Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств

Шульгина, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств"

ЦЕНТР ПО ХИМИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ( ЦХЛС - ВНИХФИ )

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТУБЕРКУЛЕЗА РАМН

На правах рукописи

Г Г 5 ОД

Шульгина Марина Владимировна. 4 цдд ^дд

РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПОВ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ, НА ДОКЛИНИЧЕСКОМ ЭТАПЕ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Специальности: 14.00.25- Фармакология 03.00.07- Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1999

Работа выполнена в Центре по химии лекарственных средств и Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН.

Научные консультанты:

профессор, доктор медицинских наук В,И. Голышевская

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук С.А. Вичхалоаа

профессор, доктор медицинских наук Ю.Ф. Крылов

доктор биологических наук Б.И. Маракуша

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. ИМ. Сеченова

Защита состоится "28 " сентября 1999 года в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 074.53.01 в ЦХЛС-ВНИХФИ по адресу: 119815 Москва, Зубовская ул, д. 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦХЛС-ВНИХФИ

Автореферат разослан " "_ 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук Л.Ю. Крылова

член-корр. РАМН, профессор,

Т.А. Гуськова

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. При решении задач, стоящих перед современной химиотерапией бактериальных инфекций, возникают две проблемы: 1) преодоление постоянно растущей устойчивости бактерий к известным антибактериальным средствам, и 2) увеличение числа патогенных микроорганизмов за счет штаммов, относившихся ранее к условно-патогенным. Это диктует необходимость поиска антибактериальных препаратов с новыми механизмами действия, в связи с чем изучение механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе разработки препарата приобретает все большее значение. Определение мишени и механизма антибактериального действия позволит уже на ранних этапах исследования оценить химиотерапевтические перспективы потенциального лекарственного средства, а также прогнозировать место этого соединения на высоко насыщенном фармацевтическом рынке. Разработка адекватных моделей для изучения структурно-функциональных зависимостей соединений новых химических рядов будет способствовать проведению направленного синтеза высокоактивных антибактериальных веществ, а также может стать основой для их компьютерного моделирования.

Для фармакологических препаратов, антибактериальная активность которых является побочным эффектом, расшифровка механизмов этого эффекта позволит прогнозировать его значимость. Проведенные исследования структурно-функциональных зависимостей, базирующиеся на данных о механизме действия, а также определение фармакоформных заместителей в молекуле фармакологического препарата, ответственных за антибактериальную активность, создают предпосылки для направленного синтеза веществ, сохраняющих фармакологические свойства, но лишенных

нежелательной антибактериальной активности, или, наоборот, для создания нового антибактериального средства.

Детальное изучение механизмов действия антибактериальных препаратов проводится, как правило, на стадии внедрения препарата б практику позже Сложнейшие эксперименты с привлечением молехулярпо-биологических, биохимических и других методой трудоемки и дорогостоящи, поэтому весь комплекс исследований на стадии доклинического изучения лекарственного средства обычно не проводится. Научно обоснованный и экспериментально подтвержденный выбор методов, позволяющих но этой стадии исследования определить мишень и ба:гтериаль5юГ1 клггхс, на которую воздействует потенциальный препарат, даст возможность ирогиозяроаять перспективу его примененил в кпнинхе. До последнего гремели, треооаання к предоставлению данных о возможном механизме действия антибактериального препарата на этапе доклинического жныташи отсутствовали. Методические рекомендации по проведению - такого рода исследований представлены только в одном сборнике под редакцией Г.Н. Перэтдна (Методы экспериментальной химиотерапии, 1971). В этом пособии прг/утсаемя дг-а метода изучения механизма антибактериального действия сседингмий •• метод антагонизма, заключающийся с 25еслсдозазнш пзгтаготкггоз антибактериальной активности испытуемого сссдинсшы; л юучгзис влуюняя хнмютерапсатических веществ нп отдельные фгр:«Е1птале система. Выбор испытуемых метаболитов я ферментативных рсахций при таком подхода достаточно случаен. Развитие кодгхуллрной фгл^опопш мнхрооргашголов н бактериальной генетики «жрняо 5* настоят» ¡¡¡имя более широкие возможности длл систематизации псслздогшшй мехашимоэ антибактериального действия зсществ. Раеширепи-г арсенала методических подходов, а также необходим ост;, соэданш жонх^рбмтоспособшх антибактериальных средств, требования

современных рыночных отношений определяют актуальность разработки единых принципов изучения механизмов антибактериального действия на стадии доклинического изучения потенциальных лекарственных средств.

Целью исследовании явилась разработка методологических подходов 1С оценке механизма антибактериального действия фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.

Задачи исследования:

1) Создание алгоритма тестирования химических соединений с целью определения механизма их антибактериального действия на примере известных антибактериальных препаратов.

2) Сравнительное изучение механизма антибактериального действия 6-фтор и 6-нитро производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты на основе разработанного алгоритма тестирования.

3) Углубленное изучение особенностей механизма антибактериального действия и структурно-функциональные зависимости производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты.

4) Выявление мишени антибактериального действия антндепрессантов - пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пнразинокар-базолов на основе разработанного алгоритма тестирования.

5) Определение структурно-фунциональных зависимостей антибактериальной активности для соединений ряда карбазола.

Научная новизна исследования. 1. Впервые предложена схема исследования механизма антибактериального действия веществ, отличительной особенностью которой является использование генетически сконструированных и мутантных штаммов как для определения мишени действия веществ, так и для изучения их структурно-функциональных зависимостей.

2. Впервые предложено использование определение влияния веществ на скорость аккумуляции пролина и а-метилглюкопиранозида для оценки их мембранотропного действия на бактериальную клетку. С помощью этого метода выявлено влияние тиазолидиндионов на бактериальные мембраны.

3. Впервые изучена структурно-функциональная зависимость в ряду 6-нитро производных хинолон-З-карбоновой кислоты.

4. Впервые выявлены различия в механизме действия фтор- и нитропроиз-водных 4-хинолона.

5. Впервые установлена механизм воздействия антидепрессантов лиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокарбазола на бактериальную клетку. Разработаны модели для выявления структурно-функциональных зависимостей соединений ряда пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола для грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

6. Впервые выявлены фармакоформные группы, обеспечивающие высокую активность, в отношении Mycobacterium tuberculosis в ряду пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола. Наиболее активными оказались соединения: 2,3,ЗаД5,6-гексагидро-&-адамантил-1 и-пиразино-[ 3,2,1 j ,к]карбазол (ШКИ-114) и 1-фенилэтиламино-6-циклогексил-1,23,4-тетрагидрокарбазол (Ш-1046).

Научно-практическая значимость исследования.

1. Разработана рациональная схема оценки механизма антибактериальной активности фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.

2. Методологические подходы оценки механизмов антибактериального действия учтены в требованиях к доклиническому изучению антибакте-

риальной активности фармакологических веществ, одобренных Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве официального документа.

3. Предложенная схема, а также отдельные методические подходы, были применены во Всероссийском Научном Центре по безопасности биологически активных веществ и в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН для предварительной оценки механизмов антибактериального действия новых групп химических соединений с выраженным антимикробным эффектом. Применение разработанных в диссертационной работе методологических подходов позволило на ранних этапах исследования определить точку приложения антибактериального действия новых групп соединений.

4. Высокая антибактериальная активность и особенности механизма действия соединения РГ-10 (1-циклопропил-6-нитро-7(3-метилпиперазинил)-1,4,дигидро-4-оксохи-нолин-3-карбоновой кислоты) с учетом его низкой токсичности, явились основанием к рекомендации этого соединения для клинических испытаний в качестве антибактериального средства.

5. Впервые выявлены фармакоформные группы в молекуле пиразинокарба-зола и аминотетрагидрокарбазола, обеспечивающие антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий.

6. Установление структурно-функциональных зависимостей активности в отношении М. tuberculosis производных пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола позволило определить направление синтеза соединений с высокой противотуберкулезной активностью в ряду карбазола.

7. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы, показанное в настоящем исследовании, и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда соединений с антибактериальной активностью - ингибиторов бактериальной ДНК-гиразы

Апробация работы. Диссертационное исследование выполнено по плану научно-исследовательских работ в Центре химии лекарственных средств -Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе в 1989-1992 годах и Центрально?.! научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН в 1998 - 1999 годах.

Основные положения диссертации были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на 11 и 19 сьездах Федерации Европейских биохимических обществ в 1977, 1989 г., на Международном генетическом хонгрессе в Москве, в 1980 г., на 8 и 9 Средиземноморсхом конгрессе по химиотерапии в 1992 и 3994 годах, на 18 Международном конгрессе по химиотерапии в 1993 г., на заседаниях секции туберкулеза Всероссийского микробиологического общества в 1998 и 1999 годах, на Конгрессе "Челок;:; м лехарство" в 1998 г., на коллоквиумах и заседаниях Ученых советов ЦХЛС - ВНИХФИ и ЦНИИ! РАМН, а отчетах по темам НИР ЦХЛС ВШ1ХФИ к ЦНИИТ РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа в отечественных и зарубежных научных периодических изданиях.

Структура диссгртацз5»;шон работы. Работа изложена на 178 страницах, содержит 5 разделоз, включая "Введение", "Литературный обзор", "Экспериментальную часть", состоящую из "Общей характеристики материалов и методов", четырех глав "Результатов и обсуждения", "Заключения", "Выводов" и содержит "Список цитируемой литературы"

В диссертационной работе представлено 24 рисунка, 15 таблиц. Список цитируемой литературы включает 245 публикации отечественных и зарубежных авторов.

Основные результаты, представленные в диссертации, получены самим соискателем и сотрудниками лаборатории экспериментальной химиотерапии инфекционных заболеваний под руководством соискателя, а также в совместных исследованиях с сотрудниками ЦХЛС ВНИХФИ профессором, д.б.н. Н.И. Фадеевой, к.х.н. Л.И. Будановой, к.б.н. Л.Ф.Стебаевой, сотрудниками института общей генетики РАМН под руководством профессора В.А. Тарасова, сотрудником института биохимии им. А.Н. Баха РАН к.б.н. ВА. Ереминым.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы Esherichia coli KI2 дикого типа, штамм KL16thy- и изогенные к нему KL164, несуший nalC мутацию и KL166, дефектный по А субъединице ДНК-гиразы (gyrA); штамм К1871, несущий температурочувствительный дефект в В субъединнце ДНК-гиразы (gyrB'!); штаммы SN15 и SN23 со сниженной проницаемостью клеточной стенки; штамм EClOOO/pJE47 (F\ Д(ргоВ-!ас) thil supE44 strA/co!El fid Ар-lac), сконструированный в институте Общей генетики РАН под руководством В.А. Тарасова для SOS-хромотеста. Кроме того, применяли штаммы дикого типа Escherichia coli АТСС25922 и Staphylococcus aureus АТСС6538р.

Среды н условия культивироваиня. Бактерии выращивались в жидких средах Nutrient Broth (Difco), L- бульон, среда Abbott, минимальная синтетическая среда М9 с необходимыми добавками и на агаризованных вариантах Nutrient Broth и L- бульона.

Определение антибактериальной активности веществ. Антибактериальный эффект (МИК - минимальные ингибирующие концентрации и МБК-минимальные бактерицидные концентрации, МГПС - минимальные подавляющие концентрации) определяли по общепринятой методике, а также по влиянию на рост культуры в жидкой среде, определяемой по приросту оптической плотности (ИД50 -концентрации, вызывающей 50% подавление скорости роста, определенного по приросту оптической плотности).

Накопление гетероциклических соединений в цитоплазматиче-ской и мембранной фракциях бактериальной клетки после разделения лизата центрифугированием при 16000 С на фракции фракцию. Содержание веществ во фракциях определяли методом ВЭЖХ.

Филаментацию бактериальных клеток определяли с помощью электронного микроскопирования и сравнения их длины со стандартом.

О влиянии веществ на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке судили по включению радиоактивно меченых предшественников макромолекул - Н3-тимидина, Н3-уридина и С14-лейцина в высокомолекулярную (кислотонерастворимую) фракцию растущей бактериальной культуры.

Индукция БОБ-ответа. Индукцию БОБ-ответа оценивали по абсолютным значениям активности р-галактозидазы в штамме ЕС1000/рШ43, инкубировавшемся в присутствии испытуемого вещества. Кроме того, для большей наглядности ДНК-повреждающего эффекта вещества, мы ввели коэффициент индукции - соотношение абсолютных значений активности фермента в присутствии ДНК-повреждающих агентов и в контрольной, неповрежденной культуре. В качестве стандартного контроля на ДНК-повреждающее действие использовали облучение культуры ультрафиолетовым светом с ^=254 нм, 30 сек.

Уровень трансмембранного потенциала Дцц+. Об уровне трансмембранного потенциала ионов водорода судили по скорости аккумуляции |4С-пролина и МС -а-метилглюкопиранозида клетками бактерий.

Активность фосфолипаз С и В определяли на модели искусственных везикул с лецитином и лецитином и фосфатидилинозитом. Образовавшийся продукт определяли с красителем Виктория голубой К.

Статистическая обработка данных. Полученные результаты подвергались статистической обработке. Для каждой серии опытов определялась величина вероятности р, которая не превышала величины 0,001 для биохимических опытов, 0,05 - для опытов по определению длины бактериальной клетки и микробиологических исследований. Для каждой величины, предстааденной в таблицах или на графиках, определяли коэффициент вариации.

Группы исследуемых гетероциклических соединений.

С целью отработки предлагаемой схемы в исследовании были использованы пять групп антибактериальных препаратов различной химической . природы с известными мишенями - тетрациклин, сульфаниламиды, производные ди-М-окиси хиноксалина, нитрофурана и хинолон-3-карбоновой кислоты.

Для апробации предложенного алгоритма в исследованиях использовались оригинальные соединения различных химических групп, синтезированные в ЦХЛС-ВНИХФИ: нитропроизводные хинолон-3-карбоновой кислоты, производные пиразинокарбазола, среди которых были активные фармакологические препараты пиразидол и тетриндол, и производные тиазолидиндмона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка алгоритма изучения механизмов антибактериальной активности синтетических гетероциклических соединений.

Основой всех экспериментов явилось определение временных и концентрационных параметров антибактериального эффекта,

определяющих условия дальнейших экспериментов. Кинетические параметры антибактериального действия вещества определяли на основании изучения его годавляющего воздействия на рост культуры бактерий. Определение действия вещества на динамику прироста оптической плотности жидкой культуры позволило определить временные и концентрационные параметры процесса достаточно точно, что позволило опираться на эти параметры в дальнейших исследованиях.

На втором этапе определяли группы биохимических процессов бактериальной клетки, подверженных воздействию изучаемых соединений, в соответствии с временными и концентрационными характеристиками, полученными на первом этапе. В первую очередь изучали воздействие веществ на процессы репликации ДНК, транскрипции и трансляции.

Определение действия веществ на структуру ДНК. В случае влияния веществ на репликацию ДНК, проверяли способность этик соединений к ДНК-повреждающему эффекту. Сравнение динамики антибактериального эффекта вещества с его способностью вызывать разрывы в ДНК также позволяет определить мишень действия соединения. Изучение влияния соединений на первичную структуру ДНК важно не только с точки зрения определения механизма их антибактериального действия, но и для прогноза их возможной генотоксичности.

Таблица 1. Характеристики действия антибактериальных препаратов на бактерии ЕС 1000/р1Е43

Название вещества МГТК* м кг/мл ид» ♦♦ мкг/мл +/-У% Индукция БОБ-ответа

Концентрация, мкг/мл Активность Р-галакто-з плазы усл. ед. Киид.

Контроль - -- - 6615 1

УФ (X = 254 нм. 30 мин ) - -- - 1380x80 21

Диоксидин 100 109+4 25 1386±100 21

50 22441115 34

100 26401105 40

Хиноксидин 400 87±4 50 594137 9

100 1491196 23

500 24761105 37,5

Фуразолидон 5 3,8+ 2 1 330115 5

5 14711110 22

Фурадонии 10 9,3 ± 2 5 686123 10

10 865118 13

Фурагин 20 17.814 5 264112 4

10 462125 7

20 1386+83 21

Оксолиииевая к-та 4.0 1,9± 4 1 329112 5

5 772115 12

Пефлоксацин 1,0 0,87±1,5 0,5 649115 9,8

1,0 927121 14

Ломсфлоксацин 2,0 1,2±2 1,0 535114 8

2,0 1081161 16

Офлоксацин 0.4 0,34±2 0,2 1133175 17

0,4 23691120 36

Ципрофл оксаци н 0.2 0,1813 0,1 1833163 28

0,2 2163198 33

Сул ьфам ето ксазол 75 78±6 100 6615 1

Сульфамонометоксин 100 88+4 100 4413 0,67

Тетрациклин 5 25015 10 3315 0,5

* - С рс-иичг и) 1{ч'\ опыте. '•-С'рс.тес «и пягиогшгив. (♦ -V), V - ко»ффиииентвзрнаиик § %

Для изучения способности веществ повреждать первичную структуру ДНК в институте Общей генетики РАН, под руководством В.А. Тарасова был сконструированный штамм Escherichia coli, в котором геи р-галактозидаза "сшит" с промотором одного из генов SOS-ответа - colE геном. Этот штамм (EC1000/pJE43) был использован в настоящем исследовании для определения ДНК-повреждающего действия веществ с антибактериальной активностью. Была изучена способность известных лекарственных препаратов с известными механизмами действия индуцировать SOS-ответ в клетках этого штамма.

Дня характеристики способности вещества вызывать разрывы в ДНК, выявляемой по его способности индуцировать SOS- ответ нами предложен коэффициент индукции - соотношение уровня р-галактозидазы до начала действия вещества и через 20 минут его воздействия. В качестве стандартного ДНК-повреждающего фактора был выбран УФ (X = 254 нм, 3 мин.). Такое воздействие вызывало индукцию Р-галактозидазы до уровня 1300 - 2000 ' условных единиц, или в 15 - 21 раз по сравнению с базальиым уровнем этого фермента в необлученных клетках (Таблица t).

Оказалось, что препараты, иигибирующие синтез предшественников ДНК - сульфаниламиды, не вызывали индукцию SOS-ответа. Тетрациклин, действие которого связано с рибосомальньш синтезом белка, также не индуцировал синтез р-галактозидазы, т.е. не вызывал разрывов в цепи ДНК (таблица I)

Однако производные ди>-М-окиси хиноксалина и 5-нитрофураны вызывали индукцию SOS-ответа в Ю - 40 раз (Таблица 1), что согласуется с известными данными об их механизме действия. Ингибирование репликации ДНК производными ди-Ы-окиси хиноксалина коррелирует с

уровнем индукции SOS-ответа, что отражает прямую связь подавления синтеза ДНК и образования разрывов в этой молекуле.

Таким, образом, тест на ДНК-повреждающее действие адекватно отражает механизмы действия известных антибактериальных препаратов, что позволяет использовать его для оценки механизмов антибактериального действия препаратов, относящихся к различным химическим группам. Штамм EC1000/pJE43 может быть использован для выявления ДНК- повреждающего действия веществ с антибактериальной активностью. Введенный коэффициент индукции наглядно отражает развитие SOS-ответа.

Влияние веществ на мембранные процессы в бактериальной клетке. Возможной мишенью действия антибактериальных препаратов может быть цитоплазматическая мембрана бактериальной клетки. Одним из показателей мембранотропного действия вещества является его влияние на уровень трансмембранного электрохимического потенциала нонов водорода (Дцц+). Повреждение цигоплазмагичёской мембраны приводит к падению Ар.ц+, в следствии чего замедляются энергозависимые мембранные процессы, например, транспорт пролина в клетку. , , . ,

Для транспорта неметаболизируемого аналога глюкозы а-метилглюкозида (МГ) в клетку Escherichia coli существует обратная зависимость от величины Дцц+.: при увеличении ДЦн+. поступление МГ снижается, а при падении Дцц+- резко возрастает .

Мы изучили действие веществ - ингибиторов энергетических процессов (снижающих мембранный потенциал и вызывающих деэнер-гизацию мембраны) - КЦФГ или №N3, на аккумуляцию МГ в клетках KL16 thy" При деэнергизации мембраны резко возрастала скорость и

максимальный уровень аккумуляции углевода бактериальными клетками (рисунок 1, А).

IHM |c*i>

Конц«нтр»ш«о првмрсто», ша1шi

Рисунок 1. Влияние веществ, рассеивающих трансмембранный потенциал и источников энергии, на аккумуляцию МГ(А) и пролина (Б) бактериями. Escherichia coli К12 штамм КЬ 16 thy-. ♦ - без добавок, А -КЦФГ, В- NaN3, 8 - глкнконат кальция 0,5%. Бактерии выращивались в солевой среде М9

Добавление глкжоиата натрия, приводящее к активации процессов дыхания и увеличению уровня АЦц+, снижало как скорость, так и

максимальный уровень аккумуляции МГ. Эффект вышеназванных веществ на аккумуляцию пролина был обратным (рисунок 1, В).

Таким образом, уровень энергизацин мембраны оказывал разнонаправленное влияние на процессы аккумуляции пролина и МГ. Вместе с тем, аккумуляция этих веществ позволяет оценить повышение энергизацин цитоплазматической мембраны и падение уровня Дцн+ в целых бактериальных клетках.

Использование двух различных тестов для характеристики уровня Дцн+ позволило адекватно оценить способность вещества повреждать цитоплазматическую мембрану бактерий и исключить их влияние на структуру транспортных белков.

2. Механизмы и структурно-функциональные зависимости антибактериального действия производных хинолон-З-карбоновой кислоты

2.1. Изучение действия производных хинолон-3-карбоиовой кислоты на параметры роста бактериальной культуры. В соответствии со схемой, изложенной в первом разделе, были определены временные н концентрационные параметры антибактериального эффекта нитропро-изводных хинолон-З-карбоновой кислоты.

Метод определения антибактериального эффекта по изменению прироста оптической плотности культуры в жидкой среде оказался достаточно информативным и в случае производных 4-хинолона, вызывающих филаментацию бактериальных клеток. Такие характеристики как время проявления эффекта и действующие концентрации веществ, определенные по их влиянию на скорость прироста оптической плотности, близки к истинным, несмотря на то, что оптическая плотность культуры не отражает число жизнеспособных бактерий.

Изменение прироста оптической плотности за 1 час коррелирует с падением количества колониеобразукнцих единиц в зависимости от концентрации 4-хинолона, хотя и не соответствует степени гибели бактерий. В случае, когда число жизнеспособных бактерий составляло 0,5% от исходного количества, скорость прироста оптической плотности уменьшилась в 5 раз. Подобные соотношения наблюдаются как для бактерий Escherichia coli дикого типа (KL16), так и для мутантных по мишени действия 4-хинолонов - ДНК-гиразе (KL-166 - gyrA мутант Escherichia coli К12).

Минимальный эффект пефлоксацина (бактериостатический эффект) как на скорость роста культуры, определенную по приросту оптической плотности, так и на число жизнеспособных бактерий (КОЕ) наблюдается при 0,1 мкг/мл для бактерий дикого типа и при 0,3 мкг/мл для мутантных бактерий (значения МИК- минимальные ингибирующие концентрации). Наибольший эффект пефлоксацин вызывает в концентрации I мкг/мл (МБК) на бактериях дикого типа. 'Значения МБК определенные по числу жизнеспособных бактерий И по падению скорости прироста оптической плотности совпадают. При дальнейшем увеличении концентрации препарата уменьшения скорости прироста оптической плотности не наблюдалось, тогда как число жизнеспособных КОЕ возрастало, что демонстрирует широко- известный "парадоксальный эффект" производных хинолон-3-карбоновой кислоты (рисунок 2).

. Значения МИК для пефлоксацина и ЛИБ-71 для бактерий дикого типа составляли 0,1 и 0,05 мкг/мл, МБК - 1 и 3 мкг/мл, соответственно. Однако, процентное количество бактерий, выживших при концентрациях ЛИБ-71, равных МБК, было больше, чем при действии фторхинолона -

0,33 и 0,95%, соответственно. Для ЛИБ-71, также как и для пефлоксацина, характерен "парадоксальный эффект".

Мутантный по ДНК-гиразе штамм Escherichia coli резистентен как к фторхинолону пефлоксацину, так и к нитрохинолону ЛИБ-71, что свидетельствует о том, что ДНК—гираза является мишенью антибактериального действия 6-нитропроизводных хинолон-3-карбоновой кислоты.

0.00 1 J---- ------*----------

Рисунок 2. Антибактериальное действие производных 4-хкколон-З-карбоновой кислоты на бактерии Escherichia coli К.12. А - бактерии с неповрежденной ДНК-гиразой KL16, Б- gyrA мутант K.L166 ЕЗ- РГ-10, РГ-20, О-ципрофлоксацин

Полученные данные позволяют сделать вывод об общих мишенях антибактериального действия 6-фтор- и б-нитропроизводных хинолон-3-карбоновой кислоты.

Однако более низкий бактерицидный эффект нитрохинолонов свидетельствует об определенных различиях в молекулярных механизмах воздействия этих препаратов на мишень.

Использование мутантных штаммов различного типа для первичной характеристики антибактериального действия гетероциклических соединений, демонстрирует возможности подобного подхода для изучения особенностей механизмов антибактериального эффекта веществ с различными химическими заместителями. Такая характеристика, как изменение скорости прироста оптической плотности, может быть использована для первичной оценки антибактериального действия антибактериальных веществ различной природы, не зависимо от того, вызывают ли данные вещества филаментацию бактериальных клеток или нет.

