Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов

Дудникова, Елена Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов"

На правах рукописи

Дудникова Елена Андреевна

Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2009 г.

003459794

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Научный руководитель: Кандидат химических наук, доцент

Красноштанова Алла Альбертовна

Официальные оппоненты: Доктор технических наук, профессор

Строгое Семён Ефимович

Доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич

Ведущая организация: Научно - технический центр

«Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Защита состоится «17» февраля 2009 г. в 12м часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева

Автореферат диссертации разослан « » января 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13

Шакир И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время пищевая промышленность является одним из лидирующих направлений народного хозяйства Российской Федерации. Наиболее высокие темпы развития наблюдаются в мясоперерабатывающей промышленности. Существенное увеличение масштабов производства в данной отрасли ставит вопрос о переработки образующихся отходов, одним из которых является поджелудочная железа крупного рогатого скота. Выход биомассы поджелудочной железы при убое 1000 голов крупного рогатого скота составляет 250 кг, что для среднего мясокомбината приводит к образованию 35-45 тонн данного отхода в год.

Несмотря на то, что поджелудочная железа используется для выделения инсулина, опита, панкреатина, рибонуклеазы, карбоксипептидазы Б и других практически значимых препаратов, полная переработка сырья при этом не достигается. Так известно, что при производстве трипсина остаётся до 85 % от исходной массы поджелудочной железы, а при производстве рибонуклеазы не менее 80 % (Баурина М. М., 2002). Таким образом, существующие технологии не позволяют переработать поджелудочную железу в полном объёме.

Следует отметить, что поджелудочная железа является ценным сырьём для биотехнологической промышленности, поскольку содержит гидролитические ферменты, среди которых наибольшее практическое значение имеют карбоксипептидаза Б и рибо-нуклеаза, используемые в пищевой промышленности и медицине. Потребность в кар-боксипептидазе Б для России составляет около 40 кг/год, а в рибонуклеазе - 100-450 кг/год и т. д., причем, промышленное производство ряда гидролитических ферментов, содержащихся в поджелудочной железе не налажено (Хомов В. В., 2001). Выделение данных ферментов является многостадийным процессом из-за необходимости введения дополнительных стадий их очистки от примесных гидролаз. К таким гидролазам относятся амююлитические, липолитические и протеолитические ферменты, области применения которых, в настоящее время значительно расширяются за счет использования в пищевой, микробиологической промышленности, при производстве синтетических моющих средств, поэтому потребность в этих ферментных препаратах постоянно растёт.

Таким образом, разработка технологии полной комплексной переработки поджелудочной железы с получением максимального количества субстанций гидролаз является актуальным. Данные ферментные препараты после соответствующей очистки могут найти применение в различных отраслях промышленности, включая пищевую и медицинскую. Однако, процесс такой переработки поджелудочной железы, безусловно, приведет к образованию больших объёмов жидких стоков, что значительно осложнит работу сооружений биологической очистки предприятий мясоперерабатывающего комплекса. Поэтому важным аспектом разрабатываемой технологии должна стать минимизация образующихся твёрдых и жидких отходов.

Целью настоящей работы явилась разработка научных основ технологам гибкой малоотходной переработки поджелудочной железы с получением субстанций гидролитических ферментов.

В задачи работы входило: 1. Изучение количественных закономерностей стадии извлечения ферментов из поджелудочной железы, установление последовательности ее обработки различными экстра-гентами, что обеспечило бы минимальные потери активности каждого из них. Список сокращений и обозначений: ПЖ - поджелудочная железа; КРС - крупный рогатый скот; ФП -ферментные препараты; Кп Б - карбоксипептидаза Б; РНК-аза - рибонуклеаза; СВ - сухие вещества; ВМФ - высокомолекулярная фракция; НМФ - низкомолекулярная фракция; Xs - степень осаждения.

2. Изучение количественных закономерностей стадий концентрирования и осаждения выделяемых гидролаз.

3. Разработка кинетических схем извлечения ферментов из биомассы поджелудочной железы, и на их основе предложить алгоритмы управления отдельными технологическими стадиями с целью модификации технологической схемы для получения одного или группы ферментов с максимальным выходом.

4. Разработка пути утилизации отходов, образующихся в технологической схеме комплексной переработки ПЖ.

5. Проведение расчета технико-экономических показателей разрабатываемой технологии.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения кинетических моделей извлечения белковых веществ из биомассы микроорганизмов к процессам извлечения гидролитических ферментов из биомассы ПЖ.

Разработана единая схема последовательно-параллельных превращений для кинетического описания процесса извлечения белковых веществ, показана возможность её модификации для описания процессов извлечения отдельных фракций белковых веществ.

Предложены алгоритмы управления процессом экстракции гидролитических ферментов, позволяющие подобрать оптимальные условия извлечения индивидуального фермента с минимальными потерями остальных.

Проведено количественное изучение стадий ультрафильтрации и осаждения ферментов из водных и водно-спиртовых растворов.

Показана перспективность переработки образующихся в данной технологии отходов в продукт кормового назначения.

Практическая значимость. Разработана гибкая технологическая схема выделения субстанций ферментов карбоксипептидазы Б и рибонуклеазы с получением в качестве попутной продукции субстанций липазы, а-амилазы, протеолитического комплекса, что позволяет упростить известные технологии очистки карбоксипептидазы Б и рибонуклеазы. Такой подход позволил повысить выход карбоксипептидазы Б в 2 раза, а рибонуклеазы в 3 раза, при этом качество получаемых субстанций соответствовало препаратам пищевого назначения.

Установлено, что себестоимость получаемых препаратов в 2+2,5 раза ниже себестоимости отечественных и зарубежных аналогов.

Показано, что предложенный способ утилизации стоков данной технологии позволяет снизить их ХПК не менее чем в 3 раза, кроме того, количество твёрдого отхода биомассы ПЖ уменьшается на 70%.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г.; Москва, апрель 2007 г.); Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2005 г.; Москва, ноябрь 2006 г.; Москва, ноябрь 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе одна статья из списка журналов, рекомендованных ВАК; 2 тезисов докладов в материалах научных конференций; подана заявка на патент.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и анализов, 7-ти глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, выводов, списка литературы, 2 приложений. Работа изложена на140 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунков, 41 таблиц. Библиография включает 201 наименований, из них 131 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы приводятся характеристики и свойства ферментов, входящие в состав ПЖ, описание и анализ способов получения ферментов из животного сырья и методы их очистки. Анализ литературы позволяет заключить, что существующие схемы комплексной переработки поджелудочной железы дают возможность получить не более 3-х субстанций ферментов и являются многостадийными. Кроме того, вопросы утилизации образующихся отходов в литературе не описаны.

2. Материалы и методы

Основным объектом исследования являлась измельчённая до размера частиц 1 '-3 мм свежезамороженная поджелудочная железа крупного рогатого скота Можайского мясокомбината с содержанием 25 % сухого вещества (СВ) и сырого протеина 50 % по СВ.

В работе использовали химические реактивы квалификации не ниже «чда». Содержание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля; истинный белок в биомассе - методом Барнштейна; растворённые белковые вещества - по модифицированному методу Лоури. Активность а-амилазы определяли спектрофотометрическнм методом с применением 1 %-ного раствора крахмала в качестве субстрата и 3,5-динитросалициловой кислоты в качестве реагента, активность пересчитывали на 1 мкмоль образовавшейся мальтозы. Активность липазы измеряли по количеству щёлочи, пошедшей на поддержание рН 8, в течение 5-^6 мин. Общую протеазную активность определяли модифицированным методом Ансона с применением казеината натрия. Для определения активности трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы Б использовали специфические субстраты метиловый эфир п-толуолсульфонил-Ь-аргинина (ТАМЕ); этиловый эфир бензоил-тирозина (ВТЕЕ); гиппурил-Ь-аргинин (НА) соответственно. Контроль проводили но увеличению оптической плотности при оптимальных условиях гидролиза при соответствующих длинах волн. Определение активности РНК-азы проводили методом Калницкого. ХПК измеряли путём дихроматнометричсского определения окисляемости воды.

Исследование количественных закономерностей процесса экстракции ферментов из биомассы поджелудочной железы проводили в стеклянном аппарате ёмкостью до 1 л с мешалкой и рубашкой для подвода теплоносителя, штуцерами для установки термометра и пробоотборника.

Для изучения процесса ультраконцентрирования использовали лабораторную ячейку с рабочим давлением 0,2 МПа с мембранными фильтрами УПМ-10, 20, 50 фирмы «Владипор» и модуль на основе полых волокон ВПУ-20 ПА.

Спекгрофотометрические измерения выполняли на спектофотометре марки «Бресогс! М-40».

Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные программы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их параметров с последующим сопоставлением результатов расчёта с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности разработанных математических зависимостей эксперименту.

3. Экспериментальная часть

3.1 Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС

Использованная в работе ПЖ содержит различные гидролитические ферменты, способные расщеплять белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты (табл. 1). Анализ литературы показал, что данные гидролазы заметно отличаются по стабильности. Наиболее стабильной является РНК-аза, далее следуют химотрипсин, трипсин и Кп Б,

наименее стабильной - а-амилаза. Из перечисленных ферментов наибольшую практическую ценность и, соответственно, стоимость имеют Кп Б и РНК-аза. Поэтому при разработке технологии комплексной переработки ГОК целесообразно, в первую очередь, обеспечить максимальный выход именно этих ферментов. Согласно литературным данным для извлечения Кп Б используются растворы хлоридов натрия и кальция. Поэтому на первом этапе исследований изучили процесс экстракции Кп Б растворами этих солей при обработке 10 %-ой суспензии клеток ПЖ при температуре 30 °С и концентрации соли 1 % масс. Было установлено, что в этих условиях выход Кп Б на уровне 24 % наблюдается при времени экстракции 3 ч.

Результаты эксперимента показали, что тип соли не оказывает принципиального влияния на выход Кп Б, поэтому, руководствуясь соображениями получения субстанций пищевого назначения, в качестве экстрагента был выбран хлорид натрия.

На первом этапе исследований была подобрана оптимальная концентрация хлорида нагрия, обеспечивающая максимальный выход Кп Б (58 %). Она составляет 5 % масс. В табл. 1 представлен состав получаемого при этом экстракта, а также отработанной биомассы ПЖ. Как видно из табл.1, экстракт содержит значительное количество других гидролаз, и, прежде всего, а-амилазу, поэтому целесообразно извлекать из водно-солевого экстракта в качестве побочного продукта а-амилазу.

Таблица I

Характеристики исходной поджелудочной железы и полупродуктов, получаемых в ходе водно-солевой экстракции _____

Остаточное содержание в Степень

Характери- шламе ПЖ после водно-солевой экстракции Состав водно-солевого экстракта* экстракции ферментов

Показатель стики исходной ПЖ Характеристики ПЖ % от исходного содержания* в раствор при обработке солевым раствором, %

Сухие вещества (СВ), % 25 21 67 6,9 33

Сырой протеин, % по СВ 50 36 48 78 52

а-Амилаза, ед./г св 1061 286 18 103 68

Липаза, ед./г св 132 89 41 6 40

КпБ, ед./г св 6923 3115 35 544 47

Трипсин, ед./г св 600 126 40 68 40

Химотрипсин, ед./г св 1700 510 37 170 45

Общая протеаза, ед./г св 10044 4821 32 746 52

РНК-аза, ед./г св 316300 240388 51 10845 24

* активности ферментов в экстракте приведены в ед./мл.

Следует отметить, что отработанная биомасса ПЖ характеризуется высоким остаточным содержанием Кп Б, трипсина, химотрипсина и РНК-азы. Кроме того, при проведении водно-солевой экстракции удаётся извлечь не более 33 % по СВ. Таким образом, проблема снижения количества твёрдого отхода не решается. Поэтому необходимо разработать способы доизвлечсния субстанций ферментов.

