Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез дрожжами рода Cryptococcus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез дрожжами рода Cryptococcus"

1 П Г.-1П

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

111УБАКОВ АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 582. 284. 017. 7: 577. 152. 321

БИОСИНТЕЗ КСИЛАКАЗ ДРОЖЖАМИ РОДА СРУРТОСОССШ специальность: 03. 00. ИЗ - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидат;! - биологических наук

11У"1)1ИН0 - 1994

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Е. Л. Головлев кандидат медицинских наук О. Н. Окунев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И. Н. Позмогова доктор биологических наук Е К. Ерошин

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет

Зашита диссертации состоится Ж . 1994 Г.

в /У. г. часов на заседании Специализированного совета Д002. 69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов. РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино, проспект науки 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан ЛИ 1994

г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В.М. Вагабов

- i -

I. Введение

Актуальность проблемы. Биоконверсия растительного сырья в кормовые и пищевые продукты, а также топливо, представляет одну из важных задач биотехнологии. В основе микробиологической конверсии растительного материала лежит его ферментативный гидролиз при участии целлюлолитических, гемицеллюлолитических и лиг-нолитических полиферментных систем. Значительная часть гемицеллюлозной растительной фршщии представлена ксиланами, в ферментативный гидролиз которых основной вклад вносят эндо-кси-ланазы. Одними из наиболее перспективных продуцентов ксиланаз являются дрожжи рода Cryptococcus, поскольку многие из них по уровню активности фермента не уступают мицелиальным грибам и не синтезируют при этом целлюлаз. Кроме того, в сравнении с мице-лиальными грибами, дрожжи благодаря большей гомогенности их культур являются удобным объектом для фундаментальных исследований биосинтеза ферментов и его регуляции.

Существенным недостатком для практической реализации процесса биоконверсии гемицеллюлозы, как и целлюлозы, является низкая скорость ферментативного гидролиза, а также невысокий уровень биосинтеза ферментов у известных культур микроорганизмов, продуцентов ксиланаз. Отсюда вытекают несколько направлений в исследованиях по получению и последующему применению гемицеллюлолитических ферментов, и в частности ксиланаз; отбор и селекция высокоактивных природных штаммов - продуцентов ксиланаз; оптимизация условий культивирования микроорганизмов для повышения выхода ксиланаз; изучение механизмов, регулирующих синтез и секрецию ксиланазы и, на их основе, создание эффективных' процессов получения фермента.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке способов получения ксиланаз у дрожжей рода Cryptococcus. В основные задачи работы входили: отбор дрожжевых продуцентов ксиланазы, оптимизация условий их культивирования и изучение основных регуляторных механизмов биосинтеза фермента.

Научная новизна. Обнаружен новый дрожжевой продуцент ксиланазы Cryptococcus podzol icus, по уровню активности фермента не уступающий мицелиальным грибам. Установлено, что ксиланаза у данной культуры является индуцибельным, синтезируемым de novo внеклеточным ферментом и по типу воздействия на субстрат (кси-

- г -

лан) принадлежит к эндо-ксиланазам. На основании изученных особенностей биосинтеза ксиланазы у С. podzol icus разработан способ получения фермента в условиях хемостата с лимитом по глюкозе в присутствии неметаболизируемого индуктора бета-ме-тилксилоэида. Предложен более подходящий для практического использования способ получения ксиланазы С. podzolicus в условиях периодического культивирования в среде, содержащей смесь водных экстрактов свекловичного жома, пшеничных отрубей и солодовых ростков.

Практическое значение работы. Дрожжевой продуцент ксиланазы С. podzol icus не синтезирует целлюлаз, поэтому полученный препарат ксиланазы может быть применен для отбелки бумаги и-других целлюлозосодержащих материалов, что предотвратит или уменьшит использование для этой цели хлора. Предложены способы получения больших количеств этих ценных дрожжевых ксиланаз.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 15- м международном специализированном симпозиуме по дрожжам (Рига, сентябрь-октябрь 1991 г.) и обсуждены на семинарах лаборатории экологической физиологии микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАЕ

Публикации. Ш результатам работы опубликовано 2 статьи и 1 тезисы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 18 рисунков. Список литературы насчитывает 184 источника.