2.2. Влияние производных хниолон-3-карбоновой кислоты на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке. Как известные фторпроизводные, так и нитропроизводные хинолон-3-карбоновой кислоты подавляют синтез ДНК в клетках Escherichia coli К12, и не влияют в изученных концентрациях на биосинтез РНК и белка. Значения ИДзо (концентрации, вызывающие 50% подавление синтеза ДНК) как для фтор-, так и для нитропроизводных близки и составляют 0,230,32 мкг/мл и 0,27-0,31 мкг/мл, соответственно. Подавление репликации ДНК как фтор-, так и нитропроизводными 4-хинолона коррелируют с бактерицидным эффектом этих препаратов. Значения МИК как для

пефлоксацина, так и для ЛИБ-71 совпадают с концентрациями, вызывавшими 10-20% подавление репликации бактериальной ДНК. Иными словами, бактериостатический эффект как фтор-, так и нитрохиноло-нов обеспечивался уже 10-20% ингибированием синтеза ДНК. Значения МБК совпадали с концентрациями, вызывающими 70 - 80% ингибиро-вания репликации.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что антибактериальный эффект нитрохинолонов, подобно фторхинолонам, связан с подавлением синтеза бактериальной ДНК.

2.3. Индукция ЯОЗ-огвета производными 4-хннолон-З-карбоновой кислоты. Нитрохинолоны способны индуцировать БОБ-ответ у бактерий ЕС1000/р1Е43, однако, по сравнению с фторхинолонами и оксоли-ниевой кислотой, их эффект менее выражен (таблицы 2 и 3).

Другой процесс, относимый к БОБ-функции бактериальной клетки, а именно, процесс филаментации, изученный нами совместно с Л.Ф. Стебаевой методом электронной микроскопии, показал, что 6-нитро, также как и 6-фторпроизводные хинолон-3-карбоновой кислоты, и 4-хинолоны первого и второго поколения, вызывают филаментацию клеток у бактерий дикого типа (Таблица 2). Однако, как и в случае индукции со1Е оперона у бактерий ЕС1000/р.1Е43, способность 6-нитропроизводных 4-хинолона вызывать филаментацию бактерий менее выражена, по сравнению с фторхинолонами.

Если ципрофлоксацин индуцировал 3-4 кратную индукцию ВОЗ-ответа уже при 15% подавлении репликации ДНК, то РГ-10 (ЛИБ-183) и РГ-20 (ЛИБ-174), также как и оксолиниевая кислота, вызывали такую же индукцию при 28% и 55% ингибировании репликации, соответственно. Максимальные уровни индукции БОБ-ответа нитрохиполонами

оказались ниже индуцированных ципрофлоксацином и офлоксацином. Низкоакгивное 6-нитропроизводное хинолон-3-карбоновой кислоты ЛИБ 195 (МПК по данным Т.П. Радкевич > 20 мкг/мл) не индуцировал БОБ-ответ даже в концентрациях, вызывающих 50% подавление репликации ДНК (9,5 мкг/мл).

Таблица 2. Индукция БОБ-ответа фтор- и нитрохинолонами

Название ЕС1000/р.1Е43 КЫ6 гЬу'

Вещества С*, ИДзо к* «■ИНД С* И&о длина

мкМ +/- V0/«** +/- У%** клеток****

Ломефлок- 0,1 I 0,1 150±5%

сдцин 0,5 1,9±2% 4,6 0,5 1,1 ±3% 181 ±7%

1,0 5,6 1,0 18(>±7%

2,0 6,2 2,0 233±5%

Пефлокса- 0,1 3,7 0,1 11В±3%

цин 0,5 1,2±2,5% 6,7 0,5 0,61±3% 197±5%

1,0 6,9 1,0 204±5%

ЛИБ-71 0,1 2,7 0,1 109±3%

0,5 1,2±2% 3,0 0,5 0,55±2.2% 126±5%

1,0 4,1 1,0 131±5%

2,0 6,5 2,0 183±3%

*- С - концентрация, мкМ

** - ИД50+/- - концентрация, вызывающая 50% подавление репликации ДНК у соответствующего штамма

*** - Кянд - коэффициент индукции Р-галактозидазы, соответствующий в штамме ЕС1000/рЛ343 уровню индукции БОв-ответа.

***• - длина бактериальных клеток выражена в условных единицах (см. Материалы и методы)

Объяснением этих различий могла бы быть большая по сравнению с фторхинолонами способностью нитрохинолонов ингибировать белковый синтез, однако, проведенные исследования свидетельствуют о том, что и фтор- и нитрохинолоны в равной степени неактивны в отношении процессов, связанных с белковым синтезом (см. раздел 2.2),

2.4. Структурно-функциональные зависимости в ряду 4-хинолон-З-карбоновых кислот. Нижеприведенный анализ структурно-функциональных зависимостей опирается плавным образом на данные о подавлении репликации ДНК у E.coli. Как было показано ранее, подавление репликации ДНК препаратами этой группы адекватно отражает, их действие на комплекс гираза-ДНК, также как и их антибактериальную активность in vitro. В связи с этим, модель влияния 6-нитрохинолонов на репликацию ДНК может быть использована для изучения зависимости антибактериальной активности соединений этой группы от особенностей структуры их молекулы.

Сравнительное изучение действия нитрохмнолонов с фторхиноло-нами, оксолиниевой и налидиксовой кислотами на репликацию ДНК у бактерий E.coli К12 (таблицы 4, 5) позволило выяснить роль заместителей в различных положениях молекулы 4-хинолона на их биологическую активность. Как видно из таблицы 4, природа заместителя в положении 6 имеет большое значение для способности производных 4-хинолона ингибировать репликацию ДНК. Соединения, имеющие одинаковые заместители в положениях 1 и 7, но отличающиеся заместителями в положении 6, различались по способности ингибировать синтез ДНК (ципрофлоксацин и ЛИБ-170). Одной из причин падения активности в этом ряду может быть увеличение стерического размера заместителя.

В соответствии с этим предположением находятся и данные об ИД50 для вещества МН-205, содержащего метальный радикал в положении 5. Положение 5 молекулы 4-хинолона, по-видимому, также как и положения 3,4 и 6, находится в части молекулы, образующей комплекс с молекулой ДНК.

Таблица 3. Влияние заместителей в положениях 5 и 6 молекулы 4-хинолона на его способность ингибировать репликацию ДНК у бактерий Е. coli.

Соединения, препарат R, R2 R3 R< ИДзо, мкМ

Цнпрофлоксаци н -<3 н F Pyp 0,25±0,01

РГ-10(ЛИБ-183) -< н no2 3-MePyp 0,75±0,02

ЛИБ-71 -< н no2 4-MePyp 0.6810,02

ЛИБ-170 -< н NO¡ Pyp 0,74±0,01

МН-205 СН} NO¡ 3-MePyp 49,2±2,5

КБ-658 Et н 5-N02T\ii Pyp 35,2±1,4

Рур - пиперазинил, Fui - фурил, Met- метил, Et - этил.

По литературным данным, введение метальной группы » положение 5 на фоне F в, положении 6- приводило к незначительному увеличению: активности 4-хинолона в отношении E.coli in vitro и к расширению спектра действия и существенному усилению активности in vivo. Однако введение метального, радикала в положение 5 на фоне большей по размеру нитрогруппы привело к падению активности у производного 4-хинолона MB-205 почти на 2 порядка.

Таблица 4. Влияние заместителей в положении 1, 7 и 8 молекулы 4-хинолона на способность вещества ингибировать репликацию ДНК у бактерий Escherichia coli.

Соединение, препарат Я, R, ИДмьмкМ

ГБ -295 -4 EtrN-(CH2b-NH NO, 2,5S±0,25

ГБ -283 H2N- NO, 0,42±0,02

ГБ -287 -< HCKCH;)rHN- NO, 0,48±0,02

ЛИБ- 170 -4 Рур- NO, 0,74±0,02

ЛИБ-188 -4 4-Et-3-Me-Pyp NO, 0,28±0,0l

ЛИБ-190 -4 HCKCH2b-Pyp NO, 0,91.tO,02

ЛИБ-176 -4 (ВгГ(4-СН,)«)Рур NO, 13,7±0,5

ЛИБ-182 -4 (CI)-4-{CHj)5N)P>p NO, 8,7±0,5

ЛИБ-195 —4 p- F-Ph-P>p NO, 11,9±0,5

ЛИБ-196 -4 Morf NO, 13,3 ±0,5

ЛИБ-198 -4 HO»)C-HC(OH>HjC-f NO, 9,3±0,3

МН -406 Et ^-MePh-O- NO, 64,2±2,0

МН -407 Et Py-O- NOj 5I,6±1,5

ЛИБ -204 -< EtOOC-C(CN)=HC-P) NO, 41,7±2,5

ЛИБ -205 -< EtOOC-C(CN)=HC-3-Mi N03 40,2±3,l

ЛИБ-174 -4 4,3-TmPyp NOз 0,I6±0,005

Ципрофлоксацин 0,25±0,01 Пефлоксацин 0,75±0,02 Ломефлоксацин 0.68±0,02 Офлоксаиин 0,74±0,01

Рур - пипсрачикил, Met- метил, Et - этил, Morf -иорфолнл, 4,3 -Тт- триметиленовый мостик, Ру - пиридин,р- пара-положение, -циклопропил

Влияние различных заместителей в положении 7 на активность нитропроизводных 4-хинолона в отношении репликации ДНК у бактерий E.coli отражено в таблице 5. Соединения, содержащие в положении 7 4-хинолонового кольца такие заместители как аминогруппу (ГБ-283), оксиэтиламиногруппу (ГБ-287) и диэтиламино-этиламиногруппу (ГБ-295), обладали высокой активностью в отношении репликации ДНК (ИДзо составляли 0,42, 0,48 и 2,55 мкМ, соответственно). ИДзо для пиперазин -содержащего 4-хинолона ЛИБ-170 составляло 0,74 мкМ.

Введение заместителей в структуру пиперазинильного остатка в положении 7 4-хинолонового кольца, таких как: 4-оксиэтил- (ЛИБ-190), 4-этил-3-метил-(ЛИБ-188), также как и 3-метил (РГ-10 (ЛИБ-183) или ЛИБ-183) и 4-метильного производного (ЛИБ-71) существенно не сказывалось на способности ингибировать синтез ДНК. Значения ИДзо для этих соединений колеблются от 0,68 до 0,91 мкМ.

Дальнейшее "утяжеление" заместителя в положении 7 за счет введения радикалов в пиперазинильный остаток (ЛИБ-176, ЛИБ-198, ЛИБ-182, ЛИБ-204, ЛИБ-205, ЛИБ-195) приводит к снижению активности. К еще более существенному снижению активности приводит введение в положение 7 тиоморфолинового радикала (ЛИБ-196), а также п-толилокси- (МН-406) и {5-пиридилокси- групп ( МН-407).

Все вышеперечисленные модификации в положении 7 не привели к увеличению активности в отношении репликации ДНК по сравнению с соединением РГ-10 (ЛИБ-183) (ЛИБ-183), содержащим З-метил-4-пиперазинил в положении 7. Исключением является соединение РГ-20 (РГ-20 (ЛИБ-174)), содержащее триметиленовый мостик между 4 и 3 положениями пиперазинильного остатка (1,4-диазо-бицикло (4,3,0)-нонанил). Это 6-нитропроизводное сравнимо по своей активности в

отношении репликации ДНК с наиболее активным 6-фторхинолоном -ципрофлоксацином

2.5. Особенности молекулярного связывания производных 4-хинолон-З-карбоновон кислоты с ДНК-гиразой.

С целью выяснения молекулярных особенностей действия производных 4-хинолона на ДНК-гиразу было изучено влияние этих соединений на репликацию ДНК у бактерий Escherichia coli К12 с мутационным повреждением A (gyr А) и В (gyrB) субъединиц ДНК-гиразы. Степень ингибирования репликации ДНК соединениями этого ряда определяется их способностью образовывать связи с комплексом гираза-ДНК. Молекула 4-хинолона образует водородные связи с ДНК и с определенной аминокислотной последовательностью А субъединицы ДНК-гиразы. Для анализа способности различных 4-хинолонов ингибиро-вать репликацию ДНК у мутантных и нормальных штаммов, был введен "индекс резистентности репликации ДНК" (К рез.) - соотношение ИД50 для мутантного и исходного штаммов (Таблица 5). Индекс резистентности отражает изменение сродства молекулы 4-хинолона к участку аминокислотной последовательности субъединицы ДНК-гиразы, измененной в результате мутации. Уменьшение сродства вещества к полипептидной молекуле приводит к увеличению значения ИДз0 репликации ДНК для мутантного штамма.

На основании величины индексов резистентности все изученные производные 4-хинолона были разделены на три группы. Соединения первой группы имели два сайта связывания с молекулой гиразы - в А и В субъединице. 4-хинолоны второй и третьей группы имели значительно меньшее сродство к В субъединице. Меньшее сродство к В субъединице не отражало абсолютную способность 4-хинолонов ингибировать синтез ДНК, но коррелировала с их антибактериальной активностью in vivo.

Таблица 5. Способность 4-хинолонов подавлять репликацию ДНК у нормального и мутантных по gyrA и gyrB штаммов Escherichia coli Kl 2

№ Ppynni Название вещества НДзо. мкМ +V

штамм дикого типа gyrA мутанта К рез. gyrA штамм дикого типа * gyrB мутант К рез. gyrB

I ЦипрофлоСАЦНЫ 0,25 +/-2,5% 0,51+/-5% 2,11 0,49+/-2% 1,99+/-5% 4,05

ЛИБ-71 1,03± 3% 2,10+/-3% 2,04 - - -

ЛИБ-170 0,74+2% 1,1 ±2,5% 1,48 -- - -

РГ-10(ЛИБ-183 0,76±4% 1,76±3,5% 2,31 0,71 ±4% 2,96±5% 4,12

Офлоксацин 0,52±1,5% 0,91+2% 1,63 2,29±3% 5,51 ±5% 2,4

11 Пефлоксацин 0,71± 3% 3,7015% 5,24 0,92±3% 1,43±2% 1,68

Ломефлоксацин 1,00±3% 4,31+4,5% 4,22 0,83± 5% 2,5215% 3,05

РГ-20 (ЛИБ-17^ 0,16±2% • 0,94±3% 5,81 0,43±1,5% 0,73±5% 1,68

III ГБ-295 2,55 ± 3% 39,69+5% 15,52 -- - -

ГБ-283 0,42± 4% 7,7313% 18,40 - -

ГБ-287 0,48 ± 4% 7,87+3% 16,61 -

Налиликсовая кислота 41,01 ± 5% 838,0+2% 20,43 — -

Оксолиннеаая кислота 1,4±3% 33,0±5% 24,03 1,87± 5% 11,53 5,96

* В случае gyrA мутанта данные дл* штамма с неповрежденной ДНК-гиразой и мутантного получены при 37°С, в случае gyrB мутанта - для штамма дикого типа - при 28°С, а для мутантного - при 42°С т.к. мутант по В субъединице является температурочувствительным мутантм.

Это наблюдение позволяет использовать более простой тест на антибактериальную активность in vitro с использованием хотя бы одного штамма, мутантного по ДНК-гиразе, для более точного выявления соединений этого ряда, для которых низка вероятность проявления антибактериальной активности in vivo.

Природа заместителя в положении 6 (нитро- или фтор) не отражалась на сродстве 4-хинолона к А или В субъединице ДНК-гиразы, однако, как отмечалось выше, сказывалось на способности вещества вызывать разрывы в ДНК. По-видимому, заместитель в положении 6 участвует в образовании связи 4-хинолона с одноцепочечной петлей ДНК в комплексе гираза-ДНК.

Разделение производных 4-хинолона на группы на основании величины Крс совпадает с принятой в настоящее время классификацией препаратов группы .производных хинолон-3-карбоновой кислоты на препараты первого, второго и третьего поколения. Особенно важно, что в случае нитрохннолонов, предложенная нами классификация была подтверждена профессором E.H. Падейской в опытах in vivo. Препараты ГБ-283, ГБ-287 и ГБ-295, имеющие низкие значения ИД jo для бактерий дикого типа, но относящиеся к третьей группе по величине Кр„, обладали и низкой активностью в экспериментах in vivo.

Суммируя вышеприведенные данные, а также данные литературы, была предложена следующая схема образования комплекса 4-хинолон-гираза-ДНК: 4-хинолон образует водородные связи с одноцепочечной петлей ДНК за счет 3-карбоксильной и 4-карбонильиой группы. Заместитель в положении 6 также участвует в связывании с ДНК. Одновременно 4-хинолон связывается с А субъединицей гиразы, которая находится в комплексе с ДНК. У 7-пиперазинилсодержащих производных 4-хинолона

появляется еще один сайт связывания - в В субъединице гиразы. Таким образом, 6-фтор, 7-пиперазинилхинолон имеет 3 точки связывания с комплексом гираза - ДНК и должен образовывать вместе с ним жесткую структуру. Мутационные повреждения А или В субъединиц приводит к утрате одного из сайтов связывания молекулы 4-хинолона и, в результате, к нечувствительности репликации ДНК к 4-хинолонам у мутантных штаммов. Аминокислотная последовательность В субъединицы, участвующая в связывании с молекулой 4-хинолона, по-видимому, жестко не фиксирована: в зависимости от структуры 4-хинолона зона связывания на аминокислотной цепи может смещаться. Этим могут быть объяснены различия в индексах резистентности единственного изученного gyrB штамма для 7-пиперазинилсодержащих 4-хинолонов первой и второй группы: введение циклопропила в положение 1 приводит к изменению зоны связывания 4-хинолона.

2.6. А и В механизмы бактерицидного действия 4-хинолонов

Известны три механизма бактерицидного действия 4-хинолонов -А, В и С (J. Smith, 1986). Высокоактивные фторхинолоны (ципрофлокса-цин и офлоксацин) способны вызывать гибель бактерий в условиях ингибирования белкового синтеза. Эта способность фторхинолонов обеспечивается бактерицидным действием по механизму В.

Проведенные эксперименты подтвердили способность фторхино-лона ципрофлоксацина убивать бактерии в присутствии ингибитора белкового синтеза - хлорамфеникола (Таблица 6). Нитросодержащий структурный аналог ципрофлоксацина - РГ-10 (ЛИБ-183), утрачивал способность к бактерицидному действию в присутствии ингибитора белкового синтеза. Это свидетельствует о важности наличия фтора в положении 6 для бактерицидного действия 4-хинолона по механизму В.

Таблица 6. А и В механизмы антибактериального действия производных хинолон-3-карбоновой кислоты на Escherichia coli К12.

Название Соединения, Препарата МБК, мкг/мл % жизнеспособных бактерий, КОЕ Механизм бактерицид. действия

Концентрация хлорамфеникола, мкг/мл

0 50 100 200

KL16

Налидиксовая Кислота 90 13,2 46 59 98 А

Пефлоксацин 1 1,0 38 60 90 А

Ломефлоксацин 3 0,15 5,5 15 16 А, В

Ципрофлоксацин 0,2 0,1 0,55 4,6 6,0 А, В

РГ-10 (ЛИБ-183) 3 0,5 40 87 100 А

РГ-20 (ЛИБ-174) 3 2,0 6,0 6,0 7,0 А, В

KL166 (gyrA)

Ломефлоксацин 10 0,35 10 100 100 А

Ципрофлоксацин 0,5 0,66 1,0 1,7 1,7 А, В

РГ-20 (ЛИБ-174) 10 0,86 1,5 8,3 8,6 А, В

Однако, природа заместителя в положении 6, по-видимому, не является решающим фактором для "способности 4-хинолона к бактерицидному эффекту по механизму В: введение фтора в положение 8 (ломефлоксацин) или циклопропила в положение 1 (ципрофлоксацин) также делает 4-хинолон способным к бактерицидному эффекту по механизму В. Различия в заместителях в положении 7 также влияют на активность вещества по механизму В: нитрохинолон РГ-20 (ЛИБ-174) способен оказывать бактерицидное действие в присутствии ингибитора белкового синтеза (Таблица 6).

Мутационное повреждение А субъединицы ДНК-гиразы делает бактерии резистентными к бактерицидному эффекту ломефлоксацина в присутствии ингибитора белкового синтеза (Таблица 6), но при этом сохраняется чувствительность к действию ципрофлоксацина и РГ-20 (ЛИБ-174). Это свидетельствует о различиях в сайтах связывания ломефлоксацина и ципрофлоксацина в процессе бактерицидного эффекта по механизму В и о сходстве механизмов связывания с мишенью действия в присутствии , ингибитора белкового синтеза ципрофлоксацина и РГ-20 (ЛИБ-174).

Анализ полученных данных позволил разделить функции различных заместителей 4-хинолона в связывании с мншенью их действия. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда ингибиторов бактериальной ДНК-гиразы.

Таким образом, уровень резистентности к производным хинолон-3-карбоновой кислоты у мутантного по А субъединице ДНК-гиразы штамма, выраженный как К^ А и уровень индукции SOS-ответа, выраженный как Кинд могут быть использованы для прогноза активности препаратов этого ряда в экспериментах in vivo.

3. Механизмы и структурно-функциональные зависимости антибактериальной активности производных пиразннокарбазола.

В связи с высокой антибактериальной активностью, обнаруженной у антидепрессантов пиразидола и тетриндола, анализ зависимости антибактериального эффекта от структуры пиразинокарбазолов, к которым относятся указанные препараты, является чрезвычайно важным. Выявление фармакоформных групп в молекуле пиразннокарбазола,

обуславливающих антимикробную активность вещества, может создать предпосылки для направленного синтеза соединений, лишенных этого негативного побочного действия, но сохраняющих фармакологическую активность. С другой стороны, возможность разделить антимикробное и антидепрессивное действие соединений этого ряда открывает возможность создания антибактериальных препаратов оригинальной химической структуры.

3.1. Влияние производных пиразинокарбазола на параметры роста культуры и макромолекулярные синтезы бактерий.

Для производных пиразинокарбазола репликация ДНК оказалась точкой приложения антибактериального действия. Тетриндол подавлял включений Н3-тимидина в ДНК Escherichia coli с ИД50 равным 50 мкМ, а пиразидол - 100 мкМ. Ингибирование синтеза ДНК тетриндолом происходило параллельно подавлению им скорости роста культуры KL16(thy ). Пиразидол и териндол не действовали на биосинтез РНК и белка в изученных концентрациях, оказывающих антибактериальный эффект.

Исследования показали, что ни пиразидол, ни тетриндол не вызывают разрывы в бактериальной ДНК в концентрациях, вызывающих существенное подавление синтеза ДНК. Эти результаты согласуются с известным фактом отсутствия мутагенной и канцерогенной активности тетриндола и пиразидола.

Было установлено, что тетриндол и пиразидол ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу (ДФР), выделенную из St. aureus, который участвует в синтезе предшественников ДНК -нуклеозидов. Подавление

активности этого фермента у бактерий Escherichia coli может приводить к

„у

уменьшению пула нуклеозидов в бактериальной клетке и остановке синтеза ДНК (Таблица 8).

Таблица 7. Влияние различных заместителей в положении 3 и 8 на активность производных пиразинокарбазолов в отношении синтеза ДНК в бактериях Escherichia coli Kl2

Структура А Структура Б

Название вещества Тип структуры R» Rj Концентрация вызывающая 50% подавление V роста ид50. м кг/мл

Тетриндол А Циклогексил ННС1 15,8±2,0 7,3± 0,1

111-1421 А Циклогексил HCH2S03H 42,4±5,3 39,9±1,5

111-1306 Б Фенил ННС1 34,0±5,8 31,1±1,5

Ш-869 А Фенил HHCi 30,1±5,1 46,7±5,1

ШКИ-114 А' Адамантил ННС1 75,3±10,5 213,7±10,1

Пиразидол А Метил HCH2S03H 70,8±8,8 161,2±9,0

LU-1483 А F HCH2S03H 40,5±5,5 139,0±10,3

Ш-1407 А NO2 H CHjSOjH 35,2±5,1 41,2±2,0

Ш-1246 . А Циклогексил NO 56,1 ±6,2 19,4± 0,9

Ш-И18 А Циклогексил C(0)CH2-Пиперазино 62,1±7,5 3%9± 2,2

Ш-1115 А Циклогексил С(0)СН2-Морфолино 52,8±6,8 40,5± 4,1

Ш-1259 А Метил N0 72,5tlO,l 141,0± 11,1

Ш-1006 А Метил СНг-фенил 85,0±10.0 423,4±10,7

Таблица 8. Влияние производных пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола на активность ДФР и их антимикобактериальный эффект.

II I

I I

Структура А

Структура Б

Н NH-R, Структура В

Название и Формула Соединения Тип структуры Re Rj МП К, м кг/мл ДФР из St. aureus Iso(M)

М. tuberculosis М. bovis St. aureus

H37RV Academia АТСС607

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Пиразидол метансульфонат А Метил HCH3S03 5,0-10,0 10,0-20,0 10,0-20,0 20,0-40,0 1x10J

Тетриндол А Циклогексил HHCI 0,06-0,12 J), 12-0,25 0,25-0,5 1,0-2,0 5x10*

Ш-1006 А Метил СН2-фенил >1000 >1000 >1000 >1000 >1

Ш-1011 Б Метил HHCI 2,5-5,0 2,5-5.0 2.5-5,0 25,0-50,0 1x1o*4

Ш-1118 А Циклогексил С(0)СНг- пиперазино 0,06-0,12 0,12-0,25 0,5-1,0 2,5-5,0 1x104

Ш-1115 А Циклогексил C(0)CHr морфолино >1000 >1000 >1000 >1000 >1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ш-1483 А F Н CH,S03 25,0-50,0 25,0-50,0 100,0-200,0 200,0-400,0 >1

Ш-1246 А Циклогексил NO 25,0-50,0 25,0-50,0 >1000 >1000 >1

ШКИ-114 А Адамантил HHCI 0.06-0,12 0,06-0,12 0,5-1,0 1,2-2,5 5x10-0

Ш-1259 А Метил N0 >1000 >1000 >1000 >1000 >1

Ш-869 А Фенил HHCI 25,0-50,0 25,0-50,0 2,5-5,0 2,5-5,0 бхЮ"3

Ш-1019 В Метил -(СНг)г-О-фенилНС! 0.25-0.5 1.2-2,5 0,06-0,12 2,5-5,0 1x105

Ш-1036 В CI -СНгфенил 0,25-0,5 1,2-2,5 0,06-0,12 2,5-5,0 5x10"

Ш-1037 В CI ЧСНг)гО-фенил 0,25-0,5 1,2-2,5 0,06-0,12 2,5-5,0 1X10"5

Ш-1045 В CI -<СН2)г фенил HCl 0,06-0,12 0,06-0,12 * 2,5-5,0 10.0-20.0 ÖXlO"1

Ш-1046 В Циклогексил -(СНг)г-фенил HCl 0,06-0.12 0.25-0,5 2,5-5,0 10,0-20,0 1х10~*

Ш-1047 В F ЧСН2)г фенил HCl 2,5-5,0 2,5-5,0 0,06-0,12 2,5-5,0 5x10'5

Ш-1048 В Н -СНг-фенил HCl 0,5-1,0 1,2-2,5 2,5-5,0 2,5-5,0 1x10'5

Ш-1071 В Н ЧСНг)г-СвН51 0,06-0,12 0,25-0,5 2,5-5,0 0,25-0,5 1x10-"

'Isa- концентрация соединения, вызывающая 50% подавление активности ДФР, коэффициент вариации <5%

Таким образом, на основании предварительных исследований модель влияния пиразинокарбазолов на репликацию ДНК у Е. coli была выбрана для исследования структурно - функциональных зависимостей соединений этого ряда для грамотрицательных бактерий

3.2 Структурно-функциональные зависимости антибактериальной активности пиразинокарбазолов. Дальнейшее изучение структурно-функциональных зависимостей в ряду пиразинокарбазолов показало, что положения 3 и 8 особенно важны для их антибактериальной активности. Наилучшую активность как в отношении грамотрицательных, так и в отношении грамположительных бактерий проявило соединение с циклогексильным заместителем в положении 8. Адамантильный заместитель в положении 8 приводил к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов St. aureus и Mycobacterium (Таблица 8).

Пиперидинильный радикал в положении 3 обеспечивал более высокую антибактериальной активности в отношении грамположительных бактерий, тогда как отсутствие заместителя в положении 3 приводила к наиболее высокой активности в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli (Таблица 8).

4. Механизмы действия производных тиазолидиндиона. .

ЛИБ-4 ЛИБ-22

4.1. Исследование влияния вешеств на параметры роста бактериальной культуры in vitro.

Разработанная схема изучения механизма антибактериального действия веществ была применена на ранних этапах изучения оригинальных соединений - производных тиазолидиндиона - ЛИБ-4 и ЛИБ-22. Эти вещества обладают высокой противогрибковой активность в опытах in vitro.

Попытки определения кинетических параметров этих веществ на бактерии дикого типа не принесли успеха: ЛИБ-4 и ЛИБ-22 не проявили существенную антибактериальную активность' в отношении бактерий дикого типа. Однако, учитывая высокую гомологию ферментных систем, определяющих основные метаболические процессы у филогенетически отдаленных организмов, мы продолжили исследования этих соединений

Было предположено, что клеточная стенка бактерий Escherichia coii в норме непроницаема для изученных производных тиазолидиндиона. Поэтому было изучено действие веществ этого химического ряда (ЛИБ-4 и ЛИБ-22) на бактерии Escherichia coli дикого типа и бактерии с поврежденной клеточной стенкой. Проницаемость клеточной стенки возрастала в ряду Е. coli К12 дикого типа - Е. coli К12 SN15 - Е. coli К12 SN23.

Исследования показали, что чувствительность бактерий с поврежденной клеточной стенкой к тиазолидиндионам значительно выше, чем у бактерий дикого типа Escherichia coli К12'и АТСС25922: изменения в кривых роста бактерий SN15 и SN23 под воздействием ЛИБ-4 и ЛИБ-22 были значительны; уменьшается скорость роста культуры уже при концентрациях 5 мкг/мл для обоих веществ, при высоких концентрациях (50 мкг/мл) лаг-период увеличивается до 4 - 5 часов. Эффект тиазолидин-дионов на бактерии дикого типа был менее выражен и наблюдался при концентрациях 50 - 100 мкг/мл.

Данные о накоплении ЛИБ-4 в субклеточных фракциях, полученные с применением ВЭЖХ, также свидетельствуют о значении клеточной стенки в устойчивости бактерий дикого типа к этим соединениям. При концентрации ЛИБ-4 50 мкг/мл в среде роста, вещество накапливается во фракциях цитоплазмы (81%) чувствительного к тиазолидиндионам штамме SN15. В резистентных к данному препарату бактериях с интакт-ной клеточной стенкой Escherichia coli К. 12 80 - 87% вещества оказались связанными с клеточной стенкой.

4.2. Влияние производных тназолидиндиона на макромолеку-лярные синтезы в бактериальной клетке.

При изучении действия тиазолидиндионов на репликацию ДНК и синтез РНК в чувствительном и устойчивом к соединениям этого ряда штаммах Escherichia coli было установлено, что оба вещества не оказывали существенного влияния в концентрациях, оказывающих антибактериальный эффект, на процессы репликации ДНК, транскрипции и трансляции.

43. Мембранотропный эффект тиазолидиндионов. Однако, приведенные выше данные не позволяли однозначно судить о мишени действия ЛИБ-4 и ЛИБ-22. Одной из возможных мишеней антибактериального действия этих веществ является цитоплазматическая мембрана бактериальной клетки. Для проверки этого предположения было изучено действие ЛИБ-4 на мембранные процессы, связанные с энергетическим зарядом мембраны процессы транспорта веществ в бактериях Escherichia coli.

Для этого сравнивали влияние ЛИБ 4 на аккумуляцию пролина и МГ клетками дикого типа и мутанта с дефектной клеточной стенкой -SN 15. Показано (Таблица 9), что производное тназолидиндиона подав-

ляло аккумуляцию пролина и стимулировал аккумуляцию МГ, хотя и в меньшей степени, чем КЦФГ - вещество, вызывающее падение Дди+. Эффект ЛИБ-4 возрастал с повышением его концентрации и был более выражен у чувствительного к ЛИБ-4 штамму БК' 15 (Таблица 9). Это свидетельствует о способности тиазолидиндионов снижать трансмембранный потенциал протонов Дрн+ , возможно, за счет повреждения цитоплазматической мембраны.

Таблица 9. Влияние ЛИБ-4 на аккумуляцию |4С-пролина и ,4С-а-метилглюкозида у бактерий Escherichia coli

Вещество Концентрация, мкг/мл Аккумуляция В%

% |V+/-,% % | V+/-, %

SN15 К12

Аккумуляция нС-пролина

Контроль - 100 5 100 4

КЦФГ 4 7 0.5 4 1

ЛИБ4 5 52 3 75 5

10 32 3 60 3

Аккумуляция |4С-а-метилглюко1ида

Контроль - 100 3 100 4

КЦФГ 4 190 7 154

ЛИБ4 5 138 5 111 4

10 181 5 122 4

Далее, предположив, что антибактериальное действие тиазолидиндионов связано с неспецифическим воздействием на липидные мембраны, было изучено действие этих веществ на активность фосфоли-паз С и Э на модели синтетических липосом.

Как оказалось, оба изученных вещества влияли на активность той и другой фосфолипазы. При этом ЛИБ-4 стимулировал активность фосфолипаз С и О на 20 - 43%, тогда как ЛИБ-22, наоборот, ингибировал эти фосфолипазы.

СХЕМА

изучения механизма антибактериального действия химических соединений на

доклиническом этапе

СкгаД

ДЖ-иерссшс

к®

Опрсдак жгабагеришо наест I опыта ¡л «го а на удал тацриюшш Ь и»

Опредаеякшсп ааибапфш ПКШПфШСГр« ьногозффша

Опрсювжфуш прощссм ш о ЧуКШТОМШК ш биохвдшнх ккиипрупур, пиушоиувещест)

Сшобеав

Пронишкосл шким дай

Дсшмеисшез Сипа РНК Рнбосомпышйшно Цинщаиал неточном пан Цжткосп

врцшгаадамДНК быв дшшшш!

иибри

Таким образом, действие тиазолидиндионов на бактерии Escherichia coli обусловлено, по-видимому, неспецифическим связыванием с липидным компонентом цитоплазматической мембраны. Подавление процессов транскрипции и изменение белкового спектра могут быть вторичными процессами, индуцированными повреждением клеточной мембраны.

На основании проведенных исследований, предложена схема изучения механизмов антибактериального действия химических соединений на доклиническом этапе исследования веществ, у которых обнаружена значимая антибактериальная активность (см. Схему). Разработанная схема изучения антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания препаратов позволяет определить мишень действия соединения и подобрать адекватную модель изучения структурно-функциональных зависимостей для изучаемой химической группы. Применение разработанных таким образом моделей исследования позволило установить некоторые особенности механизма действия нитрохинолонов, пиразинокарбазолов и тиазолидиндионов, а также выяснить структурно-функциональные зависимости антибактериального действия производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты и пиразинокар-базола и аминотетрагидрокарбазола.

ВЫВОДЫ

1. Алгоритм исследования механизма антибактериального действия веществ включает в себя:

• определение концентрационных и временных параметров антибактериального действия на культуру бактерий;

в выявление группы метаболических процессов бактериальной клетки, чувствительных к действию исследуемых веществ (репликация ДНК, транскрипция, трансляция); • определение влияния веществ на отдельные ферментативные реакции или группы реакций, а также структур бактериальной клетки (например, ДНК-повреждающее , мембранотропное действие),

® анализ структурно-функциональных зависимостей для каждой химической группы соединений.

2. Введение нитрогруппы в положение 6 молекулы 4-хинолока вместо фтора не изменяет механизм действия этих соединений. Нитрохиноло-ны, так же как и фторхинолоны ингибируют синтез ДНК и вызывают разрывы в этой молекуле в результате ингибирования комплекса гираза ДНК, хотя и отличаются от фторхинолонов в механизмах взаимодействия с мишенью.

3. Введение нитрогруппы в положение 6 не влияет на сродство 4-хинолона к А или В субъединице ДНК-гиразы, по сравнению с 6-фторхинолонами.

4. Введение нитрогруппы в положение 6 уменьшает способность вещества вызывать разрывы в ДНК, по сравнению с 6-фторхинолонами.

5. Введение пиперазинила или (1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила) в положение 7 молекулы 4-хинолона, при наличие циклопропильного заместителя в положении 1, увеличивает сродство молекулы 4-хинолона к В субъединице ДНК-гиразы.

6. В молекуле ДНК-гиразы имеется несколько сайтов для связывания молекулы 4-хинолона. Ципрофлоксадин и 6-нитро-7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанил)-4-хинолон-3-карбоновая кислота способны к неза-

висимому от белкового синтеза бактерицидному эффекту в результате связывания с одним и тем же сайтом в А субъединице ДНК-гиразы. Сайт связывания дифторхинолона ломефлоксацина, обеспечивающий аналогичный эффект, отличается от сайта связывания вышеназванных 4-хинолонов.

7. Антибактериальный эффект производных пиразинокарбазола обусловлен ингибированием репликации бактериальной ДНК вследствие подавления синтеза предшественников ДНК - нуклеотидов. Изучение влияния пиразинокарбазолов на репликацию ДНК и активность дигид-рофолагредуктазы может быть использовано как модель для выявления структурно-функциональных зависимостей антибактериальной активности соединений этого ряда.

8. Циклогексильный заместитель в положении 8 в сочетании с водородом в положении 3 обеспечивает высокую активность в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coii.

9. Адамантильный заместитель в положении 8 и пиперидинильный радикал в положении 3 молекулы пиразинокарбазола приводит к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов.

10. Гидрофобные адамантильный радикал положении 8 молекулы пиразинокарбазола и циклогексильный радикал в положении 6 амино-тетрагидрокарбазола обусловливают высокую активность в отношении микобактерий туберкулеза in vitro.

М. Производные- гиазолидиндионов оказывают мембранотропное действие на чувствительные к ним бактерии Escherichia coli, взаимодействуя с фосфолипидами мембраны.

12. Штамм Escherichia coli K12 EC1000/pJE43 может быть использован для изучения ДНК-повреждающего действия соединений с выраженной антибактериальной активностью. 33. Уровень резистентности репликации ДНК у мутантного по А субъединице штамма Escherichia coli и способность вещества индуцировать SOS-ответ позволяют прогнозировать активность in vivo соединений из группы производных хинолон-З-карбоновой кислоты 14. Предложенная схема исследования позволяет на этапе доклинического изучения определить механизмы антибактериального действия соединений различной химической структуры, разработать адекватные модели для изучения структурно-функциональной зависимости антибактериальной активности в новых химических рядах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шульгина М.В., И.Я. Калачев, Г.И. Бурд. Транспорт а-метилглюкозида в клетках Е. coli К12. // Биохимия, - 1977- 2, с. 2235 - 2245

2. Shulgina M.V., V.N. Gershanovitch. G.I. Bourd Facilitated Diffusion of a-Methylglucoside in Bacteria E. coli K12.// 11-th FEBS Meeting, Abstracts, -1977- B7-1 360 1/2

3. Shulgina M.V., I. Ya. Kalachev, G.l. Bourd . The a-Methylglucoside Effect on Adenylate Cyclase Activity and Membrane Energisation in E. coli K12. // FEBS Letters-1979-v. 103, N12, p. 238 - 240.

4. Gershanovitch V.N., T.N. Bolshakova, A.M. Umyarov, M.V. Shulgina, G.I. Bourd Transport of Carbohydrates and Regulation of Activity of Catabolite Sensitive Operons in E. coli // Proceed, of the 14 International Congress of Genetics, Moscow, 1980, p. 37 - 44.

5. Гершанович B.H., Г.И. Бурд, Т.Н. Большакова, A.M. Умяров, М.В. Шульгина. Транспорт углеводов и регуляция активности катаболитчув-ствительных оперонов у бактерий Е. coli К12. // в сб. "Молекулярные основы генетических процессов", "Наука", Москва, 1981, с. 37 - 43.

6. Eryomin V.A., S.P. Poznyakov , M.V. Shulgina. Simple Colorimetric Vethod of Quantitative Phospholipase С and D Assays with Victoria Blue R and B. 19-th FEBS Meeting, Rome Abstract Book, - 1989 - FR 501

7. Фадеева Н.И., М.В. Шульгина. Антибактериальное действие производных 4-хинолонов на чувствительные и резистентные бактерии Е. coli. //

Всесоюзная конференция по химиотерапии инфекционных заболеваний, Москва - 1991-Тезисы, т.4, с. 218

8. Shulgina M.V.., N. I. Fadeeva, L.D. Filitis Inhibitors of Bacterial Dihydrofolatereductase. // 8-th Mediterranean Congress of Chemotherapy, Athens, Greece, Abstracts, - 1992- A-95

9. Shulgina M.V., N.I. Fadeeva. The Mode of Action of Lomefloxacin. // 4-th BICON Biennial Conference on Chemotherapy of Infectious Disease and Malignancies, Prague, - 1992- Abstracts, 218

10. Фадеева Н.И., M.B. Шульгина, Р.Г. Глушков. Молекулярно-биологиче-ские особенности антибактериального действия производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты. // Хим.-фарм. хурн.-1995- №5, с. 4 - 12

11. Фадеева Н.И., М.В. Шульгина. Механизмы бактерицидного действия Максаквина в опытах с Escherichia coli К12.//Пульмонология, Приложение -1993-с.55 - 58

12. Шульгина М.В., Н.И. Фадеева, Л.Д. Филитис. Антибактериальная и антифолатредуктазная активность производных пиразинокарбазола. // Хим.-фарм..журн. - 1994 - №8, с.9 - 12

13. Shulgina M.V., N.I. Fadeeva, T.N. Bolshakova The Effect of 4-Quinolones on DNA Replication in Normal and GyrA Mutant Cells of E. coli K12. //6-th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Sevilia, Spain. - 1993- Abstracts A 1037

14. Bolshakova T.N., Rudnev I. A., Shulgina M.V. Properties of the Klebsiella pneumonia mutants resistant to lomefloxacin.// //18-th International Congress on Chemotherapy, Stockholm, Sweden,-1993- Abstracts, A435.

15. Shulgina M.V., N.I. Fadeeva. Mode of Bacterial Action of Fluoroquinolones in the Wild Type and GyrA Cells of Escherichia coli К12. //18-th International Congress on Chemotherapy, Stockholm, Sweden,-1993-Abstracts, A436

16. Shulgina M.V., N.I. Fadeeva. The Effect of Ciprofloxacin on Cytoplasmic Membrane Energisation in Escherichia coli K12.// 5-th BICON Bienniel Conference on Chemotherapy of Infectious Disease and Malignancies, Saltzburg, Austria, - 1994- Abstracts, 42

17. Shulgina M.V., N.I. Fadeeva, V.A. Tarasov, L.M. Kalinina. The Ability of Different Groups of Antibacterial Drugs to Induce SOS-Responce in Escherichia coli К12// 9-th Mediterranean Congress of Chemotherapy, Mylan, Italy -1994-Abstracts, A-66

18. Шульгина M.B., Н.И. Фадеева, Л.М. Калинина, В.А. Тарасов. Особенности ДНК-повреждающего действия некоторых антибактериальных препаратов.// Хим.-Фарм. Журн.-1995- №6, с.10 - 12.

19. Шульгина М.В., Н.И. Фадеева, Т.Н. Большакова О механизме бактерицидного эффекта производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты у бактерий Escherichia coli К12. // Хим.-Фарм. Журн. - 1995- №4, с. 8 - 11.

20. Шульгина М.В., Н.И. Фадеева, Л.Ф. Стебаева, Т.Н. Большакова. Индукция 4-хинолонами SOS- ответа у бактерий Escherichia cli К12// Хим.-Фарм. Журн.-1995-№6, с. 12 - 15.

21. М.В. Шульгина, Н.И. Фадеева, Л.И. Буданова, Е.В. Дегтярев, И.Б. Левшин, Р.Г. Глушков. Механизмы антибактериального действия некоторых производных тиозолидиндионов. // Хим.-Фарм. Журн.-1996-№6, с. 3 - 6

22. M.V. Shulgina, N.I. Fadeeva. Biological Activities of the Derivatives of Pyrazinocarbazole. // Interdisciplinary World Congress on Antimicrobial and Anticancer Drugs, Switzerland, - 1994- A-114

23. Shulgins M.V., N.I. Fadeeva. The Ability of 4-Quinolones to Inhibit DNA Replication in the Wild Type ang Gyr Mutants of Escherichia coli К12. // 9-th Mediterranian Congress of Chemotherapy, Milan, Italy -1994- Abstracts, A-78

24. Shulgina M.V., T.A. Guskova. Molecular mechanisms of antibacterial action of 6-fluoroquinolones. // 8-th International Congress of Infectious Disease, Boston, USA - 1998- A- 11114

25. Shulgina M.V., T.A. Guskova. Antimicrobial activity of 6-nitro derivatives of 4-quinolones. // 8-th International Congress of Infectious Disease, Boston, USA-1998- A- 11116

26. В.И. Голышевская, Л.П. Мартынова, М.В. Шульгина, И.А. Васильева Антимикобактериальцое действие аналогов рифампицина - Рифабутина и Азорифа. // 5-ый Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" - 1998- с.557

27. Шульгина М.В., Н.И. Фадеева, Т.Н. Большакова, И.Б. Левшин, Р.Г. Глушков. // Структурно-функциональные отношения в ряду производных хинолон-3-карбоновых кислот//. Хим-Фарм Журн. -1999- №7, с.З - 7

28. Шульгина М.В., Н.И. Фадеева, Т.Н. Большакова, И.Б. Левшин, Р.Г. Глушков.Механизмы антибактериального действия фтор- и нитрсхино-лонов у бактерий Escherichia coli К12// Хнм-Фарм Журн. -1998- №7,- с. 7 -11.

29. А.Г. Хоменко, В.И. Голышевская, А.А. Корнеев, М.В. Шульгина, С.Г. Сафонова, В.А. Пузанов. Распространеннонсть и микробиологическая характеристика штаммов Mycobacteria tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. //Рос. мед. вести -1999,

30. Golyshevskaya V.I., Korneev А.А., Puzanov V.A., Sevastyanova E.V., Shulgina M.V. Comparative Evaluation of Methods for Laboratoiy Diagnostics of Antituberculosis Drug Resistance. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis.-1998- v. 2, N 11, Suppl. 2, S288, 66-PC

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шульгина, Марина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы. Механизмы действия синтетических антибактериальных препаратов и методы их исследования.

1.1. Общая характеристика действия антибактериальных fö средств.

1.2. Сульфаниламидные препараты

1.3. Производные диаминопиримидина zh

1.4. Производные 5-нитрофурана и 5-нитроимидазола ^

1.5. Производные ди-N -окиси хиноксалина

1.6. Производные хинолон-3-карбоновой кислоты ^

1.7. Синтетические противотуберкулезные препараты 48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы. Общая характеристика.

Глава 3. Разработка методологических подходов к изучению механизмов антибактериальной активности синтетических гетероциклических соединений.

3.1. Исследования влияния веществ на параметры роста бактериальной культуры in vitro.

3.2. Изучение влияния гетероциклических соединений на различные группы биохимических процессов в бактериальной клетке.

3.2.1. Влияние на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке

3.2.2. Влияние на белковый спектр бактериальной клетки.

3.2.3. Влияние гетероциклических соединений на структуру бактериальной ДНК. jg

3.2.4. Влияние гетероциклических соединений на мембранные процессы в бактериальной клетке.

Глава 4. Механизмы и структурно-функциональные зависимости антибактериального действия производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты. tS

4.1. Исследование влияния производных хинолон-3-карбоновой кислоты на параметры роста бактериальной культуры in vitro.

4.2. Исследование влияния производных хинолон-3-карбо-новой кислоты на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке. ^ 4.3. Исследование влияния производных хинолон-3-карбо-новои кислоты на структуру ДНК бактериальной клетки $$

4.4. Структурно-функциональные зависимости в ряду хи-нолон-3-карбоноых кислот.

4.5. Особенности молекулярного связывания 4-хинолонов с ДНК-гиразой.

4.5.1.Связывание 4-хинолонов с А и В субъединицами ДНК-гиразы. №

4.5.2. Индукция разрывов в ДНК, ^ -j

4.5.3. А и В механизмы бактерицидного действия 4хинолонов,

Глава 5. Механизмы и структурно-функциональные зависимости антибактериальной активности производных пиразинокарбазола. $

5.1. Исследование влияния производных пиразинокарбазола на кинетические параметры роста бактериальной культуры и макромолекулярные синтезы бактериальной клетки. AZ

5.2. Исследование влияния производных пиразинокарбазола на структуру бактериальной ДНК. -(2.

5.3. Исследование структурно-функциональных зависимостей производных пиразинокарбазола jZB

Глава 6. Механизмы действия производных тиазолидиндиона. 05"

6.1. Исследование влияния производных тиазолидиндиона на параметры роста бактериальной культуры in vitro. ^

6.2. Исследование влияния производных тиазолидиндиона на макромолекулярные синтезы в бактериальной клетке. /3?

6.3. Исследование влияния производных тиазолидиндиона на белковый спектр бактериальной клетки jjg

6.4. Исследование влияния производных тиазолидиндиона на мембранные процессы в бактериальной клетке.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств"

Перед современной химиотерапией инфекционных заболеваний стоят две острые проблемы: 1) преодоление постоянно растущей устойчивости бактерий к известным антибактериальным средствам, и 2) увеличение числа патогенных микроорганизмов за счет штаммов, относившихся ранее к условно-патогенным /85, 104, 200/. Все это диктует необходимость поиска антибактериальных препаратов с новыми механизмами действия. В связи с этим задача изучения механизма антибактериального действия вновь синтезированных веществ на ранних этапах их исследования выходит на первый план.

Актуальность настоящего исследования вытекает из необходимости постоянного расширения спектра антибактериальных препаратов и стандартизации методов доклинического испытания новых веществ, обладающих антибактериальной активностью.

В последнее время все большее значение придается изучению механизмов действия новых классов химических соединений, обладающих антибактериальной активностью. В настоящее время в России зарегистрировано более 400 антибактериальных препаратов с различными механизмами действия. Особое значение имеет выяснение мишени действия веществ на стадии их доклинического изучения. Для новых классов антибактериальных соединений данные о мишени действия позволяют оценить химиотерапевтические перспективы изученной группы, а также провести направленный синтез высокоактивных соединений.

Выяснение механизма действия нового класса антибактериальных веществ на ранних стадиях изучения позволит также определить место этих соединений на высоко насыщенном фармацевтическом рынке и коммерческие перспективы их распространения а также избежать расходов на создание препарата, аналогичного по своим свойствам уже используемым.

Для фармакологических препаратов, антибактериальная активность которых является побочным эффектом, расшифровка механизма позволит прогнозировать его значимость. Проведенные исследования структурно-функциональных зависимостей, базирующиеся на данных о механизме действия, создают предпосылки для направленного синтеза веществ, сохраняющих фармакологическую, но лишенных полностью или частично нежелательной антибактериальной активности, или, наоборот, для создания нового антибактериального средства.

Несмотря на очевидное значение изучения механизмов антибактериального действия химических соединений, в последних Методических указаниях по экспериментальному изучению новых антибактериальных препаратов и антибиотиков, изданных Фармкомитетом СССР в 1978 году, рекомендации по проведению определения механизмов действия изучаемых препаратов отсутствуют /23/. В настоящее время методические рекомендации по проведению такого рода исследований представлены только в одном сборнике /24/. В чрезвычайно полезном и^до настоящего времени актуальном, пособии по экспериментальной химиотерапии издания 1971 года предложены два метода изучения механизма антибактериального действия соединений - метод антагонизма /36/, заключающийся в поиске среди естественных метаболитов веществ - антагонистов антибактериальной активности испытуемого соединения, и изучение влияния химиотерапевтических веществ на отдельные ферментные системы /28/. Предлагаемые авторами подходы основаны на достаточно хаотичном испытании метаболитов в качестве антагонистов антибактериального действия соединений или такого же случайного набора ферментативных реакций, которые могут быть изучены экспериментатором. Развитие молекулярной физиологии микроорганизмов и бактериальной генетики открыло в настоящее время более широкие возможности для систематизации исследований механизмов антибактериального действия. Расширение арсенала методологических подходов, а также требования современных рыночных отношений определяют актуальность разработки единых принципов изучения механизмов антибактериального действия.

Целью исследования явилась разработка методологических подходов к оценке механизма антибактериального действия фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.

Задачи исследования:

2) Сравнительное изучение механизма антибактериального действия 6- фтор и 6-нитро производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты на основе разработанного алгоритма тестирования.

4) Выявление мишени антибактериального действия антидепрессантов - пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокарбазолов на основе разработанного алгоритма тестирования.

Научная новизна исследования.

1. Впервые предложена схема исследования механизма антибактериального действия веществ, отличительной особенностью которой является использование генетически сконструированных и мутантных штаммов как для определения мишени действия веществ, так и для изучения их структурно-функциональных зависимостей.

3. Впервые изучена структурно-функциональная зависимость в ряду 6-нитро производных хинолон-3-карбоновой кислоты.

4. Впервые выявлены различия в механизме действия фтор- и нитропроиз-водных 4-хинолона.

5. Впервые установлена механизм воздействия антидепрессантов пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокар-базола на бактериальную клетку. Разработаны модели для выявления структурно-функциональных зависимостей соединений ряда пиразинокар-базола и 1-аминотетрагидрокарбазола для грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

6. Впервые выявлены фармакоформные группы, обеспечивающие высокую активность в отношении Mycobacterium tuberculosis в ряду пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола. Наиболее активными оказались соединения: 2,3,За,4,5,6-гексагидро-8-адамантил-1н-пиразино-[3,2,1 j,к] карбазол (ШКИ-114) и 1-фенилэтиламино-6-циклогексил-1,2,3,4-тетра-гидрокарбазол (Ш-1046).

Научно-практическая значимость исследования.

2. Методологические подходы оценки механизмов антибактериального действия учтены в требованиях к доклиническому изучению антибактериальной активности фармакологических веществ, одобренных Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве официального документа.

5. Впервые выявлены фармакоформные группы в молекуле пиразинокар-базола и аминотетрагидрокарбазола, обеспечивающие антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложен алгоритм исследования механизма антибактериального действия гетероциклических соединений: . — ~

• определение концентрационных и временных параметров антибактериального действия на культуру бактерий;

• выявление группы метаболических процессов бактериальной клетки, чувствительных к действию исследуемых веществ;

• определение способности веществ к ингибированию отдельных биохимических реакций или повреждению клеточных структур (ДНК-повреждающее действие, мембранотропный эффект и т.д.)

• анализ структурно-функциональных зависимостей для каждой химической группы соединений.

2. Антибактериальный эффект производных тиазолидиндионов является следствием их мембранотропного действия, связанного с их неспецифическим взаимодействием с фосфолипидами мембраны.

3. Антибактериальный эффект производных пиразинокарбазола обусловлен ингибированием репликации бактериальной ДНК вследствие подавления синтеза предшественников ДНК - нуклеотидов.

4. Положения 3 и 8 в молекуле производных пиразинокарбазола особенно важны для их антибактериальной активности. Наилучшую активность в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli обеспечивал циклогексильный заместитель в положении 8 в сочетании с водородом в положении 3. Адамантильный заместитель в положении 8 и пиперидинильный радикал в положении 3 приводили к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов St. aureus и Mycobacterium.

5. Механизм и мишень действия 6-нитрохинолонов аналогичны таковым для фторхинолонов: нитрохинолоны ингибируют синтез ДНК и вызывают разрывы в этой молекуле в результате ингибирования комплекса гираза - ДНК.

6. Природа заместителей в положениях 1, 7 и 8 определяют сродство молекулы 4-хинолона к А и В субъединицам ДНК-гиразы, причем введение 7-пиперазинила или 7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила), на фоне 1-циклопропила, увеличивают сродство молекулы к В субъединице ДНК-гиразы.

7. Природа заместителя в положении 6 (нитро- или фтор) не отражалась на сродстве 4-хинолона к А или В субъединице ДНК-гиразы, однако сказывалась на способности вещества вызывать разрывы в ДНК.

8. Ципрофлоксацин и 6-нитро-7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанил)-4-хинолон-3-карбоновая кислота способны к независимому от белкового синтеза бактерицидными эффектами в результате связывания с одним и тем же сайтом в А субъединице ДНК-гиразы, тогда как сайт связывания дифторхинолона ломефлоксацина, обеспечивающий аналогичный эффект, отличается от сайта связывания вышеназванных 4-хинолонов.

Апробация работы. Диссертационное исследование выполнено по плану научно-исследовательскиз работ в Центре химии лекарственных средств - Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе в 1989-1992 годах и Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН в 1998 - 1999 годах.

Основные положения диссертации были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на 11 и 19 съездах Федерации Европейских биохимических обществ в 1977, 1989 г., Международном генетическом конгрессе в Москве, в 1980 г., 8 и 9 Средиземноморском конгрессе по химиотерапии в 1992 и 1994 годах, 18 Международном конгрессе по химиотерапии в 1993 г., Заседаниях секции туберкулеза Всероссийского микробиологического общества в 1998 и 1999 годах, Конгрессе "Человек и лекарства" в 1998 г., на коллоквиумах и заседаниях Ученых советов ЦХЛС - ВНИХФИ и ЦНИИТ РАМН, в отчетах по темам НИР ЦХЛС ВНИХФИ и ЦНИИТ РАМН.

По материалам диссертации опубликована 30 работ в отечественных и зарубежных научных периодических изданиях.

Структура диссертационной работы. Работа изложена на страницах, содержит 5 разделов, включая "Введение", "Литературный обзор", Экспериментальную часть, состоящую из Общей характеристики материалов и методов, четырех глав Результатов и обсуждения,

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шульгина, Марина Владимировна

8. ВЫВОДЫ

1. Алгоритм исследования механизма антибактериального действия веществ включает в себя:

• определение концентрационных и временных параметров антибактериального действия на культуру бактерий;

• выявление группы метаболических процессов бактериальной клетки, чувствительных к действию исследуемых веществ (репликация ДНК, транскрипция, трансляция);

• определение влияния веществ на отдельные ферментативные реакции или группы реакций, а также структур бактериальной клетки (например, ДНК-повреждающее , мембра-нотропное действие),

• анализ структурно-функциональных зависимостей для каждой химической группы соединений.

2. Введение нитрогруппы в положение 6 молекулы 4-хинолона вместо фтора не изменяет механизм действия этих соединений. Нитрохино-лоны, так же как и фторхинолоны ингибируют синтез ДНК и вызывают разрывы в этой молекуле в результате ингибирования комплекса гираза ДНК, хотя и отличаются от фторхинолонов в механизмах взаимодействия с мишенью.

6. В молекуле ДНК-гиразы имеется несколько сайтов для связывания молекулы 4-хинолона. Ципрофлоксацин и 6-нитро-7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанил)-4-хинолон-3-карбоновая кислота способны к независимому от белкового синтеза бактерицидному эффекту в результате связывания с одним и тем же сайтом в А субъединице ДНПС-гиразы. Сайт связывания дифторхинолона ломефлоксацина, обеспечивающий аналогичный эффект, отличается от сайта связывания вышеназванных 4-хинолонов.

7. Антибактериальный эффект производных пиразинокарбазола обусловлен ингибированием репликации бактериальной ДНК вследствие подавления синтеза предшественников ДНК - нуклеотидов. Изучение влияния пиразинокарбазолов на репликацию ДНК и активность дигидрофолатредуктазы может быть использовано как модель для выявления структурно-функциональных зависимостей антибактериальной активности соединений этого ряда.

8. Циклогексильный заместитель в положении 8 в сочетании с водородом в положении 3 обеспечивает высокую активность в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli.

10. Гидрофобные адамантильный радикал положении 8 молекулы пиразинокарбазола и циклогексильный радикал в положении 6

157 аминотетрагидрокарбазола обусловливают высокую активность в отношении микобактерий туберкулеза in vitro.

11. Производные тиазолидиндионов оказывают мембранотропное действие на чувствительные к ним бактерии Escherichia coli, взаимодействуя с фосфолипидами мембраны.

12. Штамм Escherichia coli Kl 2 EC1000/pJE43 может быть использован для изучения ДНК-повреждающего действия соединений с выраженной антибактериальной активностью.

13. Уровень резистентности репликации ДНК у мутантного по А субъединице штамма Escherichia coli и способность вещества индуцировать SOS-ответ позволяют прогнозировать активность in vivo соединений из группы производных хинолон-3-карбоновой кислоты

14. Предложенная схема исследования позволяет на этапе доклинического изучения определить механизмы антибактериального действия соединений различной химической структуры, разработать адекватные модели для изучения структурно-функциональной зависимости антибактериальной активности в новых химических рядах.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С момента открытия первых антимикробных препаратов механизмы их действия подвергались тщательному и всестороннему исследованию. Анализ накопленных данные в сочетании с опытом клинического применения антибактериальных препаратов показывают, что молекулярные механизмы их действия предопределяют такие важные характеристики препаратов как их эффективность и скорость нарастания устойчивости к ним. В последнее время, с развитием компьютерных технологий и направленного конструирования биоактивных молекул, все большее значение приобретает разработка подходов к получению данных о структурно-функциональных зависимостей различных групп химических соединений. В этой связи разработка адекватной модели изучения структурно-функциональных зависимостей на ранних этапах изучения новых химических групп соединений с антибактериальной активностью приобретает все большее значение. Попытка создания унифицированной системы исследования механизмов антибактериального действия на стадии доклинического изучения представлена в настоящем исследовании.

С целью разработки схемы исследования механизмов антибактериального действия синтетических гетероциклических соединений различных групп нами были изучены три типа веществ:

• оригинальные соединения, родственные высокоэффективным антибактериальным препаратам фторхинолонам (нитрохинолоны);

• аналоги фармакологических препаратов с психотропной активностью -тетриндола и пиразидола (производные пиразинокарбазола), у которых ранее была выявлена антибактериальная активность in vitro;

• соединения с не выявленной антибактериальной активностью производные тиазолидиндиона).

В качестве объекта действия препаратов мы выбрали бактерии Escherichia coli. Наш выбор в первую очередь обуславливался тем, что физиология этих бактерии изучена наиболее полно, доступен широкий спектр мутантов по генам, кодирующим самые разнообразные метаболические процессы. Экстраполяция данных, полученных на одном виде бактерий, к тому же условно-патогенном, может показаться недостаточно корректной. Однако, результаты сравнительного изучения механизмов действия антибактериальных препаратов на Escherichia coli и других видах бактерий, представленные в многочисленных публикациях, доказывают обоснованность подобного подхода. Так, изучение механизмов действия фторхинолонов показало существование одной и той же мишени как у Escherichia coli, так и у всех остальных изученных видов бактерий, как грамположительных, так и грамотрицательных - ДНК-гиразы /103, 168/. В последние годы была обнаружена еще одна мишень действия 4-хинолонов - топоизомераза IV. Она также обнаружена как у Escherichia coli, так и у других изученных бактерий /169/. При этом, если у Escherichia coli эта мишень является вторичной, она рассматривается как первичная мишень действия у грамположительных микроорганизмах /123/. Интересно, что две субъединицы топоизомеразы IV из Escherichia coli имеют высокую степень гомологии с А и В субъединицами ДНК-гиразы. Участок аминокислотной последовательности гиразы, участвующий в связывании с 4-хинолонами практически идентичен аналогичному участку полипептидной цепи у топоизомеразы IV /37, 131, 132/.

СХЕМА изучения механизма антибактериального действия химических соединений на доклиническом этапе

Сравнение механизмов действия противотуберкулезных препаратов у микобактерий и Escherichia coli выявили не только общие мишени у этих двух далеко отстоящих друг от друга видов, но и высокую гомологию аминокислотных последовательностей этих мишеней /162/. Даже для препарата изониазид, не действующего на Escherichia coli, обнаружены гены, кодирующие ферментативные системы, обеспечивающие устойчивость бактерий к нему, общие для обоих видов микроорганизмов /162/.

Приведенные выше примеры позволяют считать допустимым использование для определения мишени действия препаратов модель Escherichia coli с дальнейшей экстраполяцией этих данных на другие микроорганизмы. Безусловно, тонкие механизмы взаимодействия антибактериального вещества могут различаться от вида к виду, поэтому результаты анализа структурно-функциональных зависимостей, полученные на одном виде бактерий должны с осторожностью переноситься на другие виды микроорганизмов и подвергаться дополнительной проверке с использованием бактерий различных видов.

На основании проведенных исследований, предложена схема изучения механизмов антибактериального действия химических соединений (см. Схему), базирующаяся на определение временных и концентрационных параметров антибактериального эффекта, определяющих условия дальнейших экспериментов, на основании изучения подавляющего воздействия изученных соединений на рост культуры бактерий.

Наилучшим методом для определения кинетических параметров антибактериального эффекта является определение действия вещества на динамику прироста оптической плотности жидкой культуры. Этот метод оказался достаточно информативным и в случае веществ, вызывающих филаментацию бактериальных клеток: несмотря на то, что оптическая плотность культуры не отражает число жизнеспособных бактерий, такие характеристики как время проявления эффекта и действующие концентрации веществ, определенные по их влиянию на скорость прироста оптической плотности, близки к истинным. Характер кривых прироста оптической плотности культуры в присутствии 4-хинолонов соответствует степени чувствительности бактерий к препаратам этого ряда. Это справедливо для бактерий дикого типа и устойчивых к препаратам по причине нарушения транспорта веществ в клетку и мутационного изменения мишени их действия.

На втором этапе определяются группы биохимических процессов бактериальной клетки, подверженных воздействию изучаемых соединений, в соответствии с временными и концентрационными характеристиками, определенными на первом этапе. В качестве процессов, воздействия на которые целесообразно изучать в первую очередь, выделены процессы репликации ДНК, транскрипции и трансляции.

Изучение влияния веществ изучаемых химических групп на белковый спектр чувствительных к ним бактерий не выявил достоверных изменений в бактериальной клетке, которые могли бы быть охарактеризованы как первичная реакция клетки на антибактериальное воздействие. По-видимому, этот метод недостаточно чувствителен для выявления первичных нарушений в бактериальной клетке, вызванных испытуемыми веществами.

В случае влияния веществ на репликацию ДНК, целесообразно проверить способность этих соединений к ДНК-повреждающему эффекту. Для изучения способности веществ повреждать первичную структуру ДНК предложен генетически сконструированный штамм. Возможность использования штамма ЕС1000/рШ43 для определения ДНК-повреждающего действия веществ с антибактериальной активностью впервые доказана на примере нескольких групп лекарственных препаратов с известными механизмами действия. Сравнение динамики антибактериального эффекта вещества с его способностью вызывать разрывы в ДНК также позволяет определить мишень действия соединения. Изучение воздействия соединений на первичную структуру ДНК важно не только с точки зрения определения механизма их антибактериального действия, но и для прогноза их возможной генотоксичности. Для характеристики способности вещества вызывать разрывы в ДНК, выявляемой по его способности индуцировать ЗОБ-ответ нами предложен коэффициент индукции - соотношение уровня Р-галактозидазы до начала действия вещества и через 20 минут его воздействия.

Способность лекарственного препарата повреждать ДНК бактерий может рассматриваться как свидетельство его потенциальной генотоксичности в отношении организма человека и канцерогенности. Поэтому бактериальные тест - системы широко используются для выявления ДНК-повреждающих веществ.

В настоящее время не существует ни одной тест-системы, однозначно определяющей генотоксичность вещества. Соединение, оказавшееся генотоксичным в клетках одного вида, может не проявить подобное свойство в клетках другого, даже близкородственного вида. Только положительный результат нескольких конвенционных тестов позволяет говорить о потенциальной генотоксичности вещества. Причины такого несоответствия лежат в особенностях механизмов протекания мутационного процесса в различных организмах. В связи с этим, результаты применяемого нами БОЗ-хромотеста рассматриваются нами только как свидетельство связанного с ДНК механизма действия соединений, а не как свидетельство их генотоксичности для человека. Тем не менее, несмотря на невозможность однозначной интерпретации положительного результата 808-хромотеста, соединения, вызывающие индукцию 808-ответа должны с особой тщательностью проверяться на возможную генотоксичность для человека.

Одной из вероятных мишеней антибактериального действия веществ является бактериальная цитоплазматическая мембрана. Изменение уровня энергизации мембраны может быть принято в качестве показателя действие веществ на цитоплазматическую мембрану. Для выявления мембранотропного воздействия веществ на бактериальную клетку разработан метод, основанный на определении уровня трансмембранного потенциала ионов водорода Ацн+ по скорости аккумуляции радиоактивно меченного пролина и а-метилглюкопиранозида. Одновременное изучения влияния веществ на два независимых друг от друга, но зависимых от уровня энергизации бактериальной мембраны процесса, позволяют исключить иное, например, сульфгидрильное, действие изучаемых соединений.

Выявление процессов биосинтеза, чувствительных к действию испытуемых веществ позволило на ранних этапах исследования определить возможные этапы бактериального метаболизма, определяющие антибактериальный эффект соединений групп пиразинокарбазолов и нитрохинолонов. Полученные в предварительных исследованиях данные позволили разработать модели для проведения структурно-функционального анализа для этих групп соединений.

Проведенные исследования показали, что антибактериальное действие нитрохинолонов, подобно фторхинолонам связано с А субъединицей ДНК-гиразы. Подобно фторхинолонам, антибактериальное действие соединений этого ряда сопровождается появлением разрывов в ДНК, проявляющееся индукцией SOS- ответа.

Однако, по сравнению с фторхинолонами, способность нитрохинолонов индуцировать SOS-ответ снижена, что может быть объяснено иным, чем у фторхинолонов, механизмом ингибирования комплекса ДНК-гираза-ДНК.

Анализ структурно-функциональных зависимостей 4-хинолонов подтвердил известное из литературы преимущество фтора перед нитрогрупппой в положении 6 и пиперазинила в положении 7. Сравнение способности 4-хинолонов с различными заместителями в положениях 5 и 6 позволяют предположить существование оптимальных соотношений стерических размеров групп -заместителей в этих положениях. Кроме 7-пиперазинила, введение 1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила в положение 7 также приводит к существенному увеличению активности вещества в отношении бактериальной репликации ДНК.

Для оценки сродства 4-хинолонов различной структуры мы ввели индекс резистентности - соотношение ИД5о для штамма с нормальной гиразой и мутантной по А или В субъединице. Индекс резистентности отражает изменение сродства молекулы 4-хинолона к участку аминокислотной последовательности, измененной в результате мутации. Уменьшение сродства вещества к полипептидной молекуле приводит к увеличению значения ИД50 репликации ДНК для мутантного штамма. На основании величины индексов резистентности все изученные 4-хинолоны были разделены на три группы. 4-хинолоны первой группы имели два сайта связывания с молекулой гиразы - в А и В субъединице. 4-хинолоны второй и третьей группы имели значительно меньшее сродство к В субъединице.

Меньшее сродство к В субъединице не отражало абсолютную способность 4-хинолонов ингибировать синтез ДНК, но коррелировала с их антибактериальной активностью in vivo. Это наблюдение позволяет использовать более дешевый тест на антибактериальную активность in vitro с использованием хотя бы одного штамма, мутантного по ДНК-гиразе, для более точного выявления соединений этого ряда, для которых низка вероятность проявления антибактериальной активности in vivo.

Способность 4-хинолона оказывать бактерицидное действие в условиях ингибирования белкового синтеза увеличивает общую бактерицидную активность (бактерицидный механизм В) и присуща наиболее активным фторхинолонам ципрофлоксацину и офлоксацину /51/. Наши исследования показали, что природа заместителя в 1, 6, 7 или 8 положениях 4-хинолона определяет его способность к бактерицидному действию по механизму В. замена фтора в положении 6 на нитрогруппу на фоне 1-циклопрпила и 7-пиперазинила приводит к утрате 4-хинолоном способности к бактерицидному действию по механизму В. Однако 6-нитрохинолон с 1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанилом в положении 7, также как и ципрофлоксацин, способен к независимому от белкового синтеза антибактериальному действию. Введение фтора в положение 8 (ломефлоксацин) молекулы фторхинолона с этильным заместителем в положении 1 также приводила к появлению способности к бактерицидному действию по механизму В.

Изучение антибактериального действия 4-хинолонов в присутствии ингибитора белкового синтеза на бактерии, мутантные по ДНК-гиразе, показало, что сайт связывания в А субъединице ДНК- гиразы для ципрофлоксацина и нитрохинолона РГ-20 (ЛИБ-174)) с 7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанилом), приводящего к независимому от белкового синтеза бактерицидному эффекту этих соединений, отличается от такового для дифторхинолона ломефлоксацина.

На основании полученных данных нам удалось разделить функции различных заместителей 4-хинолона в связывании с мишенью действия гираза-ДНК. Заместитель в положении 6 участвует в создании разрывов в ДНК и тем самым в значительной степени определяет его бактерицидность. Заместитель в положении 7 участвует в связывании молекулы 4-хинолона с ДНК-гиразой, не связываясь с самой ДНК и влияя на возникновение разрывов с этой молекуле только косвенно.

Комплекс проведенных исследований позволил определить мишень действия пиразинокарбазолов как синтез нуклеотидов- предшественников бактериальной ДНК, по-видимому, вследствие ингибирования дигидрофолатредуктазы. Ингибирование репликации ДНК у Е. coli и активности ДФР из St. aureus были выбраны как модели для изучения структурно-функциональных зависимостей соединений этой группы.

Дальнейшее изучение структурно-функциональных зависимостей в ряду пиразинокарбазолов выявили, что положения 3 и 8 особенно важны для их антибактериальной активности. Наилучшую активность как в отношении грамотрицательных, так и в отношении грамположи-тельных бактерий проявило соединение с циклогексильным заместителем в положении 8. Адамантильный заместитель в положении 8 приводил к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов St. aureus и Mycobacterium. Пиперидинильный радикал в положении 3 обеспечивал более высокую антибактериальной активности в отношении грамположительных бактерий, тогда как отсутствие заместителя в положении 3 приводила к наиболее высокой активности в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli.

Применение предложенной схемы к препаратам из группы тиазо-лидидиона было осложнено отсутствием активности веществ этого ряда в отношении бактерий. Тем не менее, наличие у ЛИБ-4 и ЛИБ-22 антимикотического действия давало основание для углубленного изучения этих соединений. Мы надеялись разработать модель для изучения биологической активности тиазолидиндионов in vitro.

В случае соединений, относящихся к принципиально новым химическим группам, не проявившем антибактериальный эффект в отношении бактерий дикого типа, целесообразно изучить их действие на бактерии с поврежденной клеточной стенкой. Эти эксперименты позволяют сделать заключение о роли клеточной стенки в защите бактерий от антибактериального действия изучаемых соединений. В случае ЛИБ-4 и ЛИБ-22 штаммы бактерий Escherichia coli с поврежденной клеточной стенкой оказлись чувствительными к соединениям этой группы. Однако нам не удалось выявить существенного влияния тиазолидиндионов на процессы синтеза ДНК и белка и в чувствительных бактериях.

Неудача в определении возможного механизма действия тиазо-лидиндионов на этом этапе, тем не менее позволила значительно сузить поиск возможных мишеней действия этих соединений в дальнейшем. С помощью разработанного способа определения действия на уровень трансмембранного потенциала выявлено влияние тиазолидиндионов на мембраны. Дальнейшее изучение действия соединений этого ряда на активность фосфолипаз С и Б на модели искусственными липосомами позволило связать антибактериальный эффект тиазолидиндионов с неспецифическим связыванием с липидами мембран.

Проведенные исследования легли в основу разработки алгоритма исследования механизмов антибактериальной активности гетероциклических соединений различных химических групп, позволили получить оригинальные данные о механизмах антибактериального действия химических соединений, относящихся к трем различным группам гетероциклических соединений: определены мишени антибактериального действия тиазолидиндионов, пиразинокарбазолов и 6-нитрохинолонов.

Установленные структурно-функциональные зависимости в ряду пиразинокарбазолов могут быть использованы для направленного синтеза как новых антибактериальных препаратов, так и психотропных препаратов, лишенных антибактериальной активности.

Данные о структурно-функциональных зависимостях в ряду 4-хинолонов позволяют существенно расширить знания о механизмах их действия. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы, показанное в настоящем исследовании, и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда соедине

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шульгина, Марина Владимировна, Москва

1. Geliert M., Mizuuchi K., O'Dea M.H., Nash H.A. DNA-gyrase: an enzyme that introduces superhelical turns into DNA. Proc. //Natl. Acad. Sei. USA 1976 - v. 73, N11, p. 3872-3876.

2. Hane M.W., Wood T.N. Escherichia coli Kl2 mutants resistant to nalidixic acid: genetic mapping and dominance studies // J. Bacteriol. 1969 - v. 99, N 1, p. 239 -241.

3. Hedgecock L.W., Faucher I.O. Relation of pyrogallol-peroxidative activity to izoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis // Am. Rev. Tuberc. 1957 -v. 74, p. 670-674.

4. Heym B., Zhang Y., Poulet S., Young D., Cole S.T. Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniazid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis // J. Bacteriol. 1993 - v. 175, p. 4255 - 4259.

5. Hirai K., Aoyama H., Suzue S. et al. Isolation and characterization of norfloxa-cin-resistant mutants of Escherichia coli K12.// Antimicrob. Agents Chemother. -1986-v. 30, N2, p. 248-253.

Информация о работе

Шульгина, Марина Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 1999
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы