Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы оптимизации репродуцирования in vitro различных представителей рода Rosa L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Факторы оптимизации репродуцирования in vitro различных представителей рода Rosa L."

fí-ЪЯШ

На правах рукописи

КРАСИЛЬНИКОВА Татьяна Анатольевна

ФАКТОРЫ ОПТИМИЗАЦИИ РЕПРОДУЦИРОВАНИЯ IN VITRO РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ROSA L.

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата бологических наук

МОСКВА 1999

Диссертационная работа выполнена в Лаборатории 6л чиологии и биохимии растений Главного ботанического с ада им Н В Цицина РАН

Научный руководитель—доктор биологичьских наук Е. Б. Кириченко.

Официальные оппоненты—доктор биологических наук, профессор В. В. Мазин, доктор сельскохозяйственных наук В. А. Высоцкий.

Вед\щее учреждение — Институт физиологии расгслн и\г К А Тимирязева, РАН

Зашита состоится « 1<)Ч<) г

в «44 > час на засед шин диссертациопног) ».овет« Д 120 35 07 в Московской сепьскочозяйственной академии имени К А Тимирязева

Адрес 127550, Чосква 330, Тимиря ¡свская у 4Ч Ученый совет Л1СХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ \\СХ\

Автореферат разослан <■ ^

Ученый секрета"^ диссертационного сове' доктор биологических

Е. Е. Крастина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Специфика регенерационных процессов при восссозда-нии целостных растений из изолированных апексов и возможности получения высококачественного посадочного материала ценных в ботаническом и экономическом отношениях объектов обуславливает теоретическую и практическую значимость исследований в области клонального микроразмножения растений.

Особый интерес в качестве объектов клонального микроразмножения представляют розы, в связи с тем, что многие представители рода Rosa L. при введении в культуру in vitro характеризуются низкой выживаемостью первичных эксплантов и низким коэффициентом микроразмножения. Технологии клонального микроразмножения представляют исключительную ценность для поддержания биоразнообразия коллекций роз ботанических садов и сохранения генофонда растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен в ограниченных экземплярах или находится под угрозой исчезновения.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей регенерации из вычленяемых меристем целостных растений разных представителей рода Rosa L., выявление благоприятных условий органогенеза на основных этапах цикла клонального микроразмножения (ЦКМ). В связи с этим решались следующие задачи:

- изучить регенерационные способности первичных эксплантов роз, относящихся к различным садовым группам, на начальном этапе введения в культуру in vitro;

- определить наиболее благоприятный состав питательной среды для инициации роста микропобегов роз и укоренения in vitro;

- выявить условия, обеспечивающие укоренение микропобегов эфиро-маслнчных роз и осуществить полный цикл их клонального мккроразмно-жения;

- изучить особенности пигментного аппарата и потенциаяьную способность фотоассимиляции СО г у репродуцируемых растений разных представителей рода Rosa L.;

- определить эндогенное содержание индолилуксусьой кисло1Ы с использованием иммуноферментного метода "ELISA" в микропобегах разных представителей рода Rosa L. на этапах их роста и субкультивирования;

- изучить возможность долговременного депонирования in vitro микропобегов разных представителей рода Rosa L.;

центральная научная Бг,5/1;-¡отека .

Мсх:к. оольскохсз. екадэмиа.

- изучить особенности развития и жилнеспосоОность витрорастений при их адаптации в нестерильных условиях и при выращивании в открытом грунте.

Научная новизна. Изучены особенности репродуцирования растении в цикле клоналъного микроразмножения (ЦКМ) у представителей рода Ro^a L., относящихся к различным группам (декоративные, дикие, эфиромаслич-ные). Впервые осуществлен ЦКМ для 3 сортов эфиромасличных роз Определен благоприятный состав компонентов питательной среды на основных этапах ЦКМ для указанных представителей рода Rosa L , обеспечивающий получение качественных растений - регенерантов с высокой зимостойкостью и эхорезистентностью в период их активной вегетации. Впервые изучены особенности пигментного аппарата и потенциальная активность фо-тоасснмнляции СОг у репродуцируемых растений роз. Показано, что формирующийся in vitro фотосинтстический аппарат храктеризуется пониженным уровнем содержания хлорофиллов и каротиноидов. низким отношением хлорофилл а / хлорофилл b и высокой потенциальной активностью фотоассимиляции СОг.

Впервые изучено эндогенное содержание индолилуксусной кислоты у микропобегов роз на этапах их роста н субкультивирования и показана ге-нотнпическая обусловленность уровня содержания ИУК в микропобегах разных представителей рода Rosa L.

Практическая значимость. Разработанные варианты технологии клоналъного микроразмножения разных представителей рода Rosa L. могут быть использованы для поддержания биоразнообразия коллекций роз ботанических садов (особенно редких и исчезающих видов), сохранения их генофонда, интродукции и селекции новых форм, получения качественного посадочного материала, применяемого в декоративном садоводстве. Показанная возможность использования цеолита в качестве добавок в составе субстратов на этапе адаптации регенерантов в нестерильной среде открывает перспективу их дальнейшего применения при клональном микроразмножении роз в промышленных масштабах. Определенный оптимальный режим депонирования микропобегов ш vitro можно использовать для создания коллекций ценных и редких сортов и видов роз

Реализация работы. Полученные в результате проведенной работы адаптированные регенеранты роз, находящиеся в ограниченном количестве в коллекциях ГБС РАН, переданы в Отдел декоративных растений для дальнейшего размножения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VIII Всесоюзной конференции по регуляторам роста (Киев, 1989), на Всесоюзной выставке "НТП и передовой опыт в агропромышленном комплексе" (1989), на V Всесоюзном симпозиуме "Основные направления научных исследований по интенсификации эфиромасличного производства" (Кишинев, 1990), на Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), на IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1996), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на VII Международной конференции "Биология клеток растений ш vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), на расширенных научных семинарах Лаборатории физиологии и биохимии растений ГБС РАН.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Миннауки РФ в рамках международного проекта "Новые растения" (1991 -1995 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ..

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и рекомендаций по практическому использованию результатов. Работа изложена на 169 страницах, содержит 35 таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает 105 работ отечественных авторов и 77 работ зарубежных исследователей.

ОБЪЕКТЫ, УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В программу исследований включены следующие представители рода Rosa L.: декоративные розы, принадлежащие к разным садовым группам -Helmut Schmidt, Esmeralda, Red Success - чайно-гибридные розы; Red Velvet, Forever Amber, Esperanzó- флорибунда; Rise'n Shíne, Midget - миниатюрные; эфиромасличные розы - сорта Украина, Радуга, Лань; дикие виды -R.multiflora, R.acicularis, R.divina.

В качестве инициальных эксплантов использовали изолированные апексы размером 0,3-0,6 мм, вычленяемые из латеральных почек, расположенных на различных частях побега в разные сроки вегетации.

Для оптимизации этапа стерилизации растительного материала испытывали различные стерилизующие агенты: гипохлорид кальция, пантацид, диацид.

В качестве основной использовали питательную среду с минеральными солями по прописи Мурасиге-Скуга (М.С.) с добавлением (мг/л) тиамина 1,0; пиридоксина 0,5; никотиновой кислоты 1,0; аскорбиновой кислоты 50,0; мезоинозита 100; глицина 2,0; сахарозы 30000, агара 6000-7000

Изучали влияние модифицированной среды М.С., включающей Са2\ М%2* (в 1,5 раза увеличенный уровень), Рег- и Мпг* (в 2 раза увеличенный уровень). Для индукции развития эксплантов использовали цитокинины -6-бснзиламинопурин (БАП), изопентенил-аденин (21Р), зеатин, кинетин в различных концентрациях (0,2; 0,4; 0,8; 1,0 мг/л)

Для изучения действия гибберелловой кислоты на стимуляцию роста микропобегов роз на начальном этапе культивирования добавляли ее в питательную среду в концентрациях I; 2 мг л На этапе укоренения концентрацию солей по М.С. уменьшали в 2 раза. Стимуляцию ризогенеза осуществляли различными обработками ауксинов (ПУК, ИМК, НУК), введением непосредственно в среду (1 мг/л); обработкой базальных зон микро побегов в растворе ИМК (концентрация 25, 50 мг л, экспозиция б часов)

Изучали действие регулятора роста ливала (концентрация 1 мг/л, раствор 25 и 50 мг/л, экспозиция 6 часов), салициловой кислоты (1, 10, 15 мг п) на процесс ризогенеза мнкропобегов роз

Для оптимизации этапа укоренения эфиромасличных роз испыгывалн среды: жидкие, агаризованные, комбинированные

Для изучения долговременного депонирования мнкропобегов роз использовали среду М С. с повышенным содержанием Са, Мп, Ре, СаС1. заменяли на Са(ЫОз)г, КН2РО4 увеличивали в 2 раза В среду добавляли БАП (0,8 мг/л) или исключали его из среды, вносили АБК (1,5 мг'л) в зависимости от варианта опыта.

