Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ДЕКОРАТИВНО- ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ДЕКОРАТИВНО- ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР"

МИРОНОВА Ольга Юрьевна

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ

ТЕХНОЛОГИЙ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководитель - доктор биологических наук Е А Калашникова

Официальные оппоненты

доктор сельскохозяйственных наук В А Высоцкий

кандидат биологических наук П В Лапшин

Ведущая организация Главный ботанический сад им Н В Цицина РАН

Защита диссертации состоится / декабря 2004г в .АЗ

часов на

заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К А Тимирязева по адресу 127550, „ Москва, ул Тимирязева, 49, отдел защиты диссертаций, тел /факс 976-40-7 976-29-10, 976-29-84

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотек МСХА им К А Тимирязева

Автореферат разослан « ноября 2004 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Карлов Г И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В связи с возрастающим интересом и спросом в России на новые растения и развитием внутреннего и внешнего озеленения строений, а также необходимостью сокращения импорта посадочного материала низкого качества становится актуальной проблема массового размножения однолетних и многолетних декоративно-цветочных культур. Наличие инфекционного фона у посадочного материала сказывается не только на качестве цветения, внешнем виде и продолжительности жизни растений, но и на заражение окружающей среды опасными патогенами, что оказывает отрицательное влияние на экологию данного участка. ;

Эта проблема может быть успешно решена методом клонального микроразмножения, который используется не только в коммерческих целях, но и для выявления общих закономерностей морфогенеза растений, их особенностей и проявления в условиях iv vitro.

Декоративно-цветочные культуры относятся к различным, как правило, отдаленным друг от друга ботаническим таксонам, значительно отличающихся уровнем тотипотентности клеток и регенерационным потенциалом, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения. При оптимизации таких технологий массового производства растений важно обеспечить их экономическую эффективность за счет снижения затрат на химические реактивы, удешевления питательных сред и повышения адаптационной способности пробирочных растений к условиям in vivo при увеличении выхода и качества конечной продукции.

В настоящее время такие страны как Голландия, Дания, Бельгия, Польша, США и др. широко применяют данный метод для размножения декоративных, цветочных, кустарниковых и других видов растений. Однако сведения в литературе по вопросу клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур противоречивы или технологии приведены не полностью. В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было разработать новые, усовершенствовать существующие и предложить универсальные технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур в условиях in vitro.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методику введения в культуру in vitro различных типов эксплантов и изучить зависимость прямой регенерации от типа первичного

ЭКСПЛаНТа: _ ЦНБМСХА

.ФОНД ручной литературы

- изучить рост и развитие пробирочных растений на разных этапах клонального микроразмножения;

- подобрать оптимальные питательные среды и условия культивирования эксплантов на разных этапах клонального микроразмножения,

изучить факторы гормональной и негормональной природы, влияющие на процессы ризогенеза,

- апробировать альтернативные питательные среды для замены среды Мурасиге-Скуга для хризантем и сенполий,

- разработать эффективные способы адаптации пробирочных растений к почвенным условиям,

- провести сравнительную экономическую оценку применения вегетативного и клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур

Научная новизна. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro групп декоративно-цветочных культур луковичных (гиацинт, лилия, рябчик), побеговых (хризантема, бальзамин) и листовых (сенполия, петуния, бегония), разработана универсальная технология клонального микроразмножения на основе прямой регенерации растений из первичного экспланта, обеспечивающая сохранение морфофизиологических и хозяйственно-ценных признаков растений-доноров

Впервые на исследуемых сортах хризантемы и гиацинта показана возможность их размножения в культуре in vitro с использованием в качестве первичного экспланта листовых пластинок Эта технология позволяет многократно увеличить коэффициент размножения и сохранить целостность маточных растений

Впервые для хризантем и сенполий испытаны комплексные минеральные смеси питательных сред, использование которых позволяет сократить время на их приготовление и снизить стоимость в 8 раз, а также проводить консервацию растений до 6-8 месяцев без пересадки при сохранении стандартных устовий культивирования.

Разработаны новые технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных растений, предусматривающие сокращение технологического цикла в культуре in vitro с трех этапов до двух (за счет исключения стадии укоренения на питательной среде), получить чистый посадочный материал на 1,5-2 месяца раньше и в 2 3 раза дешевле, чем при традиционной технологии.

Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработанные технологии предложены для практического применения в меристемных лабораториях (для фирм-производителей, совхозов и др. учреждений), использование которых позволит снизить затраты на

производство рассады в 2-3 раза по сравнению с традиционными способами и обеспечить промышленное цветоводство элитным посадочным материалом.

Предлагаемые методики регенерации целых растений из изолированных соматических тканей могут быть применены в клеточной селекции и генной инженерии декоративно-цветочных растений на устойчивость к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды, при выведении новых сортов и восстановлении генотипического разнообразия флоры, а также в физиологических и генетических исследованиях.

Результаты экспериментальных исследований и теоретические обобщения . работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов МСХА агрономических и биологических специальностей по курсу «Сельскохозяйственная биотехнология».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Апробация работы

Научные разработки экспонировались на различных выставках с 2001 года по 2004 год и были отмечены серебряной медалью ВВЦ (2001г.), в том числе на ежегодной Международной выставке «Цветы-2002» на ВВЦ, на ежегодной Всероссийской выставке «НТТМ-2004» (работа удостоена именных медалей выставки). Результаты исследований были доложены на 2-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на научной конференции, посвященной 160-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2003); на конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004); в клубе любителей комнатных растений г. Москвы.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа изложена на / У Л страницах компьютерного текста, содержит —^таблиц и ■^рисунков. Список использованной литературы включает / источников, из них у/ на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили гиацинт, рябчик, лилия, бегония, петуния, сенполия, хризантема, бальзамин.

Культуры были объединены по группам: первая группа - луковичные (гиацинт, рябчик, лилия); вторая группа - листовые (бегония, петуния, гиацинт, сенполия, хризантема); третья группа — побеговые (бальзамин и хризантема). Разделение на группы обусловлено общими методами введения в культуру т

vitro, а затем на этапе микроразмножения растения были объединены по технике их культивирования

В качестве первичных эксплантов использовали у лилии и рябчика -сегменты чешуй, у гиацинта - сегменты чешуй и листьев, у бальзамина -побеги; у хризантемы и петунии - побеги и листовые пластинки, у бегонии и сенполии — листовые пластинки. В работе были исследованы следующие генотипы

БАЛЬЗАМИН, махровый бальзамин Уоллера, Конголезский (Impatiens

congolensis), Серия «Paradise» (белый, красный, розовый)

БЕГОНИЯ - "Comtesse Louise Erdoedi", В rex "Merry Christmas", В rex, В

tiger

ХРИЗАНТЕМА — сорта Дипломат, Делана, Инга, Вестланд, Аленушка, Кружевница, Снежок, Рыжик, Мальчиш - Кибальчиш, Липстик ПЕТУНИЯ - 2 сорта серии Пикоти (крупный цветок синей или красной окрасок с широкой белой каймой), 2 сорта серии Звездопад (красный или синий крупный цветок с белыми полосами, исходящими из центра в виде звезды) ГИАЦИНТ - Белые. Carnegie, White Pearl; розовые Anna Marie, Pink Pearl, красные- Jan Bos, Cyclope, синие Delft Blue, Sky Jacket; сиренево-фиолетовые Amethyst, Pearl Brilliant, желтые City of Harlem, Gipsy Queen РЯБЧИК (фритиллярия) — императорский

СЕНПОЛИЯ: Зеленолистные Blue Dragon, Arapahoe, Victorian Valentine, Music Box Dancer, Зима улыбается. Карнавал Пестролистные Midnight Romance, Old Fashion Love, Apache Shadows, Pink Chablis, Pink Sensation Химеры King David, Ness Cherry Confection, Northern Reflection

ЛИЛИЯ— 4 сорта азиатских (America, Yellow and Brown, Batist, Vivaldi) и 4 сорта восточных (Star Gaser, Marco Polo, Сибирь, Muscadet) гибридов

Техника культивирования in vitro, В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА методик приготовления и стерилизации питательных сред, инструментов и оборудования, изложенных в изданном коллективом кафедры практикуме «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996,2004)

Изолирование и стерилизация первичных эксплантов. В качестве первичного экспланта использовали сегменты листовых пластинок, побегов, а также чешуи луковиц Экспланты стерилизовали 0,1% раствором сулемы с подбором оптимального времени их обеззараживания и многократным промыванием стерильной дистиллированной водой Оптимальное время стерилизации определяли по жизнеспособности первичных эксплантов и зараженности фитопатогенами

Регенерация декоративно-цветочных культур. Для культивирования декоративно-цветочных растений (ДЦР) использовали минеральную основу питательной среды Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) в сочетании с агаром и сахарозой. В качестве регуляторов роста в питательные среды добавляли БАЛ, кинетин (К), эпин, циркон, НУК, ИУК, ИМК, 2,4-Д в различных концентрациях и комбинациях.

Укоренение растений. Исследованы факторы, влияющие на интенсивность ризогенеза микрокультуры декоративно-цветочных растений, такие как: пониженные концентрации сахарозы, цитокининов и ауксинов, а также возможность исключения из технологии микроразмножения этапа укоренения микрокультуры перед их адаптацией.

Адаптация растений. Для адаптации отбирали микрорастения различного размера с хорошо сформированной корневой системой на этапе микроразмножения. Изучена адаптационная способность микрорастений в различных почвенных субстратах. При завершении 3-4-х недельной адаптации растения пересаживали в нестерильные условия.

Условия культивирования. Культивирование эксплантов осуществляли в пробирках, чашках Петри, а также в колбах в климакамере, где поддерживалась относительная влажность воздуха 70%, температура от +15°С до +30°С, 16-часовой фотопериод. Освещение осуществляли белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 2,5-5 тыс. люкс. Условия культивирования эксплантов и растений-регенерантов подбирали индивидуально для каждой культуры, учитывая температурный и световой режим в климакамере.

В экспериментах оценивали: количество первичных эксплантов, способных к прямому морфогенезу; интенсивность роста и развития микрокультуры; скорость вторичной регенерации; коэффициент размножения; способность к ризогенезу и адаптации микрорастений к почвенным условиям.

Статистическая обработка результатов исследований. Опыты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М ± т, где М - математическое ожидание, а т-доверительный интервал (Доспехов, 1985). Анализ данных проводили на ЭВМ с использованием программ Straz и Excel.

ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ

Процесс клонального микроразмножения растений начинается с изолирования экспланта, его стерилизации и посадки на питательную среду. Методами индивидуального отбора первичных эксплантов растений и сезона введения в культуру in vitro было показано, что эффективность данного этапа зависит от многих факторов, в том числе: типа стерилизующего агента и

времени обработки, видовых и сортовых особенностей растений, типа первичного экспланта, возраста и качества растительного материала. Наши исследования показали, что для всех изучаемых культур оптимальным сезоном изоляции первичных эксплантов является весна, а период, при котором экспланты характеризуются низкой регенерационной способностью - период с октября до конца декабря С целью освобождения раститечьного материала от внешней инфекции и получения высокого выхода жизнеспособных эксплантов на первом этапе технологии клонального микроразмножения растений играет важную роль выбор стерилизующего агента и продолжительность его действия. В качестве стерилизующего вещества использовали 0,1%-ный раствор сулемы Установлено, что для чешуй луковичных культур оптимальное время стерилизации сулемой составляет 15-20 минут; для листовых эксплантов (сенполия, хризантема, петуния, гиацинт, бегония) — от 40 секунд (для петунии) до 5-6 минут (для бегонии), для побегов (хризантема, бальзамин) - 1,5 - 4 минуты Коррекция времени стерилизации по культурам зависела от толщины, физиологического состояния (стадии развития) и качества первичного экспланта (опушенность, гладкость, жесткость)

Использование растений - маточников отечественного тепличного и зарубежного производства для введения в культуру

in vitro

С целью выявления наличия внешней и внутренней инфекций для введения в культуру ш vitro растений зарубежного производства (Голландия, Дания, Германия, США и т д) оптимальным сроком является осенний период Экспериментально установлено, что наряду с проявлением внешней инфекции отмечено появление на 5-7 день культивирования первичных эксплантов и внутренней (бактериальной) инфекции, которые подавляли процессы регенерации у эксплантов и наблюдалась гибель растительной ткани Для ингибирования развития внутренней инфекции были использованы антибиотики Наилучшим препаратом для оздоровления эксплантов оказался «Ампиокс», который добавляли непосредственно в питательную среду после автоклавирования С целью снижения содержания внутренней инфекции в растениях был использован прием естественного оздоровления для уличных -высадка в открытый грунт сроком не менее чем на 1 год, для комнатных -содержание в условиях пониженной влажности не менее чем 6 месяцев

Зависимость морфогенеза от полярного расположения первичных эксплантов на питательной среде Установлено, что существует зависимость образования первичных регенерантов от полярного расположения эксплантов на питательной среде Так, у бегоний наблюдали активную первичную регенерацию на нижней

стороне листовой пластинки, в то время как на верхней — морфогенез был замедлен в 2 и более раз в зависимости от исследуемого сорта. Для сенполий и петуний расположение эксплантов на питательной среде не имело значения, так как регенерация с успехом происходила на обеих сторонах листа. У лилий образование микролуковичек происходило только на внутренней стороне чешуи, у гиацинтов - в равной степени на обеих сторонах чешуи, а для рябчиков — на всех сторонах экспланта, включая срезы.

ПЕРВИЧНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ

РАСТЕНИЙ

Регенерация растений является центральной частью методологии культуры клеток и тканей. Отсутствие данного процесса исключает исследования в области роста и дифференциации, гибридизации, генетической трансформации, а также теряет свою значимость при клонировании ценных генотипов.

В этой связи нами проведены исследования, лозволяющие инициировать первичную регенерацию декоративно-цветочных растений (ДЦР) в культуре in vitro и определить факторы, оказывающие влияние на этот процесс.

Эксплантами для получения первичной регенерации растений служили сегменты листьев, чешуй и побегов, которые помещали на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую различные концентрации и сочетания фитогормонов (2,4-Д, БАП, ИУК).

Установлено, что введение в питательную среду ауксинов в сочетании с цитокининами стимулировало образование первичных и вторичных регенерантов в 1,5 и более раз по сравнению с использованием только цитокининов. Возможно, данный эффект вызван синергизмом'— эффектом взаимного усиления действия веществ. Наглядно данное взаимодействие представлено на сенполиях (Табл. 1).

В ходе работы выявлена низкая жизнеспособность у темно — окрашенных сортов луковичных и пестролистных форм растений как на этапе введения в культуру так и на этапе микроразмножения и вторичной регенерации. Данная реакция эксплантов, вероятно, связана с выделением в питательную среду веществ фенольной природы, которые ингибируют процессы дифференциации и последующее развитие сформировавшихся меристематических очагов. В качестве антиоксиданта в питательную среду была добавлена аскорбиновая кислота (АК) в концентрации 20 - 50 мг/л. Показано, что применение АК необходимо только на средах, содержащих ИУК. При наличии НУК в питательной среде добавление АК не требовалось.

Табчица I

Влияние фитогормонав на первичную регенерацию растений из чистовых

пластинок сенполий

Гормоны, мг/л

Форма 0,5 БАП 0,5 БАГЬ-0,5 ИУК | 1 БАП+1 ИУК

ДР К ДР К , ДР | К

зеленолистные 32±4 21±6 22 ±3 36±6 1 18±2.к 68±7

пестролистные » * 25-4 14±3 | 21±3 1 33±4

химеры 34±5 18±3 24±3 28±5 ' 22±3.к ! 52±6

*- низкая жизнеспособность первичных зксплантов, ДР - дней регенерации, К-количество первичных микророзеток на одном тспланте, к- каллусогенез.

Табчица 2

Влияние фиторег\ чяторов на продолжительность первичной регенерации из сегментов чешуи чуковицы гиацинта

Сорт Цвет С аскорбиновой кислотой | Без аскорбиновой кистоты

6-БАП, мг/л

1 2 3 3 1 2 3 3

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

ИУК ИУК ИУК 2.4-Д ИУК ИУК ИУК 2.4-Д

Дней регенерации

Carnegie белый - 28±3 24±2 24±2 - 28±2 25±2 26=t2

White Pearl белый - ЗЬсЗ 30±3 29±3 - 30±3 30±3 2&±2

Sity of Haarle желтый - 26±2 23±2 25±2 - 27±2 25-t2 ">2±2

Gipsy Queen тососев - 31±4 24±2 28±4 - 30±4 26±2 28±3

Pink Pearl розовый - 28±3 25±2 25±3 - 27±2 24±2 25±3

Anna Mane розовый - 28±2 27±3 19±3 - 29±3 27±2

Jan Bos малин - 33 ±3 30±3 30±4 - * * *

Cyclope красный - 30±2 22±2 29±3 - * * *

Skv Jacket св -син - 37±4 31±4 43±4 - * ♦ #

Delft Blue синий - 32±3 28±3 21±2 - * * #

Amethyst фиол - 29±3 20±2 25±3 - ♦ * *

Pearl Brilliant т -гол - 24±2 23*2 24±2 - * * .... * ......

- регенерация не наблюдалась в течение 2-х и более месяцев.

*- регенерация не наблюдалась в течение 2-х месяцев и составила не более 15%

Возможно, это связано со специфическим воздействием каждого вещества, количественным содержанием обоих гормонов в питательной среде, с быстрым распадом ИУК по сравнению с НУК, а также консервирующим и антиоксидантным действием аскорбиновой кислоты. В ходе исследований нами обнаружено, что аскорбиновая кислота не оказывает отрицательного действия на экспланты, изолированные с растений светлоокрашенных сортов луковичных и зеленолистных форм растений (Табл. 2).

Замена в оптимальной питательной среде ИУК на 2,4-Д (0,5 мг/л) приводила к образованию более крупных луковичек (4±1 мм), но в меньшем количестве (3-5 штук на эксплант) по сравнению со средой, содержащей 0,5 мг/л ИУК. Такая тенденция наблюдалась у всех исследуемых сортов лилий и гиацинтов.

Для повышения коэффициента размножения и формирования более крупных луковиц лилий и гиацинтов нами было изучено совместное влияние двух ауксинов (2,4 - Д и ИУК в концентрации 0,5 мг/л) при оптимальной концентрации БАЛ (2 мг/л). В этих условиях культивирования, количество микролуковиц возросло в среднем на 20-26%, а диаметр увеличился на 24-29%.

Для луковичных культур на этапе первичной регенерациив ходе исследований были подобраны 2 оптимальные питательные среды: 1) 1 мг/л БАЛ + 1 мг/л НУК; 2) 1,5-2 мг/л БАЛ + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л 2,4-Д + АК. Первую среду можно рекомендовать для получения крупных луковиц, а вторую — для повышения коэффициента размножения.

У всех исследованных видов декоративно-цветочных растений, для которых характерно использование в культуре тканей в качестве первичных эксплантов побегов, наблюдали общие закономерности. Так, например, для разработки технологии клонального микроразмножения . бальзаминов, хризантем, петуний в культуру in vitro были введены черенки с 1- 4 пазушными почками (узлами). Оптимальный размер побега при введении в культуру тканей составил побег с 2 узлами независимо от генотипа и вида растения. При использовании в качестве первичного экспланта черенка с 3-4 узлами происходило медленное развитие пазушных почек (на 10-15 дней позже), из которых формировались тонкие побеги. У черенков с 1-й пазушной почкой наблюдали также замедление в развитии пазушных почек (на 5-9 дней), при этом гибель черенков составляла у бальзаминов - 19%, у петуний - 34%, у хризантем - 31%.

Изучали влияние различных концентраций сахарозы (10 — 120 г/л) на первичную регенерацию всех исследуемых растений. Исследования показали, что оптимальная концентрация источника углеродного питания на первом этапе составила для побеговых и листовых - 20 г/л, для луковичных — 30-40 г/л. В этих условиях наблюдалось образование микрорастений правильной

морфологии Уменьшение концентрации сахарозы в питательной среде индуцировало ризогенез, а более высокие - каллусогенез у всех исследуемых сортов

Анализ экспериментальных данных показал, что на этапе первичной регенерации существовало несколько исключений, например, лилия -единственная культура из изученных луковичных растений, у которой уже на этапе введения в культуру m vitro образовывались микролуковички оптимального размера (не требующих доращивания) для адаптации их к почвенным условиям, а для бальзамина был отмечен не стандартный путь формирования полноценных микрорастений Установлено, что активация роста надземной части бальзаминов происходила только в том случае, если первоначально дифференцировалась корневая система. Экспериментально установлено, что наличие БАП в питательной среде в любых концентрациях оказывало отрицатечьное влияние на развитие побегов только хризантем в условиях in vitro, вызывая при этом остановку его роста и образование каллуса в основании черенка

Влияние биологически активных веществ на первичную регенерацию растений из чешуи и листовых сегментов гиацинтов Изучено влияние биологически активных веществ на первичную регенерацию из сегментов чешуй и листьев гиацинтов

Фиторегулятор «Циркон» При изучении влияния фиторегулятора «Циркон» в концентрациях 0,5-3 мг/л наилучшие результаты были получены на среде МС, содержащей 2 или 3 мг/л циркона в сочетании с 0,5 мг/л ИУК. Для всех сортов процесс регенерации длился от 21 до 59 дней, при этом микролуковички формировались правильной формы диаметром 3±1 мм, и их количество составляло от 2 до б шт на один эксплант в зависимости от сорта (Табл 3)

Сочетание циркона с 2,4-Д в питательной среде во всех вариантах приводило к интенсивному образованию каллуса

Таким образом, можно рекомендовать использовать циркон в концентрации 2-3 мг/л для получения первичной регенерации на чешуях луковиц и листовых сегментах гиацинта как альтернативная замена БАП

Фиторегулятор «Эпин». При использовании фиторегулятора «Эпин» в концентрации 1-3 мг/л для получения первичной регенерации гиацинта также наблюдали образование микролуковичек Однако их формирование происходило на эксплантах неравномерно, а продолжительность этого этапа составила 2 месяца (Табл 3), что не позволяет использовать данный препарат в технологии промышленного микроразмножения Возможно, необходимо использовать более высокие концентрации препарата

Таблица 3

Влияние различных концентраций циркона и эпина на первичную регенерацию гиацинта из сегментов чешуи луковицы (среда МС, содержащая ИУК 0,5 мг/л)

Сорт Циркон, мг/л Эпин, мг/л

1 2 3 1 2 3

Дней регенерации

Carnegie 59±3 22±3 25±3 - 54±7 38±4

White Pearl 54±2 27±4 27±4 - 51±5 37±3

Sity of Haarle 50±3 21±3 23±3 - 50±4 40±4

Gipsy Queen ■ - 26±4 28±4 - 56±7 42±5

Pink Pearl 54±3 30±3 26±3 - 52±5 39±4

Anna Marie 52±3 31±4 29±4 - 50±3 41±4

Jan Bos - 30±2 28±3 - 49±4 36±5

Cyclope 49±5 27±3 28±4 - 47±5 48±6

Sky Jacket • - 32±2 31±5 - 51±7 41±4

Delft Blue - 27±4 25±3 - 53±6 46±5

Amethyst - 29±3 28±4 - 49±3 42±3

Pearl Brilliant 29±4 27±3 - 54±4 49±4

- регенерация не наблюдалась в течение 2-х и более месяцев.

Таким образом, в результате проведенных исследований по первичной регенерации растений в условиях in vitro можно сделать следующие выводы: 1. установлена зависимость первичной регенерации растений от сезона изоляции эксплантов; 2. выявлена зависимость процессов морфогенеза от полярного расположения первичного экспланта на питательной среде; 3. показана зависимость частоты регенерации растений от интенсивности окраски цветка и листа для декоративно-цветочных растений. Растения с белыми и светлоокрашенными цветками и зелеными листьями обладали повышенным морфогенетическим потенциалом, а темно окрашенные — низким. Оптимальные питательные среды для каждой группы культур представлены в табл. 4.

Таблица 4

Выбор питательной среды на основе МС для получения первичной регенерации в зависимости от типа жспланта

Культура Тип экспл анта Время стерили зации С, г/л АЬ Оптимальная питательная среда Время первичной регенерации

гиацинт ч 12-15 мин 30 +- 1)2 мг/т БАП+ 0,5мг/л ИУК, 2) 2 чг/л БАП + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л 2,4-Д, 3) 2-3 мг/л циркона 0,5мг/л ИУК, 4) 1 мг/л БАП + 1 мг/л НУК 30 дней

л 6-8 мин 30 + 1)2-3 мг/л БАП + 0,5 мг/л ИУК, 2) 2-3 мг/л БАП + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л 2,4-Д, 3) 2-Змг/л циркона + 0,5 мг/л ИУК 25 дней

лилия ч 15 мин | 40 1 + 1) 1,5 мг/л БАП + 0,5 мг/л ИУК +0,5 мг/л 2,4-Д, 2) 1 мг/л БАП +1 мг/л НУК 25-30дней

рябчик ч 20 мин 30 + 1) 2 мг/т БАП + 1 мг/л ИУК, , 45дней 2) 1 мг/л БАП + 1 мг/л НУК 1

бегония 7 2-4 мин + 2.5 мг/л БАП 1- I мг/л ИУК 25 -30 дней

сенполия 1 1 мин 20 - 0,8 мг/л БАП + 0.8 мг/л ИУК 20-22 дня

петуния Л 40 сек 20 - 0.5 чг/л БАП + 0,5 мг/л ИУК 12-16 дней

п 1 мин 20 - 0.5 мг/л БАЛ + 0,5 мг/т ИУК 8-10 дней

хризантема л 1,5 мин 20 - 5 мг/л НУК 1 20 - 25 дней

п 2 мин 20 - 0,5 мг/л ИУК ' 6-!0 дней

бальзамин п 3-4 мин | 20 - 2 мг/л БАП + I мг/л ИУК | 20-25дней

А К - аскорбиновая кислота; п — побег; л - лист, ч - чешуи луковиц; С - сахароза

ОСОБЕННОСТИ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И ВТОРИЧНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ПЧ УГЛЮ

Вторым этапом технологии клонального микроразмножения растений является собственно микроразмножение, при котором добиваются получения максимального количества микропобегов или микролуковиц за счет вторичной регенерации. На этом этапе экспланты культивировали на ранее оптимизированных нами средах В результате для каждой группы культур были подобраны уникальные условия культивирования, при которых сохранялся

высокий коэффициент размножения, особенности форм, окраски, химерность Обобщенные данные представлены в таблице 5 На втором этапе технологии клонального микроразмножения были отменены общие закономерности при культивировании гиацинтов, лилий и рябчиков in vitro

Таблица 5

Выбор компонентов питательной среды на основе МС и температурного режима для кучътивирования декоративно-цветочных кучьтур на этапе

микроразмножения

Род

Фиторегуляторы, мг/л

Вторич- Растений ный (ед ) в год эксплант

АК, мг/л

I Саха роза, г/т

t культивирован ия, °С

гиацинт

лилия

j рябчик

1) 1,5 БАЛ + 0,5 ИУК + 0,5 2,4-Д,

2) 1 БАП+ 1НУК

Ч,Л

>16 400

40

30-40 | +20-22

>50 000

>20 000 I

I бальзамин бегония

2 БАП + 1 ИУК 1,5 БАП ИУК

+ 0,5

П

Л

>50 000 1 -

>100 000 25-30

25-30

+22-27

+22-25

петуния сенполия

0,5 БАП (К) ИУК

0,5 Л

>100 000

15

+20-22

-22-25

0,5 ИУК

П

>50 000

I -

•21-26

хризантем

Л -лист, Ч - чешуя, П - побег, АК- аскорбиновая кислота.

Вторичную регенерацию гиацинтов и лилий можно стимулировать также и на этиолированных участках тистьев, а у рябчика - на корневых сегментах, что в дальнейшем позволило нам увеличить коэффициент размножения данных растений без повреждения микролуковиц Сформировавшиеся луковицы в этом случае не отличались по морфологии от туковиц, индуцируемых на сегментах микрочешуй

Общую закономерность наблюдали у луковичных культур, связанную с зависимостью коэффициента размножения от окраски цветков темно -окрашенные сорта характеризовались низким коэффициентом размножения и медленным ростом формирования растений Аналогичная зависимость была выявлена у незеденолистных бегоний и пестролистных сенполий

Храпение и консервация некоторых культур in vitro Одним из мало изученных этапов клонального микроразмножения растений является консервация и хранение микрокультуры в условиях in vitro Это важно при создании банков пробирочных растений и необходимостью периодического их вывода из условий m vitro для адаптации к почвенным условиям

В результате исследований обнаружено, что использование некоторых химических факторов и условий культивирования приводило к торможению ростовых процессов и консервации растительного материала в течение субкультивирования в стандартных условиях. Данный факт можно использовать для создания и поддержания Банка декоративно-цветочных растений и для микроразмножения и адаптации микрокультуры по мере необходимости, в том числе в коммерческих интересах.

Показано, что аскорбиновая кислота в высоких концентрациях являлась консерватором при культивировании микрокультуры бегоний, благодаря которой рост растений замедлялся, а пассаж увеличивался до 4-6 месяцев в зависимости от генотипа.

Хранение микрокультуры хризантем и луковичных растений в стерильных условиях при пониженных температурах позволяла сохранять данные растения длительное время без пересадки: хризантемы - до 4 мес. и луковичные - до 1 года.

Культивирование микрокультуры сенполий и хризантем на ^ нетрадиционных питательных средах, содержащих комплексные минеральные смеси (КМК, КМР, KMC) (Табл. 6) наблюдали замедление ростовых процессов. На среде KMC наблюдали 100% отсутствие роста и развития розеток сенполий, при этом жизнеспособность растений сохранялась до 12 месяцев при пассажах 1 раз в 6 мес. Питательная среда на основе КМК была признана не пригодной для культивирования сенполий и хризантем в связи с их низкой жизнеспособностью. Таким образом, смесь KMC была признана оптимальной средой для длительного депонирования микрокультуры сенполий.

Таблица б

Состав минеральных смесей КМК, KMC, КМР (в %)

Компоненты КМК КМР KMC

Азот общий 16,0 10 16,0

Фосфор 20,6 5 7,3

Калий 27,1 20 24,1

Железо 0,1 - 0,1

Бор 0,02 0,01 0,01

Медь 0,01 0,01 0,005

Марганец 0,1 0,1 0,1

Молибден 0,002 0,001 0,002

Цинк 0,01 0,01 0,01

Применение различных концентраций сахарозы на разных этапах технологии микроразмножения

Применение сахарозы в культуре тканей сенполий, петуний и бегоний зависит от задачи, стоящей в эксперименте. Так как разрабатываемые технологии предусматривали отсутствие специальной стадии для ризонегенеза микрорастений, то оптимальная концентрация сахарозы составила 15 г/т При данной концентрации сахарозы наблюдали сохранение высокого коэффициента размножения, развитие микрокультуры правильной морфологии с одновременным образованием хорошо развитой корневой системы, что позволяло уже на этапе микроразмножения отбирать розетки оптимального размера для их адаптации В случае необходимости нарашивания большого количества микророзеток в питательную среду добавляли 20 г/л сахарозы, при которой корневая система практически не формировалась Высокие концентрации сахарозы (25 г/л и выше) оказывали стимулирующее действие на каллусогенез и не зависели от вида растений

Оптимальные концентрации сахарозы были подобраны с целью получения максимального количества микрорастений на всех этапах технологии Обнаружена зависимость морфогенеза от применяемых концентраций сахарозы. Установлены ее оптимальные концентрации для получения максимального количества микрорастений и формирования хорошо развитой корневой системы Пропорциональное развитие микрокультуры исследуемых нами растений наблюдалось при использовании в питатечьной среде промежуточных концентраций сахарозы между концентрациями, применяемых при получении прямой регенерации на этапе введения в культуру in vitro и процессами укоренения микрорастений

УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ МИКРОКУЛЬТУРЫ ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ К ПОЧВЕННЫМ УСЛОВИЯМ

Одним из наиболее ответственных этапов технологии клонального микроразмножения растений является адаптация регенерантов in vivo. В результаты исследований установлено, что для большинства исследуемых кутьтур этап укоренения мог отсутствовать в технологии клонального микроразмножения, так как при микроразмножении наблюдали спонтанное образование корней Например, луковичные растения хорошо адаптировались как с корневой системой, так и без нее, а листовые и побеговые группы (от 30% - у петуний до 100% - у бальзаминов) имели развитую корневую систему, позволяющую адаптировать их, минуя этап ризогенеза, что было применено в нашей работе Данный прием позволил сократить сроки выхода конечной

продукции приблизительно на 1-1,5 месяца. Процент укоренившихся растений варьировал от 30 до 65%.

Адаптация микрокультуры к почвенным условиям

С целью получения 100% -ной приживаемости микрорастений при адаптации к почвенным условиям использовали несколько приемов. Например, побеговые культуры перед посадкой выдерживали в водных растворах ауксинов, луковичные — охлаждали, листовые - опрыскивали и т. д. Данные приемы позволяют получать максимально возможный выход растений. При этом все исследуемые культуры имеют оптимальный диапазон размеров микрорастений, при • котором они обладали наибольшей степенью приживаемости (Табл. 7).

Таблица 7

Выбор оптимального размера микрокультуры с максимальной адаптационной

способностью

Культура Микрокультура Параметры микрокультуры

минимальный длина корней

гиацинт микролуковица 0 1 см • —

лилия микролуковица 0 0,6-0,8 см —

рябчик микролуковица 01,2-1,4 см —

бальзамин микрорастение Ь 5 см 4 см

бегония микророзетка 11 2 см 2,5 см

петуния микрорастение Ь 4 см 3 см

сенполия микророзетка Ь 2 см 3 см

хризантема микрорастение Ь 3,5 см 4 см

0- диаметр микролуковиц, к — высота микрорастений

Для луковичных видов было показано, что оптимальный размер микролуковичек, способных адаптироваться к почвенным условиям, составил: для гиацинтов - 1 см, для лилий - 0,8 см, для рябчика — 1,2 см. При этом наблюдали прямую корреляцию между диаметром луковиц и их жизнеспособностью при адаптации. Вероятно, это зависит от диаметра микролуковиц, следовательно, от числа чешуй в луковице. Таким образом, с возрастанием числа чешуй в луковице возрастает адаптационная способность.

Для данной подгруппы осуществили два способа адаптации: 1) без охлаждения; 2) с охлаждением микрокультуры, т.е. стерильную культуру помещали в холодильную камеру (температура +4°С) на различные периоды времени 0,5 - 9 мес. Наилучший результат был получен при выдерживании микролуковиц в холодильной камере в течение 1 мес. При длительном хранении они уходили в глубокий покой, а при кратковременном (0,5 мес.)-

воспринимали охлаждение как стрессовый фактор Через год диаметр луковиц составил у лилий - 2,5 см, у гиацинта - 2 см, у рябчика - 2 - 3 см

Листовые культуры в отличие от луковичных растений при адаптации требовали повышенную влажность В случае отсутствия этого условия микрорастения теряли тургор и быстро погибали Для поддержания жизненного тонуса (высокой жизнеспособности) для исследуемых культур применяли микротеплички, частый полив и опрыскивание 100% -ную приживаемость наблюдали у растений, выведенных на этапе микроразмножения, при наличии хорошо развитой корневой системы

Установлено, что оптимальный грунт для адаптации бегоний - песок Приживаемость растений в этих условиях составила 86-100% в зависимости от сезонности вывода культуры

Наилучшим субстратом для адаптации сенполий является песок или сочетание торфа, опилок, песка в пропорции 1 1 1 Приживаемость микрокультуры составила 87%

Наилучшим субстратом для адаптации петуний оказался торф +■ песок -перегной (1.1:1), приживаемость микрокультуры в котором составила 89% Данная кутьтура требовала повышенной влажности при адаптации и дальнейшем выращивании

Наилучший грунт для адаптации бальзамина - торф песок (2 1) с I-кратным ежедневным опрыскиванием Приживаемость растений составила 96%

Таблица 8

Адаптационная способность декоративно-цветочных культур

Культура Ризогенез Время

I доращивания

Гормоны, мг/л Сахароза, г/л

гиацинт - - | 2 года

лилия 1,5 года

рябчик 12-3 года

бегония ♦0,8 ИУК, 0,50,8 цитокинина 15 '4-5 мес !

сенполия * 0,5 ИУК, 0,5 БАП 6-8 мес | |

петуния *0,5 ИУК, 0,3 цитокинина | 1-2 мес 1

хризантема * 0,5-1 ИУК 4-6 мес

бальзамин | 2-4 мес

• - в случае необходимости

Наилучший грунт для адаптации хризантем - торф + песок + перегной (1:1:1). 100%-ная приживаемость была достигнута при выдерживании растений в растворе ауксинов в течение 1 суток. Адаптация микрокультуры показала, что микрокультура, выращенная на питательной смеси КМК, оказалась наилучшей заменой среды Мурасиге-Скуга на этапе размножения, так как приживаемость таких растений составила 90 -100%.

Таким образом, полученные данные исследований можно обобщить в таблице 8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты показали, что качество разработанной технологии клонального микроразмножения необходимо оценивать по адаптации растений. Качество микрорастений (жизнеспособность, темпы роста и др.), выведенных из культуры in vitro на этапе микроразмножения, превышает качество микрорастений, выведенных из культуры после стадии ризогенеза. Вероятно, это связано с несколькими стрессами, которым подвергаются микрорастения на данных этапах: 1) на этапе ризогенеза - отсутствие цитокининов и низкое содержание Сахаров; 2) при адаптации — низкая влажность (быстрая потеря влаги) и слабый «защитный» слой эпидермиса. В первом случае наблюдали существенную остановку роста микрорастений и задержку их развития на 1 - 2 недели. При использовании разработанных нами технологий, предусматривающих выведение микрокультуры на этапе микроразмножения, пробирочные растения испытывали стресс только при адаптации, который компенсировался выдерживанием их в течение одних суток в водном растворе гормонов в низких концентрациях (рис. 1).

Анализируя полученные литературные данные можно объяснить наличие большого количества питательных сред с различным гормональным и углеводным составом. На наш взгляд существует зависимость морфогенетического потенциала от диапазона концентраций гормонов и Сахаров, используемых для культивирования. Эту зависимость можно представить в виде функции- у= 1/х, где у - концентрация сахарозы, х -экспериментально определяемая зависимость ауксинов от цитокининов (рис. 2).

Время

Время

1 - этап микроразмножения, 2 - этап ризогенеза, 3 - этап адаптации растений, 4 — доращивание растений-регенерантов, Р - морфогенетическяй потенциал растений

Рис 1 Изменение марфогенетического потенциала адаптированных растений на этапах ризогенеза адаптации и доращивания

Рцит(Гаук),у с

1 - этап микроразмножения, 2 - этап ризогенеза, 3 - этап адаптации растений, 4 — доращивание растений-регенерантов.

Рис 2 Зависимость марфогенетического потенциала от диапазона концентраций ормонов и Захаров при кучьтивировании микрокучьтуры

выводы

1. Клоналыюе микроразмножение растений — сложный многофакторный морфофизиологический процесс, состоящий из двух принципиально разных этапов, проходящих в разных условиях - in vitro и in vivo, базирующихся на процессах онтогенеза, морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro и на структурно-функциональной адаптации пробирочных растений в условиях in vivo. l

2. Установлено, что реализация морфогенетического потенциала декоративно-цветочных растений зависит от генотипа, соответствующей оптимизации состава питательной среды (минеральный состав, соотношение гормонов, концентрация углеводного источника), типа первичного экспланта, его полярности и времени изоляции, а также условий культивирования.

3. Впервые для луковичных (гиацинт, лилия, рябчик), побеговых (хризантема, бальзамин) и листовых (сенполия, петуния, бегония) групп растений разработана универсальная технология ' клонального микроразмножения, предусматривающая прямую регенерацию растений из первичного экспланта, которая обеспечивает сохранение морфофизиологических и хозяйственно-ценных признаков растения-донора.

4. Выявлено, что морфофизиологические процессы декоративно-цветочных растений в условиях in vitro зависят от соотношения гормонов (ауксинов и цитокининов) и концентрации сахарозы в питательной среде, которые находятся в обратно - пропорциональной зависимости, и может быть выражена функцией у=1/х, где у — концентрация сахарозы, х -экспериментально определяемая зависимость ауксинов и цитокининов.

5. Показано, что для сортов с темно — окрашенными цветками и незеленолистных форм растений необходимо присутствие в питательной среде аскорбиновой кислоты (30-50 мг/л), которая повышает жизнеспособность первичных эксплантов и растений-регенерантов.

6. Экспериментально доказано, что наличие сахарозы в питательной среде на этапе микроразмножения в промежуточной концентрации между применяемой для получения прямой регенерации и ризогенеза (15 г/л - для травянистых, 30 - 40 г/л ■ — для ■ луковичных) позволяет адаптировать микрокультуру, минуя последний этап технологии — укоренение.

7. Установлено, что применение нетрадиционных компонентов питательной среды (минеральная основа - КМК и регуляторы роста - циркон) являются альтернативной заменой питательной среды Мурасиге и Скуга и цитокинина -

БАП, которые позволяют сохранить высокий морфогенетический потенциал микрокультуры и получить качественный посадочный материал

8 Разработанная технология клонального микроразмножения декоративно-цветочных растений позволяет удовлетворить спрос потребителя и получать легко адаптируемый экологически чистый посадочный материал на 1,5-2 месяца раньше и в 2-3 раза дешевле, чем при традиционной технологии

Список научных трудов

1 Миронова О Ю , Калашникова Е А Влияние фитогормонов на размножение in vitro рябчика (Fntillana pérsica L ) // 2-я Международная научная конференция "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 2000

2 Миронова ОЮ Особенности микроклонального размножения рябчиков (Fntillana impenalis) // 6-я Международная конференция «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», 26-28 июня, Москва, 2001.

3 Миронова О Ю, Мещерская Е В Микроклональное размножение сенполий // Конференция «Памяти Грегора Менделя», Москва. 2001.

4 Шведова Е И, Миронова О Ю. Влияние регуляторов роста и условий выращивания на регенерацию бегонии в культуре in vitro // 6-я международная конференция «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», 26-28 июня, Москва, 2001.

5. Миронова ОЮ Микроклональное размножение хризантем для промышленного цветоводства // Доклады ТСХА Выпуск 275 М • МСХА, 2003

6 Миронова О Ю Выбор эксплантов для повышения коэффициента размножения в условиях in vitro // Актуальные проблемы генетики Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им Н И Вавилова, посвященной 115-летию со дня рождения Н И Вавилова 20-21 февраля, Москва, 2003

7 Миронова ОЮ Разработка технологии клонального микроразмножения рябчиков (Fritillaria impenalis) // Юбилейная международная конференция, посвященная 160-тетию Сухумского ботанического сада 22-25 мая 2001 г. Сухум, 2003.

8 Гераскина F О, Миронова О Ю, Вальдеррама Ромеро А С Влияние фитогормонов и типа первичного экспланта на регенерацию гиацинта восточного в культуре ш vitro // В сб-ке "Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений". Под рел Рейес Матаморос X М , Вальдеррама Ромеро А. С ; компания "Спутник +", Москва, 2003

9. Гераскина Е.О., Миронова О.Ю., Вальдеррама Ромеро А. С., Калашникова Е.А. Особенности клонального микроразмножения рода Бегония (Begonia L.) // в сб.-ке "Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений". Под ред. Рейес Матаморос X» М., Вальдеррама Ромеро А. С.; компания "Спутник +", Москва, 2003.

Ю.Шведова Е.И., Миронова О.Ю. Влияние фитогормонов и условий выращивания на регенерацию различных видов бегонии в культуре in vitro // Юбилейная международная конференция, посвященная 160-летию Сухумского ботанического сада. 22-25 мая 2001 г. Сухум, 2003.

11. Миронова О.Ю. Сравнение технологий вегетативного и микроклоналъного размножения хризантем для промышленного цветоводств // Сборник научных трудов международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенными» (22-25 марта 2004, Москва).

12. Калашникова Е.А., Миронова О.Ю. и др. Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. Изд. 2-е. М.: Изд.-во МСХА, 2004.

Объем 1,5 п. л._Зак. 263_Тир. 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44