При этом важное значение имеет установление последовательности обработки ПЖ различными экстрагентами, обеспечивающей получение максимального количества субстанций ФП с минимальными потерями активности каждого из них. По литературным данным протеазы (трипсин, химотрипсин, Кп Б) извлекают слабокислотными экст-

регентами (рН 2+3), а РНК-азу - сильнокислотными (0,1-Ю,5 н. Поэтому, после

обработки ПЖ водно-солевыми растворами необходимо проводить экстракцию слабокислотными растворами, а затем сильнокислотными. Ранее проведённые исследования на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева показали, что для извлечения ферментов из ПЖ целесообразно проводить её предварительную обработку органическими растворителями, что приводит к частичной дезинтеграции клеток и, соответственно, увеличивает выход ферментов при более мягких условиях.

Таблица 2 Поэтому на следующем

Влияние экстрагента на выход Кл Б и липазы в зависимо- этапе исследований был провести от последовательности обработки ПЖ раствором хло- ден выбор органического растворителя и обоснована последовательность обработки ПЖ водно-солевым или органическим экстрагентом. Кроме того, как показали предварительные исследования, при этом происходит извлечение липазы. В табл. 2 приведены данные по выходу липазы и Кп Б в зависимости от последовательности обработки ПЖ вышеуказанными экстрагентами.

Полученные результаты свидетельствуют, что обрабатывать ПЖ на первом этапе органическими растворителями нецелесообразно.

Таким образом, на основе проведённых исследований была предложена следующая схема обработки ПЖ:

солевая спиртовая слабокислотная .сильнокислотная

—> —> -> (1) экстракция экстракция экстракция экстракция 4 '

Установив последовательность обработки, необходимо было изучить кинетику экстракций ферментов для выбора оптимальных условий их извлечения и разработки алгоритма управления процессом. На рис. 1 приведены кинетические кривые извлечения ферментов из биомассы ПЖ, при этом на всех кривых имеются максимумы, что можно объяснить инактивацией ферментов, а так же на кривых экстракции липазы, хи-мотрипсина, трипсина и Кп Б на начальных участках есть выраженные точки перегиба. Аналогичные кинетические кривые были получены ранее сотрудниками кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева при изучении экстракции белковых веществ из микробной биомассы. Для этого процесса была предложена схема последовательно-параллельных превращений, состоящая теоретически из п-го количества промежуточных стадий извлечения высокомолекулярных белковых фракций и их частичного гидролиза до низкомолекулярных пептидов:

1кРР> 4-к^ 1гк„гг (2),

РР„ РР, РР РРр-р

ридом натрия и органическими растворителями

Выход липазы, % от Выход Кп

исходного содержа- Б, % от ис-

ния ходного

содержа-

Органический растворитель ния

Из наивной ПЖ Из ПЖ после об. работки хлоридом натрия При водно-солевой экстракции из ПЖ, обработанной орг. растворителями

Толуол 8 25 20

Третбутиловый спирт 25 40 15

Этилацетат 40 30 13

Ацетон 23 68 5

Этиловый спирт - 72 -

где: Е т, I,, Е р.р, Е т - соответственно, концентрация ферментов в клетках ПЖ КРС, промежуточного интермедиата, активного фермента в растворе и инактивированного

фермента; к0, к/, к:_1, кк т - эффективные константы скорости соответствующих стадий; РР0, РР,, /"/',, РРМ, -концентрации низкомолекулярных пептидов, образующихся за счёт частичного гидролиза высокомолекулярных белков; к1%, , к1Г , крр^ - эффективные константы скорости соответствующих стадий.

Так как все интересующие нас ферменты извлекаются при обработке ПЖ водно-солевым экстрагентом, была изучена кинетика их извлечения в ходе водно-солевой экстракции. На основе проведённых исследований было установлено, что схему (2) можно применить к извлечению белковых веществ из биомассы ПЖ. В отличие от экстракции микробных белков в исследуемом процессе не наблюдается гидролиз белков до низкомолекулярных продуктов, что связано с более мягкими условиями экстракции. Поэтому исследование кинетики процесса в данном случае сводилось к установлению количества лимитирующих стадий извлечения высокомолекулярных белковых фракций.

Первичная обработка полученных кинетических кривых и оптимизация процесса по методу наименьших квадратов показала, что адекватное описание вышеприведённых кривых экстракции каждого из ферментов достигается при различном количестве лимитирующих стадий в схеме превращения (2) (табл. 3).

Экспериментальных данные обрабатывались по следующей схеме: по начальным скоростям определили к]\ кии находили при изучении кинетики инактивации ферментов в зависимости от температуры. Были установлены

время, мин

Рис. 1. Зависимость степени экстракции ферментов при обработке клеток ПЖ КРС (СВ - 10%) 5 % раствором №зС7 при 30 "С. Условные обозначения:

1. Экспериментальные данные:

□ а-амилаза; А липаза; ▲ трипсин; 0 химотрипсин; о КпБ;н РНК-аза.

2. Расчётные данные:

.... а-Амилаза;-----липаза; — трипсин;--химотрипсин; -- - КпБ;—РНК-аза

Таблица 3

Кинетические модели извлечевия ферментов из биомассы ПЖ

Фермент Количество лимитирующих стадий Схема превращений

а-Амилаза 1

Липаза 2

Протеолити-ческий комплекс 2

Трипсин 2

Химотрипсин 3

КпБ 2

РНК-аза 1

зависимости эффективных констант схемы (2) от температуры и кислотности среды с использованием уравнения Арреииуса и специфического кислотно-основного катализа. На рис. 1 видно, что схемы превращений (табл. 3) адекватно описывают экспериментальные данные.

Установленные закономерности извлечения ферментов для водно-солевой экстракции были апробированы для последовательного извлечения ферментов из биомассы ПЖ вышеуказанными экстрагентами и показана справедливость применения вышеуста-новленных кинетических схем для каждого случая. Таким образом, были разработаны кинетические схемы для подбора оптимальных условий выделения ферментов, варьируя которые можно достичь выхода одного из них на максимальном уровне. В табл. 4 приведены оптимальные условия экстракции ферментов.

Таблица 4

Оптимальные условия экстракции ферментов из биомассы ПЖ

я я § Макси- Степень экстракции, %

§ а н о и г> с я Н Фермент Экстраген я а ея о я о И О О н Время, час мальный выход целевого фермента, % - | а-Амилаза Трипсин Ж X 1 е- о й Кп Б

2,5-3 - 68 50 68 55

Солевая а-Амилаза ЛЬС7 5% 30 1,5 73 - 40 45 47

Кп Б 2,5-3 55 68 50 68 -

Спиртовая Липаза с-лион 95% 20 12 78 - - - -

3,5-4 - - 47 30 45

Слабокислотная Трипсин 30 3,5 48,4 - - 31,3 46,2

Химот-рипсин НС! рН 2 4,5 32,8 - 44,6 - 43,8

Кп Б 20 4 49,7 - 46,3 29,9 -

Сильнокислотная РНК-аза н2яо4 0,25 н. 6 3,5-4 50 - - - -

Используя полученные кинетические модели, было установлено, что меняя время обработки биомассы ПЖ на стадии водно-солевой экстракции, можно получать экстракт, обогащенный а-амилазой (время экстракции 1,5 ч) или Кп Б (время экстракции 2,5-3 ч).

При извлечении комплекса протеаз слабокислотным экстрагентом можно варьировать температуру и время экстракции, и получать экстракты, обогащенные либо трипсином, либо химотринсином, либо Кп Б. Таким образом, в ходе последовательной обработки ПЖ четырьмя типами экстрагентов можно добиться переработки биомассы ПЖ на 70 % по массе.

3.2. Исследования концентрирования ферментсодержащих экстрактов ультрафильтрацией на плоских мембранных элеменах и осаждения субстанций ферментов из ретантов

Ферменты в полученных экстрактах находятся в смеси с низкомолекулярными соединениями линидной, углеводной и белковой природы, минеральными компонентами (прежде всего хлоридом натрия, концентрация которого составляет 38 г/л). В разрабатываемой технологии предполагается проводить выделение ферментов путём осаждения в изоэлектрической точке. Эффективность осаждения в значительной степени определяется концентрацией в растворе целевого продукта. Поскольку во всех получаемых

экстрактах концентрация белковых веществ не превышает 16 г/л, то не следует ожидать высокой степени осаждения ферментов. Поэтому перед осаждением необходимо провести предварительное концентрирование экстрактов. Наиболее подходящим для наших целей явилось концентрирование с использованием баромембранных методов, в частности, ультрафильтрации.

На первом этапе были проведены исследования с применением плоских мембранных элементов, что позволило выбрать оптимальный размер пор мембраны, а так же установить основные закономерности процесса (зависимости дифференциальной селективности и удельной производительности мембранных фильтров от концентрации ферментов в растворе). Это позволило определить значение концентрации гелеобразования, и, следовательно, максимально возможную степень концентрирования.

В ходе исследований ультрафильтрации для всех ферментсодержащих растворов

были получены типичные зависимости дифференциальной селективности и удельной производительности от логарифмичекой активности фермента в ретанте (рис. 2, 3). На зависимостях, приведенных на рис. 3, можно выделить участок линейного падения, что позволяет рассчитать величину концентрационной поляризации или гелеобразования, при которой производительность мембранного аппарата равна нулю.

Для нахождения величин концентрационной поляризации использовали уравнение мембраны с идеальной селективностью:

? 1

0.9 0,8 0,7 0,60,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

5,5 6 6,5

7,5 8 8,5

Рис. 2. Типичная зависимость дифференциальной селективности процесса мембранного концентрирования ферментсодержащето растворов от их активности в ретанте. (на примере трип-синсодержащего раствора) ■ УПМ 10; о УПМ 20; ▲ УПМ 50

0 = /Ип-

(3),

ко-ак-

где: О - производительность, л/м -ч; (3 ■ эффициент массоотдачи, л/м2-ч; А,,см -тивность фермента в гелиевом слое, ед./мл; Ар.р - активность фермента в растворе, ед./мл.

Обработка экспериментальных данных по уравнению (3) позволяет найти значение р и Агы„ а также по уравнению материального баланса:

плЧ>

\~пл(\-9)

(4)

Рис. 3. Типичная зависимость удельной производительности процесса мембранного концентрирования ферментсодержащих растворов (на примере трипсинсодержащего раствора) ■ УПМ 10; о УПМ 20; к УПМ 50

рассчитать максимально возможную степень концентрирования по объёму (ту), используя величину степени концентрирования по активности (пА). Дифференциальную селективность рассчитывали по формуле:

(5)

иа

Результаты расчетов приведены в табл. 5.

Таблица. 5

Характеристики процесса ультраконцентрирования ферментсодержащих экстратов на плоских

Экстракт содержащий Марка мембраны <? С, л м2 ■ ч А л м2 ■ ч Предельно допустимые значения при гелеоб-разовании Рекомендуемые значения для концентрирования экстрактов

ПА ту* "А ту* Иг**

а-Амилазу УПМ - 20 0,70 16,7 3,37 7,1 - 2,6 8,0 8,0

Липазу УПМ-20 0,74 29,8 7,68 ГТ5.6 - 2,9 8.5 8,5

Комплекс протеаз УПМ - 20 0,78 21,6 3,14 13,8 - 3,2 9,0 9,0

Трипсин УПМ - 20 0,87 24,4 3,56 45,9 - 3,7 6,3 6,3

Химотрипсин УПМ - 20 0,78 19,0 2,93 9,7 - 2,9 6.3 6,3

РНК-азу УПМ -10 0,74 6,3 0,61 16,1 - 2,8 8,0 8,0

* рассчитанное значение по формуле (4);** полученные значения из материшьного баланса

Из представленных данных видно, что во всех случаях достигаемая степень концентрирования составляет не менее 6 раз при относительно высокой селективности (74-87 %). Достижение такой степени концентрирования на практике приведёт к резкому увеличению энергозатрат. Поэтому, оптимальные условия проведения процесса ультраконцептрирования можно подобрать только после изучения количественных закономерностей осаждения ферментов и подбора активности ферментов в ретантах, обеспечивающих степень осаждения не менее 95 %.

Согласно литературным данным для осаждения ферментов используют метод высаливания сульфатом аммония, что предполагает высокую расходную норму соли. В связи с чем, в наших исследованиях было предложено заменить его осаждением в изо-элекгрической точке. Преимуществами метода осаждения являются простота аппаратурного оформления и возможность в одну или несколько стадий получить осадки препаратов с различной степенью чистоты. Его применение на практике ограничено только условиями, обеспечивающими стабильное образование осадков с заданным выходом, что связано с присутствием мешающих примесей в исходном растворе, наличие и вид которых зачастую невозможно проконтролировать.

При исследовании процесса осаждения ферментов было изучено влияние рН среды на степень осаждения (табл. 6). Из неё видно, что раздельное осаждение субстанций ферментов возможно. Поскольку водно-солевой ретант характеризуется высоким содержанием как а-амилазы, так и Кп Б, то целесообразно выделять обе субстанции из этого концентрата. Было установлено, что а-амилазу вследствие ее высокой лабильности необходимо осаждать первой.

При разработке малоотходной технологии очень важно исследовать состав образующихся надосадочных жидкостей (табл. 7) и предложить пути их переработки с целью довыделения субстанций ферментов. Надосадочная жидкость, полученная после

Таблица 6

Оптимальное значение рН среды осаждения субстанций гидролитических ферментов из ретантов

Фермент Оптимальное рН осаждения Степень осаждения фермента, %

а-Амилаза 5,2-5,6 94

Кп Б 3.5+3,8 92

Трипсин 6,5 68

Химотрипсин 6.5 72

РНК-аза 8,5 90

осаждения а-амилазы, характеризуется высоким содержанием Кп Б, поэтому ее целесообразно объединить со слабокислотным экстрактом перед ультраконцентрированием последнего и провести осаждение Кп Б из объединенного раствора. Надо-садочная жидкость после осаждения Кп Б из слабокислотиого экстракта обладает высокой протеолитической активностью за счёт наличия в ней химот-рипсина и трипсина. Однако, как следует из табл. 6, степень их осаждения при таких активностях не превышает 70 %, поэтому для выделения субстанций этих ферментов необходимо подвергнуть их концентрированию с последующим осаждением. Надосадочная жидкость, полученная после осаждения субстанций химотрипси-на и трипсина, обладает РНК-азной активностью, поэтому её можно объединить с сильнокислотным экстрактом.

Таким образом, на данном этапе исследований была разработана принципиальная схема объединения основных жидких стоков, образующихся в технологической схеме, с целью максимального выделения субстанций ферментов и минимизации объёмов сточных вод.

3.3. Концентрирование ферментных растворов ультрафильтрацией на мембранных фильтрах половолоконного типа

Поскольку в промышленности широко используют половолоконные мембранные фильтры, вследствие их более высокой эффективности, то количественные закономерности объединенных ферментсодержащих растворов были изучены именно на фильтрующих элементах данного типа.

Концентрирование на половолоконных аппаратах проводили с возвратом ретанта в исходную ёмкость при непрерывном отборе фиксированного объёма пермеата. В качестве ультрафильтрационных волокон были выбраны волокна ВПУ-20 ПА, как наиболее близкие по диаметру пор к ранее подобранным мембранам УПМ-20 и УПМ-10.

Проведенные ранее исследования показали, что удельная производительность модуля на основе полых волокон марки ВПУ-20 ПА по воде достигает 192±5 л/(м2 ч). При ультраконцентрировании ферментсодержащих экстрактов данная величина в первые часы работы мембранного аппарата снижается и в дальнейшем, в течение практически неограниченного времени сохраняется постоянной. Исследования по оптимизации параметров процесса ультраконцентрирования для половолоконных мембран, проводились аналогично вышеизложенному для плоских мембран. Их результаты приведены в табл. 8.

Из представленных данных следует, что половолоконные ультрафильтрационные установки обладают более высокой производительностью (по сравнению с плоскими мембранами выше в 45 раз), кроме того, дифференциальная селективность по всем фер-

Таблица 7

Характеристика надосадочных жидкостей, получаемых после осаждения субстанций ферментов в ИЭТ

Состав экстракта Надосадочная жидкость после осаждения:

а-амилазы (рН 5,2-5,5) Кп Б (рн з,б-з,8; трипсина и химотрипсина (рН 6,5)

СВ, % 4,37 1,34 4,15

Белок, г/л ВМФ 17,5 4 4,5

НМФ 27 15 31

Общая 44 19 35

а-Амилаза, ед./мл 44 - -

Липаза, ед./мл 6 - -

Кп Б, ед./мл 1328 148 169

Трипсин, ед./мл 93 96 35

Химотрипсин, ед./мл 303 282 109

Протеолитический комплекс, ед./мл 2046 1649 631

РНК-аза, ед./мл 26615 20095 57271

ментам составляет не менее 86 %. Таким образом, можно сделать однозначный вывод о целесообразности использования половолоконных ультрафильтрационных установок для очистки и концентрирования ферментсодержащих экстрактов. Помимо вышеперечисленных преимуществ, при работе с половолоконными мембранами удается снизить потери ферментов за счет упрощения процесса регенерации мембран с 30 % до 12 %.

Таблица 8

Значение параметров концентрирования ферментсодержащих растворов на волокнах ВПУ-15 Г1А

Экстракт, содержащий Ч> С, л А л Предельно допустимые значения при гелеобразовании Рекомендуемые значения для концентрирования экстрактов

лг ■час м~ -час Па тг* Па тг* ту**

а-Амилазу 0,99 23,67 3,82 4,8 5 4,3 4,3 4,5

Липазу 0,96 5,99 1,24 43 - 7,6 10,4 10,4

КпБ 0,90 46,70 4,98 88 - 1,9 2,1 2,0

Трипсин 0,92 46,33 8,99 6,1 11 3,7 4,8 5.3

Химотрипсин 0,91 59,45 8,9 6,3 13 3,8 5,3 5,3

РНКазу 0,86 110,90 5,95 65000 - 4,3 9,5 9,5

При загрязнении разделительных аппаратов в результате продолжительной эксплуатации их можно регенерировать водными растворами щелочей, ПАВ, кислот, перекиси водорода. Кроме того, на таких ультрафильтрах отсутствует необратимая сорбция биополимеров, что также снижает потери ферментов на стадии ультракоицентрирования. 3.4. Осаждение ферментов из водных растворов в изоэлектрической точке

Получив с применением половолоконных ультрафильтров ферментсо-держащие ретанты, изучили количественные закономерности осаждения ферментов в ИЭТ из водных растворов с целью составления научно-обоснованных рекомендаций его использования на практике и выявления факторов, оказывающих на процесс осаждения наибольшее влияние: времени образования осадков и начальной концентрации ферментов в ретанте.

На рис. 4 приведены типичные кривые осаждения ферментов из водных растворов. Их вид позволяет сделать предположение, что процесс осаждения может быть описан схемой превращений:

120 150 180 210 240 Время, мин

Рис. 4. Типичные кривые осаждения фермента на примере осаждения РНК-азы в составе экстракта (концентрата) из раствора с различной концентрации отстаиванием вблизи изоэлектрической точки (рН 8,5) Условные обозначения: Экспериментальные данные: ♦ - 17680; ■ - 20379; ▲ - 44200; • - 88402 (ед./мл). Расчётные данные

— 17680;-- 20379; — 44200; - - • 88402 (ед./мл)

2фермент0 <г-^—>(фермент1>):1 I (6), где: ' - константа равновесия, устанавливающегося между осадком и ферментов в растворе.

В соответствии с уравнением (6) величина степени осаждения должна

быть связана с начальной активностью фермента (А(1) соотношением: X,

Вышеуказанное уравнение (6) в отсутствии равновесия можно представить в виде двух процессов, протекающих навстречу друг другу с разными скоростями, обусловленных, с одной стороны, образованием осадка, а с другой, его растворением:

2А

(8)

Для зависимостей, приведенных на рис. 4 уравнение скорости образования осадков будет иметь вид:

dXs dr

= kt-A0-(l-Xsy-k_t-Xs

(9)

Схема (6), уравнение (9) и значения констант данного уравнения определяют кинетическую схему процесса осаждения ферментов в ИЭТ и позволяют дать рекомендации по оптимальному режиму процесса осаждения и необходимой степени концентрирования ферментосодер-жащих экстрактов (табл. 9).

Таблица 9

Оптимальные условия осаждения субстанций ферментов из

1 Время Максимально достигае- Активность фермента в исходном растворе, ед./мл Необходимая степень концентрирования

Фермент о. О S fS осаждения, ч мая степень осаждения, %

а-Амилаза 4+6 3,5 98 44! 4,5

КпБ 4-6 2,5 95 1515 2

Трипсин и Химотрип- 4+6 2 95 6307 5,3

син

РНК-аза 4-6 2,5 78 88400 9

3.5. Осаждение ферментов из водно-спиртовых растворов

Осадки, полученные при осаждении из водного раствора, содержали примеси. Для их очистки целесообразно применить переосаждение из водно-спиртового раствора. Согласно литературным данным, липазу можно количественно осадить только из водно-спиртового раствора, используя в качестве органического растворителя изопропанол. Для осаждения остальных субстанций ферментов применяли этанол. Поэтому на следующем этапе исследований были изучены количественные закономерности осаждения ферментов из водно-спиртовых растворов. В качестве исследуемых параметров процесса были выбраны время образования осадков и гидромодуль.

Гидромодуль варьировали в диапазоне от 1 до 10. Схема образования осадков аналогична осаждению из водных растворов. Однако численные значения эффективных констант к) и к.} при изменении гидромодуля спирта не остаются постоянными, а линейно изменяются в зависимости от концентрации спирта в среде. Наличие линейных зависимостей значительно упростило проведение соответствующих расчетов по выбору оптимального гидромодуля для осаждения ферментов, который оказался равным 5 для РНК-азы, трипсина и химотрипсина, 8 для амилазы и 15 для КПБ.

3.6. Получение растворов ферментов, свободных от минеральных примесей и пигментов

Альтернативным методом очистки субстанций ферментов является метод диа-фильтрации, поэтому на следующем этапе исследований было проведено сравнение 2-х способов очистки ферментов: методом переосаждения из водно-спиртового раствора и

диафильтрации (табл. 10).

Таблица 10

Влияние способа очистки субстанций ферментов на выход и качество конечных продуктов

Наименование субстанции фермента Удельная активность после первого осаждения, ед./г белка Удельная активность после переосаждения из водно-спиртового раствора, ед./г белка Оптимальная кратность диафильтрации Удельная активность после диафильтрации, ед./г белка Потери на стадии переосаж-дсния, % Потери на стадии диафильтрации, %

а-Амилаза 4601 5890,8 5 5997,9 11 5

Липаза 1595 - - - 6 -

Кп Б 84390 41055 3 43987 9,6 24

Тршшсин я химотрипсин 520614 - - - 8,6 -

РНК-аза 11197863 4093157 3 4093157 8 42

Как видно из приведённых данных, для амилазы можно использовать оба способа, для Кп Б и РНК-азы очистку проводить только переосажденисм. Качество субстанций таких ферментов как липаза, трипсин и химотрипсин позволяет ограничиться однократным осаждением из соответствующих растворов.

3.7. Биоконверсия отходов, образующихся при комплексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота в продукт кормового назначения

Разрабатываемая технология комплексной переработки биомассы ПЖ позволяет получать несколько ферментных препаратов: а-амилазу, липазу, протеолитический комплекс (химотрипсин, трипсин, Кп Б) и РНК-азу. Однако, следует отмстить, что на стадиях выделения ферментов происходит образование значительных количеств отходов, которые существенно отличаются по составу.

Таким образом, в рамках разрабатываемой технологии при комплексной переработке ПЖ КРС, образуются отходы, которые можно разделить на 3 группы:

• отработанная биомасса ПЖ;

• жидкие стоки с высоким содержанием спирта;

• жидкие стоки.

Переработка отходов первой группы может быть осуществлена путем использования шлама биомассы ПЖ непосредственно на корм скоту, поскольку данный отход обладает сравнительной высокой питательной ценностью и является нетоксичным.

Огходы второй группы включают в себя значительное количество этанола (более 40 масс. %), поэтому их необходимо направить на стадию регенерации спирта с последующим возвратом в основное производство, а кубовый остаток объединить с отходами третьей группы.

Отходы третьей группы содержат значительное количество органических веществ (~ 27 г/л), органические вещества как этиловый спирт, углеводы и др., а так же содержит ионы 5042', СГ, . Такой состав позволяет рассматривать данный сток, как ценный субстрат для культивирования микроорганизмов.

Анализ литературы показал, что культура Уаггои'ш ИроКИса способна высоко эффективно ассимилировать жировые отходы мясоперерабатывающей промышленности. В качестве модельного стока, образующегося в данной технологии, был выбран объединенный сток, получающийся на стадии ультрафильтрации исходных экстрактов -сток фильтратов. В качестве питательной среды использовали: сток фильтрата (А); сток

с дополнительным введением минеральных компонентов до состава минеральной осно вы среды Ридера (Б), а так же помимо введения минеральных компонентов, для поддержания оптимального соотношения азота и углерода вносили глюкозу (30 г/л) (В), так как известно, что несбалансированное содержание белковых веществ и углеводов может ингибировать рост дрожжей (табл. 11).

В результате проведённых исследований установлено, что образующаяся биомасса характеризуется сравнительно высоким содержанием белковых веществ (40+44 %) (табл. 9). Высокие показатели накопления биомассы К lipolytica в среде с большим содержанием NaCl могут быть связаны с тем, что данная культура являег-ся умеренно галофильной. При этом удельная скорость роста составляет 0,18 ч"1. Так же следует отметить, что введение дополнительных минеральных компонентов и источника углерода небелковой природы положительно влияет на ростовые характеристики микроорганизмов и в результате максимальное накопление биомассы составляет 11,2 г/л. Кроме того, удаётся снизить значения ХПК в 2+2,5 раза.

Поскольку, как указывалось ранее, на мясоперерабатывающих комбинатах существует проблема утилизации образующихся жировых отходов, то следующим этапом исследований явилось изучение биоконверсии смеси отходов - стоков, образующихся при комплексной переработки ПЖ и жировых отходов мясопереработки. Сточные воды - сток фильтратов - добавлялись в питательную среду в качестве источника азота и факторов роста, а основным источником углерода являлись жировые отходы мя-

Таблица 11

Ростовые характеристики дрожжей У. Иро1уНса при культивировании на питательных средах, содержащие концентрированный сток__

А Б В

0,15 0,17 0,18

Максимально накопленная биомасса, г/л 5,1 9,4 11,2

Исходное содержание белковых веществ, г/л ВМФ 5,27

НМФ 21,06

Остаточное содержание белковых веществ, г/л ВМФ 2,54 1,81 0,27

НМФ 10,32 12,81 8,65

ХПК „и, мг Ог/ л 131000 - -

ХПК ко«, мг Ог/ л 90000 57000 40000

Содержание сырого протеина в биомассе, % 40,0 40,1 43,2

А - концентрированный сток фильтрата; Б - сток с дополнительным введением минеральных компонентов до состава минеральной основы среды Ридера; В - сток с дополнительным введением минеральных компонентов до состава минеральной основы среды Ридера и глюкозой (30 г/л).

Таблица 12

Ростовые характеристики дрожжей К Ыро1уИса при культивировании на питательных средах различного состава.

Питательная среда, содержащая жировые отходы 20 г/л Питательная среда, содержащая сток фильтратов Питательная среда, содержащая жировые отходы 20 г/л и сток фильтратов

м" 0,26 0,15 0,25

Мах накопленная . б/м, г/л 21,8 5,3 27,4

Содержание белковых веществ, % сыр. прот. 49,2+51,4 40,6+47,4 48,4-50,2

ист. белок 42,6+44,7 38,6+41,1 41,8+43,2

Цвет бежевый охра бежевый

Запах характерный для дрожжей

Тест на острую токсичность Не токе. Не токе. Не токе.

сопереработки в количестве 20 г/л. В результате установили, что удельная скорость роста дрожжей на данной питательной среде досгигает 0,25 ч"1, при этом максимальное накопление биомассы составляет 27,4 г/л, а содержание сырого протеина в биомассе не менее 48 % (табл. 12).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о принципиальной возможности биоконверсии сточных вод, образующихся при переработке ПЖ, в продукты кормового назначения. При этом концентрированные стоки могут использоваться не только в качестве основы питательной среды, но также и в виде дополнительного компонента питания микроорганизмов при биоконверсии жировых отходов мясо-переработки, так как совместно использование данных стоков является наиболее эффективным.

На основе проведенных исследований была разработана гибкая технологическая схема комплексной переработки поджелудочной железы. Проведён расчёт технико-экономических показателей комплексной переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота мощностью 40 т/год (ПЖ). В табл. 13 приведены рассчитанные значения себестоимостей субстанции ферментных препаратов и рекомендуемых цен в сравнении с известными ценами на субстанций такого же качества.

Таблица 13

Сравнительная характеристика цен на субстанции ферментов

Субстанция ферментов Активность, ед./г Годовой выпуск, кг Цена по каталогу, тыс. руб./ кг Себестоимость, тыс. руб./кг Рекомендуемая цена сбыта, тыс.руб./кг

а-Амилаза 5891 487 11,2 3.3 4.3

Липаза 1595 54 20,0 15,0 19,4

КпБ 84390 117 230,0 115,0 149.5

Трипсин и Химотрипсин 520614 54 31,6 15,8 20,6

РНК-аза 11197863 36 42,0 21,0 27.3

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработана ресурсосбери-ающая технология комплексной переработки биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов: карбоксипептидазы Б, рибонуклеазы, трипсина и химотрипсина, а-амилазы, липазы.

2. Установлена последовательность обработки биомассы поджелудочной железы, обеспечивающая выделение ферментов: карбоксипептидазы Б, рибонуклеазы, трипсина и химотрипсина, а-амилазы, липазы, причем потери активности остальных не превышают 40 %.

3. Разработаны кинетические схемы стадий экстракции ферментов водно-солевыми, водно-кислотными и водно-спиртовыми экстрагентами, ультрафильтрации, осаждения. Предложенные кинетические схемы позволили подобрать оптимальные условия выделения каждого фермента: для водно-солевой экстракции 5% масс. ЫаС1, 30 °С время экстракции: для а-амилазы- 1,5 ч, для Кп Б - 2,5-КЗ ч; спиртовой экстракции -20 °С, 12 ч; слабокислотной экстракции рН 2, для трипсина 30 °С 3,5 ч, для химотрипсина 30 °С 4,5 ч, для Кп Б 20 °С 4 ч; для сильнокислотной экстракции выделения РНК-азы 0,25 н. Н2304 при температуре 6 °С 3,5-И ч.

4. Предложены способы очистки ферментных препаратов, основанные на применении методов диафильтрации и переосаждения, позволяющие получить субстанции пищевого назначения, с выходом 60 % от исходного содержания ферментов в Г1Ж, что в 2-К5 раза выше, чем по известным технологиям.

5. На основе предложенных кинетических схем подобраны варианты технологических схем получения ферментных препаратов с выходом не менее 60 %.

6. Предложены пути утилизации белоксодержащих отходов, образующихся в технологическом процессе, путём культивирования дрожжей рода Y. lipolytica с получением кормового белкового продукта с содержанием сырого протеина не менее 40 %.

7. Проведена технико-экономическая оценка разработанной технологической схемы. Показано, что в условиях комплексного производства себестоимость каждого из получаемых ферментных препаратов не превышает 30 % от цены зарубежных аналогов. Рентабельность производства составляет 34 %, срок окупаемости дополнительных капитальных вложений не превышает 2-х лет.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Дудникова Е. А. Изучение стадий экстракции амилазы, липазы и комплекса протеаз из поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. - М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2005. - Т. XIX, № 5 (53). - с. 136; 20 см. - 160 экз. - с. 100 - 105.

2. Дудникова Е. А. Разработка стадий выделения и очистки ферментов при комплексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. - М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2006. - Т. XX, № 6 (64). - с. 136; 20 см. - 160 экз. - с. 15 - 18. - ISSN 1506-2017.

3. Дудникова Е. А. Разработка стадий выделения и очистки рибонуклеазы при комплексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. - Москва, 2007.-Т. XX, №6 (64).-с. 15-18.

4. Dudnikova Е. A. Elaborating Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a ' Complex of Proteases from Cattle Pancreas [Text] / E. A. Dudnikova. A A. Krasnosh-

tanova, [Та. Krylov)1/ Industrial Application of biotechnology. - New York, Nova Science Publisher, 2006. - c. 28 - 37. - ISBN 1-60021-039-2.

5. Дудникова E. А. Разработка основ комплексной переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота [Тезисы] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, М.М. Баурина, [И. А. Крылов] // Сборник трудов III Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -М., 2005, - с. 327.

6. Дудникова Е. А. Разработка технологии выделения и очистки ферментов проте-олитического комплекса из поджелудочной железы крупного рогатого скота, в условиях ее комплексной переработки [Тезисы] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, [И. А. Крылов| // Сборник трудов IV Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2007. - с. 54.

7. Дудникова Е. А. Выделение а-амилазы из биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, |И. А. Крылов) // Химическая технология. - М., 2008. - Т. 9, № 4. - с. 182 - 188.

Подписано в печать: 13.01.2009

Заказ № 22 Тираж - 140 пкз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.auloreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Дудникова, Елена Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Общая характеристика поджелудочной железы высших животных и человека.

1.2. Строение, свойства и механизм действия ферментов поджелудочной железы.

1.2.1. Механизм действия, структура и свойства панкреатической а-амилазы (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, К.Ф. 3.2.1.1).

1.2.2. Механизм действия, структура и свойства панкреатической липазы (триацилглицерол-ацнлгидролаза, К.Ф. 3.1.1.3).

1.2.3. Механизм действия, структура и свойства протеаз.

1.2.3.1. Трипсин (К.Ф. 3.4.21.4).

1.2.3.2. Химотрипсин (К.Ф. 3.4.21.1).

1.2.3.3. Карбоксипептидаза Б (пептидил-Ь-лизин (L-аргинин) гидролаза, К.Ф. 3.4.17.2).

1.2.4. Механизм действия, структура и свойства рибонуклеазы (К.Ф. 3.1.27.5).

1.3. Извлечение ферментов из поджелудочной железы.

1.3.1. Получение препаратов а-амилазы из поджелудочной железы.

1.3.2. Получение препаратов липазы из поджелудочной железы.

1.3.3. Получение протеолитических ферментов из поджелудочной железы.

1.3.3.1. Получение трипсина.

1.3.3.2. Получение химогрипснна.

1.3.3.3. Получение карбоксипептидазы Б.

1.3.3.4. Получение панкреатина.

1.3.4. Получение рибонуклеазы.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.3.1. Количественное определение азотосодержащих веществ в белковых растворах.

2.3.2. Определение активности ферментов.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Методика экстракции ферментов из биомассы поджелудочной железы.

2.4.2. Методика проведения процесса ультрафильтрации на ячейках с промышленными ультрафильтрами.

2.4.2.1.Устройство и принцип действия лабораторной установки концентрирования.

2.4.2.2. Методика проведения процесса ультрафильтрации на половолоконном модуле промышленного типа.

2.4.2.3.Методика проведения процесса концентрирования.

2.4.3. Методика проведения процесса молекулярно-ситовой хроматографии.

2.4.4. Методика проведения осаждения субстанций ферментов из водных и водно-спиртовых растворов.

2.4.5. Методика проведения гель-электрофореза в полиакриловом геле.

2.4.6. Методика проведения культивирования микроорганизмов.

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС.

3.2. Исследование концентрирования ферментсодержащих экстрактов ультрафильтрацией на плоских мембранных элементах и осаждения субстанций ферментов из ретантов.

3.3. Концентрирование ферментных растворов ультрафильтрацией на мембранных фильтрах половолоконного типа.

3.4. Осаждение ферментов из водных растворов в изоэлектрическои точке.

3.5. Осаждение ферментов из водно-спиртовых растворов.

3.6. Получение растворов ферментов, свободных от минеральных примесей и пигментов.

3.7. Биоконверсия отходов, образующихся при комплексной переработке поджелудочпой железы крупного рогатого скота в продукт кормового назначения

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов"

В настоящее время пищевая промышленность является одним из лидирующих направлений народного хозяйства Российской Федерации. Наиболее высокие темпы развития наблюдаются в мясоперерабатывающей промышленности. Существенное увеличение масштабов производства в данной отрасли ставит вопрос о переработке образующихся отходов, одним из которых является поджелудочная железа крупного рогатого скота. Выход биомассы поджелудочной железы при убое 1000 голов крупного рогатого скота составляет 250 кг, что для среднего мясокомбинат приводит к образованию 35-^-45 тонн данного отхода в год.

Несмотря на то, что поджелудочная железа используется для выделения инсулина, опита, панкреатина, рибонуклеазы. карбоксипептидазы Б и других практически значимых препаратов, полная переработка сырья при этом не достигается. Так, известно, что при производстве трипсина остаётся до 85 % от исходной массы поджелудочной железы, а при производстве рибонуклеазы не менее 80 % [1]. Таким образом, существующие технологии не позволяют переработать поджелудочную железу в полном объёме.

Следует отметить, что поджелудочная железа является ценным сырьём для биотехнологической промышленности, поскольку содержит гидролитические ферменты, среди которых наибольшее практическое значение имеют карбоксипепгидаза Б и рибонуклеаза, используемые в пищевой промышленности и медицине. Потребность в карбоксипептидазе Б для России составляет около 40 кг/год, а в рибонуклеазе - 100-450 кг/год и т. д., причем, промышленное производство ряда гидролитических ферментов, содержащихся в поджелудочной железе, не налажено. Выделение данных ферментов является многостадийным процессом из-за необходимости введения дополнительных стадий их очистки от примесных гидролаз. К таким гидролазам относятся амилолитические, липолитические и протеолитические ферменты, области применения которых в настоящее время значительно расширяются за счет использования в пищевой, микробиологической промышленности, при производстве синтетических моющих средств, поэтому потребность в этих ферментных препаратах постоянно растёт.

Таким образом, разработка технологии полной комплексной переработки поджелудочной железы с получением максимального количества субстанций гидролаз является актуальным. Данные ферментные препараты после соответствующей очистки могут найти применение в различных отраслях промышленности, включая пищевую и медицинскую. Однако, процесс такой переработки поджелудочной железы, безусловно, приведёт к образованию больших объёмов жидких стоков, что значительно осложнит работу сооружении биологической очистки предприятий мясоперерабатывающего комплекса. Поэтому важным аспектом разрабатываемой технологии должна стать минимизация образующихся твёрдых и жидких отходов.

Целью настоящей работы явилась разработка научных основ технологии гибкой малоотходной переработки поджелудочной железы с получением с\бсганций гидролитических ферментов.

В задачи работы входило:

1. Изучение количественных закономерностей стадии извлечения ферментов из поджелудочной железы, установление последовательности её обработки различными экстрагентами, что обеспечило бы минимальные потери активности каждого из них.

2. Изучение количественных закономерностей стадий концентрирования и осаждения выделяемых гидролаз.

4. Разработка пути утилизации отходов, образующихся в технологической схеме комплексной переработки ПЖ.

5. Проведение расчета технико-экономических показателей разрабатываемой технологии.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения рапсе разработанных кинетических моделей извлечения белковых веществ из биомассы микроорганизмов к процессам извлечения гидролитических ферментов из биомассы Г1Ж. Разработана единая схема последовательно-параллельных превращении для кинетического описания процесса извлечения белковых веществ, показана возможность сё модификации для описания процессов извлечения отдельных фракций белковых веществ.

Предложены алгоритмы управления процессом экстракции гидролитических ферментов, позволяющие подобрать оптимальные условия извлечения индпвидуального фермента с минимальными потерями остальных.

Проведено количественное изучение стадии ультрафильтрации и осаждения ферментов из водных и водно-спиртовых растворов. Показана принципиальная возможность переработки образующихся в данной технологии отходов в продукт кормового назначения.

Практическая значимость. Разработана гибкая технологическая схема выделения субстанций ферментов карбоксипептидазы Б (Кп Б) и рибонуклеазы (PIIK-азы) с получением в качестве попутной продукции субстанций липазы, амилазы, прогео-литического комплекса, что позволяет упростить известные технологии очистки Кп Б и PIIK-азы. Такой подход позволил повысить выход Кп Б в 2 раз, а РНК-азы в 3 раз. При этом качество получаемых субстанций соответствовало препаратам пищевого назначения.

Установлено, что себестоимость получаемых препаратов в 2-^-2,5 раз ниже себестоимости отечественных и зарубежных аналогов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г.; Москва, апрель 2007 г.), Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2005 г.; Москва, ноябрь 2006 г.; Москва, ноябрь 2007 г.)

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и анализов, 7-ми глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, выводов, списка литературы. 2-х приложений. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста. Работа содержит 61 рисунок, 41 таблицу. Библиография включает 201 наименование, из них 131 иностранный источник.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дудникова, Елена Андреевна

выводы

1. Разработана ресурсосберегающая технология комплексной переработки биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов: карбоксипептидазы Б, рибонуклеазы, трипсина и химотрипсина, амилазы, липазы.

2. Установлена последовательность обработки биомассы поджелудочной железы, обеспечивающая выделение всех вышеперечисленных ферментов, причем потери активности не превышают 40 %.

3. Разработаны кинетические схемы стадий экстракции ферментов водно-солевыми, водно-кислотными и водно-спиртовыми экстрагентами, ультрафильтрации, осаждения. Предложенные кинетические схемы позволили подобрать оптимальные условия выделения каждого фермента: для водно-солевой экстракции 5% масс. NaCl, 30 °С. время экстракции: для амилазы- 1,5 ч, для КпБ - 2,5-КЗ ч; спиртовой экстракции - 20 °С. 12 ч; слабокислотной экстракции рН 2, для трипсина - 30 °С 3.5 ч, для химотрипсина - 30 °С 4,5 ч, для Кп Б - 20 °С 4 ч; для сильнокислотной экстракции выделения РНК-азы 0,25 н. H2SO4 при температуре 6 °С 3.5^4 ч.

4. Предложены способы очистки ферментных препаратов, основанные на применении методов диафильтрации и переосаждения, позволяющие получить субстанции пищевого назначения с выходом 60 % от исходного содержания ферментов в ПЖ, что в 2-КЗ раз выше, чем по известным технологиям.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Дудникова, Елена Андреевна, Москва

1. Мазурин, А. В. Болезни органов пищеварения у детей Текст.: Руководство для врачей / Под ред. А. В. Мазурина. М., 1984. - 656 е.: ил.

2. Цветкова, JI. Н. Панкреатическая недостаточность у детей Текст. / JI. Н. Цвет-кова // Вопросы современной педиатрии. М., 2003; т. 2. - №3. - с. 60 - 66. Биб-лиогр.: с. 66.

3. Костюченко, A. JI. Неотложная панкреатология Текст.: Справочник для врачей / A. JI. Костюченко, В. И. Филин. 2-е изд. - СПб.: Деан, 2000. - 480 е.: ил.; 20 см. -ISBN 5-88977-065-9.

4. Keller P. J. The proteins of bovine pancreatic juice Text. / P. J. Keller, E. Cohen, H. Neurath // J. Biol. Chem. 1958 Aug; 233 (2). - p. 344 - 349.

5. Marchis-Mouren G. E4ude compare" e de l'e'quipment enzymatique du sue pancre'atique de diverses espe'ees Text. / G. Marchis-Mouren // Bull. Soc. Chim. Biol (Paris). 1965, 47 (12).-p. 2207-2217.

6. Keller P. J. The protein composition of human pancreatic juice Text. / P. J. Keller, B. J. Allan // J. Biol. Chem. 1967 jan 25; 242. - p.281 - 287.

7. Prahl J. W. Pancreatic enzymes of the spiny Pacific dogfish. I. Cationic chymotripsi-nogen and chymotrypsin Text. / J. W. Prahl, H. Neurath // Biochemistry. 1966 Jun; ■5(6).-p. 2131 -2346.

8. Zendrian E. N. Distributions of pancreatic ribonuclease, chymotrypsin, and trypsin in vertebrates Text. / E. N. Zendrian, E. A. Barnard // Arch. Biochem. Biophys. 1967 Dec; 122 (3). -p.699 - 713.

9. Buck F. F. Some properties of human trypsin Text. / F. F. Buck, M. Bier. F. F. Nord122

10. Arch. Biochem. Biophys. 1962 Sep; 98. - p. 528 - 530.

11. Buck F. F. On the mechanism of enzyme action. 73. Studies on trypsins from beef, sheep and pig pancreas Text. / F. F. Buck, A. J. Vithayathil, M. Bier, F. F. Nord // Arch. Biochem. Biophys. 1962 May; 97. - p. 417 - 424.

12. Vithayathil A. J. On the mechanism of enzyme action. LXXII. Comparative studies on trypsins of various origins Text. / A. J. Vithayathil. F. Buck, M. Bier, F. F. Nord // Arch, Biochem. Biophys. 1961 Mar: 92. - p. 532 - 540.

13. Zendrian E. N. Reactivity avidencc for homologies in pancreatic enzymes Text. / E. N. Zendrian, E. A. Barnard // Arch. Biochem. Biophys. 1967 Dec; 122 (3). - p. 714-718.

14. Robyt J. Multiple attack and polarity of action of porcine pancreatic alpha-amylase Text. / J. Robyt, D. French // Arch. Biochem. Biophys. 1970 Jun; 138 (2). - p. 662 - 670.

15. Thoma J. A. Plant and animal amylases Text. / J. A. Thoma, J. E. Spradlin, S. Dygert// The Enzymes, 3rd Ed., Vol. V: Hydrolysis (Sulfate Esters, Carboxyl Esters, Glycosides) and Hydration, ed. byP.D. Boyer. New York, Academic Press, 1971.-p. 115- 189.

16. Biochemica information Text. / Boehringer Mannhein GmbH. 1975. - 168 p.

17. French D. 3-Amylases / D. French // The Enzymes, 2nd edn (Boyer, P. D., Lardy H. and Myrbaeck K. eds.). New York, Academic Press, 1960. - Vol. 4. - p. 345 - 350.

18. Vallee B. L. Metal content of alpha-amylases of various origins Text. / B. L. Vallee, E. A. Stein, W. N. Sumerwell, E. H. Fisher // J. Biol. Chem. 1959 Nov; 234. - p. 2901 - 2905.

19. Verger R. Purification from porcine pancreas of two molecular species with lipase activity Text. / R. Verger R. G. H. de Haas, L. Sarda, P. Desnuelle // Biochem. Biophys. Acta. 1969; 188 (2). - p. 272 - 282.

20. Брокерхоф, X. Липолитические ферменты Текст. / X. Брокерхоф, Р. Дженсен;перевод с англ. канд. биол. наук Т. П. Левчук, Э. А. Малаховой, канд. биол. наук Э. А. Толосы. М.: Мир, 1978. - 396с.: ил.; 22 см. - Библиогр.: с.354 - 385. - 4400 экз.

21. Hatch F. Т. Correlation of amino-acid composition with certain characteristics of proteins Text. / F. T. Hatch //, Nature (London). 1965, may; 206. - p. 777 - 779.

22. Verger R. Contribution a Г etude. de la lipase pancreatique de pore. PhDThesis, Fac-ulte' des Sciences de Marseille (1970).

23. Brockerhoff H. A model of pancreatic lipase and the orientation of enzymes at interfaces Text. / H. Brockerhoff// Chem. Phys. Lipids. 1973 Apr; 10 (3). - p. 215 - 222.

24. Plummer Т. H. Isolation and characterization of the glycopeptides of porcine pancreatic lipases L-A and L-B Text. / Т. H. Plummer. L Sarda // J Biol Chem. 1973 Nov 25; 248 (22). - p.7865 - 7869.

25. Garner C. W. Porcine Pancreatic Lipase. A Glycoprotein Text. / C. W. Garner, L. C. Smith // J. Biol. Chem. 1972 Jan; 247 (2). - p. 561 - 565.

26. Jackson R. L. The Primary Structure of Porcine Pancreatic Ribonuclease. I. The distribution and sites of Carbohydrate attachment Text. / Jackson R. L., Hirs С. H. W. // J. Biol. Chem. 1970; 245. - p. 624 - 636.

27. Антонов, В. К. Химия протеолиза Текст. / В. К. Антонов — 2-е изд., испр. и доп.- М.: Наука, 1991. 504 е.: ил.; 24 см. - Библиогр.: с. 482 - 500. - 490 экз. -ISBN 5-02-004111-4.

28. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки Текст. / Т Дэвени, Я. Гергей: перевод с анг. канд. мед. наук А. Н. Маца. М.: Мир, 1976. - 364 е.: ил.; 22 см. -Библиогр.: с. 352 - 354.

29. Kaiser R. Chromatographic in der Gasphase. Bd. IV Quantitative Auswertung Text. / R. Kaiser // Bibliographische Institut, Mannheim. 1965. - p. 26 - 52.

30. Kaiser R. Chromatographie in der Gasphase. Bd. I. Gas-Chromatographie Text. / R. Kaiser // Bibliographische Institut, Mannheim. 1965. - p. 58 - 59.

31. Schroeder D. D. Chromatography of Trypsin and Its Derivatives. Characterization of a new active form of bovine trypsin Text. / D. D. Schroeder, E. Shaw // J. Biol. Chem. 1968 Jun; 243. - p. 2943 - 2949.

32. Charles M. Sur le Trypsinoge'ne et la trypsine de pore Text. / M. Charles. M. Rovery, A. Guidoni, P. Desnuelle // Biohim. Biophys. Acta. 1963 Jan 1; 69. - p. 115 - 129.

33. Travis J. The crystallisation and partial characterization of porcine trypsin Text. / J. Travis, I. E. Licncr//J. Biol. Chem. 1965 May; 240. - p. 1962 - 1966.

34. Деборин Г. А. Изменение хода протеолиза сывороточного альбумина трипсином при образовании комплексов фермента или субстрата с экстрадиолом Текст. / Г. А. Деборин, М. И. Быстрова, В.Ц. Иванова // Доклады Академии наук СССР. -1959.-е. 685.-е. 124.

35. Нортроп, Д. Кристаллические ферменты Текст. / Д. Нортроп, М. Кунитц. Р. Херриот; перевод с англ. Н. Е.Плотниковой и др. М.: Издательство иностранной литературы, 1950. - 346 е.: ил.; 22 см.

36. Desnuelle P. Chymotripsin Text. / P. Desnuelle // The Enzymes, Second Edition, Chapter 6 New York, London; Acad. Press, 1960; 4. - p. 93 - 118.

37. Desnuelle P. Trypsin Text. / P. Desnuelle // The Enzymes, Second Edition, Chapter 6-New York, London; Acad. Press, 1960; 4.-p. 119-132.

38. Lazdunski M. E"tude structurale du trypsinoge'ne et la trypsine. Les diagrammes d'e'tat Text. / M. Lazdunski. M. Delaage// Biochim. Biophys. Acta. 1967 Aug 15; 140 (3).-p. 417-434.

39. Lazdunski M. Sur la morphologie des trypsines de pore et de boeuf. E4ude des de'naturations reversibles Text. / M. Lazdunski, M. Delaage // Biochim. Biophys. Acta.- 1965 Sep 20; 105 (3). p. 541 - 561.

40. Delaage M. Trypsinogen, trypsin, trypsin-substrate and trypsin inhibitor complexes in urea solution Text. / M. Delaage, M. Lazdunski // Europ. J. Biochem. - 1968 Apr; 4 (3).-p. 378-384.

41. Delaage M. Physico-chemical properties of bovine chymotrypsinogen В. A comparative study with trypsinogen and hymotrypsinogen A Text. / M. Delaage, J. P. Abita, M. Lazdunski // Europ. J. Biochem. 1968 Jul; 5 (2). - p. 285 - 293.

42. Steglish W. 4-substituted 2-trifluormethyl-4-trifluoracetylmethylene-oxazolidone-(5) and conversion products Text. / W. Steglish, V. Austel // Chem. Ber. 1967; 100 (2). -p. 547 - 554.

43. Biemann K. Separation of peptide derivatives by gas chromatography combined with the mass spectrometric determination of the amino acid sequence Text. / K. Biemann, W. Vetter // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1960; 3 (6). - p.578 - 584.

44. Gruetzmacher H. F Mass-spectrometric studies, XIV. Effect of aromatic amino acids on electron impulse fragmentation of N-acetyl peptides / H. F. Griitzmacher. К Heyns //Justus Liebigs Ann Chem. 1966 Oct; 698. - p. 24 - 33.

45. Fujioka M. Purification and properties of serine hydroxymethylase from soluble and mitochondrial fractions of rabbit liver Text. / M. Fujioka // Biochim. Biophys. Acta. — 1969; 185 (2). -p.338 — 349.

46. Hein G. E. Steric Course and Specificity of -Chymotrypsin-catalyzed Reactions Text. / G. E. Hein, C. J. Neimann // Amer Chem. Soc. 1962; 84 (23). - p. 4487 - 4494.

47. Tietz F. Release of terminal S-(beta- aminoethyl)-cysteine residues by Carboxypepti-dase В Text. / F. Tietz, J. A. Gladner, J. E. Folk // Biohem. Biophys. Acta. 1957 Dec: 26 (3). - p. 659.

48. Folk J.E. Carboxypeptidase В. III. Specific Esterase Activity Text. / J. E. Folk, J. A. Gladner // Biohem. Biophys. Acta. 1959 Jan; 33 (2). - p. 570 - 572.

49. Sokolovsky M., Eisenbach L. Porcine carboxypeptidase B. Arsanilazocarboxypepti-dase: spectral and functional consequences of modification of tyrosine-248 Text. / M.

50. Sokolovsky, L. Eisenbach // Eur. J. Biochem. 1972 Feb; 25 (3). - p. 483 - 490.

51. Folk .Т.Е. Carboxypeptidase В. I. Purification of the zymogen and specificity of the enzyme Text. / J. E. Folk, J. A. Gladner //. J. Biol. Chem. 1958 Mar; 231 (1). - p. 379 - 391.

52. Clark E. I. KINETIC PARAMETERS. The Kinetics of Carboxypeptidase В Activity Text. / Edite Clark. Wolff, E. W. Schermer, J. E. Folk. I. // J. Biol. Chem. 1962. -Vol. 237. - № 10. - p. 3094 - 3099.

53. Мосолов, B.B. Протеолитические ферменты Текст. / B.B. Мосолов. М.: Наука, 1971. - 414 е.: ил.; 22 см. - Библиограф.: с. 313 -401. - 2700 экз.

54. Ambler R. P. Enzymic hydrolysis with carboxypeptidases Text. / R. P. Ambler // In: Meth. Enzymol. -New York; London: Acad, press, 1967. vol. 11. - p. 155 - 166.

55. Plummer Т. H. Evidence for Tyrosine at the Active Centre of Bovine Carboxypeptidase В Text. / Т. H. Plummer, Jr. and William B. Lawson // J. Biol. Chem. 1966 Apr; 241(7).-p. 1648- 1650.

56. Zisapel N. Metallocarboxypeptidases: a cadminiumcarboxypeptidase В with peptidase activity Text. / N. Zisapel, M. Sokolovsky // Boichem. Biophts. Res. Communs. -1973 Aug 6; 53 (3). p. 722 - 729.

57. Folk J. E. Carboxypeptidase В. IV. Purification and characterization of the porcine enzyme Text. / J. E. Folk, K. A. Picz, W. R. Carroll, I. A. Gladner // J. Biol. Chem. -1960 Aug; 235. N 8. - p. 2272 - 2277.

58. Schmid M. Structure of carboxypeptidase В at 2-8 A resolution Text. / M. Schmid, J. R. Herriott // J. Mol. Biol. 1976 May 5; 103 (l).-p. 175- 190.

59. Bradshaw R. A. Consideration of the concept of structural homology as applied to bovine carboxypeptidases A and В Text. / R. A. Bradshaw, H. Neurath, K. A. Walsh // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1969 Jun; 63 (2). - p. 406 - 411.

60. Folk J. E. The Kinetics of Carboxypeptidase В Activity. Kinetic parameters of the cobalt and cadmium enzymes Text. / J. E. Folk, E. C. Wolff, E. W. Schirmer // J. Biol. Chem. 1962 Oct. - Vol. 237. - № 10. - p. 3100 - 3104.

61. Neurath H. Carboxypeptidases A and В Text. / Neurath H. //The Enzymes (Boyer P. D. Lardy H. A., Myrback K„ Eds.). New York; London: Acad, press, 1960. - 4. - p. 11 - 36.

62. Wintersberger E. A zink-binding thiol group in the active center of carboxypeptidase Text. / E. Wintersberger, H. Neurath, Т. I. Coombs, В. I. Vallee // Biochemistry- 1965 Aug; 4 (8). — p. 1526- 1532.

63. Titani К. A. Amino acid sequence of bovine carboxypeptidase В Text. / K. A. Ti-tani, L. N. Ericsson, K. A. Walsh, H. Neurath // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975 May; 72 (5).-p. 1666- 1670.

64. Ambler R. P. Carboxypeptidases A and В Text. / R. P. Ambler // Methods in Enzy-mology. New York; London: Acad. Press, 1972. - vol. 25. - p. 262 - 272.

65. Findlay D. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonucle-ase. 4. The activity in inert organic solvents and alcohols Text. / D. Findlay, A. P. Mathias, B. R. Rabin // Biochem. J. 1962. - v. 85, part 1. - p. 134 - 139.

66. Meadow D. H. Nuclear magnetic resonance studies of the structure and binding sites of enzymes. I. Histidine residues Text. / D. H. Meadow, J. L. Markley, J. S. Cohen, O. Jardetsky // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 1967 Oct; 58 (4). - p. 1307 - 1313.

