Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антагонистическая активность штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к дерматомицетам и его использование в разработке антимикотического препарата

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Антагонистическая активность штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к дерматомицетам и его использование в разработке антимикотического препарата"

005008730

Гиззатуллина Светлана Вадимовна

АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММА BACILLUSSUBTILIS ИБ-54 К ДЕРМАТОМИЦЕТАМ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В РАЗРАБОТКЕ АНТИМИКОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2G12

Уфа-2012

005008730

Работа выполнена в филиале «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия научно-производственного объединения «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития РФ и в Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Лукманова Клара Абдулловна

кандидат биологических наук Актуганов Глеб Эдуардович

доктор биологических наук, профессор

Албулов Алексей Иванович

доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии наук

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита диссертации состоится j®012 г. в 14.00 часов на

заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской Академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054 г. Уфа, Проспект Октября, 69, тел: 8 (347) 235-33-62, e-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра Российской академии наук и на официальном сайте: http://www.anrb.ru/inbio/dissovet.html.

Автореферат разослан J4» 1 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Р. В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время, в связи с резким увеличением заболеваемости микозами, возросла потребность в разработке новых эффективных и безопасных антимикотических средств. Одно из ведущих мест среди микотических инфекций занимают дерматомикозы [Сергеев, 2003]. Основную роль в терапии дерматомикозов играют достаточно токсичные синтетические препараты, интенсивное применение которых приводит к побочным эффектам и возникновению резистентности патогенных грибов. Таким образом, целесообразность поиска новых методов и подходов к лечению дерматомикозов очевидна. В практическом здравоохранении все более широко применяются биопрепараты (пробиотики) на основе бактерий рода Bacillus [Смирнов, 1998; Похиленко, Перелыгин, 2007]. Значительный интерес представляет опыт использования бацилл в составе наружных препаратов для заживления ран и ожогов [Горшевикова, 1992; Bolton and Fattu, 1994; Klasen, 2000; Мельникова и др., 2001; Копылов и др. 2001; Лукманова и др., 2004; Янгирова, 2004; Забокрицкий, 2005]. Данный аспект, в сочетании со способностью некоторых штаммов В. subtilis подавлять развитие дерматомицетов, представляется перспективным для разработки наружных средств профилактики и лечения дерматомикозов.

В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение антимикотической активности штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к дерматомицетам и его потенциала в создании биопрепарата для профилактики и лечения дерматомикозов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать антимикотическую активность и особенности антагонистического взаимодействия штамма В. subtilis ИБ-54 с клиническими штаммами дерматомицетов различной таксономической принадлежности - Trichophyton rubrum, Т. gypseum и Microsporum canis.

2. Выявить факторы антимикотического действия В. subtilis ИБ-54 и охарактеризовать их физико-химические и биологические свойства.

3. Изучить влияние ряда параметров культивирования на особенности роста и продукции антимикотическнх соединений штаммом Б. subtilis ИБ-54.

4. Разработать на основе В. subtilis ИБ-54 состав (рецептуру) лекарственной формы для наружного применения при дерматомикозах и оценить ее биологическую активность в доклинических испытаниях.

5. Изучить токсико-фармакологические свойства штамма В. subtilis ИБ-54 и биопрепарата на его основе.

Научная новизна. Впервые показана высокая конститутивная антимикотическая активность штамма В. subtilis ИБ-54 в отношении клинических штаммов дерматомицетов. Обнаружена специфичность в синтезе антимикотическнх веществ В. subtilis ИБ-54 при взаимодействии с дерматомицетами in vitro, тогда как проявление его действия на различные виды грибов имеет сходный характер. Установлена ключевая роль циклических липопептидов в антагонизме В. subtilis ИБ-54 к дерматомицетам. Выявлено, что одним из факторов устойчивости грибов рода Trichophyton к действию В. subtilis ИБ-54 является способность к синтезу антибактериальных веществ. Обнаружена антибактериальная активность В. subtilis ИБ-54 к клиническим штаммам патогенных и условно патогенных бактерий. Впервые разработана экспериментальная лекарственная форма препарата на основе штамма В. subtilis ИБ-54 для профилактики и лечения дерматомикозов. Обоснован состав компонентов гелевого препарата и экспериментально доказана его эффективность в отношении дерматомицетов.

Практическая значимость работы. Изучены условия максимального роста и продукции антигрибных соединений в глубинной периодической культуре В. subtilis ИБ-54, которые могут быть использованы в разработке технологии создания многофункциональных биопрепаратов на основе этого штамма. Высокие продукционные характеристики исследуемого штамма позволяют применять его для направленного получения циклических липопептидов, относящихся к различным гомологическим группам (сурфактины, итурины и т.д.).

Обоснована возможность создания нового препарата наружного применения для профилактики и комплексного лечения поверхностных

дерматомикозов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штамм В. siibtilis ИБ-54 проявляет высокую антагонистическую активность к клиническим штаммам дермагомицетов различных таксономических груип, показывая сходство в общем механизме их подавления.

2. Антимикотическая активность В. subtilis ИБ-54 к дерматомицетам обусловлена в основном синтезом липопептидных веществ, близких по строению к циклическим липопептидам класса сурфактина с присутствием других функционально активных компонентов.

3. Продукция антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54 имеет конститутивный характер, но может специфически усиливаться при непосредственном взаимодействии с различными видами дерматомицетов.

4. Источники органического азота способствуют значительному повышению синтеза антимикотических соединений в периодической культуре В. subtilis ИБ-54.

5. Опытная лекарственная форма на основе жидкой культуры В. subtilis ИБ-54 показывает высокую активность в подавлении дерматомицетов in vitro, стабильна при хранении и сравнима по эффективности in vivo с коммерческим синтетическим препаратом.

6. Штамм В. subtilis ИБ-54 и препарат на его основе не проявляют вирулентности, токсичности, токсигениости и сенсибилизирующих свойств в доклинических испытаниях.

Работа выполнена в филиале «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и CP РФ и в Институте биологии Уфимского научного центра РАН.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов» (Пермь, 2008), Пятой конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Втором международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье

человека» (Санкт-Петербург, 2008) и Втором съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), объектов и методов исследований (глава 2), результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 205 ссылок, из них 83 - на русском языке. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и 21 таблицу.

Автор выражает благодарность сотрудникам лабораторий прикладной микробиологии и экологии растительных ресурсов Института биологии Уфимского научного центра РАН Галимзяновой Н.Ф., Гильвановой Е.А., Шендель Г.В. за неоценимую помощь в проведении исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве основного объекта исследования использовали штамм из коллекции Института биологии Уфимского научного центра РАН Bacillus subtilis ИБ-54, депонированный во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-9795. Тест-объектами служили клинические штаммы дерматомицетов - Microsporum canis Bodin, выделенный в Уфимском городском кожно-венерологическом диспансере и любезно предоставленный к.м.н. O.P. Мухамадеевой, а также Trichophyton rubrum (Castell.) Sabour. и T. gypseum (Robin) Blanchard, предоставленные д.м.н., проф. Ю.А. Медеведевым. Культуры грибов поддерживали пересевами на агаризованной среде Сабуро и КГ А.