2. Материалы и методы исследований В работе использован штамм базидиомицетных дрожжей Cryptococcus podzolicus ВКМ Х-1. Культуру поддерживали на сусло -агаре при температуре +4°С. Способность дрожжевых грибов утилизировать ксилан (Serva, Германия) в качестве единственного источника.углерода (1%) проверяли на агаризованной дрожжевой азотной среде (Difco, США). Культивирование в жидкой среде проводили в колбах при перемешивании (220 об/мин) с объемом пита-.тельной среды 100 мл при 28°С и в ферментере "АНКУМ-2М" с рабо-

чим объемом среды 1,0-2,0 л при той же температуре, скорости перемешивания среды 800 об/мин, парциальном давлении кислорода в культуральной жидкости 60% от максимального насыщения. При периодическом культивировании исходное значение рН среды было 4,0 без последующего регулирования. При непрерывном культивировании рН среды поддерживали на уровне 5,0 подачей 10% (вес/объем) КОН или 10% (вес/объем) НС1. Среда имела следующий состав (г/л): дрожжевой экстракт - 2,0; пептон - 5,0; MgSOq х 7 Н20 -0,6; КНгР0ч- 1,7; К2НР0^- 0,3. При непрерывном культивировании в среду добавляли микроэлементы (мг/л): F6SO4 х 7 Н20 - 14,9; Zn304 х 6 Н20 - 8,05; CuS04 х 5 Н20 - 3,9; MnS04x 5 Н20 - 0.2 и витамины (мг/л): биотин - 50,0; тиамин - 200,0. Источниками углерода служили глюкоза, ацетат, цитрат, малат, этанол, ксилоза, ксилан и смеси ксилана с глюкозой, ксилана с этанолом, ксилана с ацетатом. Использовали также кислотные гидролизаты опилок, торфа и смесь водных экстрактов свекловичного жома, пшеничных отрубей и солодовых ростков, составленную в соотношении по объему 50: 25:25, соответственно.

При непрерывном культивировании в качестве источника углерода, лимитирующего рост культуры, использовали глюкозу (1%), а индуктором биосинтеза ксиланази являлся неметаболизируемый бета -метилксилоэид (0,3 г/л). Индуктор вносили в ферментер и подключали в проток одновременно после установления steady-state, и в последующем концентрация индуктора в среде поддерживалась на уровне 0,3 г/л. После добавления бета-метилксилозида активность внеклеточной ксиланазы при разных скоростях разбавления среды определялась в течение 4-х генераций культуры.

В экспериментах по изучению индукции ксиланазы использовали ксилан, ксилозу, арабинозу, манноэу, глюкозу, целлобиоэу, пектин, карбоксиметилцеллюлозу, авицел и бета-метилксилоэид. Клетки, выращенные в среде с глюкозой, были отмыты и инкубированы в солевой среде, содержащей указанные выше субстраты. Через 24 часа инкубирования определялась внеклеточная кеиланазная активность. В одном из вариантов наряду с индуктором в солевую среду добавляли, циклогексимид (40 мг/л).

Для изучения влияния глюкозы на биосинтез ксиланазы культуру выращивали.в среде с 1% ксилана и через 16 часов добавляли глюкозу в конечной концентрации 0,5%.

Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазным методом Щербухин и др. . 19703, концентрацию ксилозы - орцинольним методом CDische. Borenfreund, 1957]. Продукты гидролиза ксилана« определяли методом жидкостной хроматографии низкого давления [Sinner. Puls. 1978]. используя анализатор углеводов LC 2000 "Biotronik" (Германия). Роет культуры контролировали по Бесу сухой биомассы.

Для изучения локализации ксиланазы биомассу дрожжей, выращенных в среде с IX ксилана, отделяли от надосадочной жидкости, дезинтегрировали на прессе [Ратнер и др., 1972], затем, центрифугированием получали фракции цитозоля и клеточных осколков, а ультрацентрифугированием из цитозоля осаждали фракцию мембран. Осколки клеток обрабатывали 0,5 M NaCl, О,IX дезоксихолата натрия, 0,2% ТВИН-80. Во всех фракциях определяли ксиланазные активности.

