Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и экспериментальное изучение сухих питательных сред для диагностики кампилобактериоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и экспериментальное изучение сухих питательных сред для диагностики кампилобактериоза"

■ российская академия мвдаинсш. наук

пго научйот-шслбдоеашкюя институт этдакалогш ПО 1)Л и микробиологии ш.н.ф.гамши

о, шшо-производагвешов объединение шшш сгв/гг

е 5 минздрава российской фздврации

тжирханова зарипат умаровна

РАЗРАБОТКА И ЭКСПШЖНТАЛШОВ ИЗУЧЕНИЕ СУХИХ ПИТАТЕЛШХ СРЕД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ШИШЛОВАКТЕР110ЗА

ОЗ.Ю.07. - ыикробямогия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва,Махачкала - 1993г.

Работа выполнена в каучно-исслвдоватальскоы института эпидамиолотш и микробиологии ш.Н.Ф.Гамалеи Российской АМН, научно-производстаанном объединении "Питательные среда"

(г.Махатаала)

Научна а руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

доктор биологических наук, профессор А.Ф.Мороз

кандидат мадацинских наук,старший нау?шый. сотрудник П.Ш.Гаяшыова

доктор ыадацинских наук, профассор Т.И.Сергаава

доктор медицинских наук, пр^ассор Е.А.Вадшина'

Государстванный нayчнo-иccлвдQвaтeJ ский институт, стандартизации ц контроля ыадвдинских биологических .препаратов им.Л.А.Тарасавича ......

'Заидата состоится

1994 г.в

« Л„

часов

на заседании Специализированного Сгзта К 001.07.01 в научно-иеоладовательскоы институте эпдда;.шслопш и микробиологии мм.Н.О.Гамалеи Российской АМН (123098,г.Москва,ул.Гамалаи,18).

С даосертациай ¡ложно ознакомиться в библиотзка НШЗМ шл.Н.Ф.Гамалеи Российской. АМН.

„ /Г7,, /2/

Автореферат разослан

1994г.

Учашй сакретарь СпациалиаароБанного Совата, доктор мидащшских наук

Е.И.Коптелова

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема яампилобактериозной инфекции в последние годы привлекает внимание исследователей в связи с установлением этиологической роли кетилобактеркй в возникновении зстрых кишечных заболеваний, широко распространенных среди насе-»ения. Случаи'камгоьлобамериоза зарегистрированы на всех яонти-1ентах: США, ¡¡¡веции, Великобритании, Японии, Австралии, в странах Африки и Латинской Америки (¿5 ¿we*- M.et йЛ.ть; Сй^и^ШШк: MfP Puss, tm; CasnpyMcuilti u,f9Si).

В нашей стране«^ aim ияоб&чтерии выделены от больных с диарей-1вм синдромом в 10 % случаев (Хезенсон Л.Б. и др., 1906 г.).

За рубежом выпускаются коммерческие питательные среды для ранепортировки, 'обогащения, выделения кампилобактерий, но их спользование ограничено из-аа дефицита валоты (Каталог фирмы эбынх " Ль (hotd иошлоЛ,<ш ). Имевшиеся в отечественной ли-ературе сведения каСавтся питательных сред, изготовление которых лабораториях трудоемко и не давт сопоставимых результатов ¡Сазенсон Л.Б. я др.,1986). Йелезо-эритритный кровяной агар, зедназначекный для ввделения кампилобактерий в настояшее время з имеет промышленного выпуска (Черкасский Б.Л. и др.1987).

• Цель работы. Создание новых сухих препаратов, не »ребугаих ¡есения еа tcrmpoxz ' аэротолерантиых добавок и крови, что значи-шьно облегчит проведение комплекса микробиологических исследо-мий при ди аггел ике кампилобактериоаа.

В соответствии с поставленной цель» ¡работы предстояло ре-ть следующие задачи:

I. Сконструировать сухую пктательнуп среду, пригодною для льтивирования и ввделения кампилобактерий, соответствующую их экологическим потребностям. Обосновать выбор использованных в

в этой среде белковых основ и факторов роста, определить их оптимальные соотношения;

2. Разработать транспортную среду, обеспечивашув сохранение кизнеспособиоста иашилоб истерий в течение нескольких суток;

3. Изучить биологические характеристика разработанных сред обеспечивающие высокув чувствительность и полноценный рост на • них как музейных, тик и свеяеввделенньвс игаиыов кашнлобактерий

4. Оценить их диагностическую эффективность, испытав раз-работашыа каш сухие питательные среды» предназначенные для культивирования и ввделения каыпилобазиерий и транспортирования исследуемого материала^ лабораториях профильных учреяде-иий.

Научная новизна и практическая значимость проведенных исследований. Разработаны новиз сухие питательные среды : для культивирования и вцделения кашилобактерий (кашилобактер-агар состав которой сбалансирован в соответствии с физиологическими потребностями кашилобактерий, установлено. стиыулнрушее влияние глутаминовокисдого натрия на рост ксшшлобактерий и определена его оптимальная концентрация; для транспортирования исследуемого материала в бактериологическую лаборатории предложена среда, использование которой обеспечивает сохранение жизнеспособности единичных клеток кашилобактерий в течение 3-х и более суток.

Питательной основой сред является гидролизат кильки или криля, а в качестве альтернативной основы козюЗ использовать гидролизат кормовых дроааей. Включение в состав среды компонентов, повышающих аэротолерантность камгшлобактерий,обеспечи-

вает возможность культивирования их,как в условиях 3-х компонентной газовой смеси. так и в ус~ ловиях "свечного" сосуда, что в значительной мере облегчит работу лабораторий, занимающихся диагностикой кампилобактерио-за. Тест-штаимн и свехегвдслошше культуры растут на камлило-бактер-агаре без внесения ля Шпрш, ярови.

Наш установлено, что кампилобактерии, выращенные на разработанных средах, сохраняют основные биологические свойства: морфологические, культур альныэ, биохимические."

В результате проведенных исследований отработаны физико-химическио к биологические показатели каипилобактер-агара и транспортной среды, хчреитериоущие качество разработанных препаратов. **"

Новые, питательные среды признаны изобретениями : на иампи-побактер-агар и транспортнуэ - получены авторские свидетельства $ 1386657 и У 1559435 соответственно.

Кампилобактер-агар и транспортная среда апробированы в специализированных Лабораториях: Санкт-Петербургском НИИЭМ им.Пастера, инфекционной больнице $ 30 им. С.П.Боткина г.Санкт-Петербурга, Санкт-Петербургском ветеринарном и санитарно-гигиеническом институтах, Сухумском №01 экспериментальной патологии и терапии, республиканской инфекционной больнице г.Махачкалы с положительной оценкой их качества.

Промышленное производство разработанных сред освоено на ' тредприятии НЮ "Питательные среды". Оформлены норыативно-тех-шческие документации. Среда для культивирования и выделения гампилобактерий была включена в перечень важнейших препаратов Государственной инновационной программы Минздрава РФ на 1992 г.. 1олучены первые промышленные серии препарата. Транспортная

среда рекомендована Комитетом ШЕЛ для внедрения в практику

здравоохранения (протокол & 4 от 29 апреля 1993 г.). Выпушены Методические рекомендации "Этиология, клиника и диагностика кашилобактериоза (Ленинград, 19Ь8)и проспект "Лабораторная диагностика кашгалобгктериоза" по тематической выставке "йаука-эдравоохраненил" ВДНХ СССР (Яеишгрзд,19В7 г.).

Апробагг>'.я работа. Результаты исследований долохенн на Объединенном Пленуме научного совета по микробиологии АМН СССР и Проблемной кошсааи Совета "Медицинская микробиология" по проблеме "Вопросы свделения, индикацни и культивирования шн-роорганигыоз" Шахечкала,1§6б г.), на 3-ей Всесоюзной конференции "Научнио основы технологии прошзленного производства ветеринарных биологических препаратов" (ЩелкоБО,1937 г.), на 49-й объединенной итоговой научно-практической конференции молодых ученых, специалистов и студентов Дагестана по ыедицине (Махачкала,198?), на Всесовзной конференции "Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, I9&S) на научной конференции колодах ученых "Разработка иммунобиологических препаратов (Махачкала,1990), на Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала,1990), ко Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (Москва,1991)

Публикации. Результаты научных исследований опубликованы вЕработах, в том числа получено 2 авторских свидетельства, выпушен проспект по тематической выставке "Наука - здравоохранении" ВДНХ. СССР и Методические рекомендации.

'¿ТРЖШШ и.объем работы. Диссертация состоит из введения,' обзора литературы, еобстренных исследований, их обсуждения,

вкводоз» сгмско литературы. Работа изложена на 10? страницах

*

кшвинописного'текста/включая 27 таблиц, ? рисунков. В списке использованной литературы 25 работ отечественных авторов и 41 зсрубея-шх источников. Имеется Ч \ приложение.

аССПЕИШЕНГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы и i.методы исследования. При проведении работы были использствскы по 10 производственных серий сухого питательного агара на основе фергжнтативнш: гидролизатов кильки и криля (35С 42-Г&6ЕС-Ш), по 5 серий ферментативных гидролизатов кормовых: дрожжей, казеина (ФС 42-4ВС-68), клещевины,подученные, на предприятии ШО"Питательнне среда" (г.Махачкала), яелеяо сернокислое (записное) (ГОСТ 4148-98), натрий сернисто-ггцслыП пиро (ГОСТ 10575-76), натрий тгровинограднокислый [ТУ 6-09-08-1985-88), натрий-1-глуга!яшовокислнй,кислый ;ту 6-09-337-76), сода кальцинированнар(ГОСТ 5I0Q-85E).

Предметом изучения явились 300 образцов разрабатываемых >ред, а также б лабораторных и 10 экспериментальных серий.

В качестве ингибиторов ассоциативной ышсрофлоры были спьгганы'антибактериальные препараты: рнфашицш (<5С42-2037-63), мфотерицин В (SC 42-1425-89), фузвдин (ВФС 42-200-73), по'ли-иксин В (BJG 42-657-79), ристошцин (Ж 42-225704) ,цефа:";езин импортный), цефалотин (ишортный), коммерческая смесь антибиозов Бутцлера 1.Й. (фир?ш " I").

Для испытания' качества разработанных и контрольных, сред j биологическим показателя« использованы 22 эталонных итаыца

..... . .-,.< ■ • н1,

I Центра БОЗ по какпилрбактериоэу, (Брвссель, Бельгия), из

■ /

)ллекции kUrt (Канада), из Японии, а Также 19 евехеввделен-к штаммов кашилобактерий '2-х видов ( ).

иико-хишческие и биологические, показатели .сред определяли

по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, шрогенности, на отсутствие конташнируапих агентов а токсичности медицинских ишунояогическнх препаратов, излоаенн» в сборнике инструкций, у-гверзденноы МЗ СССР, ,1593 г."Методическими указаниям» по сршзнениа фгаикогхиишкскнх методов контроля питательных .сред"' (П.,1977), "Методическили рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям" Ш.,1960), "Методическими указаниями по проведении испытаний ' диагностических питательных сред" (И. ,1932), "Иетоди^скиш ре-крмендацияья ''Этиология, клиника и'диагностика кампилобантерио-эа" (Л. ,1988), а сохранение жизнеспособности камшлобактерий в транспортной среде по кетодике М/Ъпъ-Айм, /С. Ц/ощИ915>,

Микрооэрофильныз условия, создавали, откачивая полностью воздух из ш&зростата и,заполняя его смесь« газов, состоящей из 6а % азота, 10 % углекислого газа и 5 % кислорода или с по-кршьв газогенераторных пакетов фкраы "Охл^ " и научнЬ-произ-врдственной ффш "Тест". Ввиду дефицитности ыикроанаэростатов и газогенераторных пакетов, а также для обеспечения диагностик! каипилобантериоза в практике наш были использованы условия ■ "свечного" сосуда. Для определения ингибируших свойств каиталс бактер-агара в - качестве бактериальных ассоциантов использовали тест-штаммы: Ръо1с<м: Ох- 18; РъоЬеш

/9 уиг,, РъЖсш ЫЬс^и, №¿9; ¡иь&змМа. рмшпоксси,. ¿оч; {¿ЬъсбтлЬ&с ¿еСс ^Жсс ;изс^г-

ъаНлй, &£с 0£5: >'<э9 зшИ/(ЯоМ, МаркуСсеосам

Сиои-ил ¿ОЭ-Р; ЗШр'пцСсьсалоЗ асшль? И>-с'М № ¿осомлел цЬгш^ . ', Рьсийсеюни силил^полг

Х(т).

В качестве контрольных сред использовали Колумбия агар или основу кровяного агара II 2 фирш "Зелгга, " с 5 % де£ибринирован-ной крови или эритроцита арной массы, а также среду лабораторного . изготовления'на основе эритрит агара (Хазенсон Л.Б. и др.К'Ьб), Для определения сохранения Ешшваекостя камлилобантерий в транспортной среде использована контрольная среда Кери-Влср, приготовленная по оригинальной прописи ' ( И/Ыъп> -/.

Полученные результаты обрабатывали статистически (И .11. Ашарин, А.А.Воробьев,1962).

Результаты исследования. " .

Разработка и испытание среди для культивирования и вще-тения каыпилобактсрий. Изучены питательные основы из пищевого ¡1 негшаевого снр'ь'я, содержание пирокий спектр аминокислот : ферментативные гидролизаты из кильки, криля," кормовых дрожжей, к'Лешевины, казеина.

Таблица I

Сравнительная хочакгеристяяа биологических свойств кампилобактериЯ,* вырвшенннх на средах с различными . питательными основами в зависимости от содержания ш,тинного азота

¡итатэльные основы

содержание аминного азота, ж*"в

Показатели чувст- ско- чувст--ско- чувст- скопит ель- рость витель-рость витель-рость ность роста,кость роста, ность роста,

ч ч , ч

30+10

60+10

90+10

Е.Триптический .гидролиз ат кильки \сухой питатель- . ный агар)

!.Триптический гад ролизат криля

$.Трилтический гидролиз ат казеина

[.Триптичееккй гид-ролизат клешевины

¡.Триптический гидролиз ат кормовых

дрочосей

10'

10'

/

•до

10 Ю'

>-4 ,48 кг5 48 к Ю-0 4Ь

1-4 46 . Ю"5 40 Ю"5 48

48 ГС"5 46 Ю-5 4В

1-4' 48 КГ5 48 , ю-5 4с..

1-4 48 . ю-5 •48 ю~5 40

Были изучены варианты сред с различными питательными основами при содержанки ашиного азота в пределах 3Q-SQ (Таблица I).

Опыты проведены на модели плотной, среды, содержащей различные питательные основа, к которым саз Umpou еюсили 5 % дефибринированной крови. Посевы инкубиров&пи в атмосфере смеси 3-х газов ( \1Z-Wfat Cû£- 10%, 02-

Биологический контроль проводили следушиши et азямами : C.jtjcwc Л/С7С v/f/ft, С. jijm* soir, (._еой / â,zh, £. wU. лоз.

Исследование биологических свойств какпилобактерия показало, что чувствительность вариантов сред с содержанием SOilû ит% ашнного азота соответствовала разведении 10"^, на Bcèx испытанных основах.

Варианты сред с ферментативным^ гидролизатаки кильки,

i

криля, кормовых дрожкей, клещевштс содерзанием 60+10 î-rx^ ^■минного азота обеспечивали чувствительность, скорость роста к типичную ¡морфологию колоний всех испыташах шташов кампи-лобактерий из разведения. через 48 часов инкубации при температуре 42 °С в микроаэрофилыщх условия^ ( смесь 3-х газов).

' На этих средах с 5 % крови формировались влахные, слизистый, плоские колонии, сероватого цвета с ровными краями, диаметром 1-2 мм, или вшуклые, блестящие с неровной краями, диаметром 3-5 m (возможен сплошной рост). Вез внесения крови-$оркировались колоши кремового цвета. Среда на основе гидролиз ата клешевкны без добавления крови обеспечивала рост тешо-розовых колоний кампилобактерий.

На средах с триптическки гидролиз атом к аз айна при содер-кании 60+10 utâ аыинного езота формиро вали сьГ^кличные колонии

-я,- . .

б виде нитей, тдаей. Увеличение концентрации вминного азота до 90+Ю не изменяло биологические показатели сред.

В результате проведенных исследований в качестве питатель-

г

ной основа разрабатываемой среды бил выбран питательный агар на триптическом гидролизате кильки или криля, а в качестве альтернативной основы определен ферментативный гидролизат кормовых дрожяей.

В состав среда введен глутаминовскислый йатрий для изучения стииулирушего влияния на рост нашилобактерий. Исследовали несколько вариантов среда с содержанием от 0,1 до 0,2 % препарата (таблица 2). Лосевы инкубировали в атмосфере смеси 3-х газов. Установлено, что 0,15 % концентрация препарата обеспечивала биологические пбЯазатели среды на уровне контрольной - основы кровяного агара У 2 фйриы "£««лг : чувствительность составило - 10 рсзведение, скорость роста - 48 часов.

Однако, при использовании "свечного" сосуда для культивирования посевов, чувствительность среды пояикалваь на порядок и . -соответствовала Ю-ь разведенки,- видимо, вследствни токсичного воздействия избытка кислорЬда, содеряазегося в "свечном"'сосуде (I? %). Для повышения' аэроголерштнеатя кампилобаятерий в рэцеп-туру среды"внлвчена добавка, содеряеяая натрий_ шровиноградно-кисляй, натрий сернкстокислнй пиро, аелезо сернокислое (закис-ноо), которая нейтрализует производит! кислорода и свободные радикалы, к которга чувствительны к вшилоСактерга. Подбор оптимальных концентра;;!!} добавки проводили а условиях "свсчного" ■ сосуда. • . . .

Бри проведении исследований по подбору' оптимальных концентраций аороголерантких добавок в среде установлено, что 0,025$-няя концентрация их обеспечивает высокую чувстлитзль.ность среды -

Таблица 2

Сравнительная характеристика биологических свойств к вшило бактерий, выращенных на среде с различным содержанием глутаминовсРлислого натрия

Йтакмы Показатели

содержание глутаминовокислого натрия, >

0,1

0,15

0,2

Основа кровяного агаоа фирмы " ¿и-Ж "

(контроль)_

чувстви- количество чувстви- количество чувстви- количест-тельнасть колоний, тельность колоний* тельность во коло- чувст- количество М+з. М+г? ний * витель-колоний,"*"

М+ность• М+<5

5

то- -7

то* -7

ТО- -7

Ю- -7

ТО- -7

10" -7

Т0- -7

10- -У

8

10

1. e.jtjimc лЪТСл'нт Ю'

2. С. jiju-ni- ш Ю

3. С. ¿уши sos' Ю'

4. C.jtfWbb 9i0 10

5. C-itjwn* Ш ö. p iw

Ь. С- zte

-6 -6 -6

io~6

I0~6

10' 10'

-6 -6

9+2,1 10+3,0 b+4,2 13+2,0 11+1,5 12+1,2 9+4,7 10+2,2

25+3,5 22+4,0 24+2,8 26+5,0 25+2,7 26^4,7 25+4,5 28+3,5

10'

10'

10'

10'

10

10'

I0~? о

Ю-'

,-7 ■7 —7 !-7 -7 7

24+2,5. 21+3,6 2&+2,0 23+3,5 27+2,0 29+3,0 24+2,7 23+2,1

10" 10-'

10' 10 10'

10' 10' 10'

7 -7 7 7 ,-7 -7

23+3,0 24+3,1 2213,0 25+3,4 22+4,0 27+3,6 21+4,5 26+3,2

O'

Примечание: I - учет результатов проводили через 48 часов инкубации;

2-*-' количество колоний при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10"°.

10" разведение и обеспечивает возможность культивирования кампилобактер«й;как.--в условиях 3-х компонентной, газовой смеси (Но - В5 Й, СОо- 105?, §%), так и в условиях "свечного" сосуда, что в'значительной мере облегчит работу лабораторий, занимающихся диагностикой кампилобаитериоза.

Сяедушая серия опытов бнла проведена на йодели среды, содерксшей экспериментально-обоснованные концентрации глутами-новокислого натрия, аэротолерантних добавок Й питательных основ, оптимальность которых показана в предыдущих исследованиях. Концентрация аминкого азота от 30 до 90 иг£. В качестве контрольной среды использована основа кровяного агара $.2.фирмы " ВсХгИ-а.", Посевы инкубировали в микроаэрофильных условиях, :озданных смесьв газов (Г'о- 65^, СО^- 1055, 0^- 5$) и в условиях "свечного" сосуда. Биологичзские свойства сред при исполь-ювании описанных микроаэрофильных условий били идентичны.

. В результате проведенной работы получены данные>подтвер-давшие оптимальность питательных основ из кильки, криля, кор-гавых дрожжей при содержании виинного азота 60+10 При .внних значениях манного азота} биологические показатели сред аходились на уровне контрольной среды - основы кровяного ага-а й" 2 фирмы " "''среда, содержащей трилтический гид-

олизат казеина, формировались нетипичные колонии, в виде ни-ей, тяжей, как и в предвдуашх опытах. Повышение концентрации минного азота до 90+10 не влияло на качество питательных

В результате проведенных исследований бвяа разработана и 5основана рецептура'среды для культивирования и выделения шпилобактерий из исследуемого материала . (таблица А).

. Таблица 3.

Сравнительная характеристика биологических свойств кампилобактерий,вырешенных на среде с триптическим гидролиза'том кильки (сухой питательный агар) в зависимости от содержания аминного азота

Штаммы лл Показатели

Содержание аминного азота, мг5{

30ч-10

60+10

90+10

чувстви- количест- чувстви- количест- чувст- количество телъностъ во коло- тельность во коло- витель- колоний,*" .„.иа ни|ГК+г. ность М+<2

ний*Ц+<£

иснова кровяно-гоДа фирмы

(контроль)_

чувст- количест-витель- во нояо-ность ний*Ы+ 2»

X V. 2 3 4 5 . 6 7 6 9 ю

I. С ¿tfu.ru хотели/(1 10-ь 9+2,3 ю-7 21+5,1 10-7; 23+4,1 ю-'' 29+3,0 '

2. 3. С- ¿с^и-ис Ш С. /Ц-Ш^и. £05 10"6 кг6 6+2,5 9+2,3 ю-7 ю-7 23+2,4 20+3,0 .ю-7 27-45,3 22+3,8 .ТО-7 25+3,2 . 21+3,0 Й

4. 5. £ е.^иш ею ¿.¡¿¡ши иг С. б&и Л илч Ю"6 Ю"6 Ю-6 10+2,0 12+3,0 '10+2,0 ю-7 ю-7 ю-7 22+2,0 27+3,0 22+2,0 Ю-7 Ю-7 Ю -1 25^4,0 26^2,0 25^3*0 Ю-7 Ю-7 Ю-7 24+3,3 25^3,2 2Ь*3,5

? . С сои ¿09 Ю-6 9+3,0 ю-7 26+3,2 Ю-7 23+2,0 101 24+2,8 .

Ь . С. еаСь ¿31 ю~6 11^,5 ю-7 25+3,0 Ю-7 24^2,6 Ю-7 27+2,0

Примечание: I - учет результатов проводили через 48 часов инкубации: 2-*- количество колоний при посеве 0,1 мл-взвеси из

разведения 10

-6

-га-

1 Таблица ц

Состав сухой среда д£я культивирования и выделения кампилобактерий

Наименование ингредиентов

ГОСТ,ОСТ,ТУ

В г/л среды

Сухой питательный агар (на кильке или криле)

Железо сернокислое (закисное)

Натрий сернистокисли.1 пиро

Натрий пкровнноградно-кислый

ФС 42-188ВС-&8

--"1С !Г -

ГОСТ 4148-78 ГОСТ 10575-76

35,0 0,25 0,25

ТУ 6-09-03-1965-88 0,25 Натри й- 1-глут амино вонис-

лый кислый ТУ 6-09-337-75 1,5

• Сода кальцинированная ГОСТ 5100-85В 0,2

Технология получения препарата заключается в смешивании компонентов, входящих в его состав.

При выделении кампилобактерий из инфицированного материала для подавления ассоциативной микрофлоры используют смеси • антибиотиков, а состав которых входят препараты группы цефа-лоспоринов, рифамициноа, лолйииксинов, полиеноз. Мы использовали в работе 2 смеси антибиотиков: I- разработанная в Санкт-Петербургском НИИЭМ ям.Пастера и 2- во ВНИИА ( г.Москва).

Состав смесей в иг/л: ,

I. полимиксин В - 2 иг/л

рифампицин - 10 м?/л

аифотерицин В- 3 ыг/л

ристоыицин - 10 мг/л

фузидин - 2 мг/л

2. рифаыпицин - 20 кг/л фузидин - 10 мг/л амфотерицин В- 3 кг/л цзф&лотин . 'г; 15 мг/л или цефадезии - 15 ыг/л

Проведены сравнительные испытания селективных смесей на рост кампялобактерий и бактериальных ассоциантов. Для этого селективные смеси I и 2 вносили в канпилобактер-агар и основу кровяного агара }} 2. В качестве контроля использована селективная смесь Ж.П.Бутцлера, выпускаемая фирмой "Вирион" (Бель-ги). Для сравнения использован кашшлобактер-агар, не содержаний антибиотики. Посев кашилобактерий производили из разве-6 7

дения 10" и 10" , бактеряалыше ассоцхантц - из разведения Ю-1. ' - » . : '

Показано, что какпилобактерии росли на всех средах из • КГ® разведения через (43+1). ч при инкубации посевов в ыикроаэ-рофильных условиях, как с добавлением 5 крови^без добавления- Чувствительность кашидобактер-агара без ингибиторов была на порядок выше, ,чем у сред, содержавших селективную добавку. . ■ Нормировались колонии 2-х видов, влатаыз, слизистые, плоские сероватого цвета с неровными краями, диаметром 3-5 ш или выпуклые, блестшие с ровными краями, диаметрои 2-2 мы.

Рост бактериальных ассоциантов икгибировался из разредения на всех изученных вариантах среды, содержавших I и 2 селективную добавки и смесь Бутцлера Ж.П. Сплошной рост бактериальных ассоциантов наблюдался на среде, не содержащей ингибиторы.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ингибирувшие свойства I и.2 селективной добавки, а также смеси

Ж.П.Бутцлера находятся на одном уровне и обеспечивают лодавле-

1 ■ '

ние роста широкого спектра ассоциативной микрофлоры.

При контроле среды по биологическим показателям установ-, лено, что чувствительность и скорость роста кашилобактер-вга-ра находятся на одном уровне с основой кровяного агара фирмы

-15" 'ь^Ь'^сь " или Колумбия-агаром - чувствительность среды 10" разведение, скорость роста - 48 часов. На среде сохраняются основные биологические свойства катаилобактерий: продукция о'ксидазы, каталазы, чувствительность к нелидиксовой кислоте, отсутствие роста при температуре 25 °С, С.^'иШ сохраняют способность гкдролизовать гиппурат натрия, а С, сок, - отсутствие этой способности .

Кнгкбируюане свойства кампилобактер-агара и контрольных сред идентичны: подавляется рост кишечной палочки, ста*илокок-ка, протея при посеве из 10 * разведения.

Таким образом, разработанная сухая питательная среда для культивирования и взделения камвдлобактерий (кампилобактер-агар) по своим биологическим показателям не уступает коммерчески;.! средам аналогичного назначения по чувствительности,скорости • роста, сохранении основных .биологических свойств,показателю ингибиции.

Клинико-экспернментяльное изучение среды для культивирования и выявления иампилобаггтеркй.

Клиншсо-э'кспериментаяьное изучение к&чшилобактер-агара проводилось в 2 этапа: 1-й - на расширенном наборе музейных и свежсвыделенных штаммов, П-й - посев проб исследуемого материала,

Б результате исследований, проведенных по 1-ыу этапу уста--новлено, что показатели чувствительности и скорости роста культур на кампилобактер-агаре сходны с таковыми на контрольных средах.

Сохранение основных биологических свойств тест-штаккоз является ватшш показателей, характеризушим качество питательных сред, в том числе, и для культивирования камоилобактерий.

-ар-

В связи с отим изучена морфология колоний кашилобактерий , зыраленных на кампилобахтер-агаре и контрольной среде, а также другие биологические признаки. Показано, что морфология колоний на всех изученных средах была типичной: штаммы кампилобактерий формировали колонии двух видов: полупрозрачные, блестяэие, сероватого цвета (на кашилобактер-агаре без добавления крови - кремового цвета) с ровнши краями, диаметром 1-2 км или наровнши "раотекашимися" краями, диаметром от 3 до 5 ш, возможен сливной рост. В мазках, окрашенных по Граму, были видны грамотрицательные $ -образные или спиралевидные палочки. При микроскопии в темном поле были видна их подвижность. При постановка тестов на оксидазнуа и каталазную активность были получены, полокителькые результаты.,

Культуры были чувствительны к. налидиксовой кислоте. При использовании температурного теста выявлено, что данные культуры не росл?! при 25 °С. ' V

После определения родовых признаков культур кагптллобактерий, поставлен тест,позволяющий провести внутривидовую вденти-фикацко ыеад ¿.'^¡¡.ощ и С- , основанный на способ-

ности с'.^/ьопъ гидролизовать гиппура? натрия и отсутствии ЭТОЙ способности у ШТШ.2.ЮВ¿¿фаМ были гиплурат позитивны, а С. 1зй гиппурат негативны. ■ '

Таким образом, было показано, - что на разработанной среде-кашилобактер-агаре сохраняются шрфологическиз н культураль-ные свойства кампилоО'ахтерий. ."'■.•'"■

Следушим отапоы испытания кашадобактер-агара было изучение разработанной среды лри посеве материала от больных острыми кщзечньзш инфекциями, сельскохозяйственных шшотних, а также обззЬян.

Диагностическая эффективность камшлобяхтер-агара представлена на ____^___________

&мое

^аемооть I % .

t ■

Î3Î

К'

JOl п-Ьй

. то

.щ а ha — ■ У) :го • 10

íh'í

.20 n-tt

1$ Д5Ш»

/у.1

12-5ÍV

П J

re

? J

Рда71^Вы0ева£мость"*каьяило5ахтерий из rrpôcî клинического материала (фекалий).

Светлые столбики -- На кампилобактер-агаре ;

заштрихованные - на контрольной среде

Результаты апробации показали, что процент положительных находок на камтллобактер-агаре при посеве проб от больных ОКИ детеД составил 43 % {рис.1, .диаграмма I). Из ни." 63 % составили дети до I года хиэик, SOfí - дети до 2-х лет, II дети старше 3-х лет (рисЛ,диаграмма 2,3,4).

При посеве проб от обезьян высеваемооть канпилобактери?; была на IOS вкзе на разработанной среде, чем на контрольной (рис.1, диаграмма 5), а при посеве проб от свиноматок и поросят - одинаковой (рисЛ, диаграмма 6,7).

Клкнико-экспериыентальное изучение ' к азэт/ло б акт ер-^агара показало, что ои обладает вырахеягаял! селективными. свойствами о отношении бактериальных ассоциантов, при этом не'ингибируе'т-ся рост кампилобактерий и сохраняется их основные биологические свойства.

В зайлючении специалистов профильных учреждений, проводивших испытания качества качшилобактер-агара отмечено, что разработанная среда по своим биологически;.; показателям но уступает контрольна») среда:.! аналогичного назначения.

Разработка и испытание транспортир^ среды для кампилобак-тер/,;;. Изучение сохранения жизнеспособности ка?.шилобастерий в транспортных средах.

Гфи' разработке транспортной среда били использованы результаты ранее проведенных исследоЕ&шШ по подбору белковой основы ■ среды для культивирования и ввдекеккя хашилобактерий, согласно которым огтыаяьньш явились образцы сред, содержащие сухой пи-. тательный агар на основе йерментатисках гидролизатов кильки или криля. Исходя из втого, Не!,;;; использован в качества питательной .основы транспортной среда сухой питательный бульон, приготовленный из кильки или крилд. •

При содержании 30+5 аышнего азота в транспортной среде все испытанные птамш катило бактерий сохраняли жизнеспособность в течгше 3-х суток при посеве 1000 тср.кл/мл, Дальнейшее ; •увеличение шинного азота до 60+5 мгЙ не оказывало влияния на сроки выживаемости коыпилобактерий в транспортной среде,'-'."•V/.-.

При посеве высоких посевных доз культур каипилобактерий (10^ м.кл/мл) в разработанную и контрольную среды наблюдали их выживание в течение 2-х недель, а-некоторые иташы сохраняли жизнеспособность в течение кесяца» что свидетельствовало о возможности применения разработанной транспортной среды для хранения чистых культур каипилобактерий.

В результате проведенной работы в качестве белковой основы

транспортной среда выбран сухой питательный бульон на фермой-, тативных гидролизатах кильки или криля.

В состав среды входят танке аэротолерантнке добавки и глутеминовокнслкй натрий, необходимость введения хоторшс была обоснована при разработке катаилобактер-агара.

Разработанная трачскортная среда имев1? следующий состав, г/л: питателышй бульон,сухой Сна кильке илк криле) - 7,5; келезо сернокислое (заккснэе) - 0,25; натрий пяровкноградно-кнслый'-'0,25; натрий'серн:*.стокисльтл пиро - 0,25; натрий-1-глутамшовокизлый кисяцЗ - 1,5; сода кальцинированная --0,21; агар микробиологический - 1,6.

Технология получения транспортной среды заключается в смешивании сухих ингредиентов з шарозой кельннце.

Биологические показатели транспортной среды: ' Транспортная среда обеспечивает выживаемость и стабильность основных биологических свойств £.¿¿¡¿<410 гММЦ

и, С^йОк /7 114 при посеве I ья мпсробной взвеси из разе д

ведений 10 и 10 и хранении при температуре (5+1) °С в течение (72+2) ч.

Изучение сохранения ^изнеспособностк зктеробе.к?ерив и транспортньас средах.

Изучены сроки сохранения япзнеспособности возбудителей острых кишечных инфекций в транспортной и контрольной средах при посеве 1000 ы.кл/ш (разведение) к хранения посевов в условиях бытового холодильника при (5+1) °С в течение 8 дней, с ежедневным 'высевом по 0,1 мл из использозеннюс сред на чашки Петри с сухим'питательным агаром. При этом.выявлено, что разработанная среда обеспечивала сохранение зизнеспособ-ности ШЛшш* , 3. {ирАигм/иилуь ка уроБНе Среда

Кери-Вдер, а для 1Щ,ЗЛурЫ -

среда была более оптимальной, чей'-среда.сравнения, особенно для

Я. 'СЫ>&Х(ШилЗ'- ' ■■'■■' и # 'тихлеоШМЬ \ ■ , которые в процессе хранения накапливались в 4-10 раз.

Такт образом, среда ыохет быть рекомендована также для использования при бактериологических исследованиях на сельмо-" ;

■ неллез, ошерихиоз,'иерсиниоз и т.д.

Клинийо-экспёрииентальн&'е изучение транспортной среды для кампилобактерий,-

. Клинико-эксперименгальное изучение'среды проводили,, как и кампклоёактер-агара, в. два зтапа;'

При определении сроков сохранения Еизнеспособности нвмпило-. бактерий в транспортной среде то сравнения со средой Кери-Блер .

. при посеве 1000 и.кл/ыл установлено, что испытанные культуры , стабильно -сохраняли кизнесяособность 'в течение З-х'.суток на

■ обеих,средах,., а при посеве 10^ ы.кл/ья -- до 2-х недель^ за искло-чением • С.'^цили {'¿2. , который не высевался со среды Кери-Елер на 10-й день хранения'. 1 ■'''■!.'.■',... . У

При этом биологические свойства культур кампилобактерий ■' сохранялись стабильными.-' ;•.',-',''••.'..■ V.- '•',''..'■'

Сл едущим этапом исследований явились испытания качества -•' • транспортной среды при доставке клинического' материала в бактериологическую' лабораторию. • .'■'.;

■ При взятии в транспортную и контрольную среды 42 проб фекалий от больных ОКИ людей положительный результат получен в- .-■ - рдноы случае при. высевах с.' обеих сред на плотную селективную среду (январь меслц). '.: .

- В 25 пробах, взятых от свиней в опытную к контрольную, среды в бб'^случаёв^шзлюо"«»^ ,: а в. '

[О пробах от кур - в 70 % случаев обнаружены б-jtffotti,, 5ькиваемость кашилобактерий в пробах, взятых в разработанную i контрольную среды до первичного высева из них и в течение [0 дней была одинаковой.

Разработанная среда обеспечивает сохранение зшзнеспособ-ностк кампилобактерий при доставке исследуемого материала в бактериологическую лаборатории, что подтверждается актами испытания в специализированных лабораториях.

Гранспортнуа среду могло использовать для доставки исследуемых проб при всех случаях острых кишечных инфекций, т.к. з среде сохраняют жизнеспособность энтеробактерии, а некоторые представители юс даже накапливается.'

Преимуществом разработанной транспортной среда является простота в приготовлении по сравнении с оригинальной средой Кери-Влер, удобство, при транспортировке и хранении.

БЕВ0ДЫ :

I. Разработаны новые сухие питательные среды: транспортная и для культивирования к выделения кампилобактерий (кампилобак-тер-огар) на основе ферментативных-гидролиэатов кильки или крк~ Ля. Разработаннпс среды отвечают физиологически:,! потребностям кампилобактерий, повышает аэро толерантность их к условиям культивирования при повышенном'содержании кислорода. Преимуществом кампилобакгер-агара является возможность использования его для культивирования тест-юташов и свежеввделеннцх культур без. добавления крови.

Показано сткмулиругаее влияние глу т гми но во к и с л о го натрия

/ -. .

на рост кампилобактерий на модели плотной питательной среды.

Разработанные сухие среды признаны изобретениями: для культивирования - згшшека авторским свидетельством ir J3S665?,

транспортнзя - авторским свидетельством К1 1599435.

2. Проведены сравнительные испытания селективных добавок, предложенных для ингибиции сопутствующей иихрсфлоры. Показан их выраженный ингибируюший эффект в отношении широкого спектра ассоциантов, при минимальной ингибиции квыпилобактерий.

3. Транспортная среда обеспечивает сохранение жизнеспособности кампилобактерий в течение 3-х и более суток.

Показано, что культуры кемпилобактерий, хранившиеся в транспортной средв и выращенные на среде для культивирования и выделения сохраняит исходные биологические явойства.

4. Среда также моает быть рекомендована при исследованиях .на сальнонеллез, пигеллез, эшерихиоэ, иорсиаиоа и т.д. .

5. Решением Комитета медицинских и иммунобиологических препаратов (НИШ) транспортная среда рекомендована для внедрения в медицинскую практику (. протокол Р 4 от 29 апреля 1993 г.)

Ка предприятии НПО"Питательные среды" Минздрава РФ (г.Махачкала) освоено промышленное получение сред : транспоргно! и кампилобактер-агара.

Социальный эффект от внедрения сред в практику здравоохранения заключается в своевременной диагностике и выборе правильной тактики лечения каыпилобактериоэа.

■Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Авторское свидетельство У 1386657. Питательная среда для культивирования кампилобактерий /П.Ш.Гвшимова, З.У.Темир-ханова, А.й.Мороз,. Л.Б.Хаэенсон, Н.В.Сафонова, З.Н.Матвеева/ (ССОР)) 1987. , ' : ' •

2. Тедарханова З.У., Гашиыова П.Ш., Мороз А.&., Сафонова К.В. К вопросу о выделении кампилобактерий /Дезисы докладов 3 Всесоюзной конференции: Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, Москва, 19о7.-С. 91-92. ..

3. Лабораторная диагностика каипилобактериоза

/Н.В.Сазонова, Л.Б.Хазенсон, З.Н.Матвеева, H.A.Чайка, П.Ш. Гашимова, З.У.Темнрханова, К.В.Беляева, 0.В.Ркбальчекко //ВДНХ СССР, Тематическая выставка "Наука-здравоохранению". -Ленинград,1957.

4. Этиология, клиника и диагностика кампилобактериоза . /Н.В.Сазонова, Л.Б.Хаэенсон, З.Н.Матвеева, H.A.Чайка, П.Ш.

Гашимова, З.У.Темнрханова, А.Г.Бойцов, А.А.Порин//Уетодичес-кие рекомендации.-Ленинград,1968.

5. Авторское свидетельство У 1599435,Транспортная среда для каыпилобактерий /П.Ш.Гашимова, З.У.Темирханова, А.Ф.Мороз,

- Л.Б.Хазенсон, Н.В.Сафонова JCCCTy/1990. .

6. Гашимова П.Ш., Теиирхаиова З.У., Мороз А.5., Сазонова Н.В..; Бактериологическая диагностика кампилобактериоза//?аз-работка и производство препаратов медицинской биотехнологии: Тезисы конференций.-Махачкала,IS90.-С.76-77.

7. Гашимова П.Ш., Теиирханова З.У., Ыороз А.Ф., Хазенсон Л.Б., Сафонова Н.В. Среда для определения антибиотикограш кампилобактеров//Актуальниз проблеиы химиотерапии бактериальных инфекций: Тезисы докладов Всесоюзной конференцииj4.I, йосква,1991.-С.142-144.

В. Тешрханова З.У., Гашимова П.Ш., Мороз А.Ф. Питательные среды для диагностики кампилобактериоза //Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных' гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами/ профилактики¡Тезисы докладов Всесоюзной конференции,Пермь, 1993.