Для адаптации витрорастений роз в нестерильных условиях испыты вали различные субстраты с включением цеолита (Сокорницкого месторождения, фракции 3 мм).

Условия культивирования' 16-часовой фотопериод, освещенность 3 клх (источник света - люминесцентные лампы типа ЛДЦ-20), температура 25±1°С.

Для сохранения беспересадочной культуры роз использовали не сколько режимов депонирования: 1) темнота, 1=4°С; 2) освещенность 500 лк, 1= 16°С; 3) 2 клк, 1= 16°С; 4) 500 лк, 1=4°С.

Методика определения хлорофиллов а и Ь и каротиноидов в листьях репродуцируемых растений. Содержание пигментов: хлорофиллов а и Ь и каротиноидов определяли по методу Ь1сЬ1оиЬа1ег, Wellbum (1983).

Методика определения потенциальной активности фотоассимилиции СО? репродуцируемыми объектами Потенциальную активность фотоассимиляции углекислоты определяли на высечках из листьев средней пробы растений, полученных в опыте в 3-х повторностях радиометрическим методом в камере, плавающей над ртутью при стандартных условиях- экспозиция 104

30 с, концентрация 14СОг 0,1%, освещенность 15000 лк, температура +23°С (Чернядьев, Доман, 1974).

Определение эндогенного содержания свободной ИУК в микропобегах роз методом ELISA. Проводили с использованием модификации метода имму-ноферментного анализа, разработанной в Лаборатории физиологии и биохимии растений ГБС РАН (к.б.н. Л.М.Котовой).

Статистическая обработка данных. Результаты экспериментов статистически обрабатывали путем подсчета средней арифметической и ее ошибки, использовали дисперсионный анализ (однофакторный).

Сокращения:

АБК - абсцизовая кислота; БАП - 6-бензиламинопурин; ГК - гибберелловая кислота; ЭДТА - этилендиамин тетраацетат; ЭДДГА - этилендиаминдигид-роксифенил тетраацетат; ИМК - индолилмасляная кислота; 2¡P - изопенте-ниладенин; ИУК - индолилуксусная кислота; КР - коэффициент размножения; НУК - нафтилуксусная кислота; ЦКМ - цикл клонального микроразмножения.

Обозначения садовой труппы роз: ЧГ - чайно-гибридная группа; Мин - миниатюрная группа; Ф - группа флорибунда; ЭМ - группа эфиро-масличных роз.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава I. Факторы, определяющие эффективность осуществления цикла клонального микроразмножения роз.

1.1. Развитие первичных эксплантов на начальном этапе культивирования.

Для получения регенерантов роз осуществляли трехэтапную модель, хоторая заключалась в инициации развития первичных эксплантов, их собственно микроразмножении и укоренении сформированных микропобегов.

Опыты показали, что жизнеспособность и развитие первичных эксплантов роз зависят от состояния маточного растения и самих изолируемых апексов, что обусловлено сроком вычленения почек и их местоположением на побеге. Наибольшей жизнеспособностью обладали меристемы декоративных роз, вычленявшиеся во 2-ой половине июня и июля, в зависимости от сорта (табл. 1). При этом более жизнеспособными были меристемы из почех, локализованных в средней зоне побегов по сравнению с меристемами базальных зон побегов. Исключение составили сорта: Helmut Schmidt, с высокой жизнеспособностью изолированных апексов из почек всех 3-х зон побегов, н Esperanza, характеризующийся высокой жизнеспособностью эксплантов из верхней зоны побегов. У диких видов лучшая жизнеспособность эксплантов наблюдалась при взятии растительного материала из средней зоны побега, а у сортов эфиромасличных роз - из верхней и средней зон.

Таблица 1. Жизнеспособность и особенности роста эксплантов разных сортов роз на начальном этапе развития.

Сорт

Показатели Tornado Esme- Helmut Red Midget Rise'n Espe- Red Forever

ralda Schraidt Success Shine ranza Veivet Amber

Жизнеспособ- 16. VI 28 90 87 88 32 44 30 63 45

ность (%) эксп- 20ЛШ 81 84 89 42 51 54 65 85 37

лантов при раз- 18.ЛЛ11 23 25 20 56 40 48 45 48 30

личных сроках 2.Х 13 50 67 32 41 18 40 24 23

вычленения

апексов

Жизнеспособ- верхняя 22* 73 24 52 42 49 84 41 22

ность (%) эксп- зона 39** 83 82 56 45 53 79 51 42

лантов при раз- средняя ао 90 87 88 12 M ЗА 63 45

личной локали- зона 41 84 89 42 51 54 65 85 39

ции почек на ис- нижняя 11 53 23 41 20 14 22 21 20

ходном побеге зона 17 50 53 29 27 19 30 24 22

Число листьев средняя 13* 6.2 и Í2 iA и M 4J. 4J.

(шт.) на 1 микро- зона 2,5** 3,9 4,7 3,1 5,4 7,2 4,5 6,3 2,3

побеге

Высота микропо- средняя 0.4* Ш (Щ $L4 0.39 M и и U

бега (см) зона 0,25** 0,35 0,43 0,21 0,30 0,41 0,5 0,5 0,31

НСЕо^- 1,5 по числу листьев НСР^*= 0,21 по высоте микро-

НСРо5** = 2,5 НСРС5** = 0,26 побега

* в числителе - вычленение апексов 16 VI

•• в знаменателе - вычленение апексов 20.УП

Важным фактором индукции морфогенеза роз является состав питательной среды, в частности, концентрация БАП в ней. Относительно высокая активность регенерации эксплантов трех диких видов роз, а также сортов Tornado и Украина была обеспечена при содержании 0,2 мг/л БАП в среде. Для других сортов декоративных и эфиромасличных роз оптимальной была концентрация БАП 0,8 мг/л.

Культивирование изолированных апексов роз (Tornado, R.muItülora) на питательных средах, отличающихся по составу гормонов и в I варианте (МЬ 2) по составу минеральных солей, показало различную способность изолированных апексов роз к образованию и росту михропобегов (табл. 2).

Таблица 2. Развитие эксплантов роз в зависимости от состава питательных

сред.

Мв среды Tornado R.multiflora

Высота микропобега мм Число листьев шт. Высота микропобега мм Число листьев шт.

№1 11 >0± 1,05 2,8+0,32 15,0+1,20 4.0+0,70

№2 15,0+1,18 3,2+0,36 16,5+1,23 7,2+0,91

• №3 10,0+1,00 2,7+0,40 14,9+0,90 4,5+0,60

№4 0 0 0 0

№5 6,0±0,30 2,0+0,47 9,0+0,90 2,0+0,40

№6 7,0+0,35 2,5+0,41 10,0+1,30 2,4+0,60

НСРозср«» - 0,9 по высоте микропобега.

НСРоз сред» = по числу листьев. Обозначения:

№ 1 - среда М.С., БАП 0,2 мг/л;

№ 2 - среда М.С., включающая Саг+, (в 1,5 раза увеличенный уровень), Ре2+ и Мп2+ (в 2 раза увеличенный уровень), БАП 0,2 мг/л; № 3 - среда М.С., БАП 0,2 мг/л, НУК 0,2 мг/л; № 4 - среда М.С., кинетин 0,2 мг/л; № 5 - среда М.С., содержащая зеатин 0,2 мг/л; № 6 - среда М.С., содержащая 2[Р 0,2 мг/л.

Наилучшее развитие эксплантов выявлено на среде М.С. с повышенным содержанием Са, Ре, Мп, БАП 0,2 мг/л. Добавление НУК в среду не давало положительного эффекта; наблюдалось образование каллуса. Экзогенный кинетин не индуцировал развитие меристем роз. На среде с зеатином рост был замедленным, растеньица были ослабленными. При увеличении концентрации 21Р до 0,8 мг/л установлено повышение активности регенера-

ции эксплантов (образования микропобегов) на 5-9% у 2 сортов миниатюрных роз и сорта Red Success. Добавление ГК (I; 2 мг/л) в среду на фоне оптимальной концентрации БАП вызвало незначительное увеличение высоты микропобегов у роз чайно-гибридной (ЧГ) группы, для роз групп флорн-бунда (Ф), миниатюрных (Мин), эфиромасличных (ЭМ) ГК способствовала увеличению высоты микропобега в среднем в 2-5 раз.

Г.2. Особенности собственно михроразмножения.

В качестве основного способа размножения роз использовали снятие апикального доминирования и индукцию развития пазушных меристем под воздействием экзогенного БАП (0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 3,0 мг/л)

Размножение у диких видов роз начиналось на 2-ом субкультивировании (БАП 0,4 мг/л), при БАП (1,3 мг/л) на 3-ем субкультивировании был достигнут максимальный коэфффициент размножения (KPmu). Наибольшим KP характеризовался дикий вид R.multifIora (KPmu 12,3).

У декоративных роз начало размножения микропобегов зависело от принадлежности к садовой группе. У Мин и Ф роз с БАП 0,4 мг/и размножение начиналось на 5-ом субкультивировании, у ЧГ и ЭМ роз - на б-ом субкультивировании. На 7-8 субкультивированиях KP выравнивался и достигал максимального значения с БАП 0,8 и 1,0 мг/л. Наибольшим KP характеризовались следующие сорта: Esmeralda (ЧГ) - 7,4; Tornado (Ф) - 9,5; Rise'n Shine (Мин) - 12. Для ЭМ роз KP был ниже по сравнению с другими представителями рода Rosa L. Культивирование в течение месяца при t=4°C, освещенности 500 лк на питательной среде с увеличенным содержанием Ca, Mg, Мп и Fe и с БАП 0,8 мг/л по сравнению со стандартным режимом показало возможность поддержания высокого KP (на 7-ом субкультивировании) у микропобегов диких видов R multiflora, R.aciculam; повышение KP у микропобегов декоративных сортов Tornado, Helmut Schmidt, Rise'n Shine с использованием меньшей концентрации БАП в среде (для Helmut Schmidt KPm« увеличивался на 1,8).

1.3. Укоренение микропобегов.

Сравнение различных приемов индукции рнзогенеза у микропобегов показало, что обработки базальных зон микропобегов ауксином (ИМК) повышают % укоренения у всех изученных видов и сортов роз, что подтверждает положение о необходимости использования ауксина только на этапе инициации корней

Высоким уровнем укоренения характеризовались микропоОеги 2 видов диких роз R multiflora, R aciculans (96 и 100%) на агаризованнои срече

(1/2 М.С.) с предварительным замачиванием в растворе ИМК 25 мг/л, с экспозицией 6 часов.

Повышение уровня укоренения R.divina (до 59%) было достигнуто с использованием активированного угля (1%) и увеличением концентрации раствора ИМК для замачивания до 50 мг/л, 6 ч..

Сорта ЭМ роз (Лань, Украина) характеризовались низким % укоренения на агаризованных средах.

Для оптимизации этапа укоренения ЭМ роз бьши испытаны следующие среды: № I - жидкая среда с включением ИМК 1,0 мг/л; № 2 - жидкая среда, микропобеги предварительно замачивали в растворе ИМК 25 мг/л, экспозиция 6 ч;

№ 3 - жидкая среда, микропобеги обрабатывали раствором ИМК 50 мг/л. экспозиция 6 ч;

№ 4 - агаризованная среда, с предварительной обработкой базальных зон микропобега в растворе ИМК 25 мг/л (6 ч), с БАП 0,2 мг/л; № 5 - агаризованная среда, 1,0 мг/л БАП, 0,3 мг/л ИМК; № 6 - агаризованная среда, с предварительной обработкой микропобегов в растворе ИМК 25 мг/л, 6 ч;

№ 7 - комбинированная среда, состоит из агаризованной среды и жидкой среды одинакового состава (БАП 0,2 мг/л и ИМК 1,0 мг/л), которая наливается поверх агаризованной, высотой слоя 7-8 мм.

Наибольший % укоренения для сортов Лань и Радуга (98, 100) с хорошим развитием корневой системы (длина и число корней) был обеспечен на среде № 2. Для сорта Украина был достигнут 50% уровень укоренения на среде №3.

Изучение действия ауксинов (ИМК, ИУК, НУК) на представителях декоративных роз показало, что присутствие ИМК в среде способствовало получению большего числа укорененных побегов (63-85%), хотя отмечалось образование рыхлого каллуса, хлороз листьев (сорт Tornado) и замедление апикального роста у сортов Helmut Schmidt, Esmeralda. При внесении в среду НУК % укоренения был невысокий (15-60) и по своему физиологическому состоянию укорененные микропобеги характеризовались такими же особенностями, как и при укоренении с ИМК в среде. НУК в наибольшей степени обладала способностью индуцировать каллус. С ИУК (1 мг/л) в среде % укоренения был несколько ниже, чем с ИМК (50-80), но у укорененных микропобегов не происходило пожелтения листьев и образования каллуса.

Изучение особенностей укоренения декоративных и диких видов роз на агаризованной среде (1/2 М.С.) с ИМК (1 мг/л) в качестве контроля и ли-

валом (1 мг/п), а также с использованием способа замачивания в растворах ИМК и ливала (25 и 50 мг/л, 6 ч) показало, что в начале этапа укоренения ливал, по сравнению с ИМК, активировал корнеобразование и препятствовал образованию каллусной ткани. Ливал инициировал процесс ризогенеза уже на 8-ой день после помещения микропобегов на среду укоренения. Стимулирование образования корней ИМК наступало не раньше, чем через 12 дней. Но применение ИМК обеспечивало более высокий конечный уровень микропобегов (табл. 3).

Наибольшим % укоренения (с ИМК 1 мг/л в среде) характеризовались дикий вид R.multiflora (86%), сорта Tomado (80%), Rise'n Shine, Red Velvet (81%). Для остальных представителей рода Rosa L. % укоренения микропобегов варьировал от 63 до 78.

Изучение действия салициловой кислоты (1; 10; 15 мг/л) на ризогенез декоративных сортов роз - Helmut Schmidt, Rise'n Shine (с желтой окраской) показало, что введение в агаризованную среду 10 мг/л салициловой кислоты способствовало повышению укореняемости микропобегов на 4,6-15,5%, по сравнению с укоренением под действием ИМК (I мг/л) (табл. 4)

Таблица 3. Действие ливала на укоренение микропобегов различных представителей рода Rosa L.

ИМК (в среде) ливал (в среде)

контроль 1 мг/л 1 мг/л

Сорт, вид % среднее средняя % среднее средняя

укоре- число длина укоре- число длина

нения корней, корня. нения корней. корня,

шт. мм шт. мм

R.mu!tiflora 86,0 1,08+3,3 3,0+1.2 83,5 1,33+1,2 4,2+0,7

R.aciculans 76,0 1,5±0,8 2,0+1,3 50,0 2,3±0.4 3,5±0,4

R.divina 16,6 1,4+03 1.9+0,9 17,0 2.4+0,2 2,2+0,1

Red Success 75,0 1,6+0,4 1,0+0,6 46,0 4,4+0,4 1,6±0.5

Helmut Schmidt 63,0 3,2+0,6 2,5±0,4 61,3 2,7+1,0 2,9^0,4

Esmeralda 68,0 3,1+0,2 9,0+0,1 44,0 4,4+03 10,0+0,3

Rise'n Shine 81,0 2,0+0,3 2,5+0,2 52,4 2.2+0,5 2,6+0,6

Midget 78,0 3,5+0,2 2,0+0,3 75,0 4,0+0,3 2,7+0,2

Tornado 80,0 5,2+0,3 3,0+0,2 40,0 3,9+0,5 3,1+0,4

Red Velvet 81,0 4,4+0,4 6,3+0,5 70,0 5,0+1,1 7,0+0,2

Esperanza 70,0 4,3+0,1 6,9±0.1 69,0 5,0+0,9 7,5+0,6

Forever Amber 72,5 3,7+0,7 7.0+0,4 71,0 4,2+0,3 9,0+0,5

'О

Таблица 4. Активность ризогенеза михропобегов роз в зависимости от концентрации салициловой кислоты в питательной среде.

Сорт Концентрация Укоренение Среднее число Средняя длина

(мг/л) (%) корней (шт.) корня(мм)

Helmut 0 0 0 0

Schmidt 1 19,4 2,0+0,2 5,0+0,4

(ЧГ) 10 78,5 5,0+0,3 35,0+2,8

15 75,0 4,6+0,1 27,0+2,2

0 0 0 0

Rise'n Shine 1 31,0 2,3+0,1 3,0+0,3

(Мин) 10 85,6 4,0+0,3 45,0+2,1

15 82,0 4,1+0,2 31,0+2,0

HCPoJ среда 12,3 1,2 9,1

Салициловая кислота (10 мг/л) оказывала положительное влияние на хранение укорененных михропобегов роз в течение 6 месяцев при t=J6°C и освещенности 500 лк.

Таким образом, показана возможность повышения % укоренения при клональном микроразмножении микропобегов роз с желтой окраской (по сравнению с. традиционным вегетативным способом размножения), с использованием различных регуляторов и приемов обработок. Культивирование микропобегов различных представителей рода Rosa L. в течение I месяца при t=4°C и освещенности 500 лк способствовало повышению процента укоренения в среднем на 12,5%.

1,4- Адаптация укорененных микропобегов в нестерильной среде.

Наиболее трудно решаемой задачей при репродуцировании растений роз является их перевод в нестерильные условия. Это обусловлено тем, что витрорастения роз характеризуются пониженной водоудерживающей способностью, недостаточно развитой кутикулой и низким осмотическим потенциалом листьев.

Адаптацию регенерантов роз проводили при t=25°C, освещенности 3 клк, влажности воздуха 80% от полной влагоемкости. В этих благоприятных условиях изучили особенности адаптации витрорастсний к нестерильной среде с использованием 3-х композиций субстратов, включавших в качестве добавки цеолит. Было изучено действие различных субстратов на: а) приживаемость витрорастений; б) формирование и развитие корневой системы; рост и дальнейшее развитие надземной части.

Таблица 5. Характеристики витрорастеннй роз после 30 дней выращивания на различных субстратах в нестерильной среде.

торф: песок (1:1) торф : цеолит (1:1) торф: цеолит: песок цеолит сосновая кора:

Сорта (1:1:1) листовая земля (1:1:2)

Прижи- Прирост Среднее Прижи- Прирост Среднее Прижи- Прирост Среднее Прижи- Прирост Среднее

вае- расте- ЧИСЛО вае- расте- ЧИСЛО вае- расте- ЧИСЛО вае- расте- 40 ело

мость, ния, корней, мость, ния, корней, мость, ния, корней. мость, ния, корней.

% си пгт % си пп % си пгт % си пгт

Тогпа- 85 5,7 14,3 100 5,4 17,0 100 4,8 20,6 68,7 4,4 13,0

с1о

Езгае- 82 4,5 10,1 100 4,9 10,7 100 4,5 19,3 79 4,1 9,6

ralda

Ике'п 92 4,9 13,9 100 5,0 10,0 100 4,0 19,0 100 4,9 10,2

БЬтс

Я. 70 4,0 14,0 95 3,5 14,7 96 4,2 18,4 100 6,0 9,4

ти!и-

Пога

НСР05 2,5 1,4 0,3 3,8

НСРм : прирост стебля 1,0

Витрорастения декоративных сортов роз реализовали полную потенциальную способность к приживаемости на субстратах торф : цеолит (1:1) и торф : цеолит: песок (1:1:1) (табл. 5).

Сорт Rise'n Shine и дикий вид R.multiflora проявили 100%-ную приживаемость на субстрате цеолит : сосновая кора : листовая земля (1:1:2) Прирост побега в течение месяца у R.multiflora был наибольшим на данном субстрате. Корневая система лучше всего развивалась у витрорастении декоративных роз на субстрате торф : цеолит : песок, а наибольшая длина корней отмечена на субстрате торф : цеолит.

В результате этих исследований установлено, что включение цеолита в субстрат положительно влияло на приживаемость растений и развитие их корневой системы. На этом основании можно рекомендовать применение цеолита в качестве добавки к субстрату при репродуцировании роз in vitro; для декоративных роз оптимальным может быть субстрат торф : цеолит : песок, а для диких видов сосновая кора : листовая земля : цеолит.

1.5. Физиологические характеристики, отражающие видовую и сортовую специфику морфогенеза в ЦКМ роз.

1.5.1. Содержание пигментов.

Нашими работами по изучению содержания пигментов и потенциальной активности фотоассимиляции СОг у микропобегов роз (Кириченко и др., 1991; Кириченко, Куцрэ, Кузьмина, 1991) были, по существу, начаты сравнительные исследования таксономических аспектов становления фотосинтетической функции у регенерантов роз in vitro. Следует признать, что интерпретация этих данных ввиду их ограниченного характера затруднительна. Однако нам представляется, что эти данные важны, поскольку они создают основу для дальнейших исследований регуляции формирования m vitro активного фотосинтетического аппарата и его видовой специфики у репродуцируемых растений рода Rosa L.

Полученные данные показали, что листья у микропобегов декоративных роз и R.multiflora содержали 0,4-0,8 мг хлорофилла на 1 г сырого веса. Листья дикого вида R.multiflora и сорта Rise'n Shine отличались наиболее высоким содержанием хлорофилпов в ед. веса, а листья микропобегов сорта Helmut Schmidt - пониженным содержанием хлорофилла.

Содержание хлорофилпов в листьях микропобегов ЭМ розы сорта Украина бьшо выше по сравнению с упомянутыми объектами и составляло 1,97 кг/г сырлзеса (табл. 6). Отношение хл. а/хл. b варьировало в этих условиях в пределах 1,2-2,6 для декоративных сортов и R.muItiflora. Сорт Украина характеризовался более низким отношением хл. а / хл. Ь = 0,97.

Таблица б. Содержание и состав пигментов в листьях микропобегов, реге-нерантов и маточных растений эфиромасличных роз (сорт Украина).

Объект исследования Хлорофкл-лы а+Ъ, мг/г сырого веса хл. а / хл. Ь Кароти-ноиды, мг/г сырого веса Хлорофил-лы /каро-тиноиды

Микропобеги (возраст 21 день) 1,97+0,28 0,97+0,07 0,28+0,09 6,9+1,81

Регенеранты 3,14+0,33 0,97+0,16 0,38+0,1! 8,1 ±2,03

Маточные растения 3,61+0,35 2,84+0,18 0,69+0,06 5,23+0,21

Содержание каротиноидов в молодых листьях формирующихся побегов было невысоким 0,08-0,11 мг/г сырого веса, четких различий у изученных объектов еще не проявилось. Сорт Украина характеризовался более высоким содержанием каротиноидов.

Отношение хлорофиллы/каротиноиды варьировало в пределах 4,3-7,2 у декоративных сортов и Я-тикШога, а у сорта Украина было равно 6,9. Листья регенерантов на этапе адаптации в нестерильной среде содержали 2,9-4,2 мгхл. в г сыр .веса. Отношение хл.а/хл.Ь в листьях регенерантов было исключительно низким (в пределах 0,86-1,12), содержание же суммы каротиноидов было в 3-4 раза выше, чем в листьях микропобегов.

Особенностью пигментного аппарата микропобегов ЭМ роз является несколько более высокое содержание хлорофиллов и каротиноидов по сравнению с декоративными розами. Отношение хл. а / хл. Ъ у микропобегов и регенерантов ЭМ роз ниже 1,0. Полученные данные указывают на определенную специфику организации светособирающих комплексов и реакционных центров фотосистем в хлоропластах мезофилла листьев разных видов и сортов роз.

1.5.2. Потенциальная способность к фотоассимиляцни СО2-

Потенциальная активность фиксации СОг микропобегами разных сортов и видов роз была относительно низкой. Микропобеги Я.шии^Пога характеризовались наиболее низким уровнем активности, а сорта эфиромасличных роз - более высоким уровнем активности фиксации СОг (табл. 7). Этот уровень фотоассимиляции СОг у микропобегов был обусловлен тем, что их хлоропласты сформировались в условиях избыточного обеспечения углеводами из питательной среды, поэтому их функция автотрофности была недостаточно развита. При выражении активности фотоассимиляцин СОг

микропобегами в мг СО2 мг хлорофилла в час бьшо выявлено, что скорость усвоения СОг была относительно высокой (1,8-8,0), у ЭМ роз, Я.тикЛога и Яие'п БЬте она не превосходила уровень активности, выявленный у регенерантов и маточных растений. Для микропобегов сортов Украина и Радуга скорость усвоения СО2 была в несколько раз ниже по сравнению с регенератами и маточными растениями. Регенераты и маточные растения, обладавшие значительно большей ассимиляционной поверхностью, чем микропобеги, ассимилировали большее количество СОг и с более высокой скоростью.

Нормальное состояние фотосингетического аппарата маточных растений роз характеризовалось активностью фотоассимиляции СОг в листьях. Наиболее высокая активность фотоассимиляции СОг была выявлена у сорта Радуга.

Таблица 7. Потенциальная активность фотоассимиляции СОг микропобегами, регенератами и маточными растениями эфиромасличных роз.

Объект исследования Сорт, вид Активность фотоассимиляции СОг

мг/г сырого веса мгСОг/мг хлорофилла мг/дм2 листьев

Микро побеги (возраст 21 день) Украина 4,0+0,3 2,0 9.6+1,3

Радуга 3,5+0,4 1.8 11,5+1,4

Регенеранты (через месяц акклиматизации) Украина 14,4+2.9 4,6 10,7+2,3

Радуга 16.1+2,7 5.1 19,9+3,2

Маточные растения Украина 17,2+1,5 4.7 12,4+1,6

Радуга 18.9+1,2 4.9 17,5+4,3

Совокупность приведенных данных указывает на то, что изучавшиеся репродуцируемые растения успешно развивались на этапе адаптации к нестерильной среде и представляли собой жизнеспособные индивидуумы, полученные в благоприятных условиях формирования своих автотрофных функций. В характеристиках состава и содержания пигментов прежде всего отражена специфика плаехидного аппарата представителей рода Rosa L. В хлоропласта* мезофилла листьев роз формировался фотосинтетический аппарат, отличающийся особым соотношением молекул хлорофшшов, локализованных в светособирающих комплексах фотосистемы I и II и их реакционных центрах.

1.53. Эндогенное содержание ИУК в микропобегах роз.

Фитогормоны играют важную роль в формировании и функционировании фотбсинтетического аппарата растений in vitro. Для изучения этой взаимосвязи мы определили эндогенное содержание ИУК у репродуцируемых растений роз.

Как видно из таблицы 8, дикие виды и сорта декоративных роз существенно отличались по уровню содержания свободной индолилуксусной кислоты.

Таблица 8. Эндогенное содержание свободной ИУК в микропобегах роз.

Культивирование Культивирование

при t=25°C, 3 клк при t=25°C, 3 клк

Сорт, возраст микропобегов возраст микропобегов

вид 84 дня 126 дней

пикомоль пикомоль пикомоль пикомоль

г сыр. веса микропобег г сыр. веса микропобег

Tornado 83+12 2,66+0,25 147+13 3,8+0,31

Helmut 91 + 10 3,04+0,15 160+15 4,52+0,17

Schmidt

Rise'n Shine 95+11 4,31 ±0,21 171+10 5,95+0.24

R.multiflora 37+6 0,45+0,07 69+9 1,25+0,03

R.acicularis 41+3 1,03+0,04 75+5 1,8+0,05

Микропобеги диких видов содержали в I г сырлеса в 2,0-2,5 раза меньше ауксинов, чем сорта декоративных роз. При расчете содержания ИУК на микропобег эти различия составляли для R.acicularis 2,5-4,1 раза, а для Rjnultiflora 5,9-9,6. Наиболее высокое содержание свободной ИУК в единице сырой биомассы и в 1 микропобеге выявлено у сорта миниатюрной розы Rise'n Shine. Следует отметить, что и активность фотоассимиляции СО г у этого объекта была выше по сравнению с другими изученными сортами. При определении содержания ИУК в микропобегах, культивировавшихся в тех же условиях в течение 2 субкультивирований (126 дней) выявлено увеличение уровня эндогенных ауксинов в 1,5-2,0 раза. Вместе с тем, микропобеги разных видов и сортов отличались между собой так же, как - и в предыдущих определениях.

Эти данные свидетельствуют прежде всего в пользу представления о том, что видовая и сортовая специфика морфогенеза роз in vitro предопределена эндогенным гормональным статусом репродуцируемых объектов. Этим объясняются, по-видимому, и различия в отзывчивости эксплантов и микропобегов на вводимые в питательную среду экзогенные фитогормоны

и регуляторы роста. Следовательно, для определения состава и соотношений фитогормонов и регуляторов роста, вводимых в питательную среду на разных этапах цикла клонального микроразмножения, важно знать состояние эндогенного гормонального комплекса. Полученные данные также подтверждают положение о том, что одним из главных факторов изменения эндогенного содержания фитогормонов в репродуцируемых растениях является их возрастное состояние.

1.6. Долговременное депонирование микропобегов роз.

Для уменьшения числа субкультивирований с целью изучения возможного сохранения пролифелирующей культуры роз на стадии собственно микроразмножения изучали различные режимы депонирования (табл. 9). Показано, что наибольший процент выживаемости микропобегов исследуемых представителей рода Rosa L. обеспечивался с использованием хранения растений в течение года при t=4°C и освещенности 500 лк Он составил 50-80%.

Таблица 9. Сохранность (%) микропобегов роз (к концу 1 года) в зависимости от режима депонирования.

Режим Сорт, вид

культивирования R multiflora Helmut Schmidt Rise'n Shme Red Velvet Tornado

t=4°C, +БАП 75,0+ 41.0+3.2 39.0+2.3 25,0+4,0 30,0+2,5

в условиях + 10.0

темноты -БАП 21,0+5,2 10,0т 2.1 10.0+3,0 5,0*2,0 11,0+4,0

t=4°C, +БАП 80,0+ 62,0+3,2 65.0+2.3 52,0+2,0 50,0+4,4

освещенность + 10,0

500 лк -БАП 10,0+2,0 1,0+2.0 2,0+2,2 2.0+3,2 15,0+5.6

t= 16°С, 500 лк +БАП 5,0+3,1 4,0+2,5 2,0+1,5 2,5*3,1 1,0+2,1

-БАП 0 0 0 0 0

t=l6°C, 2 клк +БАП 1,0+2,2 0 0 0 0

-БАП 0 0 0 0 0

t=4°C, АБК

500 лк I.S ыг/л 4,0+2,0 7,0+3,0 12.0+2,0 15,0+4,0 50,0+9.5

Жизнеспособность микропобегов зависела от сроков хранения, сортовой и видовой специфики и содержания регуляторов роста в питательной среде.

1.7. Использование пленки "полисветан" для выращивания витро-растений. '

Положительное влияние пленки "полисветан" проявилось на этапе доращивания полученных витрорастений в нестерильных условиях закрытого грунта. Отмечено наступление фазы цветения у регенерантов роз (сорт Tomado) на 2 недели раньше под пленкой "полисветан", по сравнению с контролем. Количество побегов возобновления через месяц выращивания под пленкой "полисветан" увеличивалось в 2 раза по сравнению с контролем, что способствовало быстрому развитию и формированию кустов роз и получению качественного посадочного материала корнесобственных роз.

1.8. Особенности развития витрорастений и их жизнеспособность в

условиях открытого грунта.

Регенераты роз характеризовались высокой приживаемостью в открытом грунте и устойчивостью х зимним стрессам.

Сравнение регенерационной активности у полученных витрорастений с растениями роз, выращенных черенкованием, материал которых используется для проведения окулировок, подтвердило представление о том, что регенераты характеризуются более высокой жизнеспособностью (Бутенко, Катаева, 1982; Skirvin, 1984).

При оценке стабильности генотипов полученного материала отклонений морфологических признаков у регенератов, по сравнению с маточными растениями, не выявлено.

В результате многолетних работ по репродуцированию растений миниатюрных роз из изолированных апексов выявлена форма, обладающая рядом специфических признаков (крупный размер цветка, обильное количество цветков в течение всего периода цветения и др.). Причины, обуславливающие проявление этих признаков, могут быть выяснены в процессе дальнейших исследований. этой новой формы, производной от сорта Pink Symphony. .

Заключение.

Развитие в течение 4-х десятилетий работ по физиологии клонального . микроразмножения показало их исключительную ценность для углубления фундаментальных представлений о закономерностях жизнедеятельности растительного организма и совершенствования способов размножения важнейших в ботаническом и экологическом отношениях видов и сортов растений.

• Полученные нами результаты расширяют представления о таксономической специфичности морфогенеза in vitro растений рода Rosa L. Сильно выраженные особенности органогенеза у диких видов, различных садовых

18

групп декоративных роз и эфиромасличных роз были обусловлены многими генотипическимн детерминантами Наши данные позволили заключить, что формирование микропобегов и их укоренение in vitro может быть обусловлено гормональным статусом маточных растении и зависеть от особенностей формирования их фотосинтетического аппарата на основных этапах цикла клонального микроразмножения.

Кроме генотипической обусловленности объекта, эффективность регенерации и коэффициент микроразмножения зависели от физиологического состояния материнского растения и самого изолируемого апекса. Последнее определялось моментом вычленения и местоположением апексов на побегах маточного растения. Регенерируемые растения разных представителей рода Rosa L. отличались по своей реакции на соотношение элементов минерального питания и регуляторов роста (БАП и ГК) в питательной среде. На процесс их ризогенеза оказало положительное действие обработка микропобегов ИМК и включение в питательную среду салициловой кислоты на этапе укоренения.

Адаптация витрорастений роз в нестерильной среде было успешно осуществлено с применением цеолита в качестве компонента субстратов.

Полученные в оптимальных вариантах репродуцирования партии корнесобственных витрорастений при их выращивании в открытом грунте Проявили высокую зимостойкость и экорезистентность в течение всех летних периодов вегетации.

Витрорастения роз представляют собой ценный исходный материал дал практики декоративного садоводства и пополнения коллекций ботанических садов.

Выводы.

1. Закономерности органогенеза мнкропобегов и корнеобразования у представителей рода Rosa L. (дикие виды, декоративные и эфиромасличные розы) в цикле клонального микроразмножения in vitro определяются видовыми и сортовыми особенностями генотипов, физиологическим состоянием материнского растения и почек, из которых изолируются экспланты (т.е. их ювенильностью), составом питательной среды.

2. Впервые разработан вариант клонального микроразмножения иг vitro эфиромасличных роз с использованием жидкой питательной среды, обеспечивавшей ссшубилизацию оттекающих в базальную зону микропобегов фенсшьных соединений и эфирных масел, ингибирующих ризогенез репродуцируемых растений.

3. Показана возможность эффективного укоренения микропобегов под действием ИМК, лив ала, салициловой кислоты, г также изменения ре-

19

жима культивирования (t=4°C, освещенность 500 лк). Выявлены оптимальные условия, обеспечивающие высокий уровень (86-91%) укоренения микропобегов чайногибридных сортов роз с желтой окраской цветков, которые при традиционном вегетативном размножении характеризуются очень низким уровнем укореняемости. Эти результаты свидетельствуют о видовой и сортовой специфике ризогенеза in vitro разных представителей рода Rosa L.

4. Изучены особенности формирования фотосинтетического аппарата у репродуцируемых растений роз. В процессе генезиса хлоренхимы листьев возможна редукция губчатой паренхимы, вследствие чего листья мнкропо-бегов и регенерантов характеризовались пониженным уровнем содержания хлорофиллов и каротиноидов, низким отношением хл.а/хл.Ь и высокой потенциальной активностью фотоассимиляции СО2.

5. Определено эндогенное содержание ИУК у микропобегов роз на этапах их роста и субкультивирования. Показана генотипическая обусловленность уровня содержания ИУК в микропобегах разных представителей рода Rosa L.

6. Репродуцированные корнесобственные витрорастения роз (сорт Tornado) при их выращивании в полевых условиях в течение 5 лет проявили высокую зимостойкость (~100% выживания) и устойчивость к неблагоприятным условиям на протяжении периода вегетации, хорошие регенера-ционные способности и высокие декоративные качества.

7. Процесс клонального микроразмножения in vitro обеспечивал высокую стабильность морфологических признаков регенерантов различных представителей рода Rosa L.

8. Показана возможность депонирования in vitro при t=4°C, освещенности 500 лк с определенным составом питательной среды микропобегов роз в течение года с сохранением их способности к полному завершению цикла клонального микроразмножения. Введение салициловой кислоты в питательную среду на этапе укоренения способствовало лучшей сохранности укорененных витрорастений в течение б месяцев депонирования.

Рекомендации по практическому применению результатов исследований.

I. Разработанные варианты технологий клонального микроразмножения in vitro различных представителей рода Rosa L. (диких видов, группы флорибунда, чайно-гибридных и миниатюрных роз) рекомендуются для использования при серийном воспроизводстве посадочного материала в целях поддержания биоразнообразия коллекций роз, применения в селекции и в декоративном садоводстве.

2. Цеолит может быть использован в качестве добавки при создании композиций субстрата для быстрого формирования корневой системы вит-рорастеннй роз на этапе их адаптации к нестерильной среде и получения стандартного материала.

3. Полученная в процессе клонального микроразмножения форма миниатюрной розы (с предварительным наименованием ГБС-197), обладающая рядом особых декоративных при-)наков, совместно с Отделом декоративных растений подготавливается для передачи в госсортоиспытанне

4. Пленка "полисветан", использованная в качестве пленочного покрытия витрорастений на этапе их адаптации к нестерильной среде и в начальный период выращивания в полевых условиях, благоприятствует росту и развитию вшрорастений и стимулирует их цветение. Пленка "полисветан" может быть использована для указанных целей при реализации клонального микроразмноження роз в производственных условиях

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Т.А.Кузнецова, Е Б.Кириченко. Стимуляция формирования побегов и корней регуляторами роста при клональном микроразмноженни роз //VIII Всесоюзная конференция по регуляторам роста Киев, "Наукова Думка", 1989.-c.243

2. Е.Б.Кириченко, Ш С.Фернандо, Т-А.Кузьмина, Н В Катаева Физиоло гические аспекты клонального микроразмножения эфиромасличных роз I/V Всесоюзный симпозиум "Основные направления научных исследований по интенсификации эфнромаслнчного производства" Симферополь, 1990. с.25-26.

3. Е.Б Кириченко, ТА Кузьмина, Н В Катаева Факторы оптимизации репродуцирования декоративных и эфиромасличных роз in vitro. //Бюллетень Главного ботанического сада, 1991 .-т. 159 -с 61 -67.

4. E.B.Kinchenko, A.Coudret, TA.Kusmina, Н Sallanon. Elaboration of physiological principles of plant micropropagation and possibilities of us application. //Proceedings of IV International Conference of European-Mediteranean Division of the International Associations of Botanic Gardens Tbilisi. Georgia. I991.-p37.

4. Е.Б.Кириченко, А.Кудрэ, T.A.Кузьмина, Ю Салланон, Ш.С.Фернандо, Л.М.Котова. Клональное микроразмножение и физиологические особенности регенерантов древесных растений //Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу". Черновцы, I991.-T.1.-C.35.

6. Е.Б.Кнриченко, Ш С Фернандо, ТА Кузьмина. И.И.Чернядьев. Особенности органогенеза эфиромасличных роз при клональном микроразмноженни. //Бюллетень Главного ботанического сада, 1993 -т.167.-с.96-102.

7. Е.Б.Кириченко, А.Кудрэ, Ю.Салпанон, Ш.Фернандо, ТА.Красильникова и др. Оценка ювенильноста экспланта и оптимизации репродуцирования лекарственных- растений. //Тезисы конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 1996.-c.38.

8. ТАЛСрасильникова, А.Кудрэ, Ю.Салпанон, Е.Б.Кириченко. Действие фи-тогормонов на пролиферацию эксплантов и укоренение микропобегов различных видов и сортов роз. //Тезисы докладов IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений". Москва, 1996.-c.301 -302.

9. Б.Б. Кириченко, А.Кудрэ, Ю.Салланон, ЮКену-Гуришон, ТА.Красильникова, Г.Ф.Бидюкова. Клональное микроразмножение многолетних растений и долговременное сохранение их коллекции in vitro. //Тезисы докладов VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". Москва, 1997,-с.525.

10. ТА.Красильникова, Н.К.Федорова, Н.И.Борисова, Е.Б.Кириченхо. Поддержание биоразнообразия коллекции роз с использованием физиологических и биотехнологических методов. //Тезисы докладов конференции "Цветоводство - сегодня и завтра". Москва, 1998.-C.149-I5I.

11. Kirichenko Е.В., Coudret A., Sallanon Н., Kxasilnikova ТА., Bidukova G.F., Shelepova O.V. Maintainance of the biodiversity of native and cultivated flora: physiological and biotechnological approaches. //Acta Horticulturae. 1998. (в печати)

Объем I1/ п т

Заказ ь92

Тираж 100

Типография Издательства Л\СХА 127550, Москва, Тимирязевская ул, 44

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красильникова, Татьяна Анатольевна, Москва

/

/ O -"'""i ....../■■ '.........

Российская Академия наук Главный ботанический сад им. Н.В.Цицшт

на правах рукописи

Красильникова Татьяна Анатольевна

ФАКТОРЫ ОПТИМИЗАЦИИ РЕПРОДУЦИРОВАНИЯ IN VITRO РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА

ROSA L.

03,00,12 - физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кавдвдата

биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Е. Б. Кириченко

Москва-1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

Сокращения.............................................................................

Глава L СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЗНАНИЙ О ФАКТОРАХ ОПТИМИЗАЦИИ КЛОНАЛЬНОШ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ROSA L...........................................................Л 1

1.1. Развитие исследований по клональному микроразмножению многолетних древесных растений.............................................................................Л Í

1.2. Клональное микроразмножение роз: факторы, определяющие эффективность регенерации растений роз из изолированных апексов................19

1.2Л. Исходное материнское растение как донор экспяантов.....................19

1.2.2. Состав питательной среды......................................................................20

1.2.2.1. Углеводы................................................................................................21

1.2.2.2. Витамины.................................................................22

1.2.2.3. Фитогормоны и регуляторы роста.....................................................25

1.2.3. Условия культивирования микропобегов............................................28

1.2.4. рИ среды...................................................................................................30

1.2.5. Факторы, способствующие укоренению микропобегов....................30

1.2.6. Адаптация витрорастений в нестерильной среде.................................33

1.2.7. Оздоровление репродуцируемых растений от грибных, бактериальных и вирусных болезней методом культуры верхушечных меристем in vitro......................................................................................................................37

1.2.8. Длительное поддержание коллекций репродуцируемых растений при пониженной температуре..................................................................................40

Глава II. ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................44

II. Í. Объекты исследований.............................................................................44

11.1.1. Ботаническая характеристика рода Rosa L........................................44

ПЛ.2. Краткая ботаническая характеристика изученных видов и сортов

роз........................................................................................................................45

II. 1.3. Выбор и подготовка маточных растений............................................50

11.2, Условия культивирования........................................................................53

II .2.1. Состав питательных сред......................................................................53

П.2.2. Температурные и световые условия культивирования.....................55

11.3. Методы исследований...........................................................................57

11.3.1. Биометрическая характеристика репродуцируемых объектов........57

11.3.2. Оценка выживаемости репродуцируемых объектов.........................57

11.3.3. Количественное определение хлорофиллов а и b и суммы кароти-

11.3.4. Определение активности фотоассимиляции С02 репродуцируемыми

ОО ЪС1СТ£1МИ-<.- ■.*»«...»<,« i-..*»«» ..•..«.«г*««**«»*.*«.«.***»-*«»».* «».«*„« я ч s « я * д

ÍL3.5. Определение эндогенного содержания свободной индолилуксусной

кислоты в микропобегах роз методом "ELISA"...........................................58

II .3.6. Оценка зимостойкости, роста и развития корнесобственкых витро-растений роз при их выращивании в открытом грунте......„.„.„....„..........59

II.3.7. Статистическая обработка данных......................................................60

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 61

III,1. Введение в стерильную культуру и развитие на начальном этапе

IIL2. Собственно микроразмножение.......................................................73

111.3. Особенности развития микропобегов при высокой дозе БАЛ в питательной среде..................................................................................................80

111.4. Укоренение микропобегов.....................................................................85

111.5. Оценка применимости цеолитов в составе субстратов на этапе адаптации витрорастений к нестерильной среде.................................................102

111.6. Содержание фотосинтетических пигментов в репродуцируемых растениях.........................................................................................................Л 1 í

111.7. Активность фотоассимиляции ССЬ микропобегами, витрорастекия-ми и маточными растениями..........................................................................116

111.8. Долговременное депонирование микропобегов роз in vitro при по-

Н13ЖСННОИ 119

111.9. Эндогенное содержание свободной индолилуксусной кислоты в МИКрОП öÖüFclX рОЗ ■..^.>>...u<>>>>>i>>>.i><ci<>>>c>><.>tI..I.>EIC3uM>>3E><c3:l:»Cii>M<:>I«>KBi>>^

ШЛО. Выращивание витрорастений с использованием светочувствительной пленки.......................................................................................................130

III Л 1. Адаптация эфиромасличных роз в условиях in vivo.......................133

III Л 2. Особенности развития витрорастений и их жизнеспособность в условиях открытого грунта............................................................................135

Заключение.......................................................................................................141

Рекомендации по практическому применению результатов исследований.....................................................................................................................148

ВВЕДЕНИЕ

Г ■Ч

Актуальность темы. Экспериментальные работы по клональному микроразмножению многолетних травянистых и древесных растений интенсивно развиваются в течение четырех десятилетий. В результате этого в современной физиологии и биотехнологии растений возникла важная область самостоятельных исследований. Прежде всего решается целый комплекс новых фундаментальных проблем, имеющих общефизиологическое значение, таких, как: тотипотентность и гюлипотентность клеток меристем, специфические механизмы морфогенеза тканей и органов in vitro, интеграция гетеротрофного и автотрофного метаболизма в процессе репродуцирования растения, реювенилизация растительного организма, генетическая, эпигенетическая и онтогенетическая стабильность растений-регенерантов. Накопление новых знаний при решении этих проблем и разработка принципов осуществления цикла клонального микроразмножения придало этой области также и большую практическую значимость. Это обусловлено, в первую очередь, тем, что в процессе клонального микроразмножения возможно освобождение репродуцируемых растений от бактериальной, грибной и вирусной инфекции. Созданные технологии микроразмножения в большинстве случаев могут быть более рентабельными по сравнению с традиционными способами вегетативного или семенного размножения, и если они реализуются непрерывно в годичном цикле, могут обеспечить быстрое воспроизводство больших партий высококачественного посадочного материала. Искшочительную ценность технологии клонального микроразмножения представляют для поддержания биоразнообразия коллекций ботанических садов и сохранения генофонда растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен в ограниченных экземплярах или когда ботанический объект находится под угрозой исчезновения.

К настоящему времени цикл клонального микроразмножения осуществлен с использованием более 400 видов растений. Особый интерес в качестве объекта клонального микроразмножения представляют розы, в связи с тем» что многие представители рода Rosa L. при введении в культуру iti vitro характеризуются низкой выживаемостью первичных эксплантов и низким коэффициентом микроразмножения. Род Rosa L, включает более 500 видов, поэтому изучение особенностей репродуцирования растений, относящихся к разным видам роз, представляет большой теоретический и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Исходя из изложенного, целью наших исследований явилось изучение особенностей регенерации из изолированных апексов целостных растении разных представителей рода Rosa L., выявление благоприятных условий органогенеза на основных этапах цикла клонального микроразмножения.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи;

- изучить регенерационные способности первичных эксплантов роз на начальном этапе введения в культуру in vitro;

- определить наиболее благоприятный состав питательной среды дата инициации роста микропобегов роз и укоренения in vitro;

- выявить условия, обеспечивающие укоренение микропобегов эфи-ромасличных роз и осуществить полный цикл их клонального микроразмножения;

- изучить особенности пигментного аппарата и потенциальную способность фотоассимиляции ССЬ у репродуцируемых растений разных представителей рода Rosa L.;

- определить эндогенное содержание индолилуксусной кислоты с использованием иммуноферментного метода (ELISA) в микропобегах на этапах их роста и субкультивирования;

- изучить возможность долговременного депонирования in vitro микропобегов разных представителей рода Rosa L.;

- изучить особенности развития витрорастеннй и жизнеспособность при их адаптации в нестерильных условиях и при выращивании в открытом грунте.

Иаучная новизна. Изучены особенности репродуцирования растений в цикле клонального микроразмножения (ЦКМ) у представителей рода Rosa L., относящихся к диким видам и группам роз миниатюрных, чайноги бридных и флорибунда. Впервые осуществлен ЦКМ для трех сортов эфиромасличных роз. С?пределен благоприятный состав компонентов питательной среды на основных этапах ЦКМ для указанных представителей рода Rosa L., обеспечивающий получение качественных растений - реге-нерантов с высокой зимостойкостью и экорезистентностыо в период их активной вегетации.

Впервые изучены особенности пигментного аппарата и потенциальная активность фотоассимиляции С02 у репродуцируемых растений разных представителей рода Rosa L. Показано, что формирующийся in vitro фотосинтетический аппарат отличается пониженным уровнем содержания хлорофиллов и каротиноидов и низким отношением хл а / хл Ъ и высокой потенциальной активностью фотоассимиляции С02.

Впервые изучено эндогенное содержание индолилуксусной кислоты у микропобегов роз на этапах их роста и субкультивирования и показана генотипическая обусловленность уровня содержания ИУК в микропобегах разных представителей рода RosaL.

Показана возможность депонирования in vitro микропобегов роз в течение года без обновления питательной среды при определенном режи-

ме (1=+4°€, освещенность 500 лк) с сохранением их жизнеспособности от (50-85%) в зависимости от сорта и вида.

Практическая значимость. Разработанные варианты технологии кло-нального микроразмножения разных представителей рода Rosa L. могут быть использованы для поддержания биоразнообразия коллекций роз ботанических садов (особенно редких и исчезающих видов), сохранения их генофонда, интродукции и селекции новых форм, получения качественного посадочного материала, применяемого в декоративном садоводстве.

Установленная возможность использования цеолита в качестве добавок в составе субстратов на этапе адаптации регенерантов в нестерильной среде открывает перспективу их дальнейшего применения при клональном микроразмножении роз в промышленных масштабах.

Установленная возможность повышения жизнеспособности депонированных in vitro укорененных микропобегов с введением в питательную среду салициловой кислоты (i 0 мг/л) позволяет ее использовать в практике долговременного сохранения in vitro репродуцируемых растений.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертации были представлены на VIII Всесоюзной конференции по регуляторам роста (Киев, 1989), на Всесоюзной выставке "НТП и передовой опыт в агропромышленном комплексе" (1989 г.), на V Всесоюзном симпозиуме "Основные направления научных исследований по интенсификации эфи-ромасличного производства" (Кишинев, 1990), на Всесоюзной научной конференции "Достижения биотехнологии - агро-промышленному комплексу" (Черновцы, 1991), на IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1996), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на VII Международной

конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), на расширенных научных семинарах Лаборатории физиологии и биохимии растений ГБС РАН (1990-1993г., 1997-1998г.).

Публикации по теме диссертации. Материалы диссертации отражены в 1 í научных публикациях в российских и международных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (гл. I), изложения характеристик объектов исследования, условий проведения опытов и методов исследования (гл. II), главы с описанием результатов исследований и их обсуждением (гл. III), заключения, выводов и рекомендаций по практическому использованию результатов исследований. Работа изложена на 169 страницах, содержит 35 таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает 105 работ отечественных авторов и 77 работ зарубежных исследователей.

Сокращения:

АБК - абсцизовая кислота БАП - 6-бензиламиыопурин ВР - витрорастение ГК - гибберелловая кислота ИМК - индолилмасляная кислота 21Р - изоленте!пшаденин ИУК - иидолилуксусная кислота КР - коэффициент размножения НУК - нафтилу!ссусная кислота П - побег

ЦКМ - цикл клонального микроразмножения ЭДДГА - этилендиаминдигидроксифенил ацетат ЭДТА - этилендиамингетрацетат

Обозначения садовой группы роз: ЧГ - чайно-гибридная группа Мин - миниатюрная группа Ф - группа флорибунда ЭМ - группа эфиромасличных роз

Глава I.

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЗНАНИЙ О ФАКТОРАХ ОПТИМИЗАЦИИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ROSA L.

1.1. Развитее исследований по клональному микроразмножению In vitro

многолетних древесных растений.

Первоосновы современной биотехнологии растений, под которой следует понимать науку о репродуцировании in vitro целостного растения из изолированных микроструктур (клеток, тканей или фрагментов органов), были заложены работами французского биолога Р.Готре, выполненными в сороковых годах перед началом второй мировой войны и получившими дальнейшее развитие в исследованиях самого Р.Готре, его учеников и сотрудников, а также ряда американских, английских и японских фитофизиологов в первый послевоенный период (Gotheret, 1932; Morel, 1952; Бутенко, 1960). В то время объектом изучения физиологов растений были каллусные культуры in vitro ряда видов травянистых растений, среди которых наиболее удобными считались морковь, цикорий, табак, некоторые другие виды. Указанный период исследований составил около .двадцати лет. В 1963 году были опубликованы результаты успешных опытов одного из учеников Готре - Ж.Мореля по репродуцированию целостных растений из апикальных меристем орхидей (Morel, 1963). Он выполнил эти исследования в возглавляемой им Лаборатории культуры тканей Центральной станции физиологии растений (в Версале) Национального Института агрономических исследований Франции. Эти работы Ж.Мореля привлекли внимание многих исследователей в целом ряде стран. Интерес к работам по клональному микроразмножению растений был обусловлен тем, что целостные растения в этом случае регенерировались из меристем, клетки которой, в

отличие от клеток дифференцированных тканей, не содержали вирусов. Тем самым была открыта перспектива получения оздоровленных (свободных не только от бактерий и грибов, но и от вирусов) целостных растений. Начиная с 1965 года, во многих лабораториях различных стран были развернуты интенсивные исследования по клональному микроразмножению in vitro многолетних травянистых растений (Morel, 1972; Бутенко, 1974, 1975, 1982, 1986). Состав видов растений, которые исследователям удалось репродуцировать методом клонального микроразмножения, непрерывно пополнялся новыми объектами. К 1980 году в нем насчитывалось много десятков видов растений. Среди них наиболее эффективно репродуцировались земляника (Попов, Трушечкин, 1972; Попов, 1977, 1978), гербера (Катаева, Бутенко, 1982), мята (Rech, Pires, 1986).

Следует отметить, что к этому времени были выяснены многие методические вопросы, касающиеся выбора и подготовки маточных растений к акту изолирования почек, приемов изолирования меристем, состава питательных сред, физических условий культивирования in vitro и адаптации молодых растеньиц-регенерантов к нестерильным условиям и условий выращивания в открытом грунте. Однако, как было отмечено выше, эти достижения были реализованы на примере репродуцирования многолетних травянистых растений. Основываясь на полученных результатах и экстраполируя их в будущее, многие авторы предлагали в эти годы весьма оптимистические прогнозы развития работ по клональному микроразмножению растений. Эти прогнозы предусматривали, прежде всего, возможность интенсификации биотехнологических процессов с использованием более широкого состава видов растений и получением более значительных партий регенератов в качестве посадочного материала. Тем временем, становились все более ясными не только преимущества метода клонального микроразмножения растений, но так-

же стали очевидными и многие трудности реализации данного биотехнологического процесса. Эти проблемы были связаны с тем, что обес