Активность ксиланазы определяли по накоплению редуцирующих Сахаров после 10 мин инкубации (50°С) с 1% суспензии ксилана в 0,05 M ацетатном буфере (pH 5,0) [Gnose, Bisaria, 1984]. Редуцирующие сахара определяли по методу Нельсона - Сомоджи [Nelson, 1944; Soirogyi, 1945]. За единицу активности ксиланазы принимали количество фермента, образующее из ксилана 1 мкмоль эквивалентов ксилозы за мин.

3. Результаты исследований 3.1. Выбор дрожжевого продуцента ксиланазы Шли проверены 165 штаммов 50 видов баэидиомицетных дрожжей и дрожжевых форм базидиомицетов, принадлежащих к 20 родам, на способность образовывать внеклеточные ксиланазы при росте на плотных и в жидких ксилан-содержащих средах. В результате был отобран штамм Cryptococcus podzolieus BKM X-l. обладающий высокой ксиланазной активностью (до 150 ед/мл) и не синтезирующий при этом целлюлаз.

3.2. Влияние условий культивирования на биосинтез ксиланазы Cryptococcus podzolicus Для максимального биосинтеза ксиланазы у штамма-продуцента

были подобраны оптимальные условия культивирования.

Установлено, что культура активно синтезирует фермент в средах, содержащих в качестве источника углерода ксилан - до ОТ -60 ед/мл. В среде с ксилозой активность ксиланаэы на порядок ниже, чем на среде с ксиланом - Б-6 ед/мл. С другими источника^ ми углерода (органические кислоты, этанол) уровень активности фермента был незначителен - ниже 1,0 ед/мл. Фермент не обнаруживался в среде с глюкозой.

Показано, что максимальное образование внеклеточной ксиланаэы у штамма-продуцента происходит в средах, содержащих органические источники азота (гидролизат казеина, пептон). Неорганические источники азота (нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, дигидрофосфат аммония) способствовали образованию ксиланаэы в меньшей степени.

Оптимальными условиями для биосинтеза ксиланаэы, а также для роста культуры, являются рН среды 5,0 и температура культивирования 24-28°С.

Неочищенная ксиланаза С. podzol icus имеет оптимумы рН и температуры соответственно 5,0 и 60°С. Фермент был стабилен при

* о

рН 5,0, а область термостабильности лежала ниже 50 С.

3.3. Локализация ксиланаэы Cryptococcus podzol i cus и тип действия ее на ксилан

Исследовано распределение активности ксиланаэы С. podzolícus по клеточным фракциям в различные периоды роста (табл. 1).

Как видно из табл. 1, ксиланаза С. podzol i cus является внеклеточным ферментом и 96,6-98,0 7. ее активности обнаруживается в культуральной жидкости. С клетками было связано всего 2. 0-3,4% активности фермента. Активность ксиланаэы во фракции мембран, осажденных из цитозоля, не превышала 0,01-0,02% общей активности.

Изучение продуктов, освобождаемых из ксилана под действием ксиланаэы С. podzolicus, показало, что среди них преобладали низкомолекулярные олигосахариды. Это позволило предположить, что ксиланаза у данной культуры является, по-видимому, ферментом эндо-типа действия (эндо-ксиланаза), расщепляющим ксилан до ксилозных олигосахаридов.

- б -

Таблица 1

Распределение ксиланазы Cryptococcus podzol icus по клеточным фракциям

Фракция Активность ксиланазы, X

часы

-12 18 24

Кулътуралъная жидкость 98.0 97,5 96,6

Цитозолъ 0,3 0,9 1,9

Клеточные осколки 1.7 1.6 1,5

3.4. Некоторые особенности биосинтеза ксиланазы у штамма Cryptococcus podzolicus А. Индукция синтеза ксиланазы Представленные выше данные (см. п. 3.2. ) позволили сделать предположение об индуцируемом синтезе ксиланазы у дрожжей С. podzol icus. Для подтверждения этого было изучено влияние ряда Сахаров и известных индукторов полисахараз на образование ксиланазы у штамма-продуцента (табл. 2).

Как видно из табл. 2, синтетический бета-метилксилозид оказывает наиболее эффективное индуцирующее действие (45,5 ед/мл). Из природных субстратов наибольшая активность ксиланазы обнаружена на ксилане (13.7 ед /мл), которому уступали ксилоза, арабиноза и манноза. Остальные испытанные соединения индуцирующим действием практически не обладали.

Синтез фермента в солевой среде с ксиланом блокировался циклогексимидом - ингибитором белкового синтеза, что позволяет рассматривать процесс индукции ксиланазы С. podzolicus как синтез фермента de novo, а не как образование его из профермента.

Таким образом, ксиланаза С. podzol icus является индуци-бельным ферментом, что учитывалось, при организации процессов получения фермента

Таблица 2

Влияние различных источников углерода на биосинтез ксиланаэы отмытыми клетками Cryptococcus podzolicus

Источник углерода , Активность ксиланазы, ед/мл

Ксилан 13,7

D-ксилоэа 8,0

L-арабиноза 3,8

D-манноэа 1,7

D-глюкоза 0,0

Целлобиоза 1,1

Карбоксиметилцеллюлоза 1,3

Авицел 0,7

Пектин 0,3

Бета-метилксилозид 46.5

Без индуктора 1.1

Б. Катаболитная репрессия Как было показано, в среде с глюкозой в качестве единственного источника-углерода образование ксиланаэьгне наблюдается. Было сделано предположение о репрессирующем влиянии глюкозы на биосинтез ксиланаэы С. podzolicus. Для проверки высказанного предположения к активно синтезирующей ксиланазу культуре была добавлена глюкоза (рис. 1).

Как видно из рис. 1, активность ксиланазы в течение первых 4-х часов после добавления глюкозы оставалась практически на эдном и том же уровне, что и до внесения, то есть образование фермента приостанавливалось. Активность ксиланазы начинала увеличиваться только после потребления глюкозы. В контрольном варианте, которым служила та же самая культура, но без добавления глюкозы, активность, фермента за указанные выше 4 часа увеличи-яась в 2.8 раза.

Указанные факты могут свидетельствовать, очевидно, о репрессирующем -влиянии глюкозы на синтез ксиланазы С. podzol icus. Го есть, регуляция образования ксиланазы глюкозой происходит на

уровне синтеза, а не на уровне активности фермента.

Рис. 1. Образование ксиланазы С. podzolicus в среде с 1% ксплана при добавлении (опыт) и без добавления (контроль) глюкозы: а - биомасса, опыт, г/л;«- биомасса, контроль, г/л;о - ксиланаза, опыт, ед/мл;о - ксиланага, контроль, ед/мл; v - глюкоза, г/л

3. Б. Образование ксиланазы штаммом Cryptococcus podzolicus в условиях периодического культивирования Изучены особенности биосинтеза ксиланазы С. podzolicus в условиях периодического культивирования в среде, содержащей в качестве единственного источника углерода ксилозу или ксилан. Образование ксиланазы в среде с ксилозой (1%) является двухфазным процессом, зависящим от концентрации ксилозы в среде (рис. 2).

В первой фазе (20 часов от начала культивирования), экспоненциальном росте культуры, активность фермента увеличивается медленно и не превышает 1,0 ед/мл. По-видимому, низкий уровень биосинтеза фермента в это время обусловлен возможным репресси-

рующим действием высоких концентраций ксилозы в среде (10,0 -2.6 г/л). Интенсивное образование фермента, как видно из рис. 2. наблюдается во второй фазе ( 20-24 часа), при достаточно низких концентрациях ксилозы в среде (менее 2,6 г/л), когда

12 10

г *

2

о

Г/л

ед/мл

:д/иг

0.8 0.G 0.4 0.2

Рис. 2. Динамика роста и образования ксиланазы С. podzol icus в среде с 1% ксилозы: • - биомасса, г/л; + - ксиланаза, ед/мл; # - ксиланаза, ед/мг; □ - ксилоза, г/л

заканчивается активный рост культуры. То есть, максимальная скорость биосинтеза фермента в среде с ксилозой наблюдается при переходе культуры от экспоненциального к стационарному росту. Об этом свидетельствуют кривая удельной активности фермента (по весу сухой биомассы) (рис. 2) и кривые удельных скоростей роста и образования ксиланазы (рис. 3).

Как видно из рис. 3, максимум удельной скорости образования фермента не совпадает с максимумом удельной скорости роста и имеет место при низкой удельной скорости роста (0,03 ч* ).

Образование ксиланазы в среде с ксиланом (1%) является однофазным процессом, то есть биосинтез фермента связан с ростом культуры (рис. 4).

.«д/хг/ч

Рис. 3. Связь удельных скоростей роста и образования ксиланазы С. ройзоПсиз в среде с 17. ксилозы: ♦ - удельная скорость роста, ч"1; + - удельная скорость образования ксиланазы, ед/мг/ч

г/л

10

20 30

ч

ед/мл

60

ел/иг

30

SC 10 30 го ю с

Рис. 4. Динамика роста и образования ксиланазы С. podzolicus

в среде с IX ксилана: • - биомасса, г/л; а - ксиланаза, . ед/мл;о-кеиланаза, ед/мг

- il -

Активность ксиланазы к началу стационарной фазы роста (;24 часа) достигает значения 39.8 ед/ мл и далее существенно не увеличивается. Максимумы удельных скоростей роста и образования ксиланазы совпадают по времени и соответствуют 8 и 18 часам (рис. 5). Наличие нескольких максимумов, возможно, объясняется сложным строением ксилана как полисахарида.

ч

Рис. Б. Связь удельных скоростей роста и образования ксилана-ча в среде с 17. ксилана: ^ - удельная скорость роста, ч" ; о - удельная скорость образования ксиланазы, ед/мг/ч

Таким образом, при разработке способов получения ксиланьиы С. podzolieus необходимо учитывать индуцибельность фермента, катабодитную репрессию и, в зависимости от используемого источника углерода, различную степень связи между скоростью биосинтеза ксиланазы и скоростью роста культуры.

3.6. Способ получения ксиланазы Cryptococcus podzol i eus в условиях периодического культивирования

Для создания более экономичного процесса получения ксиланаэы в среде с ксиланом были испытаны двухкомпонентные источники углерода, в которых источником роста служил относительно дешевый и доступный субстрат (глюкоза, ацетат, этанол), а ксилан в небольшой концентрации способствовал образованию ксиланазы. Из них наибольшей активностью ксиланазы (25,7 ед/мл), а также максимальным выходом биомассы (4,2 г/л), обладает культура, выращенная в среде, содержащей глюкозу (0,5 2) и ксилан (0,22). Образование ксиланазы при этом, как и в среде, с ксилозой 1.ом. п. 3. 5.), имеет двухфазный характер (рис. 6). зависящий от концентрации глюкозы в среде.

ед/мл

ел/иг

30 25

го

ю 5 J0

Рис. 6. Динамика роста и образования ксиланазы С. podzolicus в среде с 0,6% глюкозы и 0,2% ксилана; • - биомасса, г/л;« - глюкоза, г/л; + - ксиланаза, ед/мл, * -ксиланаза, ед/мг

Активность фермента начинает обнаруживаться в среде спустя 14-16 часов от начала культивирования - 0,01-0,1 ед/мл, при

снижении концентрации глюкозы до 1,9 г/л и ниже. По-видимому, культура при данных условиях культивирования имеет низкую чувствительность к катаболитной репрессии глюкозой. Фермент активно. синтезируется и накапливается в культуральной жидкости тодько после исчерпания глюкозы из среды (через 16 часов), что соответствует периоду перехода от экспоненциальной к стационарной фазе роста. Двухфазный характер образования ксиланазы в среде, содержащей ксилан и глюкозу, объясняется, вероятно, репрессирующим влиянием глюкозы на биосинтез ксиланазы С. podzolicus.

Таким образом, несмотря на уменьшение количества ксилана в среде в 5 раз (от 1% до 0.2%), активность ксиланазы, полученная в средё с ксиланом и глюкозой, была всего в 2 раза ниже, чем в среде с 1% ксилана.

Поскольку коммерческий ксилан является достаточно дорогим субстратом, была предпринята попытка заменить его другими ксилан- содержащими субстратами, и в частности, растительными отходами (древесные опилки, свекловичный жом, пшеничные отруби, солодовые ростки, а также торф) (табл. 3).

Таблица 3

<">бразование ксиланазы дрожжами Cryptococcus podzol icus при культивировании на растительных отходах

Субстрат

Активность ксиланазы

ед/мл

ед/мг

Гидролиэат опилок

Смесь экстрактов свекловичного

жома, пшеничных отрубей и

6.8

3,1

солодовых ростков Среда, содержащая

107,8

16,3

необработанные свекловичный жом, пшеничные отруби и ,

солодовые■ростки Гидролиэат торфа

21,9 0.9

0.4

Как видно из табл. 3, из испытанных растительных отходов

наибольшая активность ксиланазы (107,8 ед/мл) обнаруживалась в среде, содержащей смесь экстрактов свеюювичного жома, пшеничных отрубей и солодовых ростков. Следовательно..указанная смесь экстрактов, содержащая водорастворимые фракции ксилана и сахара, может служить заменой коммерческому ксилану как источнику углерода и индуктору.

Таким образом, в условиях периодического культивирования наиболее подходящим является способ получения ксиланазы С. podzol i cus в среде, содержащей смесь экстрактов свекловичного жома, пшеничных отрубей и солодовых ростков. Активность ксиланазы и производительность процесса по ксиланазе при этом в 2 раза выше, чем в среде с 1% ксилана.

3.7. Способ получения ксиланазы Cryptoeoccus podzol tous в условиях непрерывного культивирования Далее был ' использован одностадийный, хемостатный режим культивирования при различных скоростях разб,авления среды как для более детального исследования взаимосвязи между ростом культуры и синтезом ксиланазы, так и для оценки этого метода с точки зрения его продуктивности. Фактором, лимитируюшим рост культуры, была глюкоза (1Z), которая при низких концентрациях в присутствии индуктора не репрессировала синтез ксиланазы и поддерживала максимальную скорость роста. Ксилоза также поддерживала максимальную скорость роста, но имела слабый индуцирующий эффект. Поэтому в качестве индуктора биосинтеза ксиланазы использовали неметаболизируемый бета-метилксилозид как наиболее эффективный для С. podzol icus индуктор (рис. 7).

Как видно из рис. 7, при скоростях разбавления от 0,025 до 0,15 ч~* глюкоза в среде не накапливалась и создавались условия для индукции. Начиная со скорости 0,2 чИглюкоаа в среде накапливалась. При скорости 0,3 ч культура из ферментера вымывалась полностью. Исходя из этого, изучение образования внеклеточной ксиланазы, индуцированной Оета-метилксилоэидом, проводили при скоростях разбавления среды от 0,025 до 0,15 ч'\

Активность внеклеточной ксиланазы при скоростях разбавления среды 0,025, 0,05 и 0,1 ч составляла соответственно 143.8, 111, 5 и 76.Б ед/мл. При удельной скорости роста 0,15 ч актив-

ность фермента отсутствовала, что можно объяснить, по-видимому, репрессией синтеза фермента "критической" внутриклеточной концентрацией глюкозы и/или ее метаболитов. Производительность процесса по ксиланазе по мере повышения удельной скорости роста

Рис. 7. Кривые роста и биосинтеза ксиланаэы дрожжей С. podzolicus в условиях хемостата с лимитом по глюкозе с использованием индуктора бета-метилксилоэида: • - биомасса, г/л; о - глюкоза, г/л; о - ксиланаза, ед/мл; д - производительность ферментера, ед/л/ч; * -продуктивность культуры, ед/г/ч

от 0, 025 до 0,1 ч"'увеличивалась от 3600 до 7650 ед/л/ч, что свидетельствует об интенсификации процесса биосинтеза и секреции фермента в среду с повышением скорости роста (рис. 7). То есть, при увеличении удельной скорости роста С. podzol icus повышается интенсивность накопления внеклеточной ксиланаэы и максимальная производительность наблюдается при скорости разбавления среды 0,1 ч .

Таким образом, непрерывное культивирование со скоростью разбавления среды 0.1 Сможет быть одним из способов получения ксиланазы. Производительность культуры по ксиланаэе при этом в 5 раз выше, чем при периодическом процессе в аналогичной среде.

3.8. Выбор оптимальных способов для получения ксиланазы у штамма Crypt.ococcus podzol i cus

В результате проведенной работы подобраны условия культивирования (состав среды, рН, температура). которые позволяет получить высокую активность внеклеточной ксиланазы у отобранного штамма-продуцента (до 150 ед/мл). На основании полученных экспериментальных данных, с учетом особенностей биосинтеза ксиланазы у С. podzolicus, предложены два способа для получения кеиланазных ферментных препаратов, свободных от целлюлазной активности.

Первый способ заключается в культивировании С. podzol icus в среде, содержащей смесь экстрактов свекловичного жома, пшеничных отрубей и солодовых ростков. В практических целях для получения ксиланазы целесообразно использовать этот способ культивирования С. podzolicus.

Второй способ состоит в использовании непрерывного культивирования в режиме хемостата с лимитом по глюкозе. Этот способ включает непрерывное добавление индуктора биосинтеза ксиланазы бета-метилксилозида, который может быть регенерирован и снова использован. Данный способ наиболее подходит для лабораторных условий.

Выводы

1. Отобран продуцент ксиланазы Cryptococcus podzolicus ВКМ X-l, обладающий высокой ксиланазной активностью и не синтезирующий целлюлаз.

2. Оптимизированы состав среды и условия культивирования с целью интенсификации биосинтеза ксиланазы у отобранного штамма-продуцента

3. Установлено, что ксиланаэа С. podzolicus является индуци-бельным, синтезируемым de novo ферментом. Наибольшая активность

иланазы наблюдается в присутствии кеилана и бета-метилкеило-ца. Ксилоза оказывает слабое индуцирующее действие. Показано, что глюкоза является репрессором синтеза ксилана-, но не ингибирует активность фермента, репрессирующая кон-нтрация глюкозы в среде с ксиланом составляет 1.9 г/л. Ксиланаза С. podzol iсиз является внеклеточным ферментом и носится к ферментам эндо-типа действия (эндо-ксиланаза) , но-эрядоченно расщепляющим субстрат (ксилан) до серии коротких клоолигосахаридов.

Показано, что связь между процессами роста и биосинтеза кси-г!азы у С. podzol i cus определяется используемым источником se рода.

Предложены два способа для получения максимальных количеств гклеточной ксиланазы. Первый способ заключается в культивиро-1ии С. podzolicus на смеси экстрактов свекловичного жома, лшчных отрубей и солодовых ростков. При этом производитель-:ть процесса по ксиланазе в 2 раза выше, чем при использова-i коммерческого кеилана. Второй способ состоит в культивиро-Ш1 С. podzolicus в режиме хемостата с лимитом по глюкозе, щстором биосинтеза ксиланазы при этом служит бета-метилкси-шд.. Производительность процесса по ксиланазе в 3 раза выше сравнению с периодическим процессом в аналогичной среде. >вый способ может быть предложен для масштабирования, а вто-i - для использования в лабораторных условиях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: Shubakov А. А. , Boyev А. V. , Mikhaleva N. I. , Okunev O.K., .ubev W. I. 1991. Xylanase production by the yeast 'ptococcus podzolicus. 15 th international specialized iiposium on yeasts. Riga. September 30 - October 6, p. 126. Щубаков A. A. , Окунев О. H. , Голубев R И., Михалева H. И. 1994. шространение ксиланазной активности среди базидиомицетных >жжевых грибов. Микробиология, т. 63, вып. 2, с. 217-220. Щубаков А. А. , Михалева R И. , Боев A. R , Окунев О. Я 1994. >азование ксиланазы дрожжами Cryptocoocus.podzol icus. Прикл.

1ХКМИЯ И MKKPnfiwn тт/-»п1дст m -an nun P.