Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование диагностикума с использованием наночастиц золота для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуноанализе

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Конструирование диагностикума с использованием наночастиц золота для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуноанализе"

На правах рукописи

Шарапова Наталия Анатольевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИКУМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНА В ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з 1 окт т

Саратов - 2013

005536199

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения

«Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: кандидат биологических наук

Абрамова Елена Геннадьевна, кандидат медицинских наук Киреев Михаил Николаевич

Официальные оппоненты: Дыкман Лев Абрамович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Безрукова Галина Александровна,

доктор медицинских наук, доцент, ФБУН «Саратовский научно-исследовательский институт сельской гигиены» Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник института

Ведущая организация: ФКУЗ «Волгоградский научио-исследовательскнй противочумный институт» Роспотребнадзора

¿о

Защита состоится «28» ноября 2013 г. в/У часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан октября 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Карпунина Лидия Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальность проблемы бешенства обусловлена широким распространением инфекции и 100 % летальностью (Львов, 2008). В большинстве регионов России эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна и поэтому организация мер борьбы с опасной болезнью, общей для человека и животных, остается важной проблемой здравоохранения (Черкасский и др., 2005; Данилов и др., 2007; Онищенко, 2011).

По данным экспертов ВОЗ, за 2011 год около 55 000 человек в мире ежегодно погибает после укусов животных, больных бешенством (Benedictis et al., 2011, http://www.int/mediacentre/factsheets/fs099/ru). В Российской Федерации за аналогичный период от бешенства погибли 14 человек, из них 2 детей до 14 лет, в 2012 г. - 4 человека, из них 2 детей до 14 лет (www.40.rospotrebnadzor.ru). Ежегодно в различные лечебные учреждения Российской Федерации за медицинской помощью по поводу укусов и других повреждений, полученных от животных, обращается более 450 тыс. человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение (Мовеесянц, 2004; Львов, 2008).

Для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными применяют антирабический иммуноглобулин в сочетании с антирабической вакциной (Селимов и др., 1978; Мовсесянц, 2004; Медуницын, 2005). Единственным производителем антирабического иммуноглобулина в России является ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов).

В настоящее время при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина уровень активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата определяют in vivo в реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства на белых мышах (Meslin, 1996). Однако, данный метод трудоемок, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения (14 дней) и предполагает использование инфекционного агента. Разработку способов определения специфических антител в антирабических препаратах in vitro настоятельно рекомендует Комитет экспертов ВОЗ по бешенству (WHO, Technical Report Series 824, 1994; Series 931, 2005).

Степень разработанности проблемы. На сегодняшний день имеется широкий спектр методов in vitro для выявления антител к вирусу бешенства, которые имеют различную степень использования в практических лабораториях - реакция непрямой ге-магтлютинации (РНГА) (Шафеева, 1995; Franco, 1996; Истомина, 2011), реакция диффузионной преципитации (РДП) (Atanasiu et al., 1971; Meslin, 1996), реакция связывания комплемента (РСК) (Сугобаева и др., 1989; Хисматулина и др., 1995), иммунофер-ментный анализ (ИФА) (Селимов, 1978; Субботина и др., 1985; Ботвинкин и др., 1988; Karamany et al., 1988; Gelosa et al., 1990; Сазанова и др., 1991; Валишина, 1992; Franco, 1996; Груздев и др., 2001; Кузьмин и др., 2001; Ondrejkova et al., 2002; Самуйленко и др., 2003; Евстигнеев и др., 2003; Евстигнеев и др., 2004; Рахманин, 2008; Metlin, 2008), тест ингибиции фокусов флюоресценции (ТИФФ), тест флюоресценции вирус-нейтрализующих антител (FAVN) (Ondrejkova et al., 2002; Cliquet et al., 2004; Stantic-Pavlinic et al., 2006; Metlin, 2008; Fooks et al., 2009; Welch et al., 2009; Zhang et al., 2009). Постановка двух последних тестов требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вируса бешенства.

Для определения уровня антирабических антител тест ИФА наиболее распростра-

нен и является одним из наиболее чувствительных и удобных методов иммунодиагностики, однако _его недостатками являются применение токсичных, канцерогенных хромогенов и необходимость использования аппаратуры для учета результатов. Указанные недостатки обусловили необходимость разработки безынструментальных тест-систем с использованием неферментных диагностикумов для определения уровня специфических антител и бесприборным учетом результатов теста. Решением данной проблемы является конструирование диагностикума для дот-иммуноанализа с использованием в качестве маркера наночастиц коллоидного золота. По литературным данным, коллоидное золото в мембранных тестах применяют для диагностики паразитарных (Stantic-Pavlinic et al., 2006; Abaza, 2008), вирусных (Samra et al., 2007; Jiang et al., 2011; Lin et al., 2011; Nurulfiza et al., 2011), грибковых заболеваний (Pal, 2004), туберкулеза (Longenberger , 1995; Kassa-Kelembho et al., 2006; http://www.atalev.com/content /instr/b- 105e.pdf), сифилиса (http://www.healthchemdiagnostics.com), бруцеллеза (Smits et al., 2003), шигеллеза (Liu et al., 2006; http://www.plosone. org/article/info: doi/10. 1371/ journal, pone.), определения беременности на ранних сроках (Тертон и др., 1991; Esumi et al., 1998), выявления дифтерийного токсина (Колодкина и др., 2009), ВИЧ инфекции (Petrov et al., 1991), мелиоидоза, вирусных гепатитов, определения групп крови, дот-блот гибридизации и др. (Дыкман и др., 2011). Однако, на сегодняшний день отсутствуют коммерческие диагностикумы на основе коллоидного золота с вирусными антигенами, в том числе для определения активности антирабических препаратов.

Таким образом, актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.

Цель работы: разработка современного диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуноанализе.

Задачи исследования:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «Москва 3253» органо-тканевого происхождения для использования его в качестве иммунореагента при конструировании диагностикума.

2. Выделить из вируса бешенства штамм «Москва 3253» культурального происхождения структурный компонент - гликопротеид и охарактеризовать его по основным биохимическим параметрам.

3. Разработать эффективный способ получения конъюгатов наночастиц коллоидного золота с иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы.

4. Отработать методики прямого и непрямого вариантов дот-иммуноанализа для определения содержания специфических антител в антирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием сконструированных конъюгатов.

5. Провести корреляционный анализ результатов реакции нейтрализации вируса бешенства in vivo и дот-иммуноанализа in vitro.

6. Исследовать стабильность сконструированных конъюгатов.

Научная новизна заключается в том, что экспериментально обоснованы условия выделения и очистки гликопротеида фиксированного вируса бешенства «Москва 3253», используемого в качестве антигена при конструировании иммуносуспензионного диагностикума.

Впервые получены конъюгаты вирусного антигена с наночастицами коллоидного золота. На их основе сконструирована тест-система и продемонстрирована возможность ее применения в производстве антирабического иммуноглобулина на этапах определе-

ния уровня специфических антител в иммунных сыворотках продуцентов и готовом иммуноглобулине.

Впервые показана эффективность применения сконструированного диагностикума для выявления уровня содержания специфических антител в сыворотках людей, вакцинированных по показаниям антирабической вакциной, что актуально для оценки напряженности создаваемого вакциной иммунитета.

Установлена корреляция результатов определения уровня специфических антител в антирабических сыворотках продуцентов и препарате иммуноглобулина в дот-иммуноанализе и реакции нейтрализации на белых мышах.

Практическая значимость работы

Разработанный неферментный диагностикум для проведения экспресс-анализа активности иммунных сывороток открывает перспективы использования в производстве препарата антирабического иммуноглобулина на этапе иммунизации животных, когда необходимо в короткие сроки принять решение о дальнейшей эксплуатации продуцентов.

По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе» (протокол заседания Ученого совета №1 от 09.04.09), «Определение уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов и человека в непрямом варианте дот-иммуноанализа с применением неферментного диагностикума» (протокол заседания Ученого совета № 3 от 05.05.11), «Выделение гликопротеида из фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» (протокол заседания Ученого совета № 3 от 31.05.12).

Приоритетность разработки подтверждена получением патента на изобретение «Иммунодиагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа» (№2360252 РФ, МПК G01N33/532; 27.06.2009, Бюл. №18).

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам выделения и очистки вируса бешенства; определения уровня антирабических антител в сыворотках животных и человека различными методами in vitro (РИГА, РСК, РДП, ТИФФ, ИФА, РН в культуре клеток (ТИФФ); методикам приготовления коллоидного раствора золота и конструирования на его основе диагностикумов; методам постановки дот-иммуноанализа. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологические и биохимические приемы позволяют получать очищенный и концентрированный вирус бешенства «Москва 3253» и его основной антигенный компонент - гликопротеид.

2. Сконструирован диагностикум на основе наночастиц коллоидного золота для определения уровня специфических антител в антирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина и предложена технология его приготовления.

3. Сконструированная тест-система позволяет определять уровень антирабических антител в иммунных сыворотках и препарате иммуноглобулина в дот-иммуноанализе.

4. Обоснованы температурно-временные интервалы хранения диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота.

Работа выполнена в лабораториях: биохимии и протеомного анализа отдела микробиологии и профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательских тем 26-205 «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (номер госрегистрации 0120.0504663) и 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации 0120.0853923).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ (Саратов, 2007); научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье человека» (Рязань, 2007); ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (, Саратов, 2007-2012); Ш Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2010), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием: «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (Пермь, 2012), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012). Принимала участие в конкурсе XII Международного салона промышленной собственности «Архимед-2009» с разработкой «Набор для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе», которая была награждена решением международного жюри дипломом и серебряной медалью.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и имеется один патент на изобретение № 2360252.

Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 206 источника, из них 83 отечественных и 123 зарубежных. Объем диссертации составляет 110 страниц машинописного текста, включает 5 таблиц, 18 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты, материалы и методы исследований

Объекты исследования

Вирусный штамм. В работе использовали производственный штамм фиксированного вируса бешенства «Москва 3253».

Вирусные антигены. В работе использованы: а) гликопротеид фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253»; б) рабические антигены органо-тканевого и культурального происхождения.

Антитела и сыворотки. В работе использованы: антирабические сыворотки лошади (26 образцов) и человека (3 образца), антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади экспериментальных и производственных серий (20 образцов), антитела кролика аффинно-очищенные к иммуноглобулинам лошади (все классы иммуноглобулинов, «ИМТЕК»); антитела овцы аффинно-очищенные к иммуноглобулинам (G+A+M) человека («ИМТЕК»); антитела диагностические против Ig (H+L) лошади, меченные пероксидазой, сухие («Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, сер. 13, 2009 г.); антитела диагностические против IgG белой мыши, меченые пероксидазой («Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, сер. 59-1110, 2012 г.), стафилококковый белок А ([Staphyloccocus aureus, «Sigma»). Нормальные сыворотки из крови лошади и человека использовали в качестве отрицательного контроля для постановки дот-иммуноанализа (ДИА).

Экспериментальные животный' Для определения антигенных свойств выделенного гликопротеида использовали белых мышей обоего пола линии BALB/c массой 18-20 г.

Материалы и методы исследований

Вирус бешенства осаждали из мозговой ткани инфицированных кроликов сахарозо-ацетоновой экстракцией методом Clarke и Casals («Итоги науки и техники», серия «Вирусология», 1991).

Концентрированную, инактивированную культуральную суспензию штамма «Москва 3253» очищали гель-хроматографией на TSK-геле HW-65.

Гликопротеид (ГП) вируса бешенства получали обработкой концентрированного и очищенного фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» культурального происхождения тритоном Х-100 в 2% концентрации по методу В. Dietzschold (Dietzschold, 1977) в нашей модификации с последующей хроматографической очисткой на TSK-геле HW-65. Молекулярную массу гликопротеида определяли методом электрофореза по U.K. Laemmli (1970) в 12% полиамилакридном геле в присутствии додецил сульфата натрия с использованием маркеров молекулярной массы - БСА (67 кДа) и овальбумина (45 кДа). Для обнаружения белков использовали окраску Кумасси синим R-250. Для выявления углеводов гели окрашивали азотнокислым серебром с помощью набора фирмы «Bio-Rad Silver Stain».

Общий белок определяли: по методу Лоури (Lowry et al., 1951) на этапе осаждения вируса бешенства сахарозо-ацетоновой экстракцией и спектрофотометрически на СФ-26 при длине волны 280 нм на этапе выделения гликопротеида.

Приготовление растворов коллоидного золота (КЗ) с различным диаметром частиц осуществляли по методу Френса восстановлением золотохлористоводородной

кислоты (ЗХВК) цитратом натрия (Frens, 1973). Оптическую плотность полученных золей золота снимали в диапазоне длин волн Х-330-850 нм на спектрофотометре СФ-56 с программным обеспечением. Средний диаметр наночасгиц золота полученных суспензий определяли путем спектрометрии на модульном спектрометре динамического и статического рассеивания света «Фотокор». рН растворов КЗ определяли потенциометрически с использованием рН METER рН410.

Конструирование биокоиъюгатов для иммунохичическиж исследований проводили нековалентной (адсорбционной) конъюгацией по метсдике Л.А. Дыкмана (Дыкман и др., 2008).

Постановку иммунофермеитного анализа для определения антигенной активности гликопротеида осуществляли по общепринятой методике (Егоров и ар.. 1991).

Определение содержания специфических антител ■ аширабических сыворотках лошадей-продуцентов, в препарате i eicpo.ioi и мною антирабичсско! о иммуноглобулина, а также в сыворотках людей, вакцинированных по показаниям антнрабнчсской вакциной, проводили прямым и непрямым вариантами ДНА по общепринятой методике (Тертой и др.. 1991) с модификациями (Дыкман и др., 2008).

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной статистики (Ашмарин и др., 1962; Лакин, 1990).

Результаты исследований и их обсуждение

Отработка технологических приемов получения це.зьновирусных антигенов оргаио-тканевого и культурального происхождения

При конструировании иммунологических диагностикумов необходимы антшены достаточной чистоты и активности, в связи с чем первым этапом наших исследований была отработка бнотехнолошческих приемов получения очищенного вируса бешенсгва. Для выделения, очистки и концентрирования цельновнруснсго антигена была применена сахарозо-ацетоновая экстракция, поскольку антиген, приготовленный данным методом, является наиболее очищенным н пригодным для постановки почти всех иммунохимическнх реакций, в том числе ИФА. Вирус бешенства осаждали из 20 % кроличьей мозговой суспензии с предварительной фильтрацией через ннтроцеллюлозные мембраны (НЦМ) с размером пор 0,22 мкм. В результате сахарозо-аистоновой экстракции был получен антиген с содержанием белка 5,5 6 мг мл Специфичность осаждешюго вируса была подтверждена в непрямом ДИА с использованием коммерческого антивидового перокендазного коныэгата (рисунок I).

ш IM LI

■ □

Рисунок 1 - Иммунохнмичсская характеристика цсльновнрусного антигена, полученного сахарозо-ацетоновой экстракцией, в непрямом ДИА Примечание - 1 - 10 % мозговая суспензия кроликов, зараженных virus (ixe;

2 - цсльновнруеный антиген, полученный сахарозо-ацетоновой

экстракцией органо-тканевого вируса бешенства; 3-10% интактиая мозговая суспензия кролика (отрицательный контроль).

Полученный из органо-тканевого вируса в результате сахарозоацетоновой экс-факции целыювирусиый антиген в дальнейшем был использован для конструирования дИагностикума.

Для выделения антигена из культуральной вирусной суспензии фиксированного вируса бешенства игтамма «Москва 3253», репродуцированного на клетках перевиваемой лннии Vero, использовали концентрированный вирусный урожай. Концентрированную гашенцнальной ультрафильтрацней и ннактивированную культуральную суспензию штамма «Москва 3253» очищали гель-фильтрацией на хроматографической системе «LKB», в качестве носителя использовали TSK-гель IIW-65, > иаковаяный в хромато-графическую колонку размером 15x250 мм, уравновешенную 3 свободными объемами 0,01 М фосфатного буфера рН 7,3, содержащего 0,137 моль/л NaCI и 0,0027 моль/л KCI (буфер элюции). Подготовленную пробу наносили на колонку в объеме 0,5-1 мл. Выход белков контролировали на проточном спектрофотометре при длине волны 280 им. В результате гель-хроматографии были зарегистрированы 3 пика (рисунок 2), фракции которых анализировали нммунохимичсски в непрямом ДИА с коммерческим антивидовым пероксидазным коиъюгатом. Наличие вируса регистрировали в пробах фракции 1 и 2 пиков, в 3 пике вирусный антиген отсутствовал, что свидетельствовало о разделении вируссодсржащен жидкости на вирусный материал и низкомолскулярные балластные компоненты (рисунок 3).

Рисунок 2 - Хроматографический профиль концентрированной инзктивированнон вируссодержащей культуральной жидкости при гель-фильтрации на TSK-геле HW-65

1 2 3

Рисунок 3 - Исследование хроматографических фракций культурального вирусного материала в непрямом ДИА с использованием коммерческого антнвидового пороке и дачного конъюгата Примечание - I образец фракции пика I;

2 - образец фракции пика II;

3 образец фракции пика III.

Очищенный гель-фильтрацией в ТБК-гслс И№'-65 культуральный вирус был использован в последующей работе для выделения гликопротенда.

Глнкопротснд вируса бсшснства выделяли из концентрированного тангенциальной ультрафилырацией и очищенного гель-фильтрацией фиксированного вируса бсшснства штамма «Москва 3253» культурального происхождения. Для растворения липопротенновой оболочки вируса бешенства использовали неионный детергент тритон Х-100. Опытным путем была выявлена оптимальная концентрация раствора тритона Х-100 - 2%, при которой солюбилизируется более 80% белка против 40-50% при применении 1% раствора детергента. Очистку гликопротенда от субвнрусных компонентов и детергента осуществляли центрифугированием и гель-фильтрацией. Для хроматографической очистки выделенного антигена были апробированы два хроматографичсских носителя Ссфадскс С-200 с параметрами фракционирования 5 800 кДа и ТЭК-гель Н\А<'-65 с параметрами по разделению белка 50 1000 кДа.

При использовании Сефадекса С-200 полностью отделить гликопротеид от балластных молекул не удалось, хроматографичсскис пики имели зо«ы перекрытия. Для лучшего разделения смеси был испытан ТЭК-гель 1№-65. В результате хроматофафи-чсской очистки ГП с использованием ТЭК-геля на хроматофамме регистрировали два пика (рисунок 4). Первый пик предположительно соответствовал конгломератам недез-интсфированного вируса с содержанием белка 0,28 мг/мл, а второй пик - глнкопроте-нду с содержанием белка 0,65 мг/мл.

Рисунок 4 - Гель-фильтрация гликопротенда вируса бсшснства на ТЭК-геле НШ-65

(15x250 мм) Примечание по оси абсцисс кремя пюпни, мин;

по оси ординат оптическая плотность элюента при 280 им.

Собирали пробы, соответствующие второму пику. Степень очистки оценивали с помощью члектрофореза в 12% полиакриламидном геле с лодецилсульфатом натрня с использованием окраски азотнокислым серебром и кумасси К-250 (рисунок 5).

Выделение гликопротенда вируса бешенства и его характеристика

3 4

I 2

67 кДа 45 «Д.

i

67 «Д. 45 «Д.

а б

Рисунок 5 - Элсктрофорсграмма гликопротсида вируса бешенства на этапах очистки: (а) - при окраске геля азотнокислым серебром; (б) - при окраске геля кумассн

синим R-250

Примечание - I - очищенным гликопротенд фиксированного вируса бешенства,

2 - препарат после осаждения ацетоном и этанолом;

3 — овальбумин (45 кДа);

4 - БСА (67 кДа).

Данные электрофоре та подтверлнли получение гликопротсида - была зафиксирована одна полоса при окраске на белок и на углеводы. Исследуемый образец, по данным электрофореза, имел молекулярный вес 65 кДа, что подтверждает литературные данные, согласно которым молекулярный вес ГП вируса бешенства составляет 65-90 кДа, в равней мосги от способа получения и исходного материала (Кротова Л И., 1985; Акииь-шина, 2005; Тнмиргалсев, 2006; Львов. 2008).

Для характеристики антигенных свойств выделенного гликопротсида проводили иммунизацию мышей иибредной линии BALB/c массой 18-20 г. Животных иммунизировали следующими а1гтигенами: изолированным ГП, цельным вирусом культурального происхождения, ГП с наиочастицами коллоидного золота в качестве адъюваита и ГП с полным адъюаантом Фрсйнда

Антиген вводили в дозе 25 мкг/мышь при первой иммунизации н 50 мкг/мышь в последующие четыре иммунизации. Отрицательным контролем служили сыворотки мышей, которым вводили 0,9 % раствор хлорида натрия. Антигены вводили внутрибрюшинно с двухнедельным шпервалом. Первое введение антигена с полным адъювантом Фрсйнда осуществляли подкожно. Кровь для исследования на наличие специфических антител брали из хвостовой вены после третьей и пятой иммуннзаций на пятые сутки после инъекции. Уровень специфических антител в сыворотках определяли в ИФА с использованием коммерческого антивидового пероксидазного конъюгата (таблица 1).

Таблица 1 - Уровень образования специфических антител в сыворотках мышей в зависимости от применяемого антигена

Антигены для иммунизации мышей Титры специфических антител после третьей иммунизации Титры специфических антител после пятой иммунизации

Изолированный ГП 1/80 1/160 1/160 1/320

Цельный вирус культуральною происхождения 1/20-1/40 1/80

ГП с наночас! ицами КЗ 1/320 1/640

ГП с полным адъювантом Фрейнда 1/320-1/640 1/640-1/1280

По результатам исследований, очищенный гликоггротсид отличался большей аи-тигснностъю, чем цельный вирус бешенства, причем наибольшей способностью к индукции вируснейтралнзующих антител обладал гликоггротсид, введенный совместно с адъювантами - титры в ИФА составили 1/640 -1/1280 соответственно при иммунизации с коллоидным золотом и полным адъювантом Фрейнда. Выделенный ГП использовали в качестве иммунореагента для конструирования диагностнкума для прямого ДИА и для сенсибилизации НЦМ при постановке непрямого ДИА.

Таким образом, результатом решения первой задачи настоящего исследования явилось получение очищенных цельновнрусных антигенов органо-тканевого и культураль-ного происхождения, а также выделение основного протектнвного компонента вируса бешенства - пшкопротенда

Получение ыаночасгиц коллоидною золота

Для решения второй задачи необходимым условием являлось получение стабильных наночастиц коллоидного золота со средним диаметром частиц 15-17 нм, оптимальным для конструирования конъюгата После приготовления золя снимали спектр полученного раствора в диапазоне длин волн Х-330-850 нм на спектрофотометре (рисунок 6).

и» •

»а •

«I •

«А

' н : il

■ ■ • • - ...,..............Т'"Ч

■ ммммммта

Рисунок 6 - Спектр золя золота при максимальной длине волны X = 515 нм. с оптической плотностью D - 0,9059 Примечание по оси абсцисс длин* волны, нм;

по оси ордии*т - оптическая плотность золя юлота.

Размер полученных наночастнц подтверждали на модульном спектрометре динамического и статического рассеивания света (рисунок 7).

Рисунок 7 - Спектр полученной суспензии золя золота на модульном спектрометре динамического и статического рассеивания свсга «Фотокор»

Морфологические свойства полученных наночастнц золота анализировали злек-зронно-микроскопнческнм исследованием и сканирующей зондовой микроскопией, позволяющей исследовать объекты на молекулярном уровне, не подвергая их воздействию Ьакуума и электронного пучка. При исследовании на сканирующем зондовом микроскопе применяли кремниевые кантелеверы N50 01, обладающие константой жесткости 1,45-15,1 Н/м и резонансной частотой 87 230 кГц. Образцы КЗ наносили на кремниевую или пластиковую подложку и высушивали. При анализе результатов были выявлены частицы со средним диаметром 15-17 нм. Все частицы располагались отдельно друг от друга, агломератов в поле зрения выявлено не было (рисунок 8, рисунок 9).

Рисунок 8 - Электроннограмма (хЗООО) коллоидного золота с наночастицамн диаметром 15-17 нм

а 6

Рисунок 9 - Сканограммы наночастии КЗ 15-17 им, полученные на сканирующем зондовом микроскопе Solver P47-PRO (NT-MD, Россия)

Примечание - а - на стекле;

б - на пластиковой пластине.

Отработка условий конструирования конъюгатов наночастии золота с иммунореагентами вирусной и иммуиоглобулиновой приролы

При конструировании диагностикума для прямого ДИА в качестве иммунореагентов для конъюгации с наночастицамн использовали экстрагированный вирус бешенства и изолированный ГП. Для выявления специфических антител в антирабических сыворотках лошадей-продуцентов, а также сыворотках людей, вакцинированных по показаниям антирабнческой вакциной, были сконструированы днашостикумы на основе наночастиц КЗ и антивидовых антител к иммуноглобулинам лошади и человека.

Процесс конструирования биоконьюгатов включал в себя следующие этапы: определение «золотого числа», прикрепление наночастиц КЗ к иммуиореагенту, добавление к полученному коньюгату вторичного стабилизатора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (ПЭГ-20000), концентрирование конъюгата центрифугированием при 12000 об/мни в течение 30 мин и оптимизацию конечного продукта для хранения путем добавления буфера. Для достижения оптимальных условий стабилизации доводили pH золя золота до выбранных значений добавлением 0,2 М раствора карбоната калия. Минимальное защитное количество стабилизирующего вещества определяли в иммунологических планшетах с лунками объемом 200 мкл. В тех лунках, где условия среды не были оптимальными по «золотому числу», происходила агрегация частиц золя после добавления к нему 20 мкл 10 % раствора хлористого натрия с изменением цвета золя с красного на голубой или серый. К необходимому количеству иммуипргяпгитя лпАяяпятги рягтяор КЗ с пптимяпкным чнячгнигм pH в соответствии с выявленным «золотым числом». С целью блокировки свободных сайтов поверхности наночастиц золота и вторичной стабилизации добавляли 0,5% раствор высокомолекулярного полимера ПЭГ-20М. После конъюгироваиия смесь аликвотировали по микропробиркам и центрифугировали при 12000 обмин в течение 30 мин при температуре (4±1) °С. Супернатант удаляли, оставшийся концентрированный коньюгат разбавляли буфером до оптической плотности Ds» ~ I и хранили при температуре (5± I) "С.

Сконструированный диагностикум дня выявления специфических антител в антирабических препаратах прямым дот-иммуноанализом представлял собой гидрозоль золота со средним размером частиц 15-17 нм, сорбционно связанный с вирусным антигеном и стабилизированный 0,5 % раствором ПЭГ-20000. Конъюгаты для непрямого дот-анализа представляли собой гидрозоль золота со средним диаметром частиц 15-17 нм, сорбционно связанные с афинно-очищенными антителами кролика к иммуноглобулинам лошади - для выявления антител в иммунных сыворотках лошади либо с афинно-очищенными антителами овцы к иммуноглобулинам человека - для выявления антител в иммунных сыворотках человека и стабилизированные 0,5 % раствором ПЭГ-20000.

Определение специфической активности антирабического иммуноглобулина и иммунных сывороток в дот-иммуноанализе с применением сконструированных

диагностикумов

Эффективность применения сконструированных диагностикумов была изучена в опыте по выявлению уровня специфических антител в препарате антирабического иммуноглобулина, иммунных сыворотках лошадей-продуцентов, а также сыворотках пациентов, вакцинированных антирабической вакциной по показаниям.

В результате проведения прямого дот-иммуноанализа с диагностикумом на основе цельновирусного антигена получены следующие результаты. Уровень активности иммунных сывороток продуцентов соответствовал значениям 1:320-1:640, у отдельных сывороток — до 1:1280 (рисунок 10).

о во • о

I ]

1 • |

0|О о о о 1

1 1

а б

Рисунок 10 - Результаты определения активности антирабических сывороток животных-продуцентов в прямом ДИА с использованием конъюгата на основе КЗ и экстрагированного вируса бешенства Примечание - а) 1 рад-двукратные разведения АИГ серии 37 с 1:160 (положительный контроль);

2—4 рады — двукратные разведения иммунных сывороток лошади № 1,2, 3 с 1:80;

5 ряд - нормальная сыворотка лошади (отрицательный контроль);

б) 1,2 ряды-двукратные разведения иммунных сывороток лошади № 4, 5 с 1:160;

3 ряд - двукратные разведения АИГ серии 37 (положительный контроль) с 1:160;

4 ряд - нормальная сыворотка лошади (отрицательный контроль).

При применении диагностикума на основе изолированного гликопротеида зафиксированы значения титров антител на таком же уровне: 1:320-1:640 (рисунок 11).

Научно-практический интерес представляло изучение возможности применения сконструированного на основе наночастиц КЗ диагностикума при определении активности сывороток людей, прошедших специфическое антирабическое лечение в связи с укусом подозрительных на бешенство животных, что актуально для оценки напряженности создаваемого вакциной иммунитета. Для этой цели было проведено исследование сыворотки крови пациента, взятой через 1 месяц после окончания курса вакцинации концентрированной культуральной антирабической вакциной (рисунок 12).

В результате проведении анализа елвороткн с использованием конъюгата на основе целыювирусного антигена выявлен титр 1:1280.

1 -

2 —

3 —

4 —

$-

• • • • •

Рисунок 11 - Результаты определения активности антирабических сывороток животных-продуцентов в прямом ДИА с не юльэованием днагаостикума на основе КЗ и

гликопротеида

Примечание - 1-3 ряды двукратные развепения иммунных сывороток лошади с 1:40;

4 рад двукратные разведения ЛИГ с 1:160 (положительный контроль);

5 ряд - нормальная сыворотка лошади (отрицательный контроль).

I —

г — у—

__[•] *]Т|

I I ПП !_]

э

Рисунок 12 - Результаты определения уровня активности иммунной сыворотки из крови человека в прямом ДИА с использованием конъюгата на основе КЗ и экстрагированного вируса бешенства Примечание - 1 ряд - двукратные разведен« сыворотки пациента С. с 1:20;

2 ряд двукратные разведения ЛИГ сср.37с 1:80 (положительный котроль);

3 ряд - нормальная сыворотка человека (отрицательный контроль).

При определении специфической активности образцов гетсрологичного антирабичсского иммуноглобулина в прямом варианте ДИА положительный результат был зарегистрирован в разведении 1:5000 - 1:10000, у отдельных серий - до 1:20000 (рисунок 13).

• • •

:::

• »

ш*

Рисунок 13 - Результаты определения активности АИГ в прямом ДИА с использованием конъюгата на основе КЗ и экстрагированного вируса бешенства Примечание -1-7 ряды — двукратные ра!всдения АИГ серий 02, 09, 012, 013, 014, 019, 032 с 1:160;

8 ряд нормальная сыворотка лошади (отрицательный контроль).

Для выявления корреляции рсзуль~атов тестов определения специфических

антител in vivo н in vitro - реакции нейтрализации и дот-нммуноакализа проведено сравнительное изучение активности 13 образцов препарата актирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади (таблица 2). Коэффициент корреляции составил г - 0,9. Титры специфических антител, выявленные в РН на мышах, колебались в пределах от 1:2576 до 1:13772, титры специфических антител, определенные методом ДИА - от 1:2500 до 1:20000.

Таблица 2 - Специфическая активность препарата аитирабичсского иммуноглобулина в тестах ш vivo (РН) и in vitro (ДИА)

Si серии AHI" Титр специфических антител в РН Количество LO» /0,03 мл в РН Активность в PH. МЕ/мл Титр специфических антител в ДИА

34 1 8000 333 320 1:10000

35 1:8812 333 360 1:10000

36 1:12912 333 410 1:10000

37 1:7962 562,5 621 1:5000

38 1:5623 576,5 634 1:5000

39 1:2951 562,5 230 1:2500

40 1:7130 469 358 1:5000

41 1:8689 469 434 1 10000

42 1:2576 576,5 291 1:2500

43 1:12302 617,8 419 1:10000

44 1:10000 617,8 341 1:10000

4S 1:13772 316 556 1:20000

46 1:10839 316 438 1:10000

Средняя геометрическая титров 1:8582 Средняя геометрическая титров 1:8462

В иммунологической практике, наряду с прямым вариантом, широко используется непрямой дот-анализ с применением антивиловых конъюгатов.

При определении уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов в непрямом варианте ДИА с применением сконструированных диагностикумов было показано, что иммунные сыворотки лошадей характеризуются титром специфических антител 1:320-1:640 (рисунок 14).

i- • • • • 9

J- •

1-4 MÍ

Рисунок 14 - Определение активности антирабнческих сывороток лошадей-продуцентов в непрямом ДИА с использованием коньюгата на основе КЗ и антивиловых

иммуноглобулинов

Примечание - 1,2 ряды - лиукратиые развелешя иммунных сывороток лошади №1.2 с 1 80;

Зряд нормальная сыворонш лошади (отрицательный кмггроль).

При сравнительном анализе результатов непрямого ДИА и реакции нейтрализации на мышах следует отметить согласованность результатов тестов in vivo и in vitro

(таблица 3).

Таблица 3 - Выявление антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей и ЛИГ in vitro непрямым ДИЛ и п vivo в РН на белых мышах

Наименование сыворотки или препарата Титр специфических антител в РИ Титр шлзгтел в непрямом ДИА

Иммуноглобулин антнрабическнй гетерологичиый, серия 55 1:9820 (826 Ml н РН 286 LD» /0,03 мл) 1:10000

Иммунная сыворотка лошади от 20.01.2009 1:617 (460 LDse /0.03 мл в РН) 1:640

Иммунная сыворотка лошади от 24.02.2010 1:327 (395 LD» /0,03 мл в РН) 1:320

Иммунная сыворотка лошади от 01.03.2010 1:500 (395 LDje /0.03 мл в РН) 1:320

При исследовании иммунных сывороток людей, вакцинированных по показаниям антирабнческой вакциной в непрямом варианте ДИЛ с применением сконструированного диапюстикума, положительный результат выявляли в разведении 1:1280 (рисунок 15).

• • • I

•

• • •

ы

Рисунок 15 - Уровень активности мммунных сывороток из крови человека в непрямом ДИА с использованием конъюгата на основе КЗ и антнвиловых иммуноглобулинов

Примечание - 1-3 ряды - двукратные рзделения сывороток людей, вакцинированных аитирабической вакштот, № 1—3 с 1:80; 4 ряд - нормальная сынорогка человека (отрицательный контроль),

Для определения активности антирабического иммуноглобулина и мммунных сывороток лошадей-продуцентов непрямым вариантом ДИА был изготовлен конъюгат на основе КЗ и стафилококкового белка А. Протеин А является универсальным компонентом для конструирования диапюстикума, заменяющим антивидовые иммуноглобулины. При исследовании иммунных сывороток лошадей-продуцентов непрямым ДИА, при постановке которого в качестве сорбируемого на твердой фазе антигена использовали выделенный ГП, зыявили титры специфических антител на уровне 1:320-1:640 (рисунок 16). Аналогичные значения титров были зарегистрированы при исследовании антнрабических сывороток в прямом ДИА с применением конъюгата на основе КЗ и гликопротеида, представлснаые выше.

• 3

• * *

Рисунок 16 - Результаты определения активности антирабнчсских сывороток животных-продуцентов в непрямом ДНА с использованием конъюгата на основе КЗ и

стафилококкового белка А Примечание -1-3 ряды - двукратные разведения антирабнчсских сывороток лошади № 1-3 с 1 40,

4 ряд двукратные разведения ЛИГ с 1:160 (положительный контроль);

5 ряд - нормальная сыворотка лошади (отрицательный контроль).

Специфичность сконструированных конъюгатов была доказана отрицательными результатами исследования в ДНА с использованием набора иммунных антибактериальных и антивирусных сывороток, включающего: коммерческие препараты сывороток против вируса инфекционного ринотрахеита КРС. вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН), вируса лейкоза КРС. а также чумную (нативную гипериммунную), холерную О! (нативную гипериммунную), псевдотуберкулезную (нативную гипериммунную), бруцеллезную (коммерческую) н хламиднйную (коммерческую) лошадиные сыворотки.

Полученные данные позволяют сделать вывод о специфичности иммунодиагаости-кумов, поскольку ни с одной из сывороток другой специфичности не был зарегистрирован положительный результат.

Проведенный сравнительный анализ показал, что диашостикумы, сконструировашше с использованием КЗ и двух видов нммунорсагснта -экстрагированного вируса бешенства н выделенного гликопротсида, способны выявлять специфические антитела в антирабнчсских сыворотках и препарате иммуноглобулина в близких по уровню значениях, однако, применение днагаостикума на основе ГП предпочтительнее, поскольку в этом случае экспресс-анализ настроен на выявление исключительно внруснейтрализующих антител. Результаты экспериментов показали, что прямой и непрямой вариант ы ДИА позволяют выявлять антирабическне антитела на одном уровне; использование конъюгата для прямого ДИА позволяет выявлять антирабическне антитела в сыворотках различных животных и человека; конъюгат для непрямого ДИА может быть использован при тестировании сывороток различной специфичности одного вида млекопитающих.

И пчгмис с"I а0и.|ыии"I и диш ииомкума и сю компонентов в процессе приготовления и хранения

На заключительном этапе исследований были проведены исследования по определению стабильности растворов коллоидного золота и полученных на его основе диагао-стикумов.

Стабильность золя золота во время хранения при температуре (5* I )®С определяли по количеству наночастиц и их агрегатов на момент приготовления КЗ. через 6, 12 и 18 месяцев хранения в защищенном от света месте. Исследования проводили с помощью

модульного спектрометра динамического и статического рассеивания света (рисунох 17).

Рисунок 17 - Кинетика образования агрегатов наночастни золота при хранении

коллоидного раствора при температуре (Sil) °С в защищенном от света месте

На момент получения КЗ представляло собой гомогенный раствор, содержащий 95-98 % наночастни с размером 15-17 нм и минорные фракции частиц с другими размерами. При хранении КЗ в условиях холодильника и в посуде из темного стекла через 6 месяцев наблюдали увеличение фракции частиц с размерами 60-90 нм. сформированной в результате агрегации нестабилизированных наночастнц. Через 12 месяцев хранения количество агрегированных частиц достигло 60-70 % и далее нарастало с меньшей интенсивностью. В результате был установлен максимальный срок хранения раствора коллоидного золота при температуре (5±1) °С - 3 месяца.

При исследовании стабильности конъюгатов на моме1ГГ получения, через 6 и 12 месяцев установлен срок годности диагностикумов - в течение 12 месяцев при температуре (5±1) "С, в течение этого срока снижения чувствительности диагностикумов не наблюдалось.

Таким образом, применение иммунодиагностикумов, сконструированных на основе КЗ, позволяют выявлять in vitro в дот-иммуноанализс уровень содержания вируснейтрализующих антител как в готовом препарате амтирабического иммуноглобулина, так н в иммунных сыворотках лошадей-продуцентов с чувствительностью не ниже, чем в РН вируса бешенства на белых мышах. При производстве препарата антирабичсского иммуноглобулина метод in vitro для определения активности лошадиных сывороток особенно актуален на этапе иммунизации животных, когда необходимо в короткие сроки принять решение о дальнейшей эксплуатации продуцентов.

Разработанный диагностикум показал свою эффективность и в выявлении специфических антител в иммунных сыворотках пациентов, получивших антирабическую помощь, что позволяет дать оценку напряженности иммунитета против бешенства.

Экономические расчеты калькуляции стоимости проведения тестов in vivo и in vitro продемонстрировали, что применение ДИА для определения специфической активности анткрабнчсскнх препаратов экономичнее традиционной РН на мышах - стоимость I

реакции нейтрализации на белых мьпнах и проведение 1000 ДИА составляет соответственно 67000 и 4600 руб.

Выводы

1. Экспериментально обоснована методика очистки фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» органо-тканевого происхождения от балластных компонентов мозговой суспензии путем сахарозо-ацетоновой экстракции.

2. Установлено, что гликопротеид, выделенный из фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» культурального происхождения с помощью неионного детергента с последующей хроматографической очисткой на TSK-геле HW-65, характеризуется молекулярной массой 65 кДа и антигенной активностью, определяемой в имму-ноферментном анализе в титрах 1:640 - 1:1280.

3. Экспериментально обоснованы условия конструирования диагностикумов на основе наночастиц коллоидного золота для определения уровня специфических антител в иммунных антирабических сыворотках лошадей-продуцентов и препарате антираби-ческого иммуноглобулина при производстве данного лечебно-профилактического средства. Принцип анализа состоит в применении наночастиц коллоидного золота в качестве маркера, выявляющего реакцию антиген-антитело.

4. Оптимизированы условия проведения прямого и непрямого вариантов дот-иммуноанализа с применением полученных диагностикумов, позволяющих в короткие сроки определять уровень специфических антител в антирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина.

5. Установлена корреляция результатов реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах и дот-иммуноанализа, что позволяет рассматривать предложенный метод экспресс-анализа in vitro как альтернативный методу in vivo на этапе иммунизации лошадей при производстве антирабического иммуноглобулина.

6. Экспериментально обоснованы условия и срок хранения сконструированных диагностикумов на основе наночастиц коллоидного золота - 12 месяцев при температуре (5±1) °С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конструирование и изучение потребительских характеристик тест-системы для определения антирабических антител в сыворотках животных / М.Н. Киреев, H.A. Подборонова (Н.А.Шарапова), Е.Г. Абрамова [и др.] // Материалы УП1 Межгос. научно-практ. конф. государств участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 219-221.

2. Дот-иммуноанализ при определении активности антирабических сывороток и иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, H.A. Шарапова [и др.] // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инф. болезней: Тезисы Всерос. науч.-практ. конференции. - М., 2008.-С. 13.

3. Пат. 2360252 Российская Федерация, МПК G01N33/532. Диагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа / H.A. Подборонова (H.A. Шарапова), Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.]; заявитель и патентообладатель Российский науч.-исслед. противочумный ин-т

«Микроб» - № 2008113918/15; заявл. 09.04.2008; опубл. 27.06.2009, Бюл. №18.

4. Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - № 1(103). - С.63-66.

5. Получение лиофилизированного препарата антирабического иммуноглобулина и исследование его основных свойств / Е.Г. Абрамова, H.H. Кочкалова, А.К. Никифоров, А.Ю. Бутырский, Ю.В. Иванов, Н.В. Синицына, Т.А. Михеева, JI.H. Минаева, М.В. Галкина, JI.B. Савицкая, C.B. Генералов, М.Н. Киреев, H.A. Шарапова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2(108). - С.75-78.

6. Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.] // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемической охране территории Российской Федерации: Реф. сборник. - Саратов: ОАО «Приволжское изд-во». - 2009. -Вып. 12.-С.20.

7. Тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе / H.A. Шарапова, М.Н. Киреев // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы науч.-практ. школы конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - М., 2010.-С. 142-144.

8. Изучение специфической активности антирабического иммуноглобулина и иммунных сывороток in vitro в дот-иммуноанализе / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамбва, А.К. Никифоров и др. И Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации: Материалы X Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2012. - Т.2, № 1-2.-С. 113.

9. Перспективы использования искусственных и природных наноматериалов и наномаркеров при разработке диагностических тест-систем / М.Н. Киреев, Д.В. Уткин, H.A. Шарапова [и др.] // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации: Материалы X Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2012. - Т.2, № 12. - С. 278.

10. Результаты использования дот-иммуноанализа для определения активности профилактических антирабических препаратов и иммунных сывороток / H.A. Шарапова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.] // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора - Пермь, 2012.- Т.2. - С. 346-348.

11. Выделение гликопротеида из фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и конструирование на его основе диагностикума для дот-иммуноанализа / H.A. Шарапова, М.Н. Киреев, Е.Г. Абрамова [и др.] Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии: Материалы науч. конф. с международным участием / Бюллетень Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН. - 2012. -№5 (87). -Ч. 1. - С. 347-350.

Подписано в печать 19.10.2013 г. Тираж 100 экз. Заказ 1910. Отпечатано в типографии ООО «Техно-Декор». 410012, г. Саратов, ул. Московская 160.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарапова, Наталия Анатольевна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИКУМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНА В

ДОТ-ИММУНО АНАЛИЗЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.01.04 - биохимия

На правах рукописи

04201365078

Шарапова Наталия Анатольевна

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук Е.Г. Абрамова,

кандидат медицинских наук М.Н. Киреев

Саратов - 2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................10

1.1. Вирус бешенства и методы его очистки и концентрирования....................................10

1.1.1. Свойства вируса бешенства....................................................................................................................10

1.1.2. Очистка и концентрирование вируса бешенства....................................................................12

1.2. Методы обнаружения антирабических антител..........................................................................15

1.3. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа..............................................................21

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................................................32

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................32

2.1. Объекты исследования......................................................................................................................................32

2.1.1. Вирусные антигены............................................................................................................................................32

2.1.2. Сыворотки и препараты..................................................................................................................................32

2.1.3. Лабораторные животные..............................................................................................................................33

2.2. Материалы и методы исследований........................................................................................................33

2.2.1. Реактивы и растворы..........................................................................................................................................33

2.2.2. Приборы и оборудование..............................................................................................................................34

2.2.3. Осаждение virus fixe из мозговой суспензии................................................................................36

2.2.4. Очистка вируса бешенства............................................................................................................................36

2.2.5. Выделение гликопротеида вируса бешенства....................................... 36

2.2.6. Определение белка..........................................................................................................................................37

2.2.7. Получение золей золота......................................................•....................37

2.2.8. Конструирование конъюгатов коллоидного золота с иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы................................................................................................37

2.2.9. Иммуноферментный анализ....................................................................................................................38

2.2.10. Дот-иммуноанализ............................................................................................................................................38

2.2.11. Статистическая обработка результатов исследований................................................38

ГЛАВ A3. ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ

КОНЪЮГАТОВ С НАНОЧАСТИЦАМИ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА..........................39

3.1. Отработка технологических приемов получения цельновирусных антигенов

органо-тканевого и культурального происхождения..........................................................................39

3.2. Выделение гликопротеида вируса бешенства и его характеристика........................42

3.2.1. Характеристика антигенных свойств выделенного гликопротеида....................46

3.3. Получение наночастиц коллоидного золота..................................................................................48

3.4. Отработка условий конструирования конъюгатов наночастиц золота с

иммунореагентами вирусной и иммуноглобулиновой природы............................................51

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПРОТОТИПА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК И

ИММУНОГЛОБУЛИНА in vitro В ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ..............................................54

4.1. Подбор твердой фазы для постановки дот-иммуноанализа..............................................54

4.2. Определение специфической активности антирабического иммуноглобулина и иммунных сывороток в дог-анализе с применением сконструированной

тест-системы..............................................................................................................................................................................56

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ДИАГНОСТИКУМА И ЕГО

КОМПОНЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ............................69

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................................................74

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................................80

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................................................................................82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................85

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................................................107

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Актуальность проблемы бешенства обусловлена широким распространением инфекции и 100% летальностью [41].

В большинстве регионов России эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна и поэтому организация мер борьбы с опасной болезнью, общей для человека и животных, остается важной проблемой здравоохранения [50, 80, 83].

По данным экспертов ВОЗ, в 2011 г. около 55000 человек погибло после укусов животных, больных бешенством, преимущественно в Африке, Азии, Южной Америке [12, 101]. В Российской Федерации за аналогичный период от бешенства погибли 14 человек, из них 2 детей до 14 лет, в 2012 г. - 4 человека, из них 2 детей до 14 лет [29]. Ежегодно в различные лечебные учреждения РФ за медицинской помощью по поводу укусов и других повреждений, полученных от животных, обращаются более 450000 человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение [41, 55].

Для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными применяют антирабическую вакцину в сочетании с антирабическим иммуноглобулином [43, 55, 62]. В Российской Федерации единственным производителем гетерологичного антирабического иммуноглобулина является Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Антирабический иммуноглобулин, получаемый из сыворотки крови лошади, зарегистрирован и успешно применяется более 10 лет.

В настоящее время при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина уровень активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата определяют in vivo в реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах [144]. Данный метод трудоемок, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения (14 дней) и предполагает использование инфекционного агента. В связи с этим актуальной является разработка ме-

годов in vitro для определения специфической активности аптирабических сывороток продуцентов на этапе иммунизации и в готовом препарате. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству в своих документах неоднократно подчеркивал необходимость разработки способов определения аптирабических антител in vitro [196, 197].

На сегодняшний день имеется широкий спектр методов in vitro для выявления антител к вирусу бешенства, которые имеют различную степень использования в практических лабораториях. Среди тких методов - реакция непрямой ге-магглютинации (РНГА) [34, 81, 111], реакция диффузионной преципитации (РДП) [89, 144], реакция связывания комплемента (РСК) [68, 75], иммупофер-мептпый анализ (ИФА) [9, 13, 19, 48, 57 - 61, 63, 67, 111, 114, 130, 146, 156], reci ингибиции фокусов флюоресценции (ТИФФ), тест флюоресценции вирусиейтра-лизующих антител (FAVN) [99, 109, 146, 156, 181, 194, 198, 206]. Постановка двух последних тестов требует специально аккредитованной лаборатории, необходимости поддержания культуры клеток, использования паюгенпого биологического агента - вируса бешенства.

Для определения уровня аптирабических антител тест ИФА наиболее распространен и является одним из наиболее чувствительных и удобных меюдов иммунодиагностики, однако его недостатками являются применение токсичных, канцерогенных хромогенов и необходимость использования аппаратуры для учета результатов. Указанные недостатки обусловили необходимость разработки безынструментальных тест-систем с использованием иефермептиых диагносги-кумов для определения уровня специфических антител и бесприборным учетом результатов теста.

Решением данной проблемы являйся разрабемка диагиостикума для до1-иммупоанализа с использованием в качес1ве маркера папочастиц коллоидного золота.

Цель и задачи исследований. Целыо работы явилась разработка современного диагиостикума на основе наночастиц коллоидного золота для определения ак-i ивпости аптирабических сывороток и иммуноглобулина в дот-иммуиоапализе.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищеииого и концентрированного вируса бешенства штамм «Москва 3253» оргапо-ткаиевого происхождения для использования его в качестве иммунореагента при конструировании диагностикума.

2. Выделить из вируса бешенства штамм «Москва 3253» культуральпого происхождения структурный компонент - гликопротеид и охарактеризовать его по основным биохимическим параметрам.

3. Разработать эффективный способ получения коиыогатов наночастиц коллоидного золота с иммунореагептами вирусной и иммупоглобулиповой природы.

4. Отработать методики прямого и непрямого вариантов дот-иммуноанализа для определения содержания специфических антител в аитирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием сконструированных конъ-югагов.

5. Провести корреляционный анализ результатов реакции нейтрализации вируса бешенства in vivo и дот-иммупоапализа in vitro.

6. Исследовать стабильность сконструированных коиыогатов.

Научная новизна работы. Экспериментально обоснованы условия выделения и очистки гликопротеида фиксированного вируса бешенства «Москва 3253», используемого в качестве антигена при конструировании иммупосуспензиоппого диагностикума.

Впервые получены конъюгаты вирусного антигена с наночастицами коллоидного золота. На их основе сконструирована тест-система и продемонстрирована возможность ее применения в производстве аптирабического иммуноглобулина на этапах определения уровня специфических антител в иммунных сыворотках продуцентов и готовом иммуноглобулине.

Впервые показана эффективность примепеиия сконструированного диагностикума для выявления уровня содержания специфических антител в сыворотках людей, вакцинированных по показаниям антирабической вакциной, что актуально для оценки напряженности создаваемого вакциной иммунитета.

Установлена корреляция результатов определения уровня специфических антител в антирабических сыворотках продуцентов и препарате иммуноглобулина в дот-иммуноанализе и реакции нейтрализации на белых мышах.

Практическая значимость работы. Разработанный иеферментный диагности-кум для проведения экспресс-анализа активности иммунных сывороток открывает перспективы использования в производстве препарата антирабического иммуноглобулина на этапе иммунизации животных, когда необходимо в короткие сроки принять решение о дальнейшей эксплуатации продуцентов.

Результаты исследований были использованы при составлении методических рекомендаций:

• «Определение активности антирабических сывороток и препарата гетеро-логичного антирабического иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе» (одобрены Ученым Советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», протокол №1 от 09.04.09 г. и утверждены директором института);

• «Определение уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов и человека в непрямом варианте дот-иммуноанализа с применением неферментного диагностикума» (одобрены Ученым Советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 3 от 05.05.11 г. и утверждены директором института);

• «Выделение гликопротеида из фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» (одобрены Ученым Советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 3 от 31.05.12 г. и утверждены директором института).

Приоритетность разработки подтверждена получением патента на изобретение «Иммунодиагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа» (Патент RU №2360252 от 27.06.2009).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологические и биохимические приемы позволяют получать очищенный и концентрированный вирус бешенства «Москва 3253» и его основной антигенный компонент - гликопротеид.

2. Сконструирован диагностикум на основе напочастиц коллоидного золоьа для определения уровня специфических антител в атирабических сыворотках и препарате иммуноглобулина и предложена 1ехиология его приготовления.

3. Сконструированная тест-система позволяет определять уровень атирабических антител в иммунных сыворохках и npenapaie иммуноглобулина в Д01-иммуноанализе.

4. Обоснованы 1емпера1урно-времеиные ишервалы хранения диагносгикума на основе наночастиц коллоидного золот.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: VIII Межгосударственной иаучно-пракгической конференции государств участников СНГ (Саратов, 2007); иаучно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье человека» (Рязань, 2007), ежегодных иаучно-пракшческих конференциях «Июги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в инсгшуте «Микроб» (Саратов, 2007-2012); III Международном форуме по напо1ехпологиям (Москва, 2010); Всероссийской научно-пракшческои конференции молодых ученых и специалисюв Роспогребпадзора с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (Пермь, 2012); X сьезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012); научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012) Принимала учасже в конкурсе XII Международного салона промышленной собственности «Архимед-2009» с разработкой «Набор для определения активности аигирабических сывороток и препарата гетерологичиого ангирабического иммуноглобулина in vitro в дог-иммупоапализе», которая была награждена решением международного жюри дипломом и серебряной медалыо

Публикации научных трудов. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ, из них 3 сттьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ Получен naiei-n на изобретение № 2425866

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 206 источников, из них 83 отечественных и 123 зарубежных. Объем диссертации составляет 110 страниц машинописного текста, включает 5 таблиц, 18 рисунков.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус бешенства и методы его очистки и концентрирования 1.1.1. Свойства вируса бешенства

Бешенство - остропротекающая инфекционная болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. По оценке ВОЗ, бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб. Помимо собак, кошек, диких животных, бешенство переносят кровососущие летучие мыши - вампиры. Из диких животных бешенством часто заражаются лисы, барсуки, скунсы, шакалы, койоты, еноты, хорьки, куницы, летучие мыши и дикие кошки. Однако бешенство собак является источником 99% случаев заражения человека и представляет собой потенциальную угрозу более чем для 3,3 миллиарда людей [2, 195].

Морфология и структура вируса. Вирус бешенства относится к роду /^.ш-У1гш, семейству КаЪс1оу1г1с1ае, порядку Mononegavirales. Большинство частиц вируса имеет пуле- или конусноподобную форму. Длина и диаметр вирусной частицы вариабельны и имеют размеры 100-430 им, диаметр - около 75 нм [19, 41, 62].

В структуре вириона выделяют два компонента: центральный плотный цилиндр, сформированный спиралевидным рибонуклеокапсидом, и окружающая его тонкая оболочка толщиной не более 8 нм, покрытая снаружи шипообразными элементами длиной 10 нм и шириной 5 нм. Спиралевидный рибонуклеокапсид характеризуется очень высокой плотностью и имеет вид сжатой пружины [146].

Вирион рабдовирусов состоит из несегментированного генома, представленного одной молекул