Штамм В. subtilis ИБ-54 поддерживали на картофельном агаре (КА). Глубинное выращивание бактерий осуществляли в питательной среде следующего состава (гхл1): КН2Р04 - 1,0; К2НР04-ЗН20 - 0,5; (NH4)2HP04 -0,5; MgS04-7H20 - 0,5; пептон ферментативный - 2,0; дрожжевой экстракт -5,0; кукурузный экстракт - 5,0; глицерин - 5,0. Значение pH в среде перед

автоклавированием - 6,6-6,7. Культивирование проводили на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 при 170 об"1 и 36,0±0,5°С в течение 72 ч.

Для оценки влияния природы источников углерода на рост и синтез антимикотических соединений штамма В. subtilis ИБ-54 глицерин в базовой питательной среде заменяли другими источниками углерода (D-глюкоза, сахароза, лактоза, D-сорбит, крахмал картофельный, инулин, пектин свекловичный, Na-КМЦ, пуллулан, хитин) в той же концентрации. Изучение влияния концентрации источников углерода и азота на рост и активность бактериальной культуры проводили, варьируя концентрации глицерина (0, 0,25,0,50, 0,75, 1,00, 1,50, 2,00%) и источников азота по отдельности.

Рост бактериальной культуры оценивали по оптической плотности при длине волны 630 нм на спектрофотометре СФ-46, а также по титру, определяемому методом предельных разведений на КА.

Концентрацию суммарного белка в КЖ В. subtilis ИБ-54 определяли методом Кристиана - Варбурга по поглощению при 280 нм, с учетом коэффициента поправки на поглощение нуклеиновых кислот при 260 нм.

Таксономическую принадлежность штамма В. subtilis ИБ-54 уточняли на основе филогенетического анализа последовательности гена 16S рРНК. Амплификацию гена 16S рРНК осуществляли методом ПЦР с использованием универсальных праймеров 16SF27 и 16SR1512. Плазмидный профиль В. subtilis ИБ-54 изучали в ГНЦ ГосНИИгенетика.

Морфологические характеристики вегетативных клеток и спор В. subtilis ИБ-54, а также влияние бактериальных экзометаболитов на дерматомицеты изучали с помощью световой микроскопии на микроскопах "Amplival" 30-G048a ("Carl Zeiss Jena", Германия) и "Leica DL1000" ("Leica Microsystems", Германия).

Антагонистическую активность В. subtilis ИБ-54 оценивали по диаметру зон подавления дерматомицетов вокруг колоний штамма на КГА. Уровень продукции антимикотических метаболитов в глубинной культуре бактерий определяли методом диффузии в агар [Егоров, 2004]. Для изучения специфичности антимикотического действия В. subtilis ИБ-54 штамм выращивали совместно с дерматомицетами в среде Сабуро при статических условиях и 28°С в течение 7 суток.

Вторичные метаболиты В. subtilis ИБ-54 выделяли методом кислотного осаждения и экстракции 60% (о/о) метанолом [Шульга и др., 1990]. Грубый экстракт дополнительно очищали с помощью препаративной обратнофазовой хроматографии на гидрофобном сорбенте Silica С-18. Аминокислотный анализ очищенных метаболитов проводили стандартным методом постколоночной дериватизации на анализаторе Т339М.

Восходящую тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах (5x10 см) модифицированного силикагеля Kieselgel 60 F254 ("Merck") в системе растворителей н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода (12:4:6). Активные компоненты на хроматограмме выявляли с помощью биоавтографии [Блинов, Хохлов, 1970; Hyun et al., 1999].

Биологическую безопасность В. subtilis ИБ-54 изучали на лабораторных животных, полученных из питомника пос. Горный Чишминского р-на Республики Башкортостан. Вирулентность, токсичность и токсигенность оценивали на белых мышах массой 15-17 г, в соответствии с ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой». Сенсибилизирующее действие КЖ В. subtilis ИБ-54 и препарата на его основе исследовали в тесте активной кожной анафилаксии на 30 белобоких морских свинках массой 200-250 г. Реакцию гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) изучали на группе мышей путем их сенсибилизации [Хабриев, 2005]. ГЗТ оценивали по индексу воспалительной реакции. Острую и хроническую токсичность КЖ В. subtilis ИБ-54 определяли по стандартным методикам.

В качестве экспериментальной лекарственной формы использовали препарат в виде геля на основе карбопола (Ultres 21, "B.F. Goodrich Chemical Co.", Бельгия) с оптимизированным составом, содержащий жидкую культуру бактерий (титр >108 КОЕ/г). Активность разработанной формы в отношении дерматомицетов in vitro определяли методом предельных разведений. Оценку эффективности препарата in vivo проводили на модели дерматомикоза морских свинок в соответствии с методическими указаниями по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ [Хабриев, 2005].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ ORIGIN 7.0 SR0 и STATISTICA 6.1, используя параметрические и непараметрические методы анализа. Значимость различий оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни для малых выборок и t-критерия

Стьюдента. Достоверными считали различия между сравниваемыми выборками при уровне достоверной вероятности 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Штамм В. subtilis ИБ-54 был выделен и идентифицирован до вида в лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН. На основе рациональной фенотипической классификации бацилл штамм был отнесен к первой морфологической группе, включающей виды с эллипсовидными спорами, не раздувающими клетку [Gordon, 1973]. Результаты дифференциально-диагностических тестов показали наибольшее сходство штамма с видом В. subtilis. Филогенетический анализ на основе ПЦР и секвенирования гена, кодирующего 16S рРНК (1470 п.о.), позволил выявить высокую степень сходства (99%) с последовательностями представителей В. subtilis, доступными из банка данных EMBL/GenBank (NCBI). Прочитанная последовательность гена 16S рРНК В. subtilis ИБ-54 депонирована в генбанке EMBL под номером АМ765842.

Анализ плазмидного профиля В. subtilis ИБ-54 с использованием стандартных методик [Манниатис, 1984] показал отсутствие у штамма плазмид, что исключает возможность горизонтального переноса нетипичных свойств представителям аборигенной микробиоты кожи человека.

Рис. 1. Антимикотическая активность В. subtilis ИБ-54 и его экзометаболитов in vitro.

