Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина

Матвеева, Жанна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина"

На правах рукописи

Матвеева Жанна Владимировна

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАБИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО И М М У НО ГЛОБУЛ ИН А

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005533915

Саратов-2013

005533915

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения

«Российский научно-исследовательский противочумный институг «Микроб»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Абрамова Елена Геннадьевна

Официальные оппоненты: Гулий Ольга Ивановна

доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институг биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиолог ии микроорганизмов

Коинова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», заведующая кафедрой биохимии и биофизики

Ведущая организация: Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Зашита состоится «¿у »скяЯСЛ>?.2013 г. вЛ5-сО часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «2Р » олщРЯ2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

^-^Карпунина Лидия Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирус бешенства способен вызвать у человека и животных неизлечимое заболевание, которое, по оценке ВОЗ, входит в группу инфекционных болезней, наносящих значительный ущерб экономике и здравоохранению (WHO Expert ... , 2004). Из-за чрезвычайной опасности и абсолютной летальности вопросы профилактики бешенства после повреждения, нанесенного больным или подозрительным на бешенство животным, имеют исключительно важное значение. Существующая во всем мире единая тактика профилактики заболевания после контакта с возбудителем инфекции обеспечивается путем немедленной местной обработки раны с последующим введением антирабической вакцины, а в случаях множественных укусов опасной локализации - в сочетании с антирабическим иммуноглобулином (Селимов, 1986; Мовсесянц и др., 1989; Медуницын, 2005). В Российской Федерации ежегодно за антирабической помощью обращаются 430-470 тысяч человек, больше половины из них получают специфическое антирабическое лечение (Онищенко, 2012).

Для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей в Российской Федерации применяют концентрированную культуральную антирабическую вакцину (КОКАВ) в сочетании с антирабическим иммуноглобулином (АИГ) из сыворотки крови человека. В России рекомендованы к применению и зарегистрированы в Государственном Реестре лекарственных средств гомологичный АИГ (Китай, Франция) и гетерологичный АИГ из сыворотки крови лошади, единственным производителем которого в Российской Федерации является РосНИПЧИ «Микроб». На сегодняшний день АИГ из сыворотки крови лошади можно считать приемлемой и безопасной альтернативой гомологичному иммуноглобулину, получаемому из иммунной сыворотки крови человека, так как использование современных методов очистки иммуноглобулиновых препаратов позволило значительно снизить частоту побочных эффектов, проявляющихся в результате применения АИГ животного происхождения - до 1-2 % (Wilde et al., 1989; WHO Expert ... , 2004; Абрамова и др., 2010). Однако даже при сравнительно небольшой доле возникновения побочных эффектов вопрос дальнейшего усовершенствования гетерологичного АИГ остается актуальным.

Среди научно-практических задач, способствующих повышению качества целевого продукта, актуальной является применение на этапе иммунизации продуцентов рабического антигена культурального происхождения взамен органо-тканевого. Применение клеточных культур в качестве основной системы для репродукции фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» должно позволить получить более безопасный очищенный антиген, исключающий риск образования в сыворотке продуцентов антител-нейротоксинов, которые могут быть причиной побочных эффектов у получающих антирабическую помощь пациентов (Селимов, 1978; WHO Expert..., 2004). Переход к использованию культурального рабического антигена на этапе получения гипериммунной сыворотки согласуется с рекомендациями ВОЗ по исключению применения органо-тканевого антигена в производстве антирабических препаратов (WHO Expert... , 2004).

Не менее важным аспектом при поиске путей совершенствования технологии производства антирабического иммуноглобулина является разработка методических подходов для количественной оценки содержания вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале in vitro с помощью полимеразной цепной реакции с ги-бридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ПЦР-РВ). Применение количественной ПЦР-РВ позволит определять содержание вируса бешенства в

антигене для иммунизации продуцентов, а также исследовать динамику накопления вируса при его культивировании в культуре клеток.

Высокая востребованность антирабического иммуноглобулина на Российском фармацевтическом рынке, обусловленная неблагоприятной эпизоотологической и эпидемиологической ситуацией по бешенству, дают основания считать актуальными исследования по совершенствованию технологии производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Степень разработанности проблемы. В настоящее время в биотехнологической практике при производстве антирабических вакцин репродукцию вируса бешенства успешно осуществляют на различных клеточных системах: первичнотрипсинизированных и перевиваемых клетках почек сирийского хомяка (Селимов, 1978; Иванов, 2001), куриных и перепелиных фибробластах (Нагиева, 1980; Madhusudana, 2002), зародышевых клетках свиньи, собаки (Perez, 1997), диплоидных клетках человека (Brookes, 2005), клетках почек сайги (Груздев, 1997), клетках почечного эпителия зелёной мартышки (Vero) (Шафеева, 1995; Петрова, 2005; Barret, 2009). Использование для ПЦР-РВ зонда, меченного флуоресцентными метками, и дополнительная амплификация количественно охарактеризованных проб нашли успешное применение для определения концентрации РНК вируса диареи крупного рогатого скота (Kosinova, 2007); жёлтой геморрагической лихорадки, человеческого герпес вируса-6 и цитомегаловируса (Radonic, 2005); для количественной оценки антигена Е вируса клещевого энцефалита в культуре клеток (Морозова, 2012); для количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемичесюзго паротита и краснухи (Аммур, 2012) и др.

По данным литературы установлено, что на сегодняшний день отсутствует способ количественной оценки вируса бешенства в инакгивированном антигенном материале.

Таким образом, актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.

Цель работы: разработка биотехнологических приемов масштабированного выращивания культурального фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и способа его количественной оценки.

Задачи исследования:

1. Экспериментально обосновать технологические параметры культивирования фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на культуре клеток перевиваемой линии Vero.

2. Разработать методические подходы для количественного определения вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

3. Усовершенствовать технологические приемы по инактивации, очистке и концентрированию культурального вируса бешенства.

4. Оценить перспективы применения культурального рабического антигена для получения специфических сывороток.

5. Получить экспериментальные серии антирабического иммуноглобулина с применением культуральных технологий и исследовать его физико-химические и биологические параметры на соответствие требованиям нормативной документации.

Научная новизна заключается в том, что впервые фиксированный вирус бешенства штамма «Москва 3253» репродуцирован на клетках перевиваемой линии Vero. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования вируса стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами.

Впервые в отечественном производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина для иммунизации продуцентов предложено использование рабического антигена на основе культурального вируса бешенства штамма «Москва 3253» взамен органо-тканевого антигена.

Впервые разработаны методические подходы для количественной оценки содержания вируса бешенства штамма «Москва 3253» в рабическом антигене с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Практическая значимость работы

По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета №5 от 23.09.10), «Количественное определение фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в вируссодержащем материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Концентрирование инактивированной суспензии культурального фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» методом тангенциальной упьтрафильтрации» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» суспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» псевдосуспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11).

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труцы отечественных и зарубежных исследователей по вопросам профилактики бешенства человека; современным методам производства антирабических препаратов, соответствующих рекомендациям ВОЗ; количественной оценки вирусов методом ПЦР-РВ в вируссодержащем материале при выявлении вирусных заболеваний различной этиологии. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологические приемы обеспечивают репродукцию фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами культивирования.

2. Экспериментально обоснованная методика проведения инактивации, очистки и концентрирования вирусного урожая при масштабированном культивировании вируса бешенства «Москва 3253» в условиях биореактора позволяет получить культуральный рабический антиген для иммунизации продуцентов, по антигенным свойствам не уступающий органо-тканевому.

3. Применение культурального рабического антигена для иммунизации продуцентов позволяет получать иммунные специфические сыворотки с уровнем защитных антител, соответствующим регламентированному значению.

4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культуральных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям нормативной документации на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади.

5. Разработанные методические подходы позволяют определять количество

вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов с помощью полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов. '

Работа выполнена в лаборатории профилактических иммуноглобулинов и лаборатории генодиагностических препаратов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014) «Разработка технологии масштабированного культивирования вируса бешенства для получения культурального рабического антигена» (номера госконтракгов 63-Д от 29.06.2010, 73-Д от 25.07.2011, 54-Д от 04.06.2012).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2007, 2008, 2011, 2012, 2013); юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 2009); X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012); научно-практической конференции Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 11 апреля 2012); Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: материалы» (Пермь, 2012); VI Региональной научно-практической конференции «Перспективы использования в медицинской практике новых иммунобиологических,, препаратов, полученных на основе клеточных культур» (Екатеринбург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (к 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова) (Саратов, 2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и пратическую значимость.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов и обсуждений, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 190 источников, в том числе 83 - отечественных и 107 - зарубежных. Объем диссертации составляет 118 страниц машинописного текста, включает 22 таблицы, 18 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты, материалы и методы исследований

Объекты исследования Вирусные и бактериальные штаммы. Производственный штамм фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» (Коллекция штаммов вирусов НЦ ЭСМП, номер депозита 61/91) применяли для приготовления рабического антигена.

Тест-штамм фиксированного вируса бешенства «CVS» (Коллекция штаммов

вирусов НЦ ЭСМП, номер депозита 78/00) использовали для определения специфической активности экспериментальных серий антирабических сывороток и иммуноглобулина.

Рекомбинантный штамм Escherichia coli KM 229, полученный методом кальциевой трансформации из штамма Е. coli TGI, использовали для разработки количественных стандартов в ПЦР-РВ.

Клеточная линия. Репродукцию фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» in vitro осуществляли на перевиваемой клеточной линии Vero (В) (африканская зеленая мартышка, почка, производственный штамм, проверена на отсутствие микоплазм, 178 пассаж) (ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург).

Экспериментальные животные. В качестве животных-продуцентов антирабической сыворотки использовали кроликов (Oryctolagus cuniculus) породы «Шиншилла» массой 2,5-3,0 кг и лошадей орловской рысистой породы (Equus férus caballus) массой не менее 400 кг. Белых мышей (Mus musculus) линии BALB/c массой 10-12 г использовали для определения инфекционной активности вируса и специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина. Испытания на токсичность антирабического иммуноглобулина проводили на беспородных морских свинках (Cavia porcellus) массой 250-350 г и беспородных белых мышах массой 18-20 г. Пирогенность антирабического иммуноглобулина определяли на кроликах (Oryctolagus cuniculus) породы «Шиншилла» массой 1,5-2,5 кг.

Вирусные антигены. В работе использованы: а) органо-тканевой рабический антиген - инактивированная карболизированная 10 % суспензия мозга кроликов, зараженных фиксированным вирусом бешенства штамм «Москва 3253»; б) культуральный рабический антиген - инактивированная очищенная концентрированная суспензия культурального фиксированного вируса бешенства «Москва 3253», репродуцированного в условиях биореактора на клетках перевиваемой линии Vero.

Материалы и методы исследований

Методы культивирования клеток линии Vero и вируса бешенства штамма «Москва 3253». Культивирование клеток Vero и адаптацию фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» осуществляли стационарным методом на культуральных флаконах. В качестве ростовой среды использовали Игла MEM («Hyclome») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки или сыворотки КРС, в качестве поддерживающей - среду 199 («Hyclome») с добавлением 0,1% ЧСА и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин - 100 ЕД/мл каждого). Инфицирующая доза составляла 0,5-1,0 ЛД50/кл. Репродукцию вируса проводили при температуре 37 °С и pH 7,2-7,4.

Цитопатическое действие вируса на культуру клеток оценивали под инвертированным микроскопом, («Биомед-ЗИ», Россия). Инфекционную активность вируса бешенства проверяли через пять последовательных пассажей титрованием на белых мышах по общепринятой методике с учётом результатов титрования по методу L. Reed и H. Muench с выражением в 1цЛД5(/мл (Meslin et al., 1996).

Масштабированное культивирование клеток Vero и вируса бешенства «Москва 3253» проводили суспензионным и псевдосуспензионным методами в условиях биореактора BioG-M Plus («Biotron», Южная Корея) объёмом 5 л с лопастной мешалкой.

Посевную культуру клеток в дозе 0,5-1,0x105 кл/мл готовили из монослойной культуры, выращенной стационарным способом. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева. Суспензию клеток в количестве 200 мл засевали в биореактор с 2 л ростовой среды и антибиотиков. Для предотвращения агрегации клеток в среду добавляли трипсин. Культивирование производили в течение 60 ч при следующих

параметрах: скорость перемешивания 80-100 об/мин; температура (37 + 1) °С; рН (7,0 + 0,2). Уровень рН поддерживали с помощью 1 моль/л раствора бикарбоната натрия и 0,2 моль/л ацетатного буферного раствора (рН 4,5). Подачу стерильного воздуха с 5% содержанием углекислого газа осуществляли периодически. Заражение клеток производили путем инокуляции вируссодержащей жидкости непосредственно в биореактор. Заражающая доза составляла от 0,05 до 0,2 ЛДо/кл. После заражения ростовую среду меняли на поддерживающую. Культивирование вируса осуществляли в течение 96 ч при следующих параметрах: скорость перемешивания - 100 об/мин; температура - (33 + 1) °С; рН (7,2 ± 0,2).

Для псевдосуспензионного культивирования использовали микроносители Cytodex-3 («Sigma», США). Посевную культуру клеток в дозе 0,5-1х 105 кл/мл и микроносители в концентрации 2,5-3,0 г/л вносили в биореактор с 2 л ростовой среды. Клетки с микроносителями культивировали в течение 60 ч при температуре (37+1) СС; рН (7,0+0,2); подачу С02 осуществляли в первые 2 ч культивирования. После накопления клеток Vero культивирование прекращали, микроносители с клетками осаждали, удаляли ростовую среду и подавали поддерживающую среду 199 с ростовыми добавками, после чего вносили вирусную суспензию в заражающей дозе 0,1 ЛД50/МЛ. Вирус культивировали при следующих параметрах: скорость перемешивания - 75 об/мин; температура -(33±1)°С; рН - (7,0 + 0,2). Инактивацию материала, содержащего фиксированный вирус бешенства, выполняли согласно МУ 3.3.1.1099-02 (Методические указания «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства», 2002). Концентрирование инактивированной суспензии культурального вируса осуществляли методом тангенциальной ультрафильтрации с применением установки Vivajlow 200 («Sartorius», Германия), снаряженной плоскорамными фильтрующими элементами.

Выделение РНК вируса бешенства «Москва 3253» проводили с помощью набора реагентов «Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Постановку реакции обратной транскрипции осуществляли с помощью набора реагентов «Реверта-L» («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя.

Для ПЦР-анализа использовали следующие ингредиенты: деионизованную стерильную воду; минеральное масло; 10-кратный буферный раствор; 50 мМ раствора хлорида магния; водный раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов в концентрации 2мМ каждого; фермент 7ад-полимеразу в концентрации 5 ед/мкл; водный раствор кДНК; олигонуклеотидные праймеры и зонд формата Taq-Man с флуоресцентными метками.

Праймеры и зонд синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК «ASM-800» (ТОО «Биоссет», Россия).

Концентрацию праймеров и температуру отжига рассчитывали по следующим формулам:

__100 х .4260_

К'-и™ ~ 1,54 х пА + 0,75 х пС + 1Д7 х иб + 0,92 х пТ 5 ([)

где А260 - коэффициент поглощения при длине волны 260 нм; п - число соответствующих оснований; А, С, G, Т - дезоксирибонуклеотиды;

Tomm=2 х (Т+А) + 3 х (C+G) - 5 (°С) (2)

Для проведения амплификации основные компоненты реакции размораживали и смешивали. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик МС 2» («ДНК-технология», Россия). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5-2% агарозном геле при градиенте напряжения 8 В/см в течение 15-20 мин., согласно рекомендациям, изложенным в руководствах Л.А. Остермана и Т. Маниатиса

с соавт. (Остерман, 1981; Маниатис, 1984). Результаты учитывали визуально, просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Для документирования полученных результатов гелевые пластинки сканировали с_ помощью системы «GelDoc 2000» («BioRad, США»),

ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов проводили на программируемом термоциклере «RotorGene 6000» («Corbett Research», Австралия). Продукты ПЦР учитывали автоматически с помощью программного обеспечения к прибору.

Для конструирования рекомбинантного штамма амплифицированный фрагмент очищали от невключившихся в реакции мононуклеотидов на колонке «Centry-sep colounins» («Pirseton Separations INC», USA) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Клонирование ПЦР-продукта проводили с использованием набора «pGEM-T Vector Systems» («Promega», США). Очищенные ампликоны лигировали в линейный ДНК-вектор pGEM-T. Компетентные клетки Е. coli TGI трансформировали лигазной смесью с использованием кальция хлорида с последующим отбором клонов на среде с ампициллином. Плазмиду pGem-T выделяли из полученной биомассы методом мембранной фильтрации с помощью набора «PureYield Plasmid Miniprep Sistems» («Promega», США). Специфичность фрагментов кДНК оценивали секвенированием на генетическом анализаторе «CeQ-800» («Bekman Coulter», США), с использованием стандартных протоколов пробоподготовки и программного обеспечения прибора.

Определение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре «Biowave II» (Швейцария). Работу выполняли в соответствии с инструкцией к прибору. Расчет концентрации ДНК проводили с помощью встроенного в прибор программного обеспечения.

Методы получения H контроля физико-химических и биологических свойств антирабических сывороток и гамма-глобулина. Фракцию гамма-глобулина из антирабических сывороток выделяли риванол-спиртовым методом (Карпов и др., 1976; Егоров и др., 1988; Краснопольский и др., 2008).

Специфическую активность антирабических сывороток и иммуноглобулина изучали методами in vivo в реакции нейтрализации на белых мышах (Meslin, Kaplan, Koprowski, 1996) относительно отраслевого стандартного образца специфической активности антирабического иммуноглобулина ОСО 42-28-200-07 НЦ ЭСМП и in vitro в прямом дот-иммуноанализе (ДИА) с использованием диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота (Шарапова и др., 2010).

Определение фракционного состава сывороток проводили электрофоретическим методом на пленках из ацетата целлюлозы (ФС 42-3874-99, 2000). Обработку результатов производили при помощи сканирования и последующего обсчета количественного содержания белковых фракций с использованием программного средства «Анализ фракций сыворотки крови», предоставленного ООО «НЦП «Астра». Концентрацию водородных ионов (pH) определяли потенциометрически (Государственная Фармакопея РФ XII, 2008).

Электрофоретическую однородность иммуноглобулина подтверждали методом электрофореза согласно (ФС 42-3874-99, 2000); прозрачность и цветность определяли спектрофотометрически (ФС 42-3874-99, 2000); пирогенность и токсичность -биологическим методом (Государственная Фармакопея РФ XII, 2008); содержание белка - методом с биуретовым реактивом (ФС 42-3874-99, 2000). Оптическую плотность растворов определяли на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2 (ПО «ЗОМЗ», Россия).

Методы статистической обработки результатов исследований. В работе использовали стандартные методы статистической обработки экспериментальных данных (Ашмарин и др. 1962;Лакин, 1990).

Результаты исследований и их обсуждение

Экспериментальное обоснование технологических параметров культивирвания производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре первиваемой линии Vero

Адаптацию фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» к клеточной линии Vero проводили с использованием следующих подходов: прямое пассирование вируса на клеточной культуре; поочередное пассирование вируса бешенства на кроликах и клеточной культуре. Первоначально культуру клеток инфицировали штаммом вируса бешенства «Москва 3253», полученным из мозговой ткани кролика. При адаптации вируса была исследована эффективность способов заражения: на клеточный монослой и в клеточную суспензию. Вирус вносили в дозах 0,01; 0,1; 1,0 ЛД5(/кл. К 35 пассажу титр инфекционной активности вируса составил (3,57±0,21) lg ЛД50/мл. Для повышения инфекционности вируса дальнейшую адаптацию вируса проводили чередующимися пассажами: мозг кролика - культура клеток. Было проведено 10 перемежающихся пассажей (кролик-клетки), после чего инфекционная активность вируса возросла до (4,34±0,32) lg ЛД50/мл. Далее проводили 15 прямых пассажей на клетках Vero, в течение которых инфекционная активность вируса не увеличилась. После дополнительных шести чередующихся пассажей (кролик-клетки) и 10 прямых пассажей на культуре клеток, вирус бешенства штамм «Москва 3253» приобрел стабильную способность накапливаться в монослое, вызывая его разрушение до 80-90 %. Инфекционная активность вируса подтверждалась его цитопатическим действием на клеточный монослой. За ЦПД принимали видимые морфологические изменения клеток в виде симпластообразования, фрагментации клеток и их отторжения. Деструкцию монослоя наблюдали с 25 пассажа.

При адаптации вируса была исследована эффективность способов заражения на клеточный монослой и в клеточную суспензию. Установлено, что при стационарном способе культивирования доза заражения 0,1 ЛД^о/кл являлась оптимальной, обеспечивая накопление вируса в титре (4,14±0,09) lg ЛД50/мл при инокуляции вируса на клеточный монослой и (4,34±0,32) lg ЛД50/МЛ - в клеточную суспензию.

Для улучшения адсорбции вируса на клеточной мембране использовали протамина сульфат в дозе 0,1 мг/мл за 10 минут до внесения вируса с последующей инкубацией при температуре (37±1) °С. Использование протамина сульфата привело к повышению специфической активности вируссодержащей жидкости на 0,1-0,5 lg ЛД50/мл. Культивирование проводили 96 ч.

При масштабированном культивировании клеток Vero суспензионным способом посевную культуру клеток готовили из однослойной культуры, выращенной стационарным способом в культуральных флаконах с рабочей поверхностью 150 см". После открепления клеток с помощью раствора версена-трипсина их центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин и осадок ресуспендировали в свежей питательной ростовой среде Игла MEM с добавлением 10 % сыворотки КРС. Полученную суспензию клеток в количестве 200 мл помещали в биореактор с 2 л ростовой среды. Конечная посевная концентрация клеток составляла 0,5-1,0х 10 кл/мл. В качестве ростовой среды использовали среду Игла MEM с добавлением 10 % фетальной или нормальной сыворотки КРС и антибиотиков. Оптимальный срок культивирования клеток составил 60 ч. Применение суспензионного метода

культивирования позволяет получать урожай клеточной культуры Vero в концентрации 2,1 х 105 кл/мл.

При отработке условий культивирования вируса суспензионным способом заражение клеток производили путем инокуляции вирусной суспензии непосредственно в биореактор. Количество посевного вируса, используемого для заражения, зависело от титра его инфекционной активности; заражающая доза составляла от 0,05 до 0,2 ЛД50/кл. Через 30 мин после инокуляции вируса в биореактор добавляли поддерживающую среду в объеме Зле добавлением ЧСА 0,1 % или нормальной сыворотки КРС (1%, 2%, 5%) и антибиотиков.

Культивирование вируса осуществляли в течение 96 ч при следующих параметрах: скорость перемешивания - 100 об/мин; температура - (33 + 1) °С; рН (7,2 + 0,2). Уровень рН поддерживали с помощью 1 моль/л раствора бикарбоната натрия и 0,2 моль/л ацетатного буферного раствора (рН 4,5). Доза заражения 0,1 ЛД50/кл явилась оптимальной. В результате исследования эффективности

ростовых добавок экспериментально подтверждена возможность замены ЧСА на компонент с более низкой стоимостью — нормальной сыворотки КРС. Использование последней не оказывает значимого влияния на урожай вируссодержащей жидкости. Титр инфекционности вируса при культивировании на среде 199 с добавлением 0,1 % ЧСА; 1%, 2%, 5% нормальной сыворотки КРС составил соответственно (4,41±0,28); (3,83±0,32); (4,27±0,26); (4,38±0,33)lg ЛД50/мл (таблица 1).

Таблица 1 - Влияние дозы заражения и состава среды на уровень инфекционной

активности фиксированного вируса бешенства при масштабированном __культивировании_

Доза заражения, ЛД50/кл Титр вируса, lg ЛД50/МЛ, при использовании поддерживающей среды

среда 199 с 0,1% ЧСА среда 199 с 1% сыворотки КРС среда 199 с 2% сыворотки КРС Среда 199 с 5% сыворотки КРС

1 2 1 2 1 2 1 2

0,05 4,12± 0,37 4,32± 0,36 3,65± 0,13 3,82± 0,32 4,23± 0,34 4,42± 0,08 4,34± 0,09 4,45± 0,35

0,1 4,41± 0,28 4,62± 0,28 3,83± 0,32 4,19± 0,27 4,27± 0,26 4,68± 0,13 4,3 8± 0,33 4,51± 0,17

0,2 4,25± 0,23 4,54± 0,31 3,82± 0,27 4,17± 0,34 4,21± 0,31 4,51± 0,33 4,22± 0,25 4,40± 0,34

Примечание — 1 — суспензионный метод; 2 - псевдосуспензионный метод.

Для псевдосуспензионного культивирования посевную культуру клеток готовили из однослойной культуры, выращенной стационарным способом. Суспензию клеток (200 мл) помещали в биореактор, содержащий 2 л ростовой среды и микроносители в концентрации 2,5-3,0 г/л. Посевная доза клеток составляла 0,5-1,0x105 клеток/мл. Для лучшего прикрепления клеток к микроносителям в первые 8 ч культивирование проводили при периодическом перемешивании: 1 мин со скоростью 50 об/мин, время остановки мешалки - 30 мин. После прикрепления клеток к микроносителям в ферментер медленно добавляли еще 3 л ростовой среды. Дальнейшее культивирование проводили с постоянной скоростью перемешивания, равной 80 об/мин. Применение псевдосуспензионного метода культивирования позволяет получать урожай клеточной культуры Vero в концентрации 2,8* 105 кл/мл. Сравнительный анализ результатов масштабированного культивирования клеток

выявил преимущество псевдосуспензионного метода, применение которого позволяет получать более высокий уровень накопления биомассы (рисунок 1).

3,5

О 12 24 36 48 60 72 М S6 Время, часы

— Суспензионный способ —Псевдосуспензионный способ

Рисунок 1 — Динамика накопления биомассы клеток Vero при культивировании в биореакторе суспензионным и псевдосуспензионным способами

При культивировании вируса псевдосуспензионным способом после накопления необходимого количества клеток Vero, выращенных на микроносителях, культивирование прекращали. После оседания микроносителей с клетками на дно ферментера и удаления ростовой среды в биореактор подавали поддерживающую среду 199 с ростовыми добавками и вносили вирусную суспензию в заражающей дозе 0,05; 0,1; 0,2 ЛД50/КЛ. Для обеспечения лучшего контакта клеток с вирусом заражение осуществляли в объеме среды, равном 1 л. После проведения адсорбции в течение 30 мин при температуре (33 + 1) °С и скорости перемешивания 50 об/мин доводили объем поддерживающей среды до 2 л и культивировали вирус при следующих параметрах: скорость перемешивания - 75 об/мин; температура - (33 + 1) °С; рН -(7,0 + 0,2). При исследовании оптимальных условий культивирования псевдосуспензионным способом было изучено накопление инфекционной активности вируса в зависимости от дозы заражения и состава среды. Культивирование проводили в течение 96 ч, затем определяли титр инфекционной активности образцов, который при культивировании на среде 199 с добавлением 0,1% ЧСА; 1%, 2%, 5% нормальной сыворотки КРС составил соответственно (4,62±0,28); (4,19±0,27); (4,68±0,13); (4,51 ±0,17) lg ЛД50/мл (таблица 1).

Таким образом, для масштабированного культивирования фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» целесообразно использование псевдосуспензионного метода при следующих параметрах: скорость перемешивания - 75 об/мин; температура - (33 + 1) °С; рН - (7,0 + 0,2); оптимальная доза заражения - 0,1 ЛД50/кл при использовании поддерживающей среды с содержанием 0,1% ЧСА или 2% сыворотки КРС.

Разработка способа количественного определения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом

результатов

Расчёт титра вируса с использованием белых мышей при оценке эффективности культивирования вируса - довольно трудоёмкий и длительный процесс, поэтому для изучения динамики его накопления при масштабированном культивировании, а также для количественной оценки содержания вируса в рабическом антигене возникла

необходимость в разработке количественного метода in vitro. Таким методом является ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов.

Разработка количественной ПЦР включала в себя несколько этапов: выбор ДНК-мишени; подбор специфичных праймеров и зонда формата TaqMan; конструирование рекомбинантного штамма и оптимизацию количественной ПЦР; подбор ПЦР-стандартов; оптимизацию методов выделения РНК и реакции обратной транскрипции; апробацию разработанной количественной ПЦР на вирусном материале.

Для оценки перспективности использования G-L области вируса бешенства штамма «Москва 3253» размером 881 н.п. в качестве ДНК-мишени была выбрана последовательность фрагмента данного участка генома, фланкированного праймерами BeshG 5'-gacttgggtctcccgaactgggg-3' и BeshL 5'-caaaggagagttgagattgtagtc-3\ Анализ гомологии полученной последовательности проводили с помощью алгоритма BLAST и генетической базы данных GenBank NCBI. На основании полученных результатов выведена консенсусная последовательность фрагмента G-L области у фиксированного штамма вируса бешенства «Москва 3253».

Специфичные для штамма вируса «Москва 3253» олигонуклеотидные праймеры и зонд подбирали так, чтобы их последовательности отличались от таковых в геномах других штаммов вируса бешенства не менее чем на 7 нуклеотидов, количество вариабельных нуклеотидов в пределах последовательности зонда у других изолятов было не менее 3, последовательность З'-конца зонда имела значительные отличия от таковой у других штаммов вируса бешенства (Wacharapluesadee et al., 2008). С учетом этих требований и на основании консенсусной последовательности выбранного участка с помощью программы Primer Premier-V5 и интернет-сайта www.genscript.com были подобраны олигонуклеотидные праймеры RV5 и RV6 и зонд формата TaqMan RV7 с флуоресцентными метками ROX и BHQ2: RV5- 5 ' -GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3 ', RV6 -5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3', RV7 -5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2. Показана высокая специфичность праймеров RV-5, RV-6 и зонда RV-7 по отношению к последовательности G-L области штамма вируса бешенства «Москва 3253». Для повышения эффективности гидролиза зонда RV7 за счет 5'-экзонуклеазной активности фермента Taq-полимеразы к его 5'-концу добавлено три нуклеотида «ААТ», некомплементарных последовательности локуса.

Для определения оптимальных условий амплификации подобранных праймеров и зондов для проведения количественной ПЦР использовали пробы, содержащие известную концентрацию ДНК. С этой целью получали рекомбинантный штамм. В качестве мишени для встраивания в вектор pGem-T использовали фрагмент G-L области фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253», изученного ранее. Амплификацию фрагмента размером 881 п.н. осуществляли с помощью праймеров Besh G и Besh L, последовательность которых указана выше. Реакцию проводили в микропробирках объёмом 0,6 мл, при этом реакционная смесь содержала 17 пМоль каждого праймера, 2,5 мМ ионов MgCl2 и 1 ед. фермента. Для осуществления амплификации использовали следующую программу: предварительная денатурация при 94 °С в течение 3 мин; 35 циклов, включающих 94 °С - 30 с, 58 °С - 30 с, 72 °С -30 с; заключительная достройка комплементарной цепи 72 °С в течение 3 мин. Наличие ПЦР-продукта определяли методом электрофореза. Концентрирование образца проводили методом переосаждения пропанолом. Осадок ампликонов растворяли в 10 мкл ТЕ-буфера, фрагмент лигировали в плазмиду pGem-T с помощью коммерческого набора «pGem-T Vector Sistems» согласно инструкции производителя. Проводили трансформацию клеток штамма Е. coli TGI аликвотой лигированной смеси.

Выросшие колонии проверяли на наличие фрагмента G-L области генома методом ПЦР с праймерами Besh G и Besh L, как описано выше.

Рекомбинантный штамм Е. coli TGl/pRVMoscow32J3G-L депонирован . в Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ 229.

Для выделения плазмидной ДНК единичную изолированную колонию рекомбинантного штамма Е. coli TGI/ pRVmoscow3253G-L с поверхности LB-arapa отсевали в среду LB с добавлением ампициллина, инкубировали с аэрацией. Далее осажденные центрифугированием клетки лизировали и проводили дальнейшую очистку с помощью набора «DNA Purification System». В результате такой обработки получали 100 мкл плазмидной ДНК в деионизованной воде. Концентрацию плазмидной ДНК определяли спектрофотометрически. Расчёт количества геном-эквивалентов плазмиды pRVMoscow3253G-L в полученном растворе плазмидной ДНК осуществляли, используя формулу:

KpRVM„Sc„w3253G-LM„l:K,a3253= А Х0,234 хЮ12[ГЭ/мл], (3)

где А - концентрация плазмидной ДНК pRVMoScow3253G-L в мкг/мл. Для определения оптимальных условий амплификации параметров использовали 10х разведения плазмидной ДНК до конечного разведения Ю"10, что ориентировочно соответствовало пхЮ2 ГЭ/мл.

Установлено, что оптимальными условиями для амплификации фрагмента G-L области фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» с подобранными праймерами и зондом являются: концентрации праймеров 10 пМоль каждого, зонда -5 пМоль; MgCl2 - 2,5 мМ, дНТФ - 0,2 мМоль, фермента йд-полимеразы - 1 ед.; программа амплификации: денатурация и плавление воска 95 °С - 5 мин; цикл 1(10 повторов) - шаг 1 - 95 °С - 10 сек, шаг 2 - 60 °С - 10 сек, шаг 3 - 72 °С - 10 сек; цикл 2 (35 повторов) - шаг 1 - 95 °С - 10 сек, шаг 2 - 56 °С - 10 сек, шаг 3 - 72 °С -25 сек. Учет флуоресценции по каналу ROX осуществляли при температуре 56 °С. При проведении реакции в соответствии с представленными выше условиями чувствительность метода составила до 102 ГЭ/мл. В пробах интактного мозга кроликов специфическая флуоресценция по каналу ROX отсутствовала.

На основании проведенных исследований получены ПЦР-стандарты: RV1 -разведение плазмидной ДНК Ю^4, что соответствует п *108 ГЭ/мл, RV2 -разведение плазмидной ДНК 10~5, что соответствует п х107 ГЭ/мл, RV3 - разведение плазмидной ДНК 10~7, что соответствует п х105 ГЭ/мл, RV4 - разведение плазмидной ДНК 10"9, что соответствует п х103 ГЭ/мл. В ходе экспериментов было установлено, что при исследовании проб антигена органо-тканевого происхождения оптимальным является использование ПЦР-стандартов RV1, RV2, RV3: RV1 - пхЮ8 ГЭ/мл pRVmoscow3253G-L, RV2 - п хЮ7 ГЭ/мл pRVMostow3253G-L, RV3 - пхЮ5 ГЭ/мл pRVMoscow3253G-L; при исследовании проб культурального происхождения оптимальным является использование ПЦР-стандартов RV2, RV3, RV4: RV2 ■ п *10' ГЭ/мл pRVMoscow3253G-L, RV3 - п хЮ5 ГЭ/мл pRVMoscow3253G-L, RV4 - п хЮ1 ГЭ/мл pRVM„scow3253G-L.

В ходе экспериментов выделение РНК осуществляли с помощью набора для выделения РНК/ДНК, производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (набор 1) и коммерческого набора «Рибо-Сорб» (набор 2). Данные наборы отличались по способу подготовки нуклеосорбента, по методике использования: разный объем вносимого в пробы нуклеосорбента, наличие двойной отмывки буфером 3 и дополнительного отмывочного буфера 4 при проведении работ с набором «Рибо-Сорб». При выделении РНК с помощью указанных выше наборов установлено, что количество РНК, выделенной из исследуемых проб, было в среднем в 10 раз выше при использовании второго набора. В связи с этим, все последующие эксперименты проводили с набор

для выделения ДНК/РНК «Рибо-Сорб»

Для оптимизации условий получения кДНК фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» методом обратной транскрипции реакцию проводили в трёх режимах, представленных в таблице 2. Установлено, что концентрация кДНК вируса бешенства была выше при использовании второго режима 1,18*10 ГЭ/мл в пробе 1 и 2,60* 105 ГЭ/мл в пробе 2, значительной разницы между вторым и третьим режимами не наблюдалось, а длительность реакции при использовании третьего режима была на 30 мин длиннее - 90 мин.

Таблица 2 - Реакция обратной транскрипции вируса бешентсва штамма «Москва

3253» в трех режимах

Проба Длительность реакции обратной транскрипции, мин Результаты ПЦР

СТ Расчётная концентрация*

Проба 1 30 (режим 1) 24,44 1,83Е+04

Проба 2 22,11 8,65Е+04

Проба 1 60 (режим 2) 21,56 1,18Е+05

Проба 2 20,33 2,60Е+05

Проба 1 90 (режим 3) 18,73 7.33Е+05

Проба 2 20,21 2.82Е+05

Стандарт 3- 3,44Е+05* н/и** 19,86 3.52Е+05

Стандарт 2 - 2,37Е+07* 13,45 2;21Е+07

Стандарт 1 - 1,94Е+08* 10,02 2,03Е+08

Отрицательный контроль 0 0

Примечание - * единица измерения расчетной концентрации и концентрации стандартов - копий ГЭ/мл, коэффициенты Е+08, +07, +05, +04, +03 соответствуют 108, 107, 105, 104и 103, соответственно; **н/и — не исследуется.

па и^нишпш иил^и-пшмл дшиишл ...........---,— —----------

фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» из купьтуральной жидкости оптимальным является применение набора «Рибо-Сорб». Реакцию обратной транскрипции оптимально осуществлять при температуре 37°С в течение 60 мин.

Апробацию разработанной количественной ПЦР на вирусном материале осуществляли путем определения концентрации фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в исследуемых пробах антигена органо-тканевого и культурального происхождения. Культуральный вирус был получен стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным способами выращивания (таблица 3).

Таблица 3 - Концентрации фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в антигенном материале

Исследуемые образцы Концентрация вируса (копий/мл) Коэффициент корреляции Эффективность реакции Коэффициент вариации, %

Органо-тканевой антиген 8 от 2,0x10 до 8 8,81x10 0,99708 -1,0 0,89667-0,97 от 7,5 до 10

Продолжение таблицы 3

Культур альная вируссодержащая жидкость (стационарный способ выращивания) 3 от 4,99x10 до 7,59x10 0,998930,99900 0,96566 - 0,97 от 8,3 до 10

Культуральная вируссодержащая жидкость (суспензионный способ выращивания) 4 от 3,31x10 до 6 1,59x10 0,99959 -0,99900 0,90885 - 0,97 от 2,4 до 8,4

Культуральная вируссодержащая жидкость (псевдосуспензионны й способ выращивания) 4 от 9,93x10 до 6 4,77x10 0,99300 - 1,0 0,93000 - 0,97 от 5,4 до 7,3

Культуральная вируссодержащая жидкость после концентрирования 7 от 3,5x10 до 8 2,23x10 0,99602 - 1,0 0,91755-0,97 от 8,0 до 10

Установлено, что концентрация вируса в исследуемых пробах культуральной

вируссодержащей жидкости варьировала от 4,99x10 копий/мл до 4,77x10 копий/мл, что предопределило необходимость в концентрировании вирусного урожая до

получения значения 10 - 10 копий/мл, сопоставимого с уровнем содержания вируса в мозговой ткани.

Совершенствование технологии инактивации, концентрирования и очистки культурального вируса бешенства

На сегодняшний день в производстве антирабического иммуноглобулина в качестве инактиванта используется фенол. Для нас интерес представляло изучение эффективности применения более современных и менее токсичных инактивантов - р-пропиолактона и теотропина, механизм действия которых заключается в необратимом повреждении репликативного механизма вируса при полном сохранении его исходной антигенной структуры. При проведении исследований по инактивации использовали вирус, полученный методом суспензионного культивирования на перевиваемой клеточной линии Vero. Применяли инактиванты теотропин и (3-пропиолактон. Инактивацию проводили при значении температур 4, 22 и 37 °С. Пробы отбирали через 2 и 24 ч. Р-пропиолакгон добавляли к вируссодержащей жидкости в конечной концентрации 0,0125 и 0,025%; инактивирующую активность теотропина исследовали в концентрациях 0,01; 0,05 и 0,1%. Выбор условий инактивации обусловлен рекомендациями отечественных и зарубежных исследователей (Гочмурадов, 1999; Иванов, 2001; Красугкин, 2003; Сливко, 2003; Frazzati-Gallina et al., 2001; Kumar et аЦ 2005; Rourou et al., 2007). Установлено, что для инактивации вируса теотропином при температуре 37 °С в течение 24 ч эффективна концентрация 0,05 % ; при использовании Р-пропиолактона полную инактивацию вируса регистрировали через 24 ч в концентрации 0,0125 % при всем исследуемом диапазоне температур.

Для получения культурального рабического антигена, сопоставимого по уровню содержания вируса бешенства с органо-тканевым, были проведены эксперименты по

концентрированию инактивированного вирусного урожая методом тангенциальной ультрафильтрации. В работе использовали инактивированную суспензию культурального фиксированного вируса ■бешенства «Москва 3253», исходный объем которой составлял 5,0 дм3. Для подбора оптимальной мембраны концентрирование проводили с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе (НОММ) 10, 30, 100, 300 и 1000 кДа в режиме тангенциальной фильтрации с давлением 0,21 МПа. Для определения эффективности процесса концентрирования определяли удельную скорость фильтрации, а также такие свойства концентрируемой жидкости, фильтрата и концентрата, как содержание белка, прозрачность, содержание фиксированного вируса бешенства. Установлено, что наиболее рациональным представляется применение мембран с НОММ 300 кДа. Содержание вируса бешенства, выявленное в ПЦР в режиме реального времени при использовании мембран с НОММ 300 кДа, составило 7,14><107 копий/мл (до концентрирования -9,69x106 копий/мл) при удельной скорости фильтрации 72,4 дм3/м2/ч. При использовании мембран с более высоким значением НОММ (1000 кДа) концентрирования не происходило и вирус бешенства в целевом продукте не выявлялся.

Для оптимизации гидродинамического режима и установления оптимальной скорости фильтрации концентрирование культуральной вируссодержащей жидкости проводили через мембраны с НОММ 300 кДа с различными значениями давления от 0,15 до 0,30 МПа. В эксперименте показано, что оптимальная средняя удельная скорость фильтрации имеет место при давлении, равном (0,25±0,01) МПа - 78,2 дм3/м2/ч.

Полученный концентрат инактивированного вирусного урожая, очищенный тангенциальной ультрафильтрацией от балластных примесей, в дальнейшем использовали как культуральный рабический антиген для последующих экспериментов по иммунизации животных-продуцентов.

Получение сывороток от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном, и выделение специфического иммуноглобулина

Необходимым этапом работы при изучении перспективы внедрения культурального антигена в производство АИГ являлась экспериментальная оценка возможности получения активных иммунных сывороток от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном. Первоначально были проведены эксперименты по получению иммунных сывороток от кроликов. Животных иммунизировали подкожно по 1 мл антигена с установленной концентрацией вирусных частиц от п*107 до п*108 копий/мл на 0, 7, 21, 28, 52, 59 сутки. Титр вируснейтрализующих антител определяли на 42 и 73 сутки. Первую группу иммунизировали культуральным антигеном без адъюванта, вторую и третью -культуральным антигеном, сорбированным на гидроокиси алюминия (ГО) (3 мг/мл), и с полиоксидонием (1,5 мг/мл) соответственно. Анализ in vitro в ДИА специфической активности антирабической сыворотки, полученной в результате пробного кровопускания на 42 сутки иммунизации, показал, что оба адъюванта - ГО и полиоксидоний способствовали усилению продукции антител (рисунок 2).

42 сутки 73 сутки

Рисунок 2 - Специфическая активность кроличьих антирабических сывороток в зависимости от применяемого адъюванта

Примечание - 1 - группа животных, иммунизированных культуральным антигеном без адъюванта;

2 - группа животных, иммунизированных культуральным антигеном с ГО (3 мг/мл);

3 — группа животных, иммунизированных культуральным антигеном с полиоксидонием (1,5 мг/мл).

Так, у второй группы животных, иммунизированных антигеном с ГО, наблюдали самый высокий уровень антител - (1:160 - 1:320) или -lg(X±x)=(2,3±0,3). Значения специфической активности сывороток у первой и третьей групп были соответственно равны (1:40-1:80) или -lg(X±x)=(l,8±0,3) и 1:160 или -lg(X±x)=(2,2±0,0). К окончанию иммунизации (73 сутки) уровень титра антител возрос во всех опытных группах, наиболее высокую активность проявляли сыворотки, полученные от второй группы животных - (1:1280-1:2560) или -lg(X±x) = (3,2±0,3). Соответственно, у первой и третьей групп значения специфической активности сывороток составили (1:320-1:640) или -lg(X±x) = (2,7±0,3) и (1:640-1:1280) или -lg(X±x)=(2,9±0,3). Полученные результаты показали, что наиболее рациональным представляется использование в качестве адъюванта ГО, хотя следует отметить тенденцию к увеличению образования антител при применении полиоксидония. Анализ in vivo специфической активности полученных антирабических кроличьих сывороток показал, что в реакции нейтрализации на белых мышах с фиксированным вирусом бешенства штамма «CVS» в количестве 349 LD50 титр специфических антител исследуемых образцов соответственно равен 1:640 (13 МЕ/мл), 1:513 (10 МЕ/мл) и 1:548 (11 МЕ/мл).

Положительный опыт получения активной иммунной сыворотки кроликов свидетельствовал о возможности применения культурального антигена для иммунизации лошадей - более крупных и традиционно используемых продуцентов антирабической сыворотки. Иммунизацию лошадей проводили на протяжении 11 недель с интервалом между первой и второй инъекциями 21 день, далее - с интервалом 7 дней. Введение антигена проводили внутримышечно. Объем иммунизирующей дозы был равен 5 мл с содержанием вируса бешенства п><108 копий/мл, по данным ПЦР в режиме реального времени.

Уровень содержания специфических антител в сыворотках лошадей на этапах иммунизации определяли in vitro в ДИА. Анализ специфической активности иммунных сывороток, полученных в результате пробных кровопусканий, показал положительную динамику образования антител. К концу срока иммунизации титр антител составил 1:1000, что явилось достаточным для завершения процесса иммунизации (рисунок 3).

Для выяснения зависимости между нарастанием антител и процентным содержанием фракций белка в сыворотках последние были исследованы методом электрофореза на ацетатных пленках. Электрофоретические исследования показали, что иммунологические сдвиги в процессе иммунизации лошадей происходили с

нарастанием гамма-глобулиновой фракции; к концу иммунизации имело место увеличение содержания гамма-глобулинов на 25 % относительно исходного их содержания (рисунок 3). В реакции нейтрализации на белых мышах с фиксированным вирусом бешенства штамма «CVS» в количестве 299 LD50 титр специфических антител исследуемых образцов лошадиных сывороток составил 1:692

Рисунок 3 - Динамика изменения специфической активности (1) и количества гамма-глобулиновой фракции (2) в антирабической сыворотке лошади в процессе иммунизации

(14 МЕ/мл); 1:554 (10 МЕ/мл) и 1:521 (11 МЕ/мл) при регламентированном значении не менее 1:500.

Таким образом, по результатам тестов in vivo и in vitro, экспериментальные серии антирабических сывороток, полученных от лошадей, иммунизированных репродуцированным на культуре клеток Vero вирусом бешенства, обладают достаточно высокой специфической активностью и могут быть использованы в качестве сырья при получении антирабического иммуноглобулина. Их специфическая активность не уступает активности сывороток, полученных с применением органо-тканевого рабического антигена.

Получение антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади и изучение его биологических и физико-химических свойств

Заключительным этапом исследований являлась экспериментальная оценка возможности получения готовой лекарственной формы АИГ из сыворотки крови лошади с использованием культуральных технологий и проверка его качества на соответствие показателям фармакопейной статьи предприятия.

Для выделения специфического иммуноглобулина использовали антирабическую сыворотку лошадей, иммунизированных культуральным антигеном, с титром антител не менее 1:500. Фракцию у-глобулина выделяли риванол-спиртовым методом. Полученный осадок иммуноглобулина разводили в 0,9 % растворе хлорида натрия, приготовленном на воде для инъекций. Предварительную осветляющую фильтрацию раствора иммуноглобулина осуществляли через полиамидные фильтры с диаметром пор 0,80 и 0,45 мкм. Для удаления остаточного спирта проводили диализ раствора иммуноглобулина против 0,9 % раствора натрия хлористого. Для улучшения показателей прозрачности и цветности, а также для удаления пирогенов осуществляли фильтрацию через глубинные фильтры Zeta Carbon. Стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина проводили через ацетатцеллюлозные дисковые фильтры с размером пор 0,22 мкм. Выделенные образцы специфического иммуноглобулина были изучены по основным биологическим и физико-химическим параметрам:

специфическая активность, токсичность, содержание белка, рН, электрофоретическая однородность, прозрачность, цветность, пирогенность, стерильность.

Уровень специфической активности образцов АИГ, полученных из иммунных сывороток лошадей, определенный in vitro в ДИА, составил 1:10000 (рисунок 4).

2->

3-.

4 ->

Рисунок 4 - Исследование иммуноглобулина антирабического экспериментальных серий 01, 02, 03 из сыворотки крови лошади, иммунизированной культуральным антигеном, в прямом ДИА с использованием диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота Примечание - 1—3 ряд — двукратные разведения иммуноглобулина серий 01, 02, 03 с 1:80. Титр 1:10000; 4 ряд - двукратные разведения нормальной лошадиной сыворотки с 1:16 (отрицательный контроль).

In vivo в реакции нейтрализации вируса на белых мышах специфическая активность антирабического иммуноглобулина экспериментальных серий имела значение 242, 214, 238 МЕ/ мл. Экспериментальный АИГ из сыворотки крови лошади успешно прошел испытания на пирогенность и токсичность, не оказывал повреждающего действия на организм экспериментальных животных: кроликов, белых мышей и морских свинок. Физико-химические показатели: содержание белка, рН, электрофоретическая чистота, прозрачность, цветность, стерильность также соответствовали требованиям фармакопейной статьи предприятия на коммерческий гетерологичный иммуноглобулин (таблица 4).

Таблица 4 - Характеристика основных показателей экспериментальных образцов антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади, полученного с применением культуральных технологий

Показатель Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади Требования ФСП PN 002639/01-250210

Специфическая активность в РН, МЕ/мл Образец 1 242 Не менее 150

Образец 2 214

Образец 3 238

Токсичность Образец 1 Нетоксичен Препарат должен быть нетоксичным

Образец 2 Нетоксичен

Образец 3 Нетоксичен

Содержание белка, % Образец 1 10,0 10,0±1,0%

Образец 2 10,0

Образец 3 10,0

рн Образец 1 7,0 7,0±0,4

Образец 2 7,1

Образец 3 7,0

Продолжение таблицы 4

Элекгроф орети-ческая однородность Образец 1 у-глобулин -91,66%; а,р-глобулины -8,34 %. Альбумин отсутствует у-глобулин - 80%; а,р-глобулины -не более 20%. Альбумин должен отсутствовать

Образец 2 у-глобулин -91,67%; а,р-глобулины - 8,33 %. Альбумин отсутствует

Образец 3 у-глобулин -92,34%; а,р-глобулины -7,66 %. Альбумин отсутствует

Прозрачность Образец 1 0,03 не более 0,05

Образец 2 0,05

Образец 3 0,04

Цветность Образец 1 0,10 не более 0,15

Образец 2 0,13

Образец 3 0,15

Пирогенность Образец 1 апирогснен Препарат должен быть апирогенным

Образец 2 апирогенен

Образец 3 апирогенен

Стерильность Образец 1 стерилен Препарат должен быть стерильным

Образец 2 стерилен

Образец 3 стерилен

Выводы

1. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре перевиваемых клеток линии Vero стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным способами.

2. Показано, что усовершенствованные технологические приемы по инактивации, концентрированию и очистке культурального вируса бешенства при масштабированном культивировании в условиях биореактора позволяют получить культуральный рабический антиген для иммунизации продуцентов, по антигенным свойствам не уступающий органо-тканевому.

3. Установлено, что антирабические сыворотки от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном, по результатам тестов in vivo и in vitro, обладают достаточно высокой специфической активностью и пригодны в качестве сырья для выделения антирабического иммуноглобулина.

4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культуральных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям ФСП PN 002639/01-250210 на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций.

5. Разработанные методические подходы позволяют с помощью полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов количественно оценивать содержание фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов для определения количественного содержания вируса бешенства в материале для иммунизации животных / Ж.В. Матвеева, H.A. Осина, Н.В. Майоров и [др.] // Актуальные вопросы инфекционной патологии: Сборник докладов юбилейной науч.-практ. конф., посвященной 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии. — Ростов-на-Дону, 2009. - С. 293-295.

2. Клеточные культуры в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Ж.В. Матвеева 11 Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 4(110). - С. 76-80.

3. Концентрирование инактивированной суспензии культурального фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» методом тангенциальной упьтрафильтрации / Ж.В. Матвеева, Е.Г. Абрамова, A.B. Комиссаров [и др.] // Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием. - Ставрополь, 2012. -С. 176.

4. Получение кроличьего антирабического иммуноглобулина с применением культурального антигена / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 2(112). - С. 78-81.

5. Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой линии клеток Vero для получения рабического антигена / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, И.М. Жулидов, Ж.В. Матвеева [и др.] // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации: Материалы X Съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М, 2012. - Т. 2, №№ 1, 2. - С. 250-251.

6. Культуральный Virus fixe как потенциальный рабический антиген в производстве иммуноглобулина для профилактики бешенства / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, И.М. Жулидов, Ж.В. Матвеева [и др.] // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Материалы. Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. - Пермь, 2012. — Т.1. — С. 137-139.

7. Получение кроличьего антирабического иммуноглобулина с применением культуральных технологий / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева [и др.] // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: Матер, науч.-практ. конф. Роспотребнадзора. - Нижний Новгород, 2012.-С. 157-159.

8. Культуральный антиген в тактике развития технологии получения антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева [и др.] // «Биотехнология. Взгляд в будущее»: Сборник трудов Междунар. интернет-конференции. - Казань, 17-19 апреля 2012. - С. 60-61.

9. Культуральный антиген в технологии получения антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. — 2012. - Вып. 4(114). - С. 65-69.

10. Получение антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади с применением культуральных технологий / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы: Матер. Междунар. научно-практ. конф., поев. 100-летию СГАУ. Саратов, 28-30 января 2013. - С. 26-28.

Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеева, Жанна Владимировна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ»

на правах рукописи

04201362644

МАТВЕЕВА ЖАННА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЁМОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАБИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Е.Г. Абрамова

Саратов - 2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................5

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР....................................................................................................11

1.1. Генетические особенности вируса бешенства и молекулярно-генетические методы количественной оценки содержания вирусов, применяемые в вирусологии

1.2. Биотехнологические аспекты культивирования фиксированного вируса бешенства in vivo и in vitro.....................................................................................................................20

1.3.Технологические приёмы инактивации, очистки и концентрирования вируса

бешенства.................................................................................................................................................26

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ...............................................................................................................................30

Глава 2. Материалы и методы............................................................................................................30

2.1. Материалы..........................................................................................................................................30

2.1.1. Вирусные и бактериальные штаммы................... .................................................................30

2.1.2. Клеточная линия Vero.................................................................................................................30

2.1.3. Реактивы, растворы и питательные среды............................................................................31

2.1.4. Экспериментальные животные............................................................................................. 32

2.1.5. Приборы и оборудование...........................................................................................................32

2.1.6. Вирусные антигены......................................................................................................................33

2.2 . Методы..............................................................................................................................................34

2.2.1. Культивирование клеток Vero и вируса бешенства штамма «Москва 3253» 34

2.2.2. Инактивация вируса бешенства штамма «Москва 3253»................................................34

2.2.3. Концентрирование вируса бешенства штамма «Москва 3253».....................................34

2.2.4. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции.........................................................35

2.2.5. Полимеразная цепная реакция................................................................................................35

2.2.6. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGem-T..................................................................36

2.2.6.1. Очистка ампликонов.................................................................................................................36

2.2.6.2. Клонирование в вектор pGem-T...........................................................................................37

2.2.6.3. Культивирование рекомбинантного штамма Е. coli TGI..............................................38

2.2.6.4. Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма

Е. coli TGI pRVMoscow3253G-L.................................................................................................................38

2.2.7. Секвенирование фрагментов кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253».....38

2.2.8. Определение количества ДНК..................................................................................................38

2.2.9. Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей 39

2.2.10. Методы выделения антирабического гамма-глобулина и контроля

его физико-химических и биологических свойств.........................................................................39

2.2.11. Статистическая обработка результатов исследований .................................................40

Глава 3. Экспериментальное обоснование технологических параметров культивирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре перевиваемой линии Vero..................................................................41

3.1. Адаптация virus fixe к перевиваемой линии Vero стационарным способом 41

3.2. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero суспензионным способом..............................................................................................................................................................45

3.3. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero

псевдосуспензионным способом.........................................................................................................48

Глава 4. Разработка способа количественного определения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в рабическом антигене методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов 52

4.1. Разработка количественной ПЦР для определения содержания вируса бешенства «Москва 3253» в антигенном материале ......................................................................................................................................52

4.1.1. Подбор ДНК-мишени...................................................... ..........................................................52

4.1.2. Подбор праймеров и зонда........................................................................................................56

4.1.3. Конструирование рекомбинантного штамма 58

4.1.4. Разработка и оптимизация условий количественной ПЦР с учётом результатов в режиме реального времени............................................................................................................................................................59

4.2. Оптимизация количественной ПЦР с учётом результатов в режиме реального времени для определения содержания вируса......................................................................................................................60

4.2.1. Оптимизация выделения РНК......................................................................................................................65

4.2.2. Оптимизация условий реакции обратной транскрипции ................................................66

4.3. Апробация разработанного метода при исследовании вируссодержащего

материала...................................................................................................................................................67

Глава 5. Совершенствование технологии инактивации, концентрирования и очистки культурального вируса бешенства ....................................................................................................69

5.1. Инактивация вирусного урожая...................................................................................................69

5.2. Концентрирование и очистка вирусного урожая....................................................................70

Глава 6. Получение сывороток от продуцентов, иммунизированных

культуральным антигеном, и выделение специфического иммуноглобулина 76

6.1. Получение кроличьих антирабических сывороток и исследование их

основных физико-химических и биологических показателей 76

6.2. Получение антирабических сывороток из крови лошади и исследование

их основных физико-химических и биологических показателей 81

6.3. Получение антирабического иммуноглобулина из сывороток крови продуцентов

и изучение его биологических и физико-химических показателей 86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................................................91

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Вирус бешенства способен вызвать у человека и животных неизлечимое заболевание, которое, по оценке ВОЗ, входит в группу инфекционных болезней, наносящих значительный ущерб экономике и здравоохранению [184].

Из-за чрезвычайной опасности и абсолютной летальности вопросы профилактики бешенства после повреждения, нанесённого больным или подозрительным на бешенство животным, имеют исключительно важное значение. Существующая во всем мире единая тактика профилактики заболевания после контакта с возбудителем инфекции обеспечивается путем немедленной местной обработки раны с последующим введением антйрабической вакцины, а в случаях множественных укусов опасной локализации - в сочетании с антирабическим иммуноглобулином [43, 47, 66].

В Российской Федерации ежегодно за антирабической помощью обращаются 430470 тысяч человек, больше половины из них получают специфическое антирабическое лечение [59].

На сегодняшний день АИГ из сыворотки крови лошади можно считать приемлемой и безопасной альтернативой гомологичному иммуноглобулину, получаемому из иммунной сыворотки крови человека, так как использование современных методов очистки иммуноглобулиновых препаратов позволило значительно снизить частоту побочных эффектов, проявляющихся в результате применения АИГ животного происхождения - до 1-2 % [1, 184, 186]. Однако даже при сравнительно небольшой доле возникновения побочных эффектов вопрос дальнейшего усовершенствования гетерологичного АИГ остается актуальным.

В настоящее время для иммунизации продуцентов при получении лошадиной гипериммунной сыворотки используют органо-тканевой рабический антиген, представляющий собой инактивированную карболизированную 10 % суспензию мозга кроликов, зараженных фиксированным вирусом бешенства. Органо-тканевой антиген характеризуется высокой иммуногенной активностью, однако содержащаяся в нём балластная мозговая ткань не исключает риска образования в сыворотке продуцентов антител-нейротоксинов, которые могут быть причиной побочных эффектов у получающих анти-рабическую помощь пациентов [65, 184]. Применение клеточных культур в качестве основной системы для репродукции фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» должно позволить получить более безопасный очищенный антиген.

Использование культурального рабического антигена на этапе получения гипериммунной сыворотки является альтернативой трудоемким процессам интрацеребраль-ного заражения животных, их вскрытия и приготовления вируссодержащей мозговой суспензии, что позволит сделать производство препарата не только более этичным, но и в большей степени соответствовать рекомендациям ВОЗ по исключению применения органо-тканевого антигена в производстве антирабических препаратов [187].

Не менее важным аспектом при поиске путей совершенствования технологии производства антирабического иммуноглобулина является разработка методических подходов для количественной оценки содержания вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов, полученном как из мозговой ткани животных, так и на клеточной культуре. На данный момент уровень содержания вируса сопоставляется с объемом вводимой продуцентам мозговой суспензии. Одним из перспективных подходов к решению данного вопроса является использование количественной полиме-разной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов (ПЦР-РВ).

Использование для ПЦР-РВ зонда, меченного флуоресцентными метками, и дополнительная амплификация количественно охарактеризованных проб позволит в полной мере дать оценку уровню содержания вируса бешенства в иммунизирующей дозе. Данный подход нашел успешное применение для определения концентрации РНК виру-

са диареи крупного рогатого скота [124]; жёлтой геморрагической лихорадки, человече-

ского герпес вируса-6 и цитомегаловируса [148]; для количественной оценки антигена Е вируса клещевого энцефалита в культуре клеток [50]; для количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи [2, 30, 31, 32]; для молекулярно-генетической идентификации вируса геморрагической болезни кроликов [12, 13, 14, 15]; для выявления генома вируса блютанга методом ПЦР в мониторинговых исследованиях и генотипирования серотипов вируса блютанга [18, 61, 62]: для идентификации генома вируса болезни Ибараки на основе ПЦР в режиме реального времени [3].

Применение количественной ПЦР позволит определять содержание вируса бешенства в антигене для иммунизации продуцентов, а также исследовать динамику накопления вируса при его культивировании реакторным способом на клетках перевиваемой линии Vero.

Высокая востребованность антирабического иммуноглобулина на Российском фармацевтическом рынке, обусловленная неблагоприятной эпизоотической и эпидемиологической ситуацией по бешенству, дают основания считать актуальными исследования по совершенствованию технологии производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Цель работы - разработка биотехнологических приемов масштабированного выращивания культурального фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и способа его количественной оценки.

Основные задачи исследования

Научная новизна работы

Впервые фиксированный вирус бешенства штамма «Москва 3253» репродуцирован на клетках перевиваемой линии Vero. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования вируса стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами.

Практическая ценность работы

По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 5 от 23.09.10), «Количественное определение фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в вируссодержащем материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Концентрирование инактивированной суспензии культурального фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» методом тангенциальной ультрафильтрации» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» суспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» псевдосуспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11).

Основные положения, выносимые на защиту

4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культураль-ных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям нормативной документации на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади.

5. Разработанные методические подходы позволяют определять количес�

Информация о работе

Матвеева, Жанна Владимировна
кандидата биологических наук
Саратов, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы