant raw materials by microorganisms, p.95-102.

7. A.ianjin V.M. Solovieva *I .V. , Xomkov A.S., Boyev A.V., Okunev O.N., Golovlev E.L. 1989. Some approaches to the optimization of fed-batch processes for producing cellobiase Aspergillus japonicus. Soviet-Finish seminar on bioconversion of plant raw materials by microorganisms, p.103-114. Puschino. 3.. Okunev O.N., Solovieva I.V, Michaleva N.I., Sokolov D.M. 1991. Features of Aspergillus japonicus cellobiase formation and optimization of its production. Acta Biotechnol. v.11, p.147-157,

3. Ananjin V.M. Komkov A.S., Solovieva I.V., Boyev A.V., Okunev D.N. 1991. Some approaches to adaptive control of fed-batch culture of cellobiase producer Aspergillus japonicus.

beta Biotechnol. v.11, p.121-128.

^.Co^ -