КД Цельная КЖ

о

I_! Отмытая биомасса

М. canis Т. gypseum Т. rubrum

Штамм проявлял высокую антагонистическую активность в отношении тестируемых видов дерматомицетов in vitro. При глубинном выращивании бактерий в синхронной культуре с дерматомицетами отмечалось полное подавление роста грибов. Высокие показатели активности В. subtilis ИБ-54 наблюдались и в условиях совместного роста с дерматомицетами на плотных питательных средах (рис. 1). Специфические особенности действия В. subtilis ИБ-54 заключались в задержке или подавлении развития М. canis и Т. gypseum на стадии прорастания спор и формирования ростковых трубок, тогда как у Т. rubrum - на стадии ветвления. При микроскопии отмечался сходный характер реакции грибов, заключающийся в нарушении прорастания спор и ветвления гиф, апикальном и интеркалярном формировании сферопластоподобных структур, отсутствии

Рис. 2. Влияние В. subtilis ИБ-54 на развитие дерматомицетов на границе зоны подавления их роста на КГА (7-е сутки). Увеличение х200. А - М. canis, Б - Т. gypseum, В - Т. rubrum. Стрелками обозначены сферопластоподобные структуры на гифах грибов.

Характер цитоморфологических изменений дерматомицетов свидетельствует о сходном механизме действия метаболитов штамма на различные виды этих грибов, приводящего к нарушениям структурно-функциональной целостности ЦПМ. Основными метаболитами бацилл, проявляющими такие свойства, являются соединения амфифильной природы, в особенности, циклические липопегггиды рУ^е^апа й а1„ 1985; БесИоуа, ЗуоЬоёоуа, 2008], что предполагает их существенную роль в антимикотической активности В. зиЬИШ ИБ-54.

При глубинном культивировании В. виЬиШ ИБ-54 его титр достигал максимального значения (>109) в интервале 18-24 ч, незначительно снижаясь в дальнейшем. Антимикотические соединения обнаруживались в среде через 12 ч от начала роста, однако существенное возрастание их концентрации начиналось после 36 ч и затем продолжалось в ходе всего дальнейшего цикла культивирования (рис. 3). Кривая накопления активных метаболитов в среде совпадала с началом процесса споруляции в бактериальных клетках.

Рис. 3. Динамика секреции антимикотических соединений (1), образования суммарного внеклеточного белка (2), рН культуральной среды (3) и процесса спорообразования клеток (4) в культуре яиЬНШ ИБ-54.

При статичном культивировании штамма его титр не превышал 10-20% от значений, достигаемых в условиях интенсивной аэрации (рис. 4). Уровень антимикотической активности экзометабоиитов из КЖ В. тЫШй ИБ-54 снижался, гто меньшей мере, в два раза по сравнению с активно аэрируемой

культурой. Таким образом, в условиях глубинной культуры аэрация способствует интенсификации роста и активности штамма.

1 ИБ-54, контроль

48 ч Т. &ряеит + ИБ-54

24 ч Т. ^уряеит + ИБ-54

ч Т. ^'ряеит + ИБ-54

24 ч М. сатч + ИБ-54

Титр В. subtilis ИБ-54, млн. КОЕ./мл

Рис. 4. Интенсивность роста В. subtilis ИБ-54 в монокультуре и в смешанных культурах с дерматомицетами при статическом выращивании. Начальный титр штамма составлял ~2,36х 107 КОЕ на 1 мл среды.

Нами были изучены также особенности роста В. subtilis ИБ-54 и биосинтеза им антимикотических соединений в бинарных, культурах с рядом дерматомицетов (рис. 4-5). Оценка активности штамма показала практически полное подавление роста дерматомицетов в синхронной культуре и при внесении бактерий после 24 ч предварительного роста грибов.

Как и в тестах на КГА (рис. 1), Т. gypseum был более устойчив к действию антагониста по сравнению с М. canis, что выражалось в резком увеличении роста мицелия в варианте, предварительно инкубированным в течение 2-х суток перед внесением В. subtilis ИБ-54. Показатели роста самого штамма в целом снижались 10-кратно с увеличением возраста и устойчивости дерматомицетов в бинарных культурах (рис. 4), что может быть обусловлено накоплением в среде антибактериальных метаболитов, либо исчерпанием источников углерода и энергии. В бинарных культурах штамма с дерматомицетами отмечалось некоторое повышение антимикотической активности метаболитов по сравнению с контролем, в особенности, против Т. rubrum (рис. 5). Инокуляция антагониста в более зрелые культуры дерматомицетов (48-72 ч) сопровождалась резким

снижением и элиминацией синтеза антимикотических экзометаболитов, несмотря на продолжающееся ингибирование роста дерматомицетов.

1 Т. гиЬгит I Т. §урзеит § М. сатз

81ИБ-54, контроль

в», 48 ч Г. &р5вит + ИБ-54

24 ч Т. ^ряеит + ИБ-54

¡ММИДД^ш» Оч

Т. ^уряеит, контроль

72 ч М. сапы + ИБ-54

О ч Т. '¿урзеит + ИБ-54

24 ч М. сат.ч + ИБ-54

О ч М. сашя + ИБ-54

ЩЯарщтм- М. сатз, контроль

о

ю

20

30 40 50 60 70 80

Степень ингибирования роста дерматомицетов, %

Рис. 5. Антимикотическая активность экзометаболитов в бинарных и монокультурах В. яиЫШя ИБ-54 и дерматомицетов.

Уровень антимикотической активности метаболитов, образуемых в

бинарных культурах, в значительной степени коррелировал с количественным выходом фракций липопептидов, выделяемых из КЖ кислотным осаждением (рис. 6). Таким образом, синтез антимикотических веществ в монокультуре исследуемого штамма был напрямую связан с показателями его роста. В то же время, в бинарных культурах штамма с грибами, несмотря на снижение титра бактерий, продукция активных метаболитов возрастала, что указывает на специфичность взаимодействия В. яиЫШя ИБ-54 с дерматомицетами.

Резкое снижение роста и активности исследуемого штамма при взаимодействии со зрелыми культурами дерматомицетов может объясняться накоплением в среде активных грибных метаболитов. Нами была изучена антибактериальная активность метаболитов из контрольных и бинарных культур дерматомицетов, выращенных в жидкой среде Сабуро, в отношении В. эиЫШз ИБ-54.

Рис. 6. Выход фракций метаболитов липопептидной природы при раздельном и смешанном культивирования дерматомицетов и В. виЬНШ ИБ-54. Обозначения: 1 - М. сам?;, контроль; 2 - 0 ч М саим + ИБ-54; 3 - 24 ч М. сап1ч + ИБ-54; 4 - 48 ч М. сап ¿я + ИБ-54; 5 - 72 ч М. сатх + ИБ-54; 6—7! Куряеит, контроль; 7 - 0 ч Т. ^урьеит + ИБ-54; 8 - 24 ч Т. ^ряеит + ИБ-54; 9 -48 ч Т. £урьеит + ИБ-54; 10-3. виЫШя ИБ-54, контроль.

Как видно из табл. 1, дерматомицеты в монокультуре продуцировали антибактериальные метаболиты, при этом М. сатз показывал более слабую активность, чем Т. §урвеит. Внесение В. зиЫШэ ИБ-54 на ранних стадиях развития Т. gypseum (0-24 ч) приводило к подавлению активности гриба; успевшая же развиться более зрелая культура (48 ч), по всей видимости, аккумулировала антибактериальные вещества, приводящие к частичному подавлению роста и активности антагониста.

Таблица 1. Активность внеклеточных метаболитов из контрольных и смешанных культур дерматомицетов в подавлении роста В. тЬНШ ИБ-54

Культура Диаметр зоны ингибирования В. subtilis ИБ-54, мм

М. canis, контроль 11,1±0,5

0 ч М. canis + ИБ-54 нет активности

24 ч М. canis + ИБ-54 нет активности

48 ч М. canis + ИБ-54 нет активности

72 чМ canis + ИБ-54 нет активности

Т. gypseum, контроль 16,8±1,7

0 ч Т. gypseum + ИБ-54 нет активности

24 ч Т. gypseum + ИБ-54 нет активности

48 ч Т. gypseum + ИБ-54 14,0±0,6

Слабо выраженная активность М. canis полностью подавлялась в присутствии антагониста вне зависимости от времени его внесения (табл. 1). Тестирование поверхностных культур дерматомицетов, выросших на КГ А, методом агаровых блоков подтвердило синтез метаболитов, активных в отношении 5. suhtilis ИБ-54, исследуемыми штаммами Т. gypseum и Т. rubrum, в то время как М. canis таких веществ не продуцировал. Полученные данные свидетельствуют о наличии слабой антибактериальной активности у Т. gypseum и Т. rubrum, что может обуславливать их более высокую устойчивость к действию В. subtilis ИБ-54 по сравнению с М. canis.

Для сравнительной оценки состава активных вторичных метаболитов, осаждаемых кислотой из совместных культур, мы проводили их ТСХ (рис. 7). Совместные культуры штамма с М. canis характеризовались присутствием двух сходных пептид-содержаших компонентов со значениями коэффициентов относительной подвижности 0,60-0,63 и 0,54-0,56, соответственно. В совместных культурах В. subtilis ИБ-54 с Т. gypseum, как и в контроле бактерий, обнаруживались аналогичные два пептид-содержащих компонента, проявляемые в виде четко дифференцируемых пятен с соответствующими коэффициентами подвижности Rf~0,60-0,61 и 0,52-0,53 (рис. 7). Интенсивность и размер этих пятен были сопоставимы с уровнем продукции антимикотических соединений бациллами в бинарных культурах.

Рис. 7. ТСХ липопептидных фракций активных метаболитов, выделяемых из контрольных и бинарных культур В. 5иЫШз ИБ-54 и дерматомицетов. 1 - контроль М. canis; 2-5 - соответственно 0, 24, 48 и 72 ч М. сяи«+ИБ-54; 6 - контроль Т. ^ряеищ-, 7-9 - соответственно 0, 24 и 48 ч Т. ^ур5еит +ИБ-54; 10 - контроль В. ¡иЫШя ИБ-54.

При взаимодействии штамма с 48-ч культурой Т. %урзеит пептид-содержащие метаболиты не обнаруживались, как и в контроле гриба, что подтверждается отсутствием роста и активности В. аиЬНШ ЙБ-54 в этих условиях (рис. 7). Полученные результаты свидетельствуют о сходстве в природе активных метаболитов, образуемых В. киЪЧИх ИБ-54 при росте в монокультуре и при взаимодействии с дерматомицетами.

С целью достижения высоких показателей титра и активности штамма В. йиЫШз ИБ-54 при глубинном культивировании мы оценивали влияние источников углерода и азота на его рост. Наиболее высокая плотность клеток в КЖ В. яиЫШх ИБ-54 наблюдалась при его выращивании в базовой синтетической среде с глицерином и достигала свыше 2 млрд. КОЕ/мл. Другие легкоусвояемые источники углерода обеспечивали заметно более низкие значения титра бактерий. Оценка влияния концентрации глицерина в питательной среде на рост и продукцию антимикотических соединений В. яиЬНШ ИБ-54 не выявила четко прослеживаемой зависимости. Максимальный рост культуры наблюдался при концентрациях субстрата 0,51,0%, тогда как секреция активных метаболитов продолжала, хотя и незначительно, возрастать с увеличением его содержания вплоть до 4,0% масс. При изучении влияния источников азота В. зиЬИНя ИБ-54 выращивали в средах с 0,5% глицерина и варьируемым содержанием пептона, дрожжевого и кукурузного экстрактов. Наиболее интенсивный рост бактерий Пц [КОЕ/мл]~ 9,8) наблюдался при суммарной концентрации источников органического азота в интервале 1,0-3,0% масс. Продукция штаммом активных метаболитов достигала максимума в диапазоне 1,0-2,0% источников азота. Замена органических источников азота на минеральные (двухзамещенный фосфорнокислый аммоний или нитрат калия) приводила к прекращению роста штамма и элиминации его активности. Полученные результаты демонстрируют существенное влияние природы и концентрации источников азота на синтез антимикотических соединений В. япЬИНя ИБ-54.

Фракцию активных метаболитов из культуральной среды В. зиЫШх ИБ-54 выделяли, используя известную методику, основанную на кислотном осаждении липопептидов и биоПАВ. По результатам первичного осаждения удавалось выделить 60-70% от первоначального объема активных веществ. Однократная экстракция промытого осадка 60%-ным (о/о) раствором

метанола позволяла получить не менее 2/3 суммарного объема активных компонентов. ТСХ-анализ метанольного экстракта показывал присутствие в нем от 3 до 4 четко различимых пептид-содержащих компонентов, выявляемых нингидрином. При препаративной обратнофазовой хроматографии экстракта в системе метанол - вода (60:40) антигрибные вещества полностью связывались с сорбентом, тогда как вещества с антибактериальной активностью выходили с элюентом (рис. 8). Дальнейшее ступенчатое повышение содержания метанола до соотношения 90:10 приводило к элюции адсорбированных соединений (рис. 8)._

ОП,

-Белок в ед. ОП

*.....Антибактериальная активность

- о — Антигрибная активность Градиент 60-90% МеОН

Объем элюирования, мл Рис. 8. Препаративная жидкостная гидрофобная хроматография метанольного экстракта (60%) фракции метаболитов, осажденных 2 M НС1 из КЖБ. subtilis ИБ-54 на колонке (1,5 х 20 см) с Silica С-18.

Оценка устойчивости антигрибных соединений к протеолитическим ферментам показала, что они не могут быть отнесены к антибиотикам чисто белковой или пептидной природы, многие из которых чувствительны к действию протеаз [Katz and Demain, 1977; Lisboa et al., 2006; Захарченко и др., 2007]. Метаболиты В. subtilis ИБ-54 практически полностью сохраняли активность при обработке различными протеазами. Следует отметить, что пептидный компонент циклических липопептидов может быть устойчив к прогеолизу в силу жесткости пептидного цикла и наличия в нем как

необычных аминокислот, так и стереоизомеров аминокислот в D-конфигурации [Stein, 2005]. В отличие от многих соединений полипептидной природы, антимикотические метаболиты В. subtilis ИБ-54 были стабильны при повышенной температуре. Рост-ингибирующая активность метанольного экстракта из ЮК штамма достоверно возрастала после 1 ч инкубации при 100°С, дальнейшее его выдерживание в течение 5 ч приводило к снижению оригинальной активности лишь на 25-30%. Результаты аминокислотного анализа очищенной фракции показали присутствие в ней посторонних примесей, поскольку содержание суммы аминокислот в гидролизате исследуемого препарата в пересчете на сухой вес составляло около 16,3%-масс. По соотношению доминирующих аминокислот (лейцин: глутаминовая кислота: валин: треонин: фенилаланин: аспарагиновая кислота, 2:1,01:0,91:0,61:0,58:0,51) метаболиты В. subtilis ИБ-54 близки к сурфактинам и лихенизинам [Yakimov, 1999; Seydlova, Svobodova, 2008], однако большие количества треонина и фенилаланина указывают на присутствие в этой смеси и других пептидных соединений, поскольку эти аминокислоты не были выявлены ранее у всех известных классов циклических липопептидов бацилл. Общая молекулярная масса обнаруженных аминокислот, характерных для структуры известных липопептидов бацилл, составляет 1150,24 Да, что близко среднему значению Mw смеси различных циклических липопептидов (-1015 Да).

Анализ концентрационных кривых ингибирования различных видов дерматомицетов суммарной изолированной фракцией липопептидов из монокультуры В. subtilis ИБ-54 выявил наиболее высокую чувствительность У Т. gypseum с дальнейшим ее снижением у М. canis и Т. rubrum (рис. 9). Минимальная ингибирующая концентрация выделенных метаболитов В. subtilis ИБ-54 находилась в интервалах 2,5-5, 5-10 и 22-25 мкг/мл для Т. gypseum, М. canis и Т. rubrum, соответственно. Существенно разнились и показатели эффективной концентрации 50%-ного ингибирования (ЭД50), составляя 10-12, 50-55 и 220-240 мкг/мл для тех же грибов.

На этапе доклинических испытаний В. subtilis ИБ-54 предваряющим шагом являлась его стандартная токсико-фармакологическая характеристика [Хабриев, 2005]. Проведенные испытания показали, что введение различных доз живой культуры и ее метаболитов, не вызывало у животных каких-либо

признаков патологических изменений регистрируемых клинически, что

свидетельствует об отсутствии у штамма вирулентных, токсичных и

токсигенных свойств (табл. 2). 100-,

- М. стт о—Т. £урвеит Т. гиЬгит

50 100 150 200 250 300

Концентрация метаболитов В. яиЫИи ИБ-54 в КГ А, мкг/мл

Рис. 9. Зависимость степени подавления дерматомицетов от содержания липопептидных метаболитов В. .чиЬггНз ИБ-54 в плотной питательной среде.

Таблица 2. Оценка биологической безопасности В. БиЫШз ИБ-54

Вирулентность Токсичность Токсигенность

Титр Кол-во Титр Кол-во Вводимая доза Кол-во

вводимой живых/ вводимой живых/ супернатанта, живых/

ДОЗЫ, павших дозы х109 павших мл павших

х109 мышей КОЕ/ мл мышей мышеи

КОЕ/ мл

1 5/0 0,5 5/0 0,5 5/0

5 5/0 1,0 5/0 1,0 5/0

10 5/0 2,0 5/0 5/0

В экспериментах по определению острой токсичности при

однократном внутрибрюшшшом введении терапевтической и 100-кратной

терапевтической дозы КЖ В. хиЫШз ИБ-54 гибели животных не

наблюдалось. Общее состояние и масса тела мышей опытных и контрольных

групп не отличались. Двигательная активность и исследовательский рефлекс

у испытуемых животных оставались в пределах нормы. В гемограмме

животных отклонений не было выявлено.

19

Результаты изучения хронической токсичности свидетельствуют о том, что введение препаратов на основе В. subtilis ИБ-54 в форме накожных аппликаций в терапевтической дозе не вызывает существенных отклонений в физиологическом состоянии животных. Изучение реакции гиперчувствительности «замедленного» типа показало, что в контроле индекс реакции составил 1,5%, в опыте - 2,8 %. В обеих группах индекс воспалительной реакции не выходил за рамки положительной реакции (5,0 %), что свидетельствует об отсутствии аллергического действия у штамма.

Экспериментальная гелевая лекарственная форма на основе В. subtilis ИБ-54 показывала высокую активность против дерматомицетов in vitro, например, при 10-кратном разведении геля наблюдалось полное подавление роста всех тестируемых грибов. Препарат сохранял высокие показатели активности при разведениях до 10"7 - 10"8 (табл. 3). По оценке жизнеспособности клеток ИБ-54 в геле после 1 года хранения при +5°С отмечено общее снижение их титра на один порядок, что не является критичным для активности препарата (табл. 3).

Эффективность экспериментальной лекарственной формы на основе В. subtilis ИБ-54 изучали in vivo - на модели зоофилыюй трихофитии морских свинок, используя в качестве возбудителя Т. gypseum.

Таблица 3. Динамика изменения титра и антимикотической активности гелевого препарата на основе В. suЪtilis ИБ-54_

Тест-объект Титр культуры В. subtilis ИБ-54 в геле, lg КОЕ/г

0 мес. 1 мес. 2 мес. 3 мес. 6 мес. 12 мес.

8,00 I 7,97 8,00 7,50 7,81 7,24

Диаметр зоны подавления роста грибов при разведении геля в 107, мм

0 мес. 1 мес. 2 мес. 3 мес. 6 мес. 12 мес.

М. canis Т. gypseum Т. rubrum HP* HP* HP* HP* 31,5±0,7 23,0±1,4 НД** HP* 32,5±3,5 27,5±3,5 35.011.4 37.513.5 25,0±2,8 31,5i2,l 29,Oil,4 21,5±2,1 27,5±3,5 23,5±3,5

*Нет роста гриба; **Нет данных.

В течение срока наблюдения в группах, получавших профилактическое лечение исследуемым препаратом и экзодерилом, больные животные не были выявлены. В контрольной группе заболели все животные. Лечение препаратами начинали через 7 суток от начала заражения, при

возникновении и развитии инфекционного процесса (табл. 4). В группах, получавших лечение гелем на основе В. subtilis ИБ-54 и экзодерилом, на 21-е сутки (от начала лечения) наступало излечение всех животных, тогда как в группе плацебо больные животные оставались до 30 суток (табл. 4).

Результаты доклинических испытаний свидетельствуют, что эффективность гелевой формы на основе В. subtilis ИБ-54 сравнима с результатами применения коммерческого синтетического препарата Экзодерил. Препарат, содержащий жидкую культуру антагониста, проявляет противогрибковую активность in vitro и in vivo. Штамм, высеваемый из препарата, сохраняет основные признаки и уровень антагонистической активности в отношении дерматомицетов.

Таблица 4. Сроки выздоровления животных, зараженных Т. gypseum

Группа 7-е сутки, 14-е 21-е 28-е сутки, 30-е

животных 02.06.09 сутки, сутки, 23.06.09 сутки,

09.06.09 16.06.09 25.06.09

больные/ больные/ больные/ больные/ больные/

здоровые здоровые здоровые здоровые здоровые

1-я контрольная 8/0 8/0 6/2 4/4 4/4

2-я опытная 8/0 5/3 3/5 0/8 0/8

3-я сравнения 8/0 4/4 4/4 0/8 0/8

(экзодерил)

Результаты проведенной работы подтверждают биологическую безопасность штамма В. зиЬНШ ИБ-54 и его потенциал в разработке технологии получения отечественного антимикотического средства, что позволяет рекомендовать препараты на его основе для дальнейшего изучения и внедрения в медицинскую практику.

Выводы

1. Штамм В. чиЬИШ ИБ-54 проявляет конститутивную способность к синтезу антимикотических соединений, специфически изменяющемуся при взаимодействии с различными видами дерматомицетов. Одним из факторов снижения чувствительности в ряду М. си/ш, Т. gypseum и Т. гиЬгит к В. тебй"/« ИБ-54 является их способность к продукции антибактериальных веществ.

2. Основную роль в подавлении дерматомицетов штаммом В. subtilis ИБ-54 играет комплекс амфифильных соединений липопептидной природы, содержащий вещества по химическому строению пептидного компонента близкие к сурфактинам.

3. Наиболее высокий уровень роста и продукции антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54 наблюдается в присутствии 0,5-1,0% масс, глицерина и 1,0-2,0% масс, дрожжевого и кукурузного экстрактов.

4. Разработан состав экспериментальной лекарственной формы на основе В. subtilis ИБ-54, которая стабильна при хранении в течение 12 месяцев и по лечебной эффективности in vivo сравнима с коммерческим синтетическим препаратом.

5. Штамм В. subtilis ИБ-54 и экспериментальный препарат на его основе не обладают токсическими, токсигенными и аллергизирующими свойствами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Лукманова К.А., Гиззатуллина C.B., Магазов Р.Ш., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Актуганов Г.Э. Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus в отношении грибов дерматофитов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 4. - С. 21-23.

2. Гиззатуллина C.B., Лукманова К.А., Галимзянова Н.Ф., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э., Ефимов Г.Е., Салихова Н.Х., Кайданек Т.В. Оценка токсико-фармакологических свойств нового противогрибкового средства, содержащего штамм Bacillus subtilis ИБ-54 // Медицинский вестник Башкортостана. - 2010. - № 6. - С. 92-95.

3. Усманов В .И., Галимзянова Н.Ф., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э., Гиззатуллина C.B., Лукманова К.А. Особенности биосинтеза антимикотических соединений штаммом Bacillus subtilis ИБ-54 -антагонистом грибов-дерматофитов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - № 1. - С. 231.

Публикации в других изданиях и материалах конференций

4. Актуганов Г.Э., Галимзянова Н.Ф., Мелентьев А.И., Лукманова К.А., Гиззатуллина C.B. Исследование влияния источника углерода в питательной среде на проявление антагонистических свойств штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к грибам - возбудителям дерматомикозов // Успехи медицинской микологии: материалы пятого всероссийского конгресса по медицинской микологии. - Москва, 2007. - С. 274-276.

5. Гиззатуллина C.B., Лукманова К.А. Разработка биопрепарата для профилактики и лечения дерматомикозов на основе Bacillus subtilis ИБ-54 и изучение его безопаности // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы всероссийской научно-практической конференции. - Пермь, 2008. - С. 149-151.

6. Гиззатуллина C.B., Зайнутдинова Ф.Н., Салихова Н.Х. Новые лекарственные формы иммунобиологических препаратов // Материалы научно-практической конференции молодых ученых ММА им. И.М. Сеченова. Приложение к журналу «Вестник РАМН», 2008, № 6, С. 106.

7. Галимзянова Н.Ф., Актуганов Г.Э., Гиззатуллина C.B., Гильванова Е.А, Лукманова К.А., Мелентьев А.И. Использование бактерий-антагонистов Bacillus subtilis в качестве основы антимикотического препарата для лечения дерматомикозов // Материалы П Санкт-Петербургского международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье человека», 0104.07.2008. - СПб.: Вестник Российской военно-медицинской академии, 2008, № 3, Вып. 23. Приложение 2. Часть 2. С. 306-307.

8. Лукманова К.А., Гиззатуллина C.B.,. Галимзянова Н.Ф, Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И., Трофимов В.А. Изучение безопасности антимикотического штамма Bacillus subtilis //«Современная микология в России». Материалы 2-го Съезда микологов России. Том 2 (548 е.). М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 296-297.

Подписано в печать 16.12.2011. Бумага офсетная. Формат 60x84 Гарнитура «Тайме». Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1. Тираж 100. Заказ 157.

Типография Уфимского государственного нефтяного технического университета Адрес издательства и типографии: 450062, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гиззатуллина, Светлана Вадимовна, Уфа

61 12-3/455

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН

На правах рукописи

ГИЗЗАТУЛЛИНА СВЕТЛАНА ВАДИМОВНА

АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS ИБ-54 К ДЕРМАТОМИЦЕТАМ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В РАЗРАБОТКЕ АНТИМИКОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе

бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Д.м.н., с.н.с. Лукманова К.А. К.б.н. Актуганов Г.Э.

Уфа-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

__V _

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ..............................................9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................10

1.1. Антагонистическая активность аэробных спорообразующих бактерий как одна из форм взаимоотношений с мицелиальными грибами............10

1.2. Основные механизмы подавления роста и развития микромицетов бациллами-антагонистами...........................................................15

1.3. Опыт практического применения бацилл-антагонистов в медицине.................................................................................20

1.4. Лекарственные формы на основе бацилл для наружного применения..............................................................................23

1.5. Актуальность биологического контроля дерматомицетов микробами-антагонистами и их метаболитами.................................................24

1.5.1. Возбудители дерматомикозов и проблемы борьбы с ними........24

1.5.2. Особенности экологии дерматомицетов и факторы их патогенности........................................................................28

1.5.3. Биологическая активность микробов-антагонистов в отношении дерматомицетов.....................................................................30

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................................33

2.1. Объекты исследований..........................................................33

2.2. Методы и условия хранения и поддержания бактериальной культуры и дерматомицетов......................................................................34

2.3. Условия глубинного культивирования бактерий..................................34

2.4. Определение общего белка......................................................35

2.5. Изучение генотипических свойств В. йиЫШБ ИБ-54......................35

2.6. Анализ антагонистической активности штамма В. зиЫШз ИБ-54 в отношении патогенных бактерий и дерматомицетов...........................37

2.7. Световая микроскопия...........................................................38

2

2.8. Оценка влияния параметров культивирования на рост и продукцию антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54................................38

2.9. Очистка и аминокислотный анализ фракции активных метаболитов В. subtilis ИБ-54............................................................................39

2.10. Характеристика физико-химических и биологических свойств антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54.................................40

2.11. Определение чувствительности В. subtilis ИБ-54 к антибиотикам...........................................................................42

2.12. Изучение биологической безопасности штамма Я subtilis ИБ-54....43

2.13. Разработка состава и технологии экспериментальной лекарственной формы наружного применения на основе В. subtilis ИБ-54.....................44

2.14. Изучение специфической активности разработанного гелевого препарата на основе В. subtilis ИБ-54 in vitro......................................45

2.15. Методы изучения стабильности экспериментального препарата при хранении.................................................................................45

2.16. Оценка эффективности экспериментальной лекарственной формы in vivo (доклинические испытания)...................................................46

2.17. Статистическая обработка результатов.....................................47

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................48

3.1. Фенотипическая и генотипическая характеристика В. subtilis ИБ-54..48

3.2. Антимикотическая активность В. subtilis ИБ-54 и особенности его антагонистического действия на дерматомицеты...............................52

3.3. Антагонизм В. subtilis ИБ-54 в отношении представителей патогенной и условно патогенной микробиоты................................................58

3.4. Антагонистические взаимоотношения В. subtilis ИБ-54 с таксономически близкими и отдаленными штаммами бацилл...............59

3.5. Рост и биосинтез антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54

в монокультуре и в бинарных культурах с дерматомицетами................61

3.5.1. Специфика совместного развития и антагонистической

активности В. subtilis ИБ-54 и дерматомицетов..................................68

з

3.6. Влияние природы и концентрации источников углерода на рост и антимикотическую активность В. subtilis ИБ-54.................................74

3.7. Влияние источников азота на рост и синтез антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54.........................................................77

3.8. Выделение и характеристика антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54........................................................................................80

3.9. Устойчивость В. subtilis ИБ-54 к антибиотикам.............................87

3.10. Биологическая безопасность штамма В. subtilis ИБ-54 как потенциальной основы препаратов наружного действия для лечения дерматомикозов........................................................................89

3.10.1. Характеристика вирулентных, токсигенных и токсичных свойств изучаемого штамма.........................................................89

3.10.2. Острая и хроническая токсичность В. subtilis ИБ-54................91

3.9.3. Оценка аллергенных свойств штамма и препарата на его основе.................................................................................93

3.11. Разработка гелевой лекарственной формы на основе В. subtilis ИБ-54 для профилактики и лечения дерматомикозов...................................94

3.11.1. Обоснование состава геля и подбор основных компонентов....94

3.11.2. Стабильность экспериментальной лекарственной формы при хранении.....................................................................95

3.11.3. Эффективность экспериментальной лекарственной формы in vitro и in vivo..............................................................................97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................100

ВЫВОДЫ..................................................................................103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................104

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время, в связи с резким увеличением заболеваемости микозами, возросла потребность в разработке новых эффективных и безопасных антимикотических средств. Одно из ведущих мест среди микотических инфекций занимают дерматомикозы [65]. Основную роль в терапии дерматомикозов играют достаточно токсичные синтетические препараты, интенсивное применение которых приводит к побочным эффектам и возникновению резистентности патогенных грибов. Таким образом, целесообразность поиска новых методов и подходов к лечению дерматомикозов очевидна. В практическом здравоохранении все более широко применяются биопрепараты (пробиотики) на основе бактерий рода Bacillus [55, 69]. Значительный интерес представляет опыт использования бацилл в составе наружных препаратов для заживления ран и ожогов [1, 8, 13, 20, 25, 34, 38, 82, 83, 94, 144]. Данный аспект, в сочетании с обнаруженной способностью некоторых штаммов В. subtilis подавлять развитие дерматомицетов, представляется перспективным для разработки наружных средств профилактики и лечения дерматомикозов.

В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение антимикотической активности штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к дерматомицетам и его возможности/потенциала в создании биопрепарата для профилактики и лечения дерматомикозов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Исследовать антимикотическую активность и особенности антагонистического взаимодействия штамма В. subtilis ИБ-54 с клиническими штаммами дерматомицетов различной таксономической принадлежности - Trichophyton rubrum, Т. gypseum и Microsporum canis.

2. Выявить факторы антимикотического действия В. subtilis ИБ-54 и охарактеризовать их физико-химические и биологические свойства.

3. Изучить влияние ряда параметров культивирования на особенности роста и продукции антимикотических соединений штаммом В. subtilis ИБ-54.

4. Разработать на основе В. subtilis ИБ-54 состав (рецептуру) лекарственной формы для наружного применения при дерматомикозах и оценить ее биологическую активность в доклинических испытаниях.

5. Изучить токсико-фармакологические свойства штамма В. subtilis ИБ-54 и биопрепарата на его основе.

Научная новизна. Впервые показана высокая конститутивная антимикотическая активность штамма В. subtilis ИБ-54 в отношении клинических штаммов дерматомицетов. Обнаружена специфичность в синтезе антимикотических веществ В. subtilis ИБ-54 при взаимодействии с дерматомицетами in vitro, тогда как проявление его действия на различные виды грибов имеет сходный характер. Установлена ключевая роль циклических липопептидов в антагонизме В. subtilis ИБ-54 к дерматомицетам. Выявлено, что одним из факторов устойчивости/конкурентоспособности грибов рода Trichophyton к бактериям-антагонистам является способность к синтезу антибактериальных веществ. Определена антибактериальная активность В. subtilis ИБ-54 к клиническим штаммам патогенных и условно патогенных бактерий. Впервые разработана лекарственная форма препарата на основе штамма В. subtilis ИБ-54 для профилактики и лечения дерматомикозов.

Практическая значимость работы. Изучены условия максимального роста и продукции антигрибных соединений в глубинной периодической культуре В. subtilis ИБ-54, которые могут быть использованы в разработке технологии создания многофункциональных биопрепаратов на основе этого штамма. Высокие продукционные характеристики исследуемого штамма позволяют применять его для направленного получения известных циклических липопептидов, относящихся к различным гомологическим группам (сурфактины, итурины и т.д.).

Обоснована возможность создания нового препарата наружного применения для профилактики и комплексного лечения поверхностных дерматомикозов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штамм В. subtilis ИБ-54 проявляет высокую антагонистическую активность к клиническим штаммам дерматомицетов различных таксономических групп, показывая сходство в общем механизме их подавления.

2. Антимикотическая активность В. subtilis ИБ-54 к дерматомицетам обусловлена в основном синтезом липопептидных веществ, близких по строению к циклическим липопептидам класса сурфактина с примесями других функционально активных компонентов.

3. Продукция антимикотических соединений В. subtilis ИБ-54 имеет конститутивный характер, но может специфически усиливаться при непосредственном взаимодействии с различными видами дерматомицетов.

4 Источники органического азота способствуют значительному повышению синтеза антимикотических соединений в периодической культуре В. subtilis ИБ-54.

5. Опытная лекарственная форма на основе жидкой культуры В. subtilis ИБ-54 показывает высокую активность в подавлении дерматомицетов in vitro, стабильна при хранении и сравнима по эффективности in vivo с коммерческим синтетическим препаратом.

6. Штамм В. subtilis ИБ-54 и препарат на его основе не проявляют вирулентности, токсических, токсигенных и сенсибилизирующих свойств в доклинических испытаниях.

Работа выполнена в филиале «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и CP РФ, а также в Институте биологии Уфимского научного центра РАН.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Пятом Всероссийском конгрессе по медицинской

7

микологии (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов» (Пермь, 2008), Пятой конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Втором международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008) и Втором съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 научных работ, в том числе - 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), объектов и методов исследований (глава 2), результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 205 ссылок, из них 83 - на русском языке. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и 21 таблицу.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. КА - картофельный агар

2. КГА - картофельно-глюкозный агар

3. МПА - мясопептонный агар

4. КЖ - культуральная жидкость

5. ГЗТ - гиперчувствительность «замедленного» типа

6. ТСХ - тонкослойная хроматография

7. РАП - редкосшитый акриловый полимер

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антагонистическая активность аэробных спорообразующих бактерий как одна из форм взаимоотношений с мицелиальными грибами

Формирование современных представлений о характере и

разнообразии микробных взаимоотношений в немалой степени происходило

и отталкивалось от изучения и терминологии экологии макроорганизмов

[170]. Несмотря на то, что представления о таких формах природных

взаимоотношений как мутуализм, протокооперация, комменсализм,

нейтрализм, конкуренция, аменсализм, паразитизм и хищничество возникли

и развивались в рамках макроэкологии, все перечисленные примеры

взаимодействий обнаружены и у микроорганизмов. Необходимость

понимания особенностей микробной экологии стала очевидной с развитием

теоретических основ и прикладных аспектов биологического контроля

болезней растений, в особенности, экономически значимых

сельскохозяйственных культур. Антагонизм в широком смысле является

одной из основополагающих форм природных взаимоотношений,

противоположных по своей сути разнообразным проявлениям мутуализма и

нейтрализма. Эта форма взаимоотношений, как на уровне макроэкологии, так

и микроэкологии, охватывает такие понятия, как конкуренция, аменсализм,

аллелопатия, паразитизм, хищничество и т.п. [170]. Однако микробный

антагонизм в его узко-классическом понимании определяется как подавление

развития одних групп микроорганизмов другими вследствие образования и

секреции в окружающую среду специфических и/или неспецифических

антимикробных веществ. В настоящее время характер антагонистических

взаимоотношений бактерий и микромицетов все чаще рассматривается в

контексте триады макроорганизм (растение-хозяин) - патоген (гриб) -

микробный антагонист [134, 198]. Отмеченное разнообразие подобных

взаимоотношений позволяет выделить несколько вариантов антагонизма

ю

бактерий, в том числе бацилл, к мицелиальным грибам: 1) прямой (направленный) антагонизм; 2) смешанный тип антагонизма; 3) косвенный (пассивный) антагонизм. Для проявления направленного типа антагонизма требуется непосредственный физический контакт антагониста с патогеном, и основными примерами такого взаимодействия являются хищничество или сверхпаразитизм. Хотя подобные эффекты описаны в основном для грибов [154, 195, 197, 203], к аналогичным типам фенотипического поведения можно отнести многочисленные варианты бактериальной микофагии, т.е. способности бактерий активно расти и размножаться исключительно за счет использования питательных веществ, полученных из клеток живых микромицетов [150]. Проявления некротрофной и биотрофной микофагии обнаружены у различных видов грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе бацилл (табл. 1.1). Для косвенного антагонистического действия прямой контакт бактерий с микромицетами не обязателен, одним из ярких примеров такого эффекта может быть индукция системной устойчивости и других защитных механизмов у растения-хозяина, приводящая к подавлению или задержке развития фитопатогенного гриба (табл. 1.2). В естественных условиях многие бактерии-антагонисты, в том числе бациллы, зачастую используют множественные механизмы контактного и дистанционного взаимодействия с микромицетами. Антагонизм классического типа широко распространен среди аэробных спорообразующих бактерий и наиболее подробно описан для представителей В. subtilis [68, 117, 174, 182, 183]. Способность подавлять рост микромицетов часто встречается и у видов В. amyloliquefaciens, В. brevis, В. cereus, В. licheniformis, В. megaterium, В. mycoides и В. pumilus [37, 90, 158, 165, 173, 205]. Антагонизм к микромицетам менее характерен для рода Paenibacillus, хотя отдельные штаммы P. polymyxa, P. macerans, P. illinoisensis и ряд других видов этого рода могут показывать высокую антигрибную активность in vitro [99, 103, 139, 158, 175, 199].

Таблица 1.1. Представители аэробных спорообразующих бактерий с доказанной и предполагаемой способностью к

микофагии в отношении различных грибов (по [150]).

Вид/штамм бактерий Среда обитания1 Подтверждение способности к микофагии Гриб(ы) - объекты воздействия Ссылка

В. cereus, В. megaterium Почвы, искусственно зараженные Fusarium oxysporum f. sp. cúbense Прямое выделение гало-формирующих бактериальных колоний на минеральной солевой среде, содержащей живой гриб в качестве единственного источника углерода Fusarium oxysporum f. sp. cúbense Mitchell and Alexander (1961)

В. thuringiensis Не указана Локальное разрушение грибных клеточных стенок, потеря протоплазмы Fusarium roseum var. sambucinum Cherif et al. (2002)

Paenibacillus polymyxa Почва Прикрепление бактерий к грибным гифам в двойной культуре и накопление на них Fusarium oxysporum Dijksterhuis et al. (1999)

Paenibacillus sp. Микоризосфера