67. Crestfield A. M. On the Preparation of Bovine Pancreatic Ribonucleasc A Text. / A. M. Crestfield, W. H. Stein, S. Moore // J. Biol. Chem. 1963 Feb; 238. - p. 618 - 621.

68. Kenkare U. W. The histidyl residues in ribonuclease-S. Photooxidation in solution and in single crystals; the iodination of histidine-12 Text. / U. W. Kenkare, F. M. Richards // J. Biol. Chem. 1966 Jul 10; 241 (13). - p. 3197 - 3206.

69. Weil L. Photooxidation of crystalline ribonuclease in the presence of methylene blue Text. / L. Weil, T. S. Seibles // Arch. Biochem. Biophys. 1955 Feb; 54 (2). - p. 368 - 377.

70. Richards F. M. The preparation of subtilisn-modified ribonuclease and the separation of the peptide and protein components Text. / F. M. Richards, P. J. Vithayathil // J. Biol. Chem. 1959 Jun; 234 (6). - p. 1459 - 1465.

71. Vithayathil P. J. Modification of the Methionine Residue in the Peptide Component of Ribonuclease-S Text. / P. J. Vithayathil, F. M. Richards //J. Biol. Chem. 1960 Aug; 235.-p. 2343-2351.

72. Richards F. M. Bovine pancreatic ribonuclease Text. / F. M. Richards, H. W.Wyckoff // In: The Enzymes, 3rd edn (Boyer P. D., ed.). Academic Press; New York, 1971. - Vol. 4. - p. 647 - 806.

73. Hirs С. H. Dinitrophenyiribonucleases Text. / С. H. Hirs // Brookhaven Symp. Biol. 1962 Dec; 15.-p. 154- 183.

74. Deavin A. Mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease Text. / A. Deavin, A. P. Mathias, B. R. Rabin // Biochem. J. 1966 Oct: 101(1). - p. 14 - 16.

75. Findlay D. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease Text. / D.Findlay, D. G. Herries, A. P. Mathias, B. R. Rabin, C. A. Ross // Nature (London). 1961 May 27: 190. - p. 781 - 784.

76. Kartha G. Tertiary structure of ribonuclease Text. / G. Kartha, J. Bello, D. Harker // Nature. 1967 Mar 4; 213 (5079). - p. 862 - 865.

77. Wyckoff H. W. The Structure of Ribonuclease-S at 3.5 A Resolution Text. / II. W. Wyckoff, K. D. Hardman, N. M. Allewell, T. Inagami, L. M. Johnson, F. M. Richards // J. Biol. Chem. 1967 Sep; 242. - p. 3984 - 3988.

78. Roberts G. C. The mechanism of action of ribonuclease Text. / G. C. Roberts. E. A. Dennis, D. H. Meadows, J. S. Cohen, O. Jardetzky // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 1969 Apr: 62 (4).-p. 1151 - 1158.

79. Wang J. H. Facilitated proton transfer in enzyme catalysis. It may have a crucial role in determining the efficiency and specificity of enzymes Text. / J. H. Wang // Science.- 1968 Jul 26; 161 (839).-p. 328-334.

80. Witzal I I The Function of the Pyrimidine Base in the Ribonuclease Reaction Text. / H. Witzal // Progress in Nucleic Acid Research and Molccular Biology. 1963, v. 2. - p. 221 -258.

81. Электрохимические основы электрофореза. Троицкий Г. В. Электрофоретиче-ские методы анализа белков. Новосибирск, Наука, 1981

82. Richards F. М. Structure and Activity of Ribonuclease Text. / F. M. Richards // Structure and Activity of Enzymes. — Academic Press, London, 1964.

83. Kartha G. Tertiary structure of ribonuclease Text. / G. Kartha, J. Bello, D. Marker // Nature. 1967 Mar 4; 213 (5079).-p. 862-865.

84. Richards F. M. On the enzymic activity of subtilisin modified ribonuclease Text. / F. M. Richards //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1958 Feb; 44 (2). - p. 162 - 166.

85. Wilcox P. E. The molccular weight of (arfa)-chymotrypsinogen .Text / P. E. Wilcox, J. Kraut, R. D. Wade. H. Neurath // Biochim. Biophys. Acta. 1957 Apr; 24 (1). -p. 72-78.

86. Schwert G. W. The molecular size and shape of the pancreatic proteases. II. Chy-motrypsinogen Text. / G. W. Schwert // J. Biol. Chem. 1951 Jun; 190 (2). - p. 799 - 806.

87. Gutfreund H. Osmotic pressure of solutions of trypsin and trupsin compounds Text. / H. Gutfreund //Trans. Faraday Soc. 1954; 50. - p. 624 - 628.

88. Anderson E. A. Homogeneity and the electrophoretic behaviour of some proteins. II. Reversible spreading and steady-state boundary criteria Text. / E. A. Anderson, R. A. Alberty // J. Phys. Colloid Chem. 1948; 52 (8). - p. 1345 - 1364.

89. Kubacki V. Electrophoresis and solubility of chymotrypsinogen В and chymotrypsin В Text. / V. Kubacki, K. D. Brown, M. Laskowski // J. Biol. Chem. 1949 Aug; 180 (l).-p. 73-78.

90. Wilcox P. E. Amino acid composition on (arfa)-chymotrypsinogen, including estimation of asparagine and glutamine Text. / P. E. Wilcox, E. Cohen, W. Tan // J. Biol. Chem. 1957 Oct; 228 (2). - p. 999 - 1019.

91. Folk J. E. Chymotripsin С. I. Isolation of the zymogen and the active enzyme: Preliminary structure and specificity studies Text. / J. E. Folk, E. W. Schirmcr // J. Biol. Chem. 1965 Jan; 240 - p. 181 - 192.

92. Grateeos D. On the tow anionic chymotrypsinogens of porcine pancreas Text. / D.

93. Gratecos, О. Guy, M. Rovery, P. Desnuelle // Biochim. Biophys. Acta. 1969 Feb 4; 175 (1).-p. 82-96.

94. Schwert G. W. The molecular size and shape of the pancreatic proteases. 111. a-Chymotrypsin Text. / G. W.Schwert, S. Kaufman // J. Biol. Chem. 1951 Jun; 190 (2). -p. 807-816.

95. Marini M. A. The hydrogen ion equilibria of chymotripsinogen and a-chymotrypsin Text. / M. A. Marini, C. Wunsch // Biochemistry. 1963 Nov - Dec; 2. - p. 1454 - 1460.

96. Tietze F. Molecular-kinetic properties of crystalline trypsinogen Text. / F. Tietze // J.Biol. Chem. 1953 Sep; 204 (1). - p. 1 - 11.

97. Kay С. M. The molecular weight of trypsinogen Text. / С. M. Kay, L. B. Smillie, F. A. Hilderman // J. Biol. Chem. 1961 Jan; 236. - p. 118 - 121.

98. Cunningham L. W. Jr. Molecular-kinetic properties of crystalline diisoproiyl phosphoryl trypsin Text. / L. W. Jr. Cunningham // J. Biol. Chem. 1954 Nov; 211 (1). - p. 13 - 19.

99. Cunningham L. W. Moleular-kinetic properties of trypsin and related proteins Text. / L. W. Cunningham, F. Tietze, N. M. Green, H. Neurath // Disc. Faraday Soc. 1953; 13.-p. 58-67.

100. Green N. M. Proteolytic enzymes Text. / N. M. Green, H. Neurath // In "The Enzymes". -New York; Acad. Press, 1954. p. 1057.

101. Davie E. W. The terminal groups of the soy bean trypsin inhibitor Text. / E. W. Davie, H. Neurath // J. Biol. Chem. 1955 Feb; 212 (2) - p. 507 - 514.

102. Smillie L. В., Kay С. M. Abnormal tyrosine ionization and confrgurational changesof trypsinogen in alkaline solutions Text. / L. B. Smillie. С. M. Kay // J. Biol. Chem. -1961 Jan; 236.-p. 112-117.

103. Cunningham L. W., Jr. Molecular-kinetic properties of crystalline diiosopropyl phos-phoryl tripsin Text. /L. W. Cunningham // J. Biol. Chem. 1954 Nov; 211(1). - p. 13 - 19.

104. Sealock R. W., Laskowski M. Jr. Enzymatic replacement of the arginyl by a lysyl residue in the reactive site of soybean trypsin inhibitor Text. / R. W. Sealock, M. Laskowski Jr. // Biochemistry. 1969 Sep; 8 (9). - p. 3703 - 3710.

105. Bier M. On the mechanism of enzyme action. XL'VI. The effect of certain ions on crystalline trypsin and reinvestigation of its isoelectric point Text. / M. Bier, F. F. Nord // Arch. Biochem. Biophys. 1951 Sep; 33 (2). - p. 320 - 332.

106. Wintersberger E. Bovine pancreatic procarboxypeptidase В. I. Isolation,propertiesand activation Text. / E. Wintersberger, D. I. Cox, H. Neurath // Biochemistry. 1962 Nov; l.-p. 1069- 1078.

107. Cox D.J. Bovine pancreatic procarboxypeptidase В. II Mechanism of activation Text. / D. J. Cox, E. Wintersberger,H.Neurath//Biochemestry.- 1962Nov; l.-p. 1069- 1078.

108. Dcsnuclle P. Recent data on exocrine pancreas enzymes Text. / P. Desnuelle // С R Seances Soc Biol Fil. 1972 Nov 9; 166 (2). - p.238 - 253.

109. Granger M. Limited action of trypsin on porcine pancreatic amylase: characterizationof the fragments Text. / M. Granger, B. Abadie, G. Marchis-Mouren //FEBS Lett. .1975 Aug 15; 56 (2). -p.189 193.

110. Cozzone P. Characterization of porcine pancreatic isoamylases: separation and amino acid composition Text. / P. Cozzone, L. Pasero, G. Marchis-Mouren // Biochim Biophys Acta. 1970 Mar 31; 200 (3). - p. 590 - 593.

111. Caldwell G. A. Treatment of mild knock knees and pronated feet in childhood; results in 63 cases Text. / G. A. Caldwell, R. L. Shorkey, T. L. Duncan // New Orleans Med Surg J. 1952 Feb; 104 (8). - p. 304 - 308.

112. Калинин, Ф. JI. Справочник по биохимии Текст. / Ф. Л. Калинина, В. П. Лобоа. В. А. Жуков. Киев: Наукова Думка. 1971. - 1014 е.; 22 см.

113. Ilirs С. II. Studies on structure of ribonuclease Text. / С. H. Hirs, S. Moore. W. H. Stein// Fed Proc. 1956 Jul; 15 (2). - p. 840 - 848.

114. Worlhington Enzyme Manual Text.: Methods in Enzymology / Worthington Biochemical Corporation Freehold. New Jersey, 1965. - 176 c. - 29 см.

115. Ramachandran S. Studies on lipase. Isolation and purification of a high molecularweight pancreatic lipase Text. / S. Ramachandran, Y. K. Yip, S. R. Wagle // Eur J Biochem. 1970 Feb; 12 (2).-p. 201 -207.

116. Gidez L. I. Purification of rat pancreatic lipase Text. / L. I. Gidez // J. Lipid Res. -1968 Nov; 9 (6). p. 794 - 798.

117. Vendermeers A. Purification, potential enzymatic activity and amino acid composition of chymotrypsinogen and trypsinogens from rat pancreas Text. / A. Vendermeers, J. Christophe //, Biochem. Biophys. Acta. 1969 Aug 12; 188 (1). - p. 101 - 112.

118. Downey W. K. Gel filtration applied to the study of lipases and other esterases Text. / W. K. Downey, P. Andrews // Biochem. J. 1965 Mar. - v. 94. - p. 642 - 650.

119. Gelotte B. Separation of Pancreatic Enzymes by Gel Filtration Text. / B. Gelotte, Acta Chem. Scand. 1964; 18. - p. 1283 - 1291.

120. Sarda L. The behavior of pancreatic lipase on sephadex. A method for purifying and determining the molecular weight of this enzyme Text. / L. Sarda, M. F. Maylie", J. Roger, P. Desnuelle // Biochim. Biophys. Acta. 1964 Jul 8; 89. - p. 183 - 185.

121. Schotz M. C. Effect of nutrition on species of lipoprotein lipase Text. / M. C. Schotz, A. S. Garfinkel // Biochim. Biophys. Acta. 1972 Aug 11; 270 (4). - p. 472 - 478.

122. Garner C. W. A convenient purification of porcine pancreatic lipase free of proteolytic activity Text. / C. W. Garner, L. C. Smith // J. Arch. Biochem. Biophys. 1970. oct; 140 (2).-p. 503 -507.

123. Melius P. Utilization of 1-butanol for the preparation of pancreatic lipase Text. / P. Melius, W. S. Simmons // Biochim Biophys Acta. 1965 Sep 20; 105 (3). - p. 600 - 602.

124. Pat. 1454983 Great Britain, Int. CI.2 С 07 G 7/026. Process of manufacturing pan-creatin enzyme preparations rich in lipase Text. / applicant A. Nattermann&Cie GmbH (Germany).-№7246/75; filed 20.02.1975; complite 10.11.1976. 5 p.

125. Pat. 1533537 Great Britain, Int. CI.2 С 07 G 7/026. Lipase preparation Text. / applicant Nattermann&Cie GmbH (Germany). № 18930/77; filed 05.05.1977; complite 29.11.1978.-8 p.

126. Marchis-Mouren G. Purification of hog pancreatic lipase Text. / G. Marchis-Mouren,

127. Sadra, P. Desnuelle // Arch. Biochem. Biophys. 1959 Jul; 83 (1). - p. 309 - 319.

128. Benzonana G Further studies on pig pancreatic lipase Text./ G. Benzonana. B. En-tressangles, G. Marchis-Mourer, L. Parsero, L. Sarda, P. Desnuelle // Metab. Physiol. Significance Lipids, Proc. Advan. Stude Course, 1963. p. 141 - 154.

129. А. с. 412248 СССР, М. Кл.2 С 12 D 13/10. Способ выделения протеолитический ферментов Текст. / Кирсе В. Г., Скуиня С. Я., Радзинь Р. Я., Пинне А. А., Ирген А. М., Эвирбуле Р.Э. 1737418/28-13; заявл. 13.01.1972; опубл. 05.10.1977, Бюл. №37.-3 с.

130. Branter J. H. Fractionation of Proteolytic Enzymes by Affinity Chromatography on Sepharose Aminocaproyl Proflavin Text. / J. H. Branter, R. G. Medicus, R. A. McRorie // Journal of Chromatography A. 1976, v. 129. - p. 97 - 105.

131. А. с. 1406162 СССР, МКИ4 С 12 N 11/14, // В 01 J 20/10. Способ получения иммобилизованного а-хнмотрипсина Текст. / Гиманова И. М., Постнов В.Н. № 4136790/28-13; заявл. 21.10.1986; опубл. 30.06.1988, Бюл. № 24. - 4 с.

132. Folk J.F. A new pancreatic carboxypeptidase Text. / J.F Folk // J. Amer. Soc. -1956; 78 (14). p. 3541 - 3542.

133. Kycia I. H. Primary structure of bovine carboxypeptidase В. I. Preparation of enzyme from pancreatie juice Text. /1. H. Kycia, M. Elzinga, N. Alonzo, С. H. W. Hirs // Arch. Biochcm. And Biophys. 1968 feb; 123 (2). - p. 336 - 342.

134. A. c. 1833427 СССР, МКИ5 С 12 N 9/64. Способ получения карбоксипептидазы В Текст. / Стекольников Л. И., Рыльцев В. В. № 4946818/13; заявл. 19.06.1991; опубл. 07.08.1993, Бюл. № 29. - 5 с.

135. Pat. 3625829 United States, Int. CI. С 07 G 7/02. Purification of carboxypeptidase В Text. / Gunther Schmidt-Kastner, Johann Putter; Assignee Farbenfabriken Bayer Akti-engesellschaft (Germany).-№ 780903; Filed 3.12.1971; patentad 7.12.1971.-4 p.

136. А. с. 1769763 СССР, МКИ5 С 12 N 11/00. Способ получения иммобилизованной карбоксипептидазы В Текст. / Ласло Борошш, Эржебет Дала, Аранка Кишш, Бела Сайани и Арпад Тецл (HU). № 4028800/13; заявл. 13.01.1987; опубл. 15.10.1992, Бюл.№38.-6 с.

137. Pat. 1328202 Great Britain, Int. CI. С 07 G 7/02. Improvements in the manufacture of pancreatin Text. / Fritz Fabian; applicant Union International Co LTD. № 30600/69; filed 17.06.1969; complite 30.08.1973. - 3 p.

138. Pat. 3956483 Unitad States, Int. CI.2 A 61 К 37/48. Preparing pancrcatin Text. / Sheldon H. Lewis; Assugnee Wilson Pharmaceutical Chemikal Corporation. № 144230; filed 17.05.1971; Pub. Date 11.05.1976. - 5 p.

139. Pat.l274604 Great Britain, Int. CI. A 61 К 19/02. Pancreatin composition and method of preparation Text. / Sheldon H. Lewis (US); applicant Wilson Pharmaceuti-cal&Chemical Corp.(US). -№ 4942/71; Filed 18.02.1971; complite 17.05.1972. 5 p.

140. Kunitz M. Isolation from beef pancreas of a crystalline protein possessing ribonucle-ase activity Text. / M. Kunitz // Science. 1939 Aug 4; 90 (2327) - p. 112 - 113.

141. McDonald M. R. Ribonucleascs Text. / M. R. McDonald // Methods in cnzymology (S. P. Colowick and N. O. Kaplan.,). New York-London: Acad. Press; 1955, v. 2. - p. 427 - 436.

142. Практикум по биохимии Текст. : учеб. пособие / Под ред. С. Е. Северина, Г. А.

143. Соловьёвой. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 509 е.: ил.; 30 см. -ISBN 5-211-00406-Х.

144. Полыгина, Г.В. Определение активности ферментов. Справочник Текст. / Г. В. Полыгина. В. С. Чередниченко, Л. В. Римарева. М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 е., ил.; 20 см. - ISBN 5-94343-044-Х.

145. Sigma quality control test procedure, Enzymatic Assay of LIPASE (EC 3.1.1.3) Режим доступа: hUp://\vww.sigmaaldrich.com/sigma/enzvme%20assav/10382enz.pdf

146. ТУ 6-09-10-452-78. Рибонуклеаза, лиофилизированная /из поджелудочной железы крупного рогатого скота / К. Ф. 2. 7. 7. 16/ марки «А». Технические условия Текст. -Введ. 1978.01.07. 12 с.

147. Шпаков, П. С. Статистическая обработка экспериментальных данных:Учеб. пособие / П. С. Шпаков, В. Н. Попов. М.:Изд-во МГГУ, 2003. - 268 с.:ил.;22 см. -Библиогр.: с. 253. - ISBN 5-7418-0275-3.

148. Сайт ЗАО НТЦ "Владипор" Электронный ресурс.: база содержит информацию о выпускаемой продукции, контакты. Режим доступа: http://wyvw.vladipor.ru. -Загл. с экрана. - Яз. рус., англ.

149. Мулдер, М. Введение в мембранную технологию Текст. / М. Мулдер; перевод с англ. канд. хим. Наук А. Ю. Алеитьева, канд. хим. Наук Г. П. Ямпольстсой. М.: Мир, 1999. - 513 е.: ил.; 22 см. - 3000 экз. - ISBN 5-03-003114-6.

150. Скоупс, Р. Методы очистки белков Текст. / Р. Скоупс; пер. с англ. проф. В. К. Антонова. М.: Мир, 1985. - 358 е.: ил.; 22 см. - Библиогр.: с. 343 - 352. - 4500 экз.

151. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот Текст. / Л. А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 е.: ил.; 22 см. - 8500 экз.

152. Деже Сомбатхейи. Гель-электрофоретические приборы и наборы химреакгивов завода «Реанал» Модель 69 Текст. / Деже Сомбатхейи, Иван Надъ, Михай Курц. -Будапешт, 1974.-36 е.: ил.; 24 см. -Библиогр.: с. 31 -35.

153. Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование Текст. практическое пособие / Л. А. Остерман. -М.: Наука, 1981. 228 е.: ил.; 22 см. - 8000 экз.

154. Кочетов. Г. А. Практическое руководство по энзимологии Текст.: Учебное пособие для студентов биологических специальностей университетов / Г. А. Кочетов. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. Школа, 1980. - 272 е.: ил.; 22 см. - 9000 экз.

155. Уильяме, Б Методы практической биохимии Текст. / Б. Уильяме, К. Уилсон; перевод с анг. Под редакцией акад. С. Е. Северина, канд. Биол. Наук А. Д, Виноградова.-М.: Мир, 1978.

156. Zvyagilskaya R.A. Characterization of the Yarrowia lipolytica proton and sodium -coupled phospate transport systems at acidic and alkaline grouth conditions Text. / R. A.Zvyagilskaya. P. Allard, B. L. Persson // IUBMB life, 2000, 49 - c. 138 - 144.

157. Градова, H. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии Текст. / Н. Б. Градова, Е. С. Бабусенко. М.: Дели принт, 2001. - 131 е.: ил.: 20 см. - 1000 экз. -ISBN 5-94343-009-1.

158. Свойства органических соединений Табл.. Справочник / Под ред. кандидата хим. наук А. А. Потехина. JL: Химия. 1984. - 520 е.; 22 см. - 36000 экз.

159. Пономарёв, В. Д. Аналитическая химия Текст. : Учебник для фармац. и фак. мед. ин-тов. В 2 ч. 4.1. Теоретические основы. Качественный анализ. / В. Д. Пономарёв. М.: Высшая школа, 1982. - 288 е.: пл.; 22 см. - 50000 экз.

160. Баурина М. М. Разработка основ тсхнолгии получения панкреатического гид-ролизата дрожжевой РНК Текст. : дис. канд. хим. наук : 03.00.23 : защищена 22.05.2007 : утв. 24.08.2007 / Баурина Марина Михайловна. М., 2007. - 120 с. -Библиогр.: с.

161. Дытнерский, Ю. И. Баромембранные процессы. Теория и расчёт Текст. / Ю. И. Дытнерский. М.: Химия. 1986. - 272 е.; 22 см. - 4000 экз.

162. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии Текст. : в 3 ч. Ч. 2. / Дж. Бейли, Д. Оллис; перевод с англ. А. А. Кирюшкина. М.: Мир, 1989. - 590 е.: ил.; 22 см. -7500 экз.-ISBN 5-03-001029-7.

163. Суясов Н.А., Шакир И.В., Панфилов В.И. Лапин Е.И. Биотехнологический путьпереработки жиросодержащих отходов// Труды XVIII международной конференции «Окружающая среда для нас и будущих поколений». Самара, 2003. - с. 92 - 93.

164. Андреев, А. А., Производство кормовых дрожжей Текст. / А. А. Андреев, JI. И. Брызгалов //. Изд. 2-е. М., «Лесная промышленность», 1970. - 296 с.

165. Биотехнология Текст.: Учебное пособие для вузов в 8 кн. / Под ред. Н С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 5. Проиводство белковых веществ/ В. А. Быков, М. Н, Манаков, В. И, Панфилов, А. А, Свитцов, Н. Т. Тарасова. М.; Высш. Шк., 1987. -142 с: ил.

Информация о работе

Дудникова, Елена Андреевна
кандидата технических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы