Молекулярные механизмы антиаритмической активности лекарственных препаратов

Фарафонтова, Екатерина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы антиаритмической активности лекарственных препаратов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы антиаритмической активности лекарственных препаратов"

На правах рукописи

ФАРАФОНТОВА ЕКАТЕРИНА ИВАНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Уфа-2013

005543608

Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Вахитова Юлия Венеровна доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор кафедры генетики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Иваненков Ян Андреевич кандидат биологических наук,

преподаватель кафедры инновационной фармацевтики и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского физико-технического института (Государственного университета)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Официальные оппоненты

Ким Александр Иннокентьевич

Защита диссертации состоится «¿Я_» декабря 2013 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «15 » itoofyu? 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нарушения ритма сердца - одно ш наиболее частых и тяжелых осложнений различных сердечно-сосудистых заболеваний. Известно, что более чем у 90% пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, возникают опасные для жизни нарушения ритма сердечных сокращений, которые могут привести к фибрилляции и внезапной остановке сердца (Каверина, 1986). В настоящее время антиаритмическая фармакотерапия является основным методом лечения нарушений сердечного ритма (Фогорос, 2009). Несмотря на появление большого количества антиаритмических препаратов, новых методов диагностики и схем фармакотерапии, достаточного эффекта от применения антиаритмической терапии до сих пор не получено. По данным мультицентровых исследований, эффективность противоаритмнческих препаратов составляет 50-70% (Touboul, 1990; Wys.c et ai., 2001; Каверина и созвт., 2007; Гиляров, Сулимов, 2009; Piccini et al., 2009), при этом отмечается их недостаточная эффективность в купировании аритмий и профилактике их рецидивов. Отдельной проблемой представляется наличие у многих известных и широко применяемых в медицинской практике антиаритмических средств (хинидин, новокаинамид, пропранолол, амиодарон, соталол, верапамил) аритмогенного действия (Бобров, Крушювицкая, 1991; Дощицын, 1993; Алперт, Фрейсис, 1994). Риск развития аритмогенного эффекта, по данным ряда авторов, составляет около 10% для большинства антиаритмических средств и чаще встречается у больных с сердечной недостаточностью в стадии декомпенсации и с нарушениями функции левого желудочка (Gorgeles et al., 1992; Сметнева и соавт. 1993). В этой связи разработка новых эффективных и безопасных антиаритмических средств, основанная на знаниях о молекулярных основах патогенеза аритмий, а также изучение механизмов их действия является актуальной задачей.

5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.026]декан-4-он (лабораторный шифр Р11) -синтезирован и фармакологически изучен в ФГБУН Институте органической химии УНЦ РАН (Горпинченко и др., 2005; Петров и др., патент РФ № 2281938, 2006). Выбор соединения в качестве объекта исследования обусловлен его высокой биологической активностью, установленной в доклинических исследованиях in vivo, а главное, сложным фармакологическим спектром, включающим антиаритмические, противовоспалительные, анальгетические и ноотропные свойства. Проведенные исследования показали, что соединение проявляет выраженную активность в трёх экспериментальных моделях аритмии, воспроизводящих различные нарушения ритма сердца, включая наиболее опасную для жизни - фибрилляцию. Соединение по

выраженности антиаритмического действия превосходит большинство известных антиаритмических средств и нетоксично.

Лекарственное средство аллапинин (лаппаконитина гидробромид) был разработан в Институте химии растительных веществ АН Узбекской ССР в конце 70-х годов XX века и в настоящее время успешно применяется в медицине в качестве аптиаритмического средства. Препарат проявляет высокую активность при различных формах нарушений ритма сердца, особенно при различных формах желудочковых аритмий, пароксдамальной мерцательной аритмии и при хронической монофокусной предсердной тахикардии (Джахангиров и др., 1987; Соколов, Джахангиров, 2002).

Изучение молекулярных механизмов формирования биологической активности лекарственных препаратов является приоритетной задачей фундаментальных фармакологических исследований, как на этапе доклинического отбора новых потенциальных лекарственных средств, так и для характеристики спектра действия уже применяющихся препаратов. С этой точки зрения большой интерес представляет изучение молекулярных механизмов формирования антиаритмической активности и оценка кардиотоксичности оригинальных и ранее известных препаратов. Данная работа посвящена исследованию механизмов действия веществ с антиаритмической активностью - оригинального соединения 5-амино-экзо-З-азатрицикло [5.2.1.02'6] декан-4-она и используемого в клинической практике препарата аллапинин. Следует подчеркнуть, что в доступной нам литературе сведения о молекулярных механизмах действия биологически активных веществ подобной химической структуры не обнаружены, что определяет приоритетный характер данных исследований. Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение молекулярных механизмов антиаритмической активности лекарственного средства аллапинин и оригинального соединения PI 1 и оценка их потенциальных аритмогенных свойств. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация молекулярных мишеней оригинального соединения - 5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02,6]декан-4-она (Р11) и аитиаритмического препарата аллапинин в условиях моделирования нарушений сердечного ритма in vivo;

2. Разработка in vitro тест-системы для выявления потенциальных аритмогенных свойств химических соединений;

3. Оценка аритмогенных свойств оригинального соединения PI1 и препарата аллапинин с использованием разработанной тест-системы.

Научная новизна. Впервые проведено исследование молекулярных механизмов антиаритмической активности оригинального производного 5-амино-З-азатрицикло [5.2.1.02,6]декан-4-она. При сравнительном анализе изменений экспрессионного статуса генов в сердце крыс, индуцированных Р11 на фоне моделируемой in vivo

аритмии, выявлено 16 генов, воспроизводимо меняющих уровень экспрессии. Регулируемые препаратом гены кодируют белки внеклеточного матрикса (Gpcl, Timp2, Timp 3), внутриклеточного сигналинга (Did, Ptp4al, Pde4D, PIK3R1, Gncil2), гликолиза (Pfkl), межклеточного взаимодействия (Jap), системы гемостаза (Plat), мсмбранно-связанных насосов и транспортеров (Sldâal, Alpla) и другие (C-fos, Tip, Artxal). Полученные нами данные об избирательном влиянии Р11 на гены, продукты которых вовлечены в механизмы аритмогенеза, позволяют рассматривать это соединение в качестве перспективного средства патогенетически ориентированной фармакотерапии аритмий.

Проведено углубленное изучение молекулярных механизмов действия препарата аллашншн. Установлено, что на фоне аконитиновой аритмии аллапинии вызывает увеличение уровня мРНК генов, кодирующих различные типы К^-каналов (Кспаб, Kcnjl, Kcrtj4, Kcnq2, Kcnq4), Са2+-канала (Cacnalg), везикулярного переносчика ацетилхолина (Slcl8a3). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих К'а+-капал (Scn8a), К+-каналы (Kcnel, KcnsI), генов мембранных транспортеров (Atp4a, Slcôa'J). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях аконитиновой аритмии аллапииин модулирует экспрессию генов Na\ К-, Са2>-каналов, проводящих ионные токи (INa< ICi,t), которые участвуют в

формировании различных фаз потенциала действия. Выявленное влияние препарата на уровень мРНК генов, кодирующих переиосчики ацетилхолина и глицина, позволяет сделать предположение об участии указанных нейромедиаторов в механизмах реализации антиаритмических свойств аллапинина.

