Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика целлюлотической системы микромицетов в условиях твердофазной серментации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика целлюлотической системы микромицетов в условиях твердофазной серментации"

ГОССЙСУШ ДйАдаЗЯ НАУК !2!СТЙТУТ ЕЗОХЮЖМ И СЗЗЕЯШГЕН 1СЗРОСРГА£Ш^ОЗ

%

^ На правах рукописи

О-

ШХШРОТСЗА ЮЗИА ВЛАДШИРОВНА

УДК 577.152

ХАРАШЕРЙСТШСА ЦШШХ0.ЕГШЧЗШ>а СКСШЭ! •ЛЗРСКЗЩЗТСЗ В УСШХШ ТЕКРДОЗАЗНОЙ ®гР1ЕЯТАЩЕ1

(специальность - 03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1995

/

ы

1°

IV ; Ал"'

У

Работа выполнена в Институте бжшаяга и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор И.С.Кулазв, доктор биологических наук,' профессор Е.Л.Головлев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.Ы.Бегбородов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н.П.Головченко.

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится (/м^м^ 1995 г.

в_час._мин. на заседании диссертационого совета

Л 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, Московская область, г.Пущнно, просп. Науки, 5.

С д^рсертацией можно ознакомиться в библиотеке Инети-тута биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан " (8 " а/г/ге.'ла-. 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

В В 3 я 3 !! И 3

Аягуащятега у/ч. Биоконаерсия шдивйозосодержвсэго сырья является важгол задачей современной биотехнологии. В связи с эти! осоОсэ внимание исследователей з последние годы привлечено твердофазной феркестации (,Т®Ф), которая рассматривается как иэтод пояучэнкя обогащенных микробной биомассой коршеьк препаратов на Сазе грубых растительных кормов и различных целлзло-зосодзржазтзх отходов сельсюто хозяйства и промьшшнкости. Кроив того, наблюдается возрождение иятерэса к ТЕЗ как способу получо-нкя внеклеточных формантов, поскольку некоторые твердофазные процессы менее эиергоезжи, трудоемки и матеркаловмкл, что позволяет получать допетые.препараты с етрсккм спектром действия. И что особенно важно, в отличие, от искусственных я.чдких сред, твердые целлюлозосодоржащиэ субстраты - естественная среда обитания [¿икромицетов как по составу, так и по физически/ свойствам. Во всех случаях валшо понимать особенности процесса биосинтеза и секреции ферментов целлодолитического комплекса. Однако информация о биосинтезе целлюлолитических ферментов при ТСЭ немногочисленна, что, по-видимому, обусловлено как многокомпонентен природой целлюлаэ, так и характерными особенностями ТОЭ, где субстрат представляет собой водонерастворимый полимерный материал со сложной надмолекулярной структурой.

1&иь и задачи иссдздовання. Целью данной работы было " изучение целлюлолитической системы микромицета А^еггеие в уело-

ъ.

виях ТФФ. В соответствии с данной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Изучение состава целлюлазного комплекса в условиях ТФФ.

2. Исследование динамики биосинтеза и секреции целлюлолитических ферментов в условиях ТФФ.

3. Изучение влияния компонентов среды на биосинтез и

секрецию целлюлаз в условиях ТФФ. -

Научная новизна работы. В настоящей работе исследовались состав полиферментной целлюлолитической системы, динамика биосинтеза и секреции ее компонентов при культивировании микромицета АЛеггеиэ" в условиях ТФФ. Впервые проведен сравнительный анализ данных, полученных при культивировании одного и того же продуцента в жидкой среде и при ТФФ. Показано,что спектр целлюлолитических ферментов, образуемых при выращивании гриба на

гвэрдсй среда, идентичен образуемому в гадкой срода, за искшчо-кгэи нагкоиолвкулярной цз.££сбз;зги, которал при ТСЭ отсутствует. С0вэр7мана отличная от погруженной культуры динамика биосинтеза и секреции цешвалалитических фэршнгоз. Показано влияние допол-иитвльшх источников азотного питания и о.гигссахаридоз ка биоезш-тез, сеярац!2о и соотношение кс&зоеэнтоз цэллюлазаого комплекса.

ргЯапа. Пшхучоншэ результаты ыозао использовать 2 практических целях для получения целлалолитИчзс-кик ферментов в условиях ТвЭ. Еиявгана возмсяяооть напраавенноро получения цзллгщаз с определенный спектром действия посредством ни.-ояевия состава среды культивирозазия. Показано, что пришЕв-ш:е оОэдпэнкых срод, содержащих лигяоцэллюлозные субстраты, и.у-■¿■лт понизить содержите прккюсей, в частности протеаз, в препаратах цэллааолитических .феркзнтов.

Ыат&риалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганиз-(Кобулетн, 1086), на советско-финском сеышзре по биокон-иэрсиа растительного сырья микроорганизмам (Хельсинки, 1987). В цслсы работа обсуждена на совместном заседании отдела бцохиии ¡меточной поверхности, лаборатории физиологии микроорганизмов и лаборатории- окислительного обмана веществ ШГМ РАН.

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

и обаан дггаозэди^зг. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения • (5 глав), эеклячэбкя и выводов. Работа изложена на страницах машинописного- текста, содержит 30 таблиц и 11 рисунков. Список -литературы насчитывает источников.

ЫАТЕРИАЩ И 12ТОДа ЕШШДОГШЕЙ.

В работе использовали гриб АзрегеШш terreus ЕКЫ ? 2200 Б, любезно предоставленный сотрудниками лаборатории физиологии микроорганизмов ШШ РАН. Культуру поддерживали на сусло-агаре при температуре 28°С. Для засева питательных сред использовали 48-часовой инокулят, выращенный на качалке (240 об/мин) при температуре 28°С на среде следутаяэго состава (в %):

лактоза - 1; SHaPQ.i- 0,2; (liiti)2SO4- 0,14; NH.1H2PD.1- 0,C3; CaCle - 0,03; f.'^SOr 0,03; пэптсн - 0,05; дроияевой экстракт -0,04; каггминоЕыэ кислоты - 0,3; твин 80 - 0,01. Твордо^.знуь фгриентацщз проводили в стационарных условиях при температур® 23° С в течение la суток в колбах на 7Б0 мл, содериаацх В г опилок (размер частиц 0,5-1,0 ias), увлажненных 10 мл водопроводной, воды. Для поддержания аккшости на постоянной урогшэ еетдЕзвно добавляли в среду ферментации по 1 ил стерильной водопроводной воды. В качестве дополнительных источников азота псполвзозагл нктрат натр1я, гл'эсъ аминокислот и пептоя. В качестве прэдпола-гззйого индуктора цэллаяаз дополнительно вносили в среду олиго-сажрнды (цедлотркозы - целлогексаозы). Культивирование гриба в жидкой среда проводили при те>я:ературе 28°С на среде следущэго состава (в X): береговые опилки - 1, пептон - 0,5;КНоР0д- 0,14; СаС12 - 0,03; MSSO4 - 0,03; мочевина - 0,01; микроэлементы (мт/ЫЛ): FeS04 - 5; MjrSOi. - 1,0; ZnS04 - 1,4; CUSO4 - 1,4.

После Еыращнвания гряба на твердых средах остаточнуа жидкость из материала фэрментащ*.и отделяли фильтрованием на стеклянных фильтрах N 3 в вакууме. Смесь мицелия и опилок последовательно промывали 100 ед дистиллированной вода, 50 нл 0,05 М Трвс-HCl буфера, рН 8, содержащего 0,5 Ы NaCl, 50 мл IX-ного рестЕора твин-ео. В каждом из указанных растворов штерт-"-л инкубировали в течение 30 млн при 28°С на {фуговых качалках (240 об/шш). Надое ад очнув жидкость отделяли центрифугированием при DC00 об/мин в течение 15 юга и фильтрованием в вакууме на стеклянных фильтрах. В надосадочной яидкости определяли активность целлшолиткческих ферментов, протеазную активность, содержание бежа, рН.

Суммарную целлюлазнус активность определяли по методу Ван-дэльс (Mandels et al., 1976). Редуцирующие сахара определяли методом Сомоджи - КэльСона (Somogul, 1952, Nelson, 1944). Индивидуальные активности компонентов целлюлаэного комплекса определяли с помощью методоз, разработанных Клесовым и др. (1980). Про-теолитическуп активность определяли, используя в качестве субстрата' 1£-ный раствор казеина в 0,1 И Трис-HCl буфере, рН 7,0 (Казеранева, 1971).

Белок в материале ферментации определяли, используя реактив Кукасси 6-250, после предобработки лигноцеллялозного материала по методу, разработанному Щульгой и Брустовецкой (1985). Кон-

3

цэьтрацкз белка в растворах определял!! спэкжрафотодатрйчгскн при Аеео.

Молекулярную массу ферментов определяли двумя методами: ДЕ2К-электрофорезом в присутствии додецалсульфата натрш (ивтИ, 1970) и гельфильтрацией с биогелэм Р-100. Зашиты цэл£о-лаз после гельфкльтрацяи разделяли хрс&атофокусированием нз колонка с ПЕЕ-еонооСмэннеком. Ферканты злшровали 0,025 Н полкву-фэрш 74 в интервале рН 8,0 - 4,0, определяя во фракциях аккз-кэсть целлвлолитических ферментов и рК. Оптимальные усдоЕня действия фэрмэнтоз сг раствортсгэ субстраты определяли, кзкэркя т. активность при различных значениях рН и температуры.

р^зу^тАта ксождошиша н т СБСЯЩБЕЗ.

Состав цшыйаиывякчесяого номилаваа гр^а А.1бргекз в яатик тазцдойазьой йодмеитадш.

ТЕэрдофазная ферментация принципиально отличается от погруженной культура по характеру переноса питательных веществ, транспорту их к клетке и отводу от нее продуктов обмэка.а таагке по физиологическому состоянию микроорганизмов. В связи с вшескаганньш вполне вероятными представлялись отличия в составе цвиазлазпого комплекса гриба при. ТФ8 и глубинном культивировала;. Однако количественное разделение ферментов методом гельфкльтрз-цгш и последукядя идентификация их посредством хроматофоку-сированкя и электрофореза в ПААГ показали, что состав целаиао-литнческого комплекса гриба А^егтеиэ при культивировании в условиях Т©В подобен таковому при выращивании в жидкой срэде /табл.1/. Все ферменты не отличаются по молекулярной массе, кмевт сходные изоэлектрические точки. Оптимальные условия гидролиза субстратов для них совпадают. Целлшлолитический комплекс - гриба АЛеггеиэ, выраженного в условиях ТФФ на березовых отадезх, отличается отсутствием ниэкоыолекулярной целлобиазы 2 с мозеку-лярной массой 67 кДа, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии при ТТв посттрансляционного протеолитического расщапдопяа высокомолекулярного фермента. 4

ГвСлицп,

Состав целлюлолитическогс комплекса гриба АЛеггеий при гьгращшании в лидкой (Л; и на твердой (.5) средах.

А сь. лецкая, 1985) 1

1 Эндоглюканазы ; 1 | Пелл гбиагк "кдоглзокаиази Целлобиазы

1 9 5 '4 5 | 1 - г 2 3 4, Б - 1

Молекулярная масса, кДа, 4.2 34 , ! 1 1У В * - 71 142 • 34 "¡7 5 - 8 - -иг

р! 6,5 4,7 7,3 " 7,1 7,5 | .4,9 6,5 5,5 4,7 7.3 '7.1 - 7,5 4.Э

Оптимум рН 4,5 4,5 ! 4,5 а,5 4,5 | 5,0 4,5 4,5 4/5 ■4,5 4.е • ь.б

Оптимум 60 60 55 50 50 |, 50 50 60 60 55 50 5С

- |

СсаЕвезжупа дяягеэгш» fc^cra^

' A. tara?» g шаш fg».

В услоззг: TES,когда щстддааиЕэ ъгюхява raïôporsESssïa среды, прочее сейзыжшез . фзр&эетоа с возззхотатьз ккяк: Ovffib сувустЕвкно и&гэаэилав при ЕвргэЗЕЗЕЕЗ rp'-Ss АЛзхтеиз Е еедисй ередэ кэ SK зндоглааеаэзаЗ eœsnossa еэявапдаяпг ввакгэкявш фераэнгад /С&уг.йз кдр.ДСЗЗ, C&scima s д.p. ,1988/.в ycEJSEas ï©s с.юзэлши crasssa еаагзэ гаггкзегго ssgorassffî&acaâ кжзиасгп.Ты: фазмЕрсзгзЕЭ и ежфзэга тPQSESEÛS EOSOS EPSEOBE? к BDSSJEŒE) едЕЗгггшззЕЗза екгкь^зг-■ та.состсас^хзй 40-ГО % сушзргой essEoois'v^s.z/.&ssp^^r. о.оз ё трис-HCi буфера;, рз о,б у ksci и та^оа-сэ

дааагикзвьазо увшЕгашю бКЕиЗЕсе-я; ка низа. При этом в ёаш>гратэ и еодеш аетгршээ озаазужзгя гоаво *

гпрЕыэ фора* эндоггаяпвз с мождарзов isscoà 42кйа и cooîB0K?ifânso.Es3iîiKia2si^îap3îSi Фсрш ездоглЕсжз тю^Г-изт ерп ершшзеш cyôsïpnsa и »еарлаз os5î*s3£o®2£3 ОгСзрсл с nassss-ьЗП^З^ СПЛОЙ £2 J^rOITrCej TÎ-HK'00, ч/Q ^iT-wUjXC? По pSSXjtC-

Eja изажЕцш s^DomsxasysssEK H зндого-

капаз в tssopmra фг^зекщш. Ш->пра ^дьяаэдазгЕЛ ' продуцента па гаврдоЗ ерэде вцэсшявдгюгзсргагэ Ccs^ïïiKAS • кДа,34дД&/!зщзтся,в сеЕакзи,а сткс^ос?;^.--^ иые/17 j^,6-8s3ïa/-cbsb£ssss} с мзтечаз! еэеэ;шкятыз.

Црв шсфсцзазж! A. tenets на jrafiassensas eoscû

берэгоЕШ ощгааа нэ ta ойгащ&эзд вкэкгзкяа» цашйсза, дзаэ к концу ьулькайрщ^Егз, тогда как согяаспо пасучзшли раагз рэауяывтаа (Ствйкова, 1CS5) в процессе гнра^дашка прздуцзнта б £3ерзйэ EïaL3?,2SÇ0î/ кяз&гезяе Е.*зтрицэгснга5 и увагазегЕЗ Езэкгзгсшгг Серэатаз.Й уехэггзх ТОЭ ниг-кки урссэзь цэлюг&ааиой eïaas:xEss о,os u ns^-Eci ©фзреи.ря а,о с о,б

и ЙЗШ Й 1X-ESM pastscfesj ÏE2HQ-60. По- ЕИДЕМОИу, при 1фС>таЕЕрС&5,-e|i ¡врсщу1щ2за в угзо^кх ПО на береговых оюшшя цеялобкагкгш вятквеость свазЕаа с кюточныки станками гркба.

Таблица 2.

Распределение эндоглакаыаз мзиду фкхьтрахеи и аксгриеквги.

Время культивирования, сутки, Эндогли-каназа Молекулярная масса, кДа Содержание эндоглвкаказ, X от суммы

фильтрат нго, 0.05 и трис-НС1 буфор, рН 8 с 0.5 Ы.Н£С1 IX- ный Гвин-80

4 1,2 43,34 37 12 9 9

3 17 0 0 5 5

4,5 5 - 8 0 0 И 12

9 1,2 43,34 .20 24 14 10

3 17 0 0 13 4

4,5 5-8 0 0 4 11

12 1,2 43,34 21 22 11 . 10

. 3 17 '0 0 - 10 Б

4,5 5-8 0 0 12, а

10 1.2 43,34 - 20 22 11 10

3 17 0 0 13 в

4,5 5-8 0 0 11 7

18 1,2 43,34 10 34 8 10

3 17 0 0 5 6

4,5 5-8 0 0 12 15

Эндэглюканазная активность,^ от сукш

À

X

ve

g <°

N1 И ** I Ol 1

н» M со СП

НА ГО CJ Ol

ГО со Ib. сл

CAÍ сл

ib О

.2.

и "Ч и Я

а; h3 о К ID

te s О

О

Ф

?» 5

i й •о

X. s Ù

tri s.: M о Р! &■ Hi

« я

pe Й s

ut

w ф

•D

S

а я a

? E Э

И « в

S ф

£U о ж

ei о s

тз а

« s

S

OI

к

о »

« к

X

и к о

* -в В

8,

S H

S S Ф в

п

о

a s ф S И Ч

р 13

ta

I I

к ~ Е

1 ? g

s » >

Ies

О - "

a s

» g

> о

■ г*

о ь

"1 п.

7, е

л s

<в ®

о о X м

о о

g в

<0 ф

с* Е HÍ Ö1

s

H

и ■а

О

ti И

.Ь Г!

3 g

I X

о К S

S'

W ь:

г

CV s » ■а

о -

о S-

и Ю

х гэ 00

« ■а СП

a Ф -—

Й 33 -

Ф со

гз

Я s

О Щ Kl

Я' s Ф о

a ж

о M

ь (D H

n

a

s С j

et О г.

г.

а-

Со:лае«') давив« о сп:0цйфичнсх2ти vf-ллюлаз A.terreus такое г.реоораь тзамне комш: кса ««обходимо для осуществления последовательного пиролиза целлюлозы до конечного продукта-глюкозы,так ;сзк высокомолекулярные андоглюканазы преимущественно гидролизувт твердые субстраты, а ниэкомолекулярные ферменты-растворимые убстраты,'Кел/цкая и др., 1585/.В отличие от имеющего место при = ipai4UBaHi.it жидкой среде постепенного накопления ниэкомолеку-:мрных эндоглкьлпаэ.при культивировании гриба в условиях TTQ пхраняетсл /г, -.обладание высокомолекулярных эндоглмканаз в тече-HÍK- всего jjper. ?ш[ ферментации/рис. 1Б/.Вероятно, такая ситуация .••лравдывае'1 :и точки прения медленного роста на древесине в условиях ТЗФ. xú|.'. »кториггпщвйся низкими скоростями массопередачи в ЙФменткру^^й i^ue. Полученные данные по динамике накопления бдгмассь и .ч-.г.^-олг.'ли'п,ческой активности гриба A.terreus в условиях ТФЭ по.:-л,<и. ют, чго максимумы энгоглюканазной и целлобиаз-нлй активности -ловпаг^иог и наблюдаются при прекращении роста продуцента е ча^гаом автолиза (рис.2).

с

время культивирования, сутки

vir :. ;сста « игллолслитич^кой -гг.тивнссти гриба

А. >.«r г*чт - условиях ТОТ. i-количество белка в материале ферментации. ¿-эндоглюканаэная активность, г-ц-»ллсбиазиая активность.

ксадогжасв cgsjgi ка - аязагдзкадвзгоги гзаиззсявь iraäa A.tszTiсач в ьтасгЕак TTv).

Введение в ' среду культивирования дополнительных источников азотного питания:пептона,аминокислот и нитрата натрия вызывает значительное увеличение эндрглаканазной активности . грпба A.terreus /рис.з/.

щеия культазграЕ^Езз, сухли Рис.3.Влияние компонентов среды на урогонь эндоглюканавной активности гриба А. геггешЛ- К-/коя$родь/,2 -К+пептон/10' мг/сут/, 3 -К+МаК0з /2,5мг/сут/ , 4 -К+амикокислотыЛОш'/сут/, 5 -К+сишгосахарццы /Юмг/сут/.

Изучение вл!шния концентрации и способа внесения пептона в среду культивкровгния гриба показало, что максимальная эидогло-каназвая активность обнаруживается в том случае, когда пептон вносится в среду в количестве 20 мг/г опилок в начале ферментации (табл.3). При этом максимальный уровень суммарной эндогдшка-наэной активности составляет 1,245 ед/г субстрата на 13 сутки куль тивирования.

Таблица 3

Влияние концентрации пептона в среде культивирования на уровень эндоггзкачазной и протеазиой аотгзпостп гркЗа A.tsrreus.

Концентрация Эвдсглвкзназзая Щюкезааа

культ-аи- пептона, активность, sotissoctb,

ра 2езкя , мг/г субстрата ед/v субстрата ед/г субстрата

cjtisi

7 0 (контроль) 0,264 0,046

0,789 O.CSB

20 1,053 0.С53

40 0,В35 0,132

13 0 (контроль) 0,207 0,043

■ - 10 0,588 0,1

20 1,245 0,24

> 40 1,184 0,23 -

Предстззхоиныэ з таОлицэ З-дзниыэ- свкдете^ьстгузот о прлгзЬЗ зависимости мекду концэктрадаэй пептона в среде и велпгашой внеклеточной протеазксй активности.мккро^ащэаа. Вероятно, пептол усиливает секрецка протеаз в среду культивнровапия гркба, что может повлиять на соотношение и лскализацет фзрмэнтов цедгзлалк-тического комплекса. Данные по злеяшо компонентов 'срэды на соотношение и локализации целлзиолатичесгсих ферментов гриба A.terreus представлена на рисунке 4. ,

100 80 60 40 20

•уг

л f о

о £ (В S

е-

к

d

100Н

80|

6Ш

40,

2Си

0

t=r

1

п

В

2 3 Б

РИС . 4 . ВЛЛ/ÎHïiKG псшенгов среды на соотношение иисо« молекулярных i.bj (M.м. 42 и 34 î;

низкомолекулирнн:»х (H) (M. м. 17 i". ; ;; КДа)

зндоглюканаз .a A.terreus на 9(A) и 14(Б) еугкк кудьтивированкл

1-К(контроль),

2-К+МаШз (Z.ÈMiv сут),

3 - К+ амиинокис л o.i и (10 ыг/сут).

4-К+лептон(30мг/ ■У у'Г у,

5- X+OJ! иг ос ахар г.;;. -(10 ыг/сут).

Етрихом выделена доля внеклеточных ферментов.

1

Олигосахарвды способствуют возрастание доли ниэкомолекуляр-шх зндоглюканаз. При этом внеклеточные формы этих ферментов не обнаружены.Пептон увеличивает содержание нкэкомолекулярных зндоглюканаз и вызывает появление внеклеточных форм этих ферментов,которые, по-видимому, образуются вследствие протеолитической модификации высокомолекулярных эндоглюкаиаз,имеющей место при выращивании продуцента в жидкой среде.Последнее подтверждает тот факт,что при культивировании грибе на твердой среде с пептоном наблюдается увеличение его протеаэной активности,величина которой зависит от концентрации пептона в среде. Олигосахарвды и нитрат натрия не вызывают увеличения протеаэной активности гриба по сравнению с контролем. 12

Вдззккэ кокпггпе:гтоз,с?э;7» ¡;а нзлгзйшзггуа аатгазгсста г*"".л А.1сггул< в усдозглх ТСЭ.

Введение в среду культивирования неорганического (МаМОз) и органического азота (пептон, аминокислоты) приводит к возрастании уровня целлобиагной активности гриба А. 1еггечэ (рис.. 5).

« О

О. н

Vi

700«

600

500

н

«5

О

ч

«

® rí

400-

300

200-

10СЦ

Е

и.

9 14

вреия кул&тнкирожшгш, супм

Рис. 5. Влияние компонентов среды на уровень целлобиагной

активности гриба A. terreas. 1 -К(контроль), Z -К+пептон (10 мг/сут),3 -K+NaNÜ3 (2,5 мг/сут), 4 -к+аминокислоты (10 мг/сут),, 5 -К+олигосахариды (10 мг/сут).

¡¿аксиальная целлобиазная активность обнаружена при культивировании продуцента на среде . с пептоном.-Среди исследуемых кон- • центрацик этого компонента наивысшй уровень целлобиазной активности^,22 ед/г субстрата)вызывает концентрация 20 мг/г опилок при внесении пептона в начале фермента5»™ (тайл.4).

Таблица 4.

Влияние концентрации пептона в среде культивирования на уровень целлобиазной активности гриба АД.егтеиБ .

1 I Время ! Концентрация ! РН I Целлобиазная активность 1

I культиви- пептона. сре-| ед/г субстрата 1

рования, мг/г субстрата ДЫ н 1 -----1

1 сутки 1 1* | 3* |

1 1 7 0 ( 4,5 0,100 1 и ! 1 0,1ПП

1 10 4, /о 0,540 0 ! 0,540 |

20 5,8 | 0,731 ~ Р 1 0,504

1 40 6,9 | • 0,723 0.269 ! 0,454

1 13 . 0 1 4,4 | 0,962 т о ! 0,962

! 10 4,?5| 1,295 о 1 1,295

20 5,5 | 2,220 0,740 | 1,480

1 40 6,9 ( 1,7*92 0,756 1 1,036

| | 1

1* - суммарная целлобиаэная активность; 2* - целлобиазная активность в фильтрате и водном экстракте; 3* - целлобиазная активность, экстрагируемая о,ОБ м трис-НС1 буфером, рН 8,0, с 0,5 М ИаС1 и 1%-ным раствором Твнна-80.

Вероятно увеличение суммарной целлобиазной активности на среде с пептоном связано4 с увеличением суммарной эндоглюканазной активности продуцента и появлением внеклеточных низкомолекулярных эадоглюканаз, продукт действия которых является индуктором биосинтеза целлобиаз.

Уровень внзшзточчсй челгсбяаепой чхтивяостп з ф;ттрате и зодвоа зистракте зависит от концентрации пеятска в среде культивирования, которая в сзсх> очередь влияет на вздичгну рН" (табл. 4). Но исклзчеяо, что пептон оказывает вггтш' ка секция цвллсбиаз посредствен изменения рЗ среди, поскольку ракее предполагалось связывание этих ¿эрмэитов с клеточной стенкой гриба посредством электростатического взаимодействия.

Таким образом, изменяя состав сроды культивирования микро-шщета A. terreus, можно влиять на биосинтез и секреция ферментов целлалолитичегкого комплекса, который наряду с сохранением некоторых физико-химических свойств, характерны-/, для погруженной культуры, приобретает специфические черты, характерные для Т5Э.

ESO®

1. Впервые изучен состав и физико-химические свойства ферментов целлюлолитической системы микромицета Aspsrjjlllus torreus в условиях твердофазной ферментации'(ТСЮ). При культизировании гриба ь-а твердой и в жидкой средах показана идентичность спектра .эндоглюканаз, состоящего-из ферментов 1,2,3,4,5 с молекулярными массами 42,34,17,5-8 кДа.

В отличие от культивирования гриба в жидкой среде единственным представителем целлобиаз в условиях ТМ является высокомолекулярный фермент 1 с молекулярной массой 142 кДа. Низкомолекулярная целлобиаза с молекулярной массой 67 кДа не обнаружена, что свидетельствует об отсутствии при ТФФ посттрансляционного протеолитического расщепления высокомолекулярного фермента.

- 2. Исследована динамика биосинтеза и секреции целлюлолити-ческих ферментов в условиях ТФВ. Обнаружено постоянство'соотношения высокомолекулярных и низкомолекулярных эндоглюканаз гриба A. terreus в течение всего времени культивирования, и отсутствие характерного для погруженной культуры, постепенного накопления •низкомолекулярных ферментов, появляющихся в результате посттрансляционной модификации посредством протеолиза.

■ 3. В условиях ИФ'на березовых опилках в отличие от ферментации в жидкой среде, вся целлобиаэная и большая часть эндоглю-каназной активности связаны с клеточной поверхностью гриба А. terreus.

4. В£ЭДЗп>!£ В СрЭДУ КУДЪТИБКрОВ£КЛЛ МИКрОмПЦеТа н. ьсГГё'иЗ

дсяйкштельных источников азотного питания /пептона, аминокислот и М&Ч'Оз /приводит к возрастанию уровня зндоглюканазной и целло-бпгхной активности.

Б присутствии пептона наблюдается корреляция между накопле-ниэм Екэвлеточных протеаз и увеличением содержания низкомолеку-ляряых зндоглаханаз, что свадетельстьует об индукции пептоном процессирукждос протеаз. 1

Б. Показано, что внесение в среду культивирования гриба,А. torreus дополнэтель-ных источников питания изменяет соотношение и локализации целлюлолитичесхкх ферментов, что дает возможность направленного получения целлюлаз с определенным спектром действия .

СКзхзк ргбот, ояуШпяагаЕЗДЗ по катер:алгл д>хсергац!И:

1. Полоротова Е.В., Еелецкая О.П., Кулаев И. С. Эндоглвканазы гриба Aspergillus terreus, выращенного в условиях твердофазной ферментации// Тез. дока. III Всесоюз. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами"/ ОНТИ НЦБИ. Пущино, 1986. .С. 52-53.

2. Beletskaya О.Р., Stalkova D.D., Polorotova Е.V., Kulaev I.S. Composition of' the cellulolytlc coraplex of the fungus A. terreus grown in submerged culture and on solid state fermentation// Soviet-Finish seminar on bloconversion of plant raw material by microorganisms. Helsinki, 1987. P. 50-56.

3. Белецкая О.П., Рязанова Л.П., Полоротова Е.В., Дон Ук Кан, Стефанова М.Е., Стайкова Д.Д., Панин А.Л., Ледова Л.Д., Го-ворко Д.В. Целдолазы и ксиланазы грибов рода Aspergillus: свойства, физиологическая роль, способ образования множественных форм// Актуальные проблемы биохимии эукариотов и прокариотов/ ОНТИ НЦБИ. Пущиио, 1590. С. 90-107.'

Подписано в лрчэть 06.04.9Ь. Обтлм 1,0 п.л. Тирад 100-экз. Заказ № 35в.

Типография Издательства Мордовского унивррсит^тгз. 430000 Саранск, ул. Советская, 24.