Получена тест-система для определения потенциальной аритмогенной активности исследуемых соединений, в основе которой лежит подход, основанный на детекшш изменений локализации белков калиевого канала h ERG при действии тестируемых соединений (Wible et al., 2005). Нами предложен более точный и чувствительный способ детекции результатов анализа с использованием проточной цитометрии, позволяющий количественно оценить эффект соединений на локализацию hERG канала. Впервые получены данные об отсутствии ингибирующего влияния на поверхностную экспрессию белков hERG канала соединения PI 1 и препарата аллапинии.

Научно-практическая значимость работы. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения данной работы, дополняют и расширяют существующие представления о спектрах и механизмах проявления фармакологической активности и возможных побочных эффектах исследованных соединений, что чрезвычайно важно для безопасной фармакотерапии аритмий. Использование полученной нами тест-системы на ранних стадиях разработки

соединений в качестве лекарств позволит отбирать потенциально кардиотоксичные соединения и исключать их из дальнейших исследований. Знания о молекулярных механизмах антиаритмической активности лекарственных соединений позволят прогнозировать спектры фармакологических свойств и возможные побочные эффекты препаратов, а также откроют новые перспективы их клинического применения.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы" (ГК 02.740.11.0290; Соглашение № 8046), Грантом Президента РФ (Договор № 16.120.11.3290 - МД), Грантом по инновационным исследованиям "У.М.Н.И.К." (ГК 001200850086) и Грантом Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине".

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII Всероссийской научной конференции с международным участием "Химия и Медицина" (Уфа, 2010), XV Международной Путинской шкапе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2011), IV Съезде фармакологов России "Инновации в современной фармакологии" (Казань, 2012), III Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии "Биомика-наука XXI века" (Уфа, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 230 наименований, в том числе 207 работ иностранных авторов. Работа изложена на 126 страницах и содержит 11 рисунков и 5 таблиц.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю Вахитовой Ю.В., сотрудникам лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Зайнуллиной Л.Ф. и Фаткуллиной У.Ш., сотрудникам лаборатории биоорганической химии, лаборатории металлорганического синтеза и катализа Института органической химии Уфимского научного центра РАН, а также Ямиданову P.C. за помощь в выполнении и написании данной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследоианин

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Все работы с использованием лабораторных животных были одобрены в Локальном Этическом комитете при ИБГ УНЦ РАН и проводились в соответствии с приказом Мннздравсоцразвития РФ от 23.08. 2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики". Во всех опытах использовали две группы животных -контрольную и опытную. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 крыс. Экспериментальную аритмию у животных вызывали введением водного раствора аконнтина в дозе 50 мкг/кг в хвостовую вену {контрольная группа). Регистрировали нарушения ритма смешанного предсердно-желудочкового типа в течение 2 ч. Аллапинин вводили внутривенно профилактически за 2 мил до введения аконитина в дозе 0.3 мг/кг (ED5()) (опытная группа); PI 1 также вводили внутривенно профилактически за 2 мин до введения аконитина в дозе 0.3 мг/кг (ED5n) (опытная группа). За критерий антиаритмического эффекта принимали устранение исследуемыми препаратами развившейся аритмии, регистрируемой на кардиограмме. Животных забивали декапитацией через 1 ч после введения препаратов при условии восстановления синусового ритма. Сразу после декапитации извлекали сердце, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Фармакологические исследования проведены совместно с лабораторией бноорганической химии ИОХ УНЦ РАН (заведующий - академик РАН Юнусов М.С.). Субстанции исследуемых препаратов предоставлены лабораторией биоорганической химии и лабораторией металлорганического синтеза и катализа ИОХ УНЦ РАН (заведующий - д.х.н., профессор Докичев В.А.). Суммарную РНК выделяли с использованием "TRIzol Reagent" (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Примеси ДНК удаляли с помощью ДНКазы I (Promega, США) с последующей очисткой смесью фенол-хлороформ. Количество и качество выделенных препаратов РНК контролировали дважды, до и после обработки ДНКазой, спектрофогометрически на спектрофотометре "NanoDrop 1000" (Thermo Scientific, США), а также путем электрофореза в 1.2% а га розном геле. Полученную РНК использовали в реакции построения первой цепи кДНК, для гибридизации на чипах и количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Гибридизацию меченых кДНК, полученных из контрольных и опытных образцов, проводили на "Atlas™ Rat cDNA Expression Array" (7738-1; BD Biosciences, США) в соответствии с протоколами производителя. Результаты гибридизации анализировали с использованием программ ImageQuant software 5.0 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, США), Atlasimage™ 2.0 (BD Biosiences, США) и Microsoft Excel (Microsoft corporation, США). Последовательности

считались дифференциально экспрессирующимися, если соотношения нормализованных результатов опытного и контрольного вариантов различались не менее чем в J.5 раза в каждой из трех независимо проведенных гибридизаций. С помощью координатной сетки, предназначенной для определения позиций гибридизационных сигналов на мембране, проводили идентификацию соответствующих генов. Полный перечень генов, представленных на мембранах, доступен на сайте http://atlasinfo.clontech.com/ailasinfo/array/info-

action.do?catalog_no=7738-l. Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием oligo(dT)i2-is-npañMepa (Invitrogen, США) и обратной транскриптазы M-MuLV (MBI Fermentas, США). Сравнительный анализ уровней мРНК подтверждаемых генов проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе "iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection System" (BioRad, США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и программного обеспечения "iCycler iQ Real-Time Detection System software" версия 3.0.6070 (BioRad, США). Праймеры к нуклеотидным последовательностям анализируемых генов подбирали с помощью программы "Primer 3" (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) с последующим анализом в программах LaserGcne (DNAStar, США). Изменения в уровнях мРНК генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы "REST 2005 ß VI.9.9" (Corbertt Research, США). Для идентификации 1'енов-мишеней аллапинина использовали коммерческий набор "Rat Neuroscience Ion Channels & Transporters RT2 Profiler™ PCR Array" (PARN-036A2, SABioscienses, США). Для проведения реакции ОТ-ПЦР использовали набор "RT2-Real Time SYBR Green / ROX PCR master mix" (SABioscienses, США) в соответствии с протоколом производителя. Результаты ОТ-ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения "RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.4" (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). В данном программном обеспечении для оценки различий в уровне мРНК используется метод 2^дло' (Livak, Schmittgen, 2001).

Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием модифицированных праймеров, содержащих нуклеотидную замену в кодирующей области гена hERG. Рекомбинантная плазмида pcDNA3IhERG "дикого" типа была любезно предоставлена профессором J. Schwarz (University of Hamburg, Германия). ПЦР проводили по стандартному протоколу с использованием набора "Tersus polymerase mix" (Евроген, Россия). Аналитический и препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях, элюцию ДНК из агарозных гелей, подготовку компетентных клеток и их трансформацию проводили в соответствии с

общепринятыми протоколами (Sambrook, F ritsch, Maniatis, 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе "ABI PRISM 310" (Applied Biosystems, США), используя наборы для секвенирования "Big Dye Terminator v.3.0". Для выделения плазмидной ДНК щелочным методом использовали набор реагентов и колонки фирмы "Цитокин" (Россия). Выделение высокоочищенной плазмидной ДНК для трансфекции проводили с использованием набора "PureLink hiPure Plasmid Filter Purification Kits for Maxi preparation of Plasmid DNA" (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя.

Оценку локализации белков hERG при воздействии исследуемых соединений проводили в культурах клеток линии НЕК293 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания моноклональными антителами к а-субъединице белка hERG, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC (Sigma, США). Клетки культивировали при 37°С при 5% С02 в среде DMEM (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина сульфата (ПанЭко, Россия). Трансфекцию клеток рекомбинантными конструкциями, содержащими ген hERG "дикого" и мутантного типов, проводили с помощью реагента "Липофектамин 2000" (Invitrogen, США) согласно протоколу изготовителя. Интенсивность флуоресценции детектировали с помощью проточного цитофлуориметра "Cytomics FC 500" (Beckman Coulter, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дифференциальная экспрессия генов в тканях сердца крыс при однократном воздействии 5-амипо-экзо-3-азатрицикло|5.2Л.0г'6|декан-4-она (Р11) на модели аритмии in vivo

Методом гибридизации на биочипах нами был проанализирован профиль экспрессии генов в ответ на воздействие PI 1 в тканях сердца крыс в условиях моделируемых аконитином нарушений сердечного ритма in vivo (рис. I). Количественный анализ результатов 3-х независимых гибридизаций позволил нам выявить 22 гена, воспроизводимо меняющих уровень экспрессии в тканях сердца крыс в ответ на однократное введение соединения Р11. Результаты гибридизационного анализа на макрочипах подтверждали с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени (рис. 2).

C-foM Tip/

Рис. 1. Радиоавтографы гибридизации на Atlas™ Rat cDNA Expression Array. A - контроль; Б - Pli. Линиями отмечены гены, дифференциально экспрессирующиеся в тканях сердца в ответ на однократное введение соединения Р11. Нижние прямоугольники обозначают положение контрольных сигналов: ДНК (отрицательный контроль); гены "домашнего хозяйства" (Gapdh, Tubal, Actb).

ГЧк 1 Tlmp2 Л1р1а Slc1&a1 Tlp1 Ptp4a1 Diet Plat Gna12 C-fos Jup Timp3 Anxel Gpc1 Pde4D нышеномнне генж

Рис. 2. Дифференциальная экспрессия генов в тканях сердца крыс на фоне аконитиновой аритмии при однократном введении соединения Р11 (данные ОТ-ПЦР в режиме реального времени). Данные нормализовали по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» Pgk. Уровень экспрессии в экспериментальных группах представлен относительно контрольных, принятых за 1. Боксы представляют межквартильный размах статистической выборки, границами показаны минимумы и максимумы значений уровня мРНК соответствующих генов.

Как следует из данных, представленных на рис. 2, исследуемый препарат вызывал увеличение уровня мРНК генов, кодирующих белки системы гемостаза (Plat), внутриклеточного сигналинга (Pde4D, Did, Ptp4al), внеклеточного матрикса (Gpcl). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих белки

внеклеточного матрикса (Timp2, Timp3). внутриклеточного сигналинга (Gnal2), межклеточного взаимодействия (Jup), гликолиза (Pjkl), мембранно-связанных насосов и транспортеров (Slclôal, Atplà).

Отметим, что на данный момент отсутствуют сведения о механизмах действия PU на электрофизиологические процессы в мембране кардиомиоцитов, не известна принадлежность соединения к тому или иному классу антиаритмических средств. Полученные нами данные о спектре генов-мишеней PI 1 позволяют, по крайней мере, частично охарактеризовать молекулярные механизмы действия этого соединения. Можно предположить, что способность PI 1 оказывать влияние на экспрессию гена, кодирующего Ка7К+-зависимую АТФ-азу, вносит вклад в формирование антиарнтмической активности соединения. Полученные нами данные о влиянии Р11 на экспрессию гена Pde4D могут свидетельствовать о вовлечении цАМФ-зависимых сигнальных путей в опосредование фармакологических активностей препарата, а также предполагают участие fc-адренорецепторного комплекса в механизмах антиаритмической активности исследуемого соединения. Кроме того, изменения функционального состояния генов, кодирующих компоненты внутри- и внеклеточного матрикса клеток, вероятно, обеспечивают механизмы нормализации сердечного ритма при действии Р11. Влияние соединения на экспрессию генов Ptp4al, Pik3Rl, Pde4D, Gpcl, белковые продукты которых участвуют во внутриклеточной передаче сигналов, позволяет с одной стороны, выявить новые терапевтически значимые мишени Р11, и с другой - оценить участие различных систем сигнальной транедукции в механизмах реализации фармакологической активности исследуемого соединения. Увеличение в 2 раза экспрессии гена тканевого активатора плазминогена (Plat) позволяет предполагать, что выявленные ранее антиагрегациоиные свойства Р11 могут быть обусловлены влиянием соединения на ключевой регуляторный фактор системы фибртголиза. Также интерес представляют данные об участии митогенных факторов и сопряженных с ними сигнальных каскадов в реализации свойств препарата.

Как известно, действие ангиаритмических препаратов главным образом направлено на изменения электрофизиологических свойств патологических измененных тканей сердца. Основной мишенью антиаритмиков являются ионные капаны, участвующие в протекании различных ионных токов, которые в свою очередь формируют различные фазы потенциала действия кардиомиоцитов. Новые стратегии медикаментозного вмешательства направлены в первую очередь на воздействие на иные, "нетипичные" патогенетические факторы нарушений ритма сердца (Gilmour, 2003). Например, весьма перспективными с точки зрения патогенеза признаются препараты, влияющие на систему ренип-ангиотензина, в частности,

ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента; антагонисты рецепторов ангиотензина II типа (Savelieva, Camm, 2004; De Millo et al., 2006). Среди средств с выраженной антиаритмической активностью и высоким профилем безопасности следует отметить ингибиторы NaVFT, Ка'7Са2,-обменников плазматической мембраны кардиомиоцитов (Hobai et al., 2004; Shinada et al., 2005); соединения, обладающие аффинностью к рианодиновым рецепторам сердца (Bers, 2004). Антиаритмическая активность обнаружена у блокаторов ацетилхолин-чувствительных калиевых каналов (Hashimoto et al., 2005). Многообещающими с клинической точки зрения выглядят фармакологические агенты, действующие на уровне межклеточных контактов, в частности, влияющие на структурные белки -N-кадгерины, десмоплакин и коннексины (Weng et al., 2002; Shiroshita-Takeshita et al., 2007). Патогенетически обоснованным можно считать разработку антиаритмиков, воздействующих на контрактильный аппарат кардиомиоцитов. (Bode et al., 2000; Weiss et al., 2003).

Представленные выше данные об избирательном влиянии соединения Р11 на гены, продукты которых вовлечены в механизмы аритмогенеза, позволяют рассматривать его в качестве перспективного средства патогенетически ориентированной фармакотерапии аритмий.

Анализ дифференциальной экспрессии генов в тканях сердца крыс при однократном воздействии препарата аллапишш на модели аритмии in vivo

Гены-мишени препарата аллапинин идентифицировали в условиях моделирования аконитиновой аритмии у крыс с использованием коммерческого набора "Rat Neuroscience Ion Channels & Transporters RT2 Profiler™ PCR Array" (SABioscienses, США). При сравнительной оценке экспрессии 84 генов у опытных (аконитиновая аритмия/аллапинин) и контрольных (аконитиновая аритмия/физиологический раствор) животных нами установлены изменения уровня мРНК 18 генов, отличающиеся в опыте от контрольного варианта более чем в 2 раза. Однако в последующих исследованиях нам удалось подтвердить изменения экспрессии только 12 генов (рис. 3). Действие аллапинина на фоне аконитиновой аритмии вызывает увеличение уровня мРНК генов, кодирующих различные типы К!-каналов (Кспаб, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, Kcnq4), Са24-канала (Cacnalg), везикулярного переносчика ацетилхолина (SlclSa3). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих Na'-канал (SciiSa), К'-каналы (Kcnel, Kcnsl), генов мембранных транспортеров (Aíp4a, S!c6a9). Значительные изменения в экспрессии наблюдались также у генов, кодирующих SIcl8a3, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, ScnSa, Aíp4a, Kcnel.

Кете» Яапеа 51с6в9 Саепэ1д Ксщ2 Ксщ1

А1р4а1 Кспэ1 Кспя4 Квпвб Кщ4 51П8а 3 ианмеиояалке г*.на

Рис. 3. Дифференциальная экспрессия генов в тканях сердца крыс на фоне аконитиновой аритмии при однократном введении препарата аллагошнн (данные ОТ-ПЦР в режиме реального времени). Данные нормализовали по уровню экспрессии гена "домашнего хозяйства" Р^к. Уровень экспрессии в экспериментальных группах представлен относительно контрольных, принятых за 1. Боксы представляют межквартильный размах статистической выборки, границами показаны минимумы я максимумы значений уровня мРНК соответствующих генов. Все различия статистически достоверны (п=3, р>0,05).

Снижение уровня мРНК гена $сп8а при введении аллапинина в условиях аконитиновой аритмии, вероятно, свидетельствует о том, что антиаритмические свойства препарата (в частности увеличение продолжительности фазы деполяризации) реализуются посредством регуляции токов проходящих, в том числе, и через натриевый канал ЫаД.б. Известно, что аконитин посредством блокады выходящих калиевых токов замедляет реполяризацию, способствуя аритмогенезу. Вызванное аллапинином увеличение уровня мРНК генов Кспаб, Кспе/2 и Кащ4, вероятно, свидетельствует в пользу предположения о нормализующем эффекте препарата на состояние реполяризующих выходящих калиевых токов /к, активированных аконитином. Некоторую настороженность вызывает снижение уровня мРНК гена Кспе1 при действии аллапинина на фоне аконитиновой аритмии в связи с вовлеченностью соответствующего белка в механизмы аритмии, однако этот аспект требует' дальнейших углубленных электрофизиологических исследований. Выявленное нами увеличение уровня мРНК гена Ксщ4 на фоне аконитнновой аритмии при действии аллапинина может свидетельствовать о влиянии препарата на ионные токи, формирующие конечную фазу потенциала действия. Как известно, аллапинин подавляет желудочковую эктопическую активность, в связи с чем применяется в клинике для купирования желудочковых экстрасистолий

(Джахангиров, Садритдинов, 1985). Можно предположить, что данный эффект препарата связан, в том числе, и с модифицирующим действием аллапинина на ионные токи /кь протекающие через калиевый канал Kir2.3. Не исключено, что формирование положительного хронотропного эффекта аллапинина может быть обусловлено его влиянием на Са2'-каналы Т-типа. Обнаруженное нами увеличение уровня мРНК гена Cacnalg свидетельствует в пользу этого предположения. Выявленное влияние препарата на уровень мРНК генов, кодирующих переносчики ацетилхолина и глицина, позволяет сделать предположение об участии указанных нейромедиаторов в механизмах реализации антиаритмических свойств аллапинина.

В настоящее время считается, что селективная коррекция функционального состояния определенного канала не имеет преимуществ по сравнению со способностью антиаритмиков модифицировать свойства многих каналов, вовлеченных в патофизиологию конкретных нарушений ритма сердца. Выявленное нами комплексное влияние аллапинина на уровень мРНК генов ионных каналов, формирующих различные ионные токи, позволяет обосновать основы фармакодинамических особенностей препарата и определить направление последующих углубленных электрофизиологических исследований.

Получение и валидация in vitro тест-системы для оценки влиянии фармакологических препаратов на процессы внутриклеточного транспорта белков калиевого канала hKRG

Кардиотоксичноеть лекарственных препаратов является одним из серьезных осложнений фармакотерапии. Как известно, аритмогенные свойства препаратов различных фармакотерапевтических групп обусловлены блокадой реполяризующих калиевых токов, опосредованных каналами hERG (Kvll.l), что приводит к пролонгированию фазы реполяризации кардиомиоцитов, удлинению интервала QT на кардиограмме и, в ряде случаев, к развитию опасной для жизни желудочковой тахикардии (Sanguinetti et al., 1996). Не так давно установлено, что некоторые лекарственные препараты способны вызывать удлинение интервала QT не за счет непосредственной блокады сопряженных с hERG-каналами калиевых токов, а оказывая ингибирующее влияние на процессы внутриклеточного транспорта соответствующего белка от эндоплазматического ретикулума (ЭПР) к поверхности мембран (Ficker et al., 2004; Kuryshev et al., 2005). В настоящее время существует ряд подходов, позволяющих оценивать эффект соединений на liERG-опосредуемые калиевые токи, в частности метод "патч-кламп" с использованием гетерологичных клеточных систем (Feniche! et al., 2004). Данный метод является наиболее точным и распространенным, однако его трудоемкость существенно ограничивает возможности его применения в скрининговых доклинических исследованиях. Кроме того,

упомянутый выше способ непосредственной регистрации изменений трансмембранных токов не учитывает иных возможных механизмов влияния соединений на hERG-зависимые ионные токи (Dennis et al., 2007).

Не так давно был предложен подход, основанный на детекции изменений уровня мембранной экспрессии калиевого канала hERG при действии тестируемых соединений с целью обнаружения среди них веществ с потенциальными аритмогенными свойствами (Wible et al., 2005). В данной тест-системе используются 2 клеточные линии, различающиеся по уровню мембранной экспрессии белка hERG. Одна линия экспрессирует ген hERG "дикого" типа; белок локализуется преимущественно на поверхности клеточной мембраны, другая - мутантную форму белка hERG с точковой мутацией G601S. Как известно, данная мутация приводит к нарушению процессинга белка в ЭПР, препятствует его транслокации к мембране, соответственно уменьшает представленность канала на поверхности клеток и снижает амплитуду К+-токов (Zhou et al., 1998; Delisle et al., 2004). Таким образом, с помощью данной тест-системы можно идентифицировать соединения, способные оказывать влияние на поверхностную экспрессию калиевого канала hERG. Так, клеточная линия, экспрессирующая ген hERG "дикого" типа, используется для выявления соединений-блокаторов, которые ингибируют внутриклеточный транспорт белка hERG "дикого" типа к клеточной мембране и снижают его поверхностную экспрессию (высокий риск аритмогенного эффекта). В том случае, когда соединения не вызывают изменений уровня поверхностной экспрессии канала "дикого" типа, их относят к группе веществ с низким риском возникновения аритмогенного действия. В отношении влияния соединений на мутантную форму канала отметим следующее. В настоящее время известно, что некоторые лекарственные препараты (в частности, астемизол, галоперидол, флуоксетин), действуют в качестве фармакологических шаперонов, стабилизируя неправильно собранные белки "мутантных" каналов, что способствует восстановлению корректной конформации белка, нормализации внутриклеточного транспорта и восстановлению мембранной экспрессии канала (Zhou et al., 1999; Ficker et al., 2002). Вещества, обладающие способностью восстанавливать поверхностную экспрессию белка hERG мутантного типа, рассматриваются в качестве соединений с высоким риском аритмогенного эффекта.

На первом этапе создания вышеописанной тест-системы нами получена рекомбинантная конструкция pcDNA3//j£7?G-G601S, содержащая мутантную последовательность гена hERG в составе экспрессионного вектора pcDNA3.1. С использованием сайт-направленного мутагенеза in vitro нами осуществлена замена 1801G>A (G601S) в нуклеотидной последовательности гена hERG. Сайт-

направленный мутагенез проводили методом ПЦР с помощью модифицированных праймеров, содержащих уникальные сайты рестрикции (PspEI и Sbfl) и требуемую замену нуклеотида (1801G>A). На первой стадии проводили Г1ЦР с использованием праймера, комплементарного 5'- концу фрагмента гена и "мутагенного" праймера, несущего требуемую замену нуклеотида. При этом праймер, комплементарный 5'-концу фрагмента гена, имел уникальный сайт для рестриктазы P.spEl. На второй стадии проводили ПЦР с использованием праймера, комплементарного З'-концу фрагмента гена и имеющего уникальный сайт для рестриктазы Sbfl и "мутагенного" праймера. Полученные после проведения двух стадий ПЦР перекрывающиеся фрагменты ДНК (рис. 4) очищали при помощи набора "QIAquick Nucleotide Removal Kit" (Qiagen, Германия) и использовали в качестве матрицы в заключительной стадии ПЦР с праймерами к 5'- и 3'- концам фрагмента гена, область которого подлежит замещению. Далее полученный фрагмент ДНК (рис. 5) также очищали, последовательно обрабатывали рестриктазами PspE\ и Sbfl и лигировали с заранее подготовленным вектором, обработанным теми же рестриктазами. После трансформации клеток Е. coli лигазной смесью отбирали отдельные клоны, выделяли плазмидную ДНК и подтверждали присутствие требуемой замены секвенированием (рис. 6).

М 1 2 м ,

Рис. 4. Продукты амплификации первого Рис. 5. Продукты амплификации второго раунда ПЦР. М - ДНК-маркер (100 - 3000 раунда ПЦР. М - ДНК-маркер (100-3000 п.н.); п.н.); 1 - 5'-область мутированного 1-мутированный фрагмент ДНК (1104 п.н.). фрагмента ДНК (710 п.н.); 2 - 3'-область мутированного фрагмента ДНК (394 п.н.).

hERG TGGACTCACGCATCGGCTGGCTGCACAACCTGGGCGACCAGATAGGCAAACCCTA

HERG-G601S TGGACTCACGCATCGGCTGGCTGCACAACCTGGGCGACCAGATAGGCAAACCCTA

hERG CAACAGCAGCGGCCTGGGCGGCCCCTCCATCAAGGACAAGTATGTGACGGCGCTC

hERG-G601S CAACAGCAGCAGCCTGGGCGGCCCCTCCATCAAGGACAAGTATGTGACGGCGCXC

hERG TACTTCACCTTCAGCAGCCTCACCAGTGTGGGCTTCGGCAA-3'

/)£7?G-G601S TACTTCACCTTCAGCAGCCTCACCAGTGTGGGCTTCGGCAA-3'

Рис. 6. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена hERG "дикого типа" (hERG) и несущего мутацию {hERG-G601S). Серым цветом выделена замена 1801G>A в нуклеотидной последовательности гена.

Анализ секвенированных нукдеотидных последовательностей мутированного фрагмента гена liEKG. проведенный в программах Genome Labs (Beckman Coulter. США), MegAlign пакета профамм LaserGene (DNAStar, США), подтвердил наличие замены 1801G>A.

Полученные рекомбннантные конструкции pcDNA3IhERG и pcDNA3/hERG-G601S далее использовали для транзиентной трансфекции клеток линии НЕК293. Относительный уровень поверхноспгой экспрессии белков hERG '"дикого" и мутантного типов оценивали с использованием моноклональных антител к экстраклеточному эпигопу белка hERG методом проточной цитофлуорометрии (рис.7).

400' 350300' 250203. 150.

Рис. 7. Поверхностная экспрессия ЬЕКО каналов в клетках НЕК293, трансфицированных рекомбшгантнымн конструкциями pcDNAЗ/A£'ЛG ирсШМАЗ/Шге-СбМв.

1 — экспрессия белков ЬЕЯС "дикого" типа;

2 - экспрессия белков hF.RO мутантиого типа.

В качестве контроля использованы клетки, трансфицированиые плазмидой рсИКАЗ. I. Уровень белка рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100%. Значения представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего.

Как следует из полученных данных, в клетках, трансфицированных рскомбпнантиой конструкцией pcDNA3//)£7?(ï, уровень белка hERG в 3 раза выше, по сравнению с контролем (рис. 7, фуппа 1). В клетках, трансфицированных мутантиой конструкцией pcDNA3//i£7ÎG-G601 S, поверхностная экспрессия hERG детектируется на уровне контрольных клеток (рис. 7, фуппа 2).

Для валпдаиии тест-системы нами был выбран лекарственный препарат амнодарон, который по своим электрофизиологическим свойствам относится к 111 классу антиаритмических препаратов (Vaughan Williams, 1984). Не так давно было установлено, что проявляющиеся в ряде случаев аритмогенные свойства препарата обусловлены непосредственной блокадой hERG канала (Kamiya et al., 2001). Кроме того, амиодарон обладает способностью ингибировать внутриклеточный транспорт белков калиевого канала hERG (Pollard et al., 2010). С использованием полученной тест-снстемы нам удалось экспериментально подтвердить это свойство препарата (рис. 8). Для этого клетки трансфицировали конструкциями pcDNA3//î£7?G и pcDNA3/AS?G-G60lS, через 12 ч добавляли амиодарон в концентрациях 1, 10, 30 мкМ и инкубировали в течение 48 ч, после чего окрашивали клетки антителами к белку hERG.

Как видно из данного рисунка, действие препарата на уровень поверхностно-представленного белка ЬЕКС "дикого" типа имеет отчетливый дозозависимый характер: повышение концентрации амиодарона сопровождается понижением мембранной экспрессии ЬЕКО. Наиболее выраженное снижение поверхностной экспрессии белка наблюдается при действии амиодарона в концентрации 30 мкМ (рис. 8А).

Рис. 8. Экспрессия белков hERG на поверхности клеток при воздействии препарата амиодарои (по данным проточпой цнтофлуометрин). А — уровень белка hERG в клетках НЕК293, трансфицированных рекомбинантиой конструкцией "дикого" типа: Б - уровень белка hERG в клетках НЕК2УЗ. трансфицированных рекомбинантиой конструкцией мутантного типа. ! - без воздействия препарата; 2 - амиодарои (1 мкМ); 3 - амиодарои (10 мкМ): 4 - амиодарои (30 мкМ). Уровень белка рассчитывали по отношению к контролю (клетки, трансфицироваиные плазмндой pcDNA3.U, который принимали за 100%. Значения представлены в виде среднего арифметического т стандартная ошибка среднего.

Эффект препарата на уровень поверхностно-локализованного белка в клетках, трансфицированных мутантной конструкцией, также имеет дозозависимый характер: с повышением концентрации соединения отмечается увеличение содержания белка hERG на мембране клеток (рис. 8Б). Таким образом, установлено, что амиодарои в данной системе in vitro обладает способностью снижать мембранную экспрессию белка hERG "дикого" типа п увеличивать уровень мутантной формы канала hERG на поверхности клеток. В соответствии с классификацией, предложенной авторами данной тест-системы (Wible et al„ 2005), соединения с подобными свойствами являются блокаторами калиевого канала hERG и обладают высоким риском возникновения аритмогенного эффекта.

Принимая во внимание перспективность соединения Р11 в качестве потенциального антиарит.мнка, представляло интерес изучение его возможного взаимодействия с калиевыми каналами и, соответственно, предсказание риска

потенциального аритмогенного действия с использованием полученной тест-системы.

Тестирование соединении Р11

Для этого клетки трансфицировалн конструкциями рсОКАЗ/йЕЯС и рсОЫАЗПгЕЯО-06015, через 12 ч добавляли тестируемое соединение Р11 в концентрациях 1, 10. 100 мкМ и инкубировали в течение 48 ч, после чего клетки окрашивали антителами к белку ЬРЛШ и уровень экспрессии канала оценивали с помощью проточной цитометрии.

Показано, что данное соединение не оказывает влияния на поверхностную экспрессию белков ЬЕИС как "дикого", так и мутантного типов (рис. 91. Недостоверное снижение поверхностной экспрессии М:КС каналов дикого типа по сравнению с контролем наблюдается лишь при действии соединения в концентрации 100 мкМ.

¡И

й»

SI-

г if "

!г

Рис. 9. Экспрессия белков hERG на поверхности клеток при действии соединения PI 1 (по данным проточной цитофлуомстргш). А - уровень белка hERG в клетках НЕК293. транефнцированных рекомсииантнон конструкцией "дикого" типа; Б - уровень белка hERG в клетках НЕК293, транефнцпровагшых рекомбшшшюй конструкцией мутантного типа. 1 -без воздействия соединения: 2 - Р11(1 мкМ); 3 - Р1 ] (10 мкМ): 4 - PI 1 (100 мкМ). Уровень белка рассчитывали по отношению к контролю (клетки, траисфицированные плазмидой pcDNA3.1), который принимали за 100%. Значения представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что соединение Р11 не обладает способностью изменять локализацию и оказывать влияние на экспрессию белка hERG, и, вероятнее всего, не обладает аритмогеиными свойствами, сопряженными с блокадой калиевого канала hERG. Несомненно, что подученные нами данные требуют дополнительного подтверждения в электрофизиологичеекпх исследованиях.

Тестирование препарата алланинин

Как уже отмечалось выше, одним из направлений повышения эффективности и безопасности терапии нарушений сердечного ритма является более подробное изучение молекулярных механизмов действия уже использующихся лекарственных средств. Несмотря на длительный срок использования аллапинина в клинической

практике, сведения о результатах его изучения до настоящего времени немногочисленны и часто противоречивы. Во многом это обусловлено настороженностью в отношении использования антиаритмнческих препаратов 1С класса при лечении разных форм нарушений ритма, что последовало за публикацией результатов исследования CAST (CAST II Investigators, 1992). К настоящему времени установлено, что аритмогенные эффекты антиаритмических препаратов 1С класса обусловлены нарушением внутрисердечной проводимости (удлинение комплекса QRS) и возникновением жизнеулрожающей желудочковой тахикардии. Это преимущественно связано с блокадой быстрых Na"-каналов и антагонистическим влиянием на Са"'-каналы. Однако, в литературе имеются данные об антагонистическом влиянии антиаритмиков 1С класса флекаинида и пропафенона на потенциал-зависимые К:-каналы, в частности hERG (Paul et а!., 2002). В отношении аллапинина подобных исследований не проводилось, в связи с чем представляет интерес изучение влияния препарата на данный тип калиевых каналов.

Клетки линии НЕК293 трансфицировали конструкциями pcDNA3/M7?G' и pcDNA3,7i£7{G'-G601S, через 12 ч добавляли аллапинин в концентрациях 1, 10, 100 мкМ н инкубировали в течение 48 ч. после чего окрашивали клетки антителами к белку hERG и уровень экспрессии канала оценивали с помощью проточной цитометрии. Результаты исследований представлены на рис. 10.

!Н

I-

п.

Рис. 10. Экспрессия белков hERG на поверхности клеток при действии аллапинина (по данным проточной цитофлуометрии). А - уровень белка ЬЕКО в клетках НЕК.293, траисфпшфоваиных рекомбинантной конструкцией "дикого" типа; Б - уровень белка ЬЕЯО в клетках НЕК293, трансфицированных рекомбинантной конструкцией мутаншого типа. 1 -без воздействия препарата; 2 - аллапинин (1 мкМ); 3 - аллапинин (10 мкМ): 4 - аллапинин (100 мкМ). Уровень белка рассчитывали по отношению к контролю (клетки, трансфицированныс плазмидой рсЭЫЛЗЛ), который принимали за 100%. Значения представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего.

Как следует из данных, представленных на рис. 10, в исследованных концентрациях аллапинин практически не оказывает влияния на поверхностную

экспрессию каналов hERG "дикого" и мугантного типов, таким образом, не проявляя

характерного для соединений-блокаторов hERG ингибирующего эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с помощью гибридизации на кДНК макрочипах в условиях моделируемой in vivo аконитиновой аритмии проведен анализ спектра генов, дифференциально экспрессирующихся в тканях сердца крыс в ответ на однократное воздействие антиаритмического соединения PI 1. Показано, что соединение PI 1 в тканях сердца крыс модулирует уровень мРНК генов, кодирующих белки системы гемостаза, внутриклеточного снгналинга, внеклеточного матрикса, межклеточного взаимодействия, гликолиза, мембранно-связанных насосов и транспортеров и других. В качестве фармакологически значимых генов-мишеней Р11 следует рассматривать гены ферментов гликолиза Pfkl, белков внутриклеточного сигналинга Pde4D, Did, Ptp4al, системы гемостаза Plat.

2. С использованием коммерческого набора "Rat Neuroscience Ion Channels & Transporters RT2 Profiler™ PCR Array" идентифицированы гены-мишени препарата аллапишпг. В условиях аконитиновой аритмии аллапинии модулирует экспрессию генов Na'-, K+-, Са2'-каналов, проводящих ионные токи (/№> [„, IKs ]K¡ ]Са7), которые участвуют в формировании различных фаз потенциала действия. Выявлено влияние препарата на уровень мРНК генов, кодирующих переносчики ацетилхолина и глицина.

3. Получена генетическая конструкция калиевого hERG канала мугантного типа, содержащая замену 1801G>A в транскрибируемой области гена hERG. Создана тест-система для оценки риска налитая аритмогенных свойств исследуемых соединений с использованием рекомбинантных конструкций, экспрессирующих калиевые hERG-каналы "дикого" и мутантного типов. Проведена валидация полученной тест-системы с использованием препарата амиодарон.

4. С использованием тест-системы впервые проведена оценка потенциальных аритмогенных свойств соединения PI 1 и препарата аллапинин. Показано, что оба препарата не изменяют поверхностную экспрессию hERG канала обоих типов, что позволяет судить об отсутствии аритмогенного эффекта у исследованных соединений, связанных с влиянием на калиевые токи, опосредуемые hERG-каналом.

Список работ, опубликованных ио теме диссертации:

Статьи в журналах из Перечня ВАК

1. Вахитова, Ю.В. Идентификация генов-мишеней 5-амино-экзо-З-азатрицикяо [5.2.1.02,6] декан-4-она на модели аритмии in vivo / Ю.В. Вахитова, Е.И. Антипина (Фарафонтова), P.C. Ямиданов, Р.Ю. Хисамутдинова, Ф.С. Зарудий, Н.Ж. Басченко, В.А. Докичев, Ю.В. Томилов, О.М. Нефедов // Биоорганическая химия. - 2011. - Т. 37. №6. - С. 821-829.

2. Вахитова, Ю.В. Влияние аляалинина на экспрессию генов ионных каналов кардиомиоцитов / Ю.В. Вахитова, В.В. Плечев, В.М. Юнусов, Е.И. Фарафонтова И Башкирский химический журнал. - 2012. - Т. 19. № 4. - С. 166-169.

3. Вахитова, Ю.В. К механизму антиаритмического действия аллапинина / Ю.В. Вахитова, Е.И. Фарафонтова, Р.Ю. Хисамутдинова, В.М. Юнусов, И.П. Цыпышева, М.С. Юнусов // Биоорганнческая химия. - 2013. - Т.39. №1. - С. 105-116.

Тезисы конференций

4. Ямиданов, P.C. Идентификация генов-мишеней, ассоциированных с антиаритмической активностью производного 5-амино-эо0-3-азатрицикяо [5.2.1.02,6] декан-4-она / P.C. Ямиданов, Е.И. Антипина (Фарафонтова), Р.Ю. Хисамутдинова, Н.С. Макара, Н.Ж. Басченко, В.А. Докичев, Ю.В. Вахитова // Материалы VIiI-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Химия и Медицина». Уфа. - 2010. - С. 47.

5. Антипина (Фарафонтова), Е.И. Разработка in vitro тест-системы для оценки потенциальной аритмогенной активности лекарственных веществ / Е.И. Антипина (Фарафонтова), C.B. Садовников, P.C. Ямиданов, Ю.В. Вахитова // Сборник тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущшю.-20Г1.-С.35.

6. Фарафонтова, Е.И. Новый способ оценки потенциальной кардиотоксичности лекарственных веществ / Е.И. Фарафонтова, Л.Ф. Зайнуллина, Ю.В. Вахитова, P.P. Магафурова // Материалы III Всероссийской школы-конференция молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика-наука XXI века». Уфа. - 2012. -Т.З. №1. - С.111.

7. Фарафонтова, Е.И. Идентификация генов-мишеней аллапинина при моделировании аритмии in vivo / Е.И. Фарафонтова, Р.Ю. Хисамутдинова, И.П. Цыпышева, Ю.В. Вахитова, М.С. Юнусов // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Казань. - 2012. - С. 184.

Подписано в печать 22.11.13. Бумага офсетная. Гарнитура «"ПтевЗЧелКотап». Формат 60x84 1/16. Усл.печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ 751 .

Типография ИИЯЛ УНЦ РАИ г. Уфа, пр. Октября, 71. Тел. 8(347) 235-60-50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фарафонтова, Екатерина Ивановна, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

04201453526

На правах рукописи

ФАРАФОНТОВА ЕКАТЕРИНА ИВАНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Вахитова Ю.В.

Уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..................................................4

ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................10

1.1. Современные антиаритмические препараты и механизмы их действия 10

1.2. Электрофизиологическая характеристика миокарда............................................................17

1.3. Основы аритмогенного действия лекарственных препаратов....................................20

1.4. Калиевый канал Kvl 1.1 (hERG)..............................................................................................................................22

1.5. Антиаритмический препарат аллапинин....................................................................................................26

1.6. Оригинальное химическое соединение 5-амино-экзо-З-азатрицикло [5.2.1.0 2б] декан-4-он (PI 1)..................................................................................................................................................31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................35

2.1. Материалы исследований ....................................................................................................................................................35

2.1.1. Бактериальные штаммы и векторы......................................................................................................35

2.1.2. Стандартные водные растворы..................................................................................................................35

2.1.3. Использованные реактивы и материалы......................................................................................35

2.1.4. Моделирование аритмии in vivo................................................................................................................39

2.2. Методы исследований..............................................................................................................................................................40

2.2.1. Выделение суммарной РНК из сердца крыс................................................................................40

2.2.2. Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы......................41

2.2.3. Гибридизация на макрочипах..............................................................................................................................42

2.2.4. Анализ радиоавтографов..............................................................................................................................................43

2.2.5. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени........................................44

2.2.6. Сайт-направленный мутагенез..........................................................................................................................46

2.2.7. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК..........................................................................47

2.2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях....................................................................................................................................................................................................48

2.2.9. Препаративный гель-электрофорез и элюция ДНК........................................................48

2.2.10. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами........................................49

2.2.11. Лигирование продуктов ПЦР ............................................................................................................................49

2.2.12. Подготовка компетентных клеток ........................................................................................................50

2.2.13. Трансформация компетентных клеток E.coli рекомбинантной

ДИК................................................................................................................................................................................................................50

2.2.14. Выделение и очистка плазмидной ДНК..........................................................................................51

2.2.15. Автоматическое секвестрование ДНК ферментативным методом 52

2.2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей......................52

2.2.17. Клеточные линии и культивирование клеток........................................................................53

2.2.18. Трансфекция клеток..............................................................................................................................................................53

2.2.19. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток......................................................................53

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................55

3.1. Дифференциальная экспрессия генов в тканях сердца крыс при

однократном воздействии 5-амино-эк,зо-3-азатрицикло [5.2.1.0*"']

декан-4-она (PI 1) на модели аритмии in vivo......................................................................................55

3.1.1. Гены ферментов различных метаболических путей..................................................58

3.1.2. Гены белков межклеточного взаимодействия........................................................................59

3.1.3. Гены белков, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов 60

3.1.4. Гены, кодирующие белки мембранно-связанных насосов и транспортеров..............................................................................................................................................................................64

3.1.5. Гены белков компонентов внеклеточного матрикса........................................................65

3.1.6. Гены белков различных функций................................................................................................................68

3.2. Анализ дифференциальной экспрессии генов в тканях сердца крыс при однократном воздействии препарата аллапинин на модели аритмии in vivo............................................................................................................................................................................................69

3.2.1. Гены натриевых каналов..............................................................................................................................................72

3.2.2. Гены калиевых каналов..................................................................................................................................................73

3.2.3. Гены кальциевых каналов............................................................................................................................................79

3.2.4 Гены переносчиков нейромедиаторов....................................................................................................80

3.3. Создание тест-системы для оценки влияния фармакологических препаратов на калиевый канал hERG..................................................................................................................81

3.3.1. Принцип работы тест-системы для идентификации соединений с потенциальными аритмогенными свойствами........................................................................81

3.3.2. Получение тест-системы для идентификации соединений с потенциальными аритмогенными свойствами........................................................................86

3.3.3. Валидация тест-системы................................................................................................................................................89

3.3.4. Тестирование соединения Р11............................................................................................................................91

3.3.5. Тестирование препарата аллапинин..........................................................................................................92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................................................................................................94

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................................................................................99

БЛАГОДАРНОСТИ............................................................................................................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................................................102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПД потенциал действия

ЭКГ электрокардиограмма сердца

всс внезапная сердечная смертность

жт желудочковая тахикардия

Ь(2Т8 синдром удлиненного интервала (^Т

ААП антиаритмический препарат

ЭПР эндоплазматический ретикулум

ЦПМ цитоплазматическая мембрана

ЖЭА желудочковая эктопическая активность

тар угрожающая жизни желудочковая аритмия типа "пируэт"

Р11 исследуемое соединение, производное 5-амино-З-азатрицикло -

[5.2.1.02'6] деканона

эд эффективная доза

Т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

ТАЕ трис-ацетатный буфер

ТЕМЕД тетраэтилметилендиамин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДТТ дитиотрейтол

Трис трис(гидроксиэтил)аминометан

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЬВ среда Лурия-Бертани для культивирования клеток Е.соН

РВ8 натрий-фосфатный буфер

ОМЕМ минимально необходимая питательная среда для культивирования

клеточных культур

БВЗ фетальная бычья сыворотка

ММП матриксные металлопротеазы

с1ЫТР дезоксинуклеозидтрифосфаты

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Нарушения ритма сердца - одно из наиболее частых и тяжелых осложнений различных сердечно-сосудистых заболеваний. Известно, что более чем у 90% пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, возникают опасные для жизни нарушения ритма сердечных сокращений, которые могут привести к фибрилляции и внезапной остановке сердца (Каверина, 1986). В настоящее время антиаритмическая фармакотерапия является основным методом лечения нарушений сердечного ритма (Фогорос, 2009). Несмотря на появление большого количества антиаритмических препаратов, новых методов диагностики и подбора лекарств, достаточного эффекта от применения антиаритмической терапии до сих пор не получено. По данным мультицентровых исследований эффективность противоаритмических препаратов составляет 50-70% (Touboul, 1990; Wyse et al., 2001; Каверина и соавт., 2007; Гиляров, Сулимов, 2009; Piccini et al., 2009), при этом отмечается их недостаточная эффективность в купировании аритмий и профилактике их рецидивов. Отдельной проблемой представляется наличие у многих известных и широко применяемых в медицинской практике антиаригмических средств (хинидин, новокаинамид, пропранолол, амиодарон, соталол, верапамил) аритмогенного действия (Бобров, Крупновицкая, 1991; Дощицын, 1993; Алперт, Фрейсис, 1994). Возможность развития аритмогенного эффекта, по данным Zipes (1988), Gorgeles и соавт. (1992), Сметнева и соавт. (1993), составляет около 10% для большинства антиаритмических средств и чаще встречается у больных с сердечной недостаточностью в стадии декомпенсации и нарушениями функции левого желудочка. В этой связи разработка новых эффективных и менее токсичных антиаритмических средств, основанная на знаниях о молекулярных основах патогенеза аритмий, а также изучение механизмов их действия, является актуальной задачей.

5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02'6]декан-4-он (лабораторный шифр Р11) - синтезирован и фармакологически изучен в ФГБУН Институт органической химии УНЦ РАН (Горпинченко и др., 2005; Петров и др., патент

РФ № 2281938, 2006). Выбор соединения в качестве объекта исследования обусловлен его высокой биологической активностью, установленной в доклинических исследованиях in vivo, а главное, сложным фармакологическим спектром, включающим антиаритмические, противовоспалительные, анальгетические и ноотропные свойства (Горпинченко и др., 2005; Петров и др., патент РФ № 2281938, 2006). Проведенные исследования показали, что соединение проявляет выраженную активность в трёх экспериментальных моделях аритмии, воспроизводящих различные нарушения ритма сердца, включая наиболее опасную для жизни - фибрилляцию. Соединение по интенсивности антиаритмического действия и хорошей переносимости превосходит большинство известных антиаритмических средств и малотоксично (Петров и др., патент РФ № 2281938, 2006).

Лекарственное средство аллапинин (лаппаконитина гидробромид) был разработан в Институте химии растительных веществ АН Узбекской ССР в конце 70-х годов XX века, и успешно применяется в медицине в качестве антиаритмического средства. Препарат проявляет высокую активность при различных формах нарушений ритма сердца, особенно при различных формах желудочковых аритмий, пароксизмальной мерцательной аритмии и при хронической монофокусной предсердной тахикардии (Джахангиров и др., 1987; Соколов, Джахангиров, 2002).

азатрицикло[5.2.1.0*" ]декан-4-она и используемого в клинической практике препарата аллапинин. Следует подчеркнуть, что в доступной нам литературе данные о молекулярных механизмах действия биологически активных веществ подобной химической структуры не обнаружены, что определяет приоритетный характер данных исследований.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение молекулярных механизмов антиаритмической активности лекарственного средства аллапинин и оригинального соединения Р11 и оценка их потенциальных аритмогенных свойств.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация молекулярных мишеней оригинального соединения - 5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02'6]декан-4-она (Р11) и антиаритмического препарата аллапинин в условиях моделирования нарушений сердечного ритма in vivo.

2. Разработка in vitro тест-системы для выявления потенциальных аритмогенных свойств химических соединений.

3. Оценка аритмогенных свойств оригинального соединения Р11 и препарата аллапинин с использованием разработанной тест-системы.

Научная новизна. Впервые проведено исследование молекулярных механизмов антиаритмической активности оригинального производного 5-амино-3-азатрицикло - [5.2.1.02'6] деканона. При сравнительном анализе изменений экспрессионного статуса генов в сердце крыс, индуцированных Р11 на фоне моделируемой in vivo аритмии, выявлено 16 генов, воспроизводимо меняющих уровень экспрессии. Регулируемые препаратом гены кодируют белки внеклеточного матрикса (Gpcl, Timp2, Timp 3), внутриклеточного сигналинга (Did, Ptp4al, Pde4D, Pik3Rl, Gnal2), гликолиза (.Pfkl), межклеточного взаимодействия (Jup), системы гемостаза (Plat), мембранно-связанных насосов и транспортеров (Slclóal, Atpla), и другие (C-fos, Tip, Anxal). Полученные нами данные об избирательном влиянии Р11 на гены, продукты которых вовлечены в механизмы аритмогенеза, позволяют

рассматривать это соединение в качестве перспективного средства патогенетически ориентированной фармакотерапии аритмий.

Проведено углубленное изучение молекулярных механизмов действия препарата аллапинин. Установлено, что на фоне аконитиновой аритмии аллапинин вызывает увеличение уровня мРНК генов, кодирующих различные типы Ю-каналов (Кспаб, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, Kcnq4), Са2+-канала (Cacnalg), везикулярного переносчика ацетилхолина (Slcl8a3). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих Ыа+-канал {Scn8ä), К+-каналы (Kcnel, Kcnsl), генов мембранных транспортеров {Atp4a, Slc6a9). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях аконитиновой аритмии аллапинин модулирует экспрессию генов Na+-, K+-, Са2+-каналов, проводящих ионные токи (/,\д It0 Jks Д/ 1сат), которые участвуют в формировании различных фаз потенциала действия. Выявленное влияние препарата на уровень мРНК генов, кодирующих переносчики ацетилхолина и глицина, позволяет сделать предположение об участии указанных нейромедиаторов в механизмах реализации антиаритмических свойств аллапинина.

Получена тест-система для определения аритмогенной активности исследуемых соединений, в основе которой лежит подход, основанный на детекции изменений мембранной локализации калиевого канала hERG при действии тестируемых соединений (Wible et al., 2005). Нами предложен более точный и чувствительный способ детекции взаимодействия исследуемых соединений с калиевым каналом hERG с использованием проточного цитофлуориметра. Впервые получены данные об отсутствии ингибирующего влияния на поверхностную экспрессию белков каналов hERG лекарственными соединениями PI 1 и аллапинин.

аритмий. Доклинический скрининг соединений с помощью разработанной нами тест-системы даст возможность отбирать потенциально кардиотоксические соединения на ранних стадиях разработки соединений в качестве лекарств и исключать их из дальнейшего исследования. Знания о молекулярных механизмах формирования антиаритмической активности лекарственных соединений позволят прогнозировать спектры фармакологических свойств и возможные побочные эффекты препаратов, а также откроют новые перспективы их клинического применения.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII Всероссийской научной конференции с международным участием "Химия и Медицина" (Уфа, 2010), XV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2011), IV Съезде фармакологов России "Инновации в современной фармакологии" (Казань, 2012), III Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии "Биомика-наука XXI века" (Уфа, 2012). П�

Информация о работе

Фарафонтова, Екатерина Ивановна
кандидата биологических наук
Уфа, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярные механизмы антиаритмической активности лекарственных препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы