Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты поджелудочной железы кур

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты поджелудочной железы кур"

РГ6 од

На правах рукописи

Нечепуренко Вячеслав Викторович

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КУР

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Краснодар - 1998

Работа выполнена в Кубанском государственном университете

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, докто

биологических наук, профессор Проскуряков М.Т.

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Скорикова Ю.Г.

кандидат биологических наук

Федорченко О.В.

Ведущая организация : Институт биохимии РАН им. А.Н. Баха

Защита состоится « 25 » июня 1998 г. в 14 час. на заседаш диссертационного совета К 063.40.03. Кубанском государственно технологическом университете по адресу : 350072, г. Краснодар, у Московская, 2, КубГТУ, корпус А, конференц - зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «¿5'» мая 1998 г.

Отзыв на автореферат просим направлять по адресу: 350072, г. Краснодар ул. Московская, 2, КубГТУ, ученому секретарю.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук,

доцент

Минакова А.1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Протеолитическке ферменты находят самое разнообразное применение в химии для анализа химического состава неизвестных белков, а также белковых гормонов, в процессинге рекомбннантных белков (Sanger, Thomson, 1953; Hirs et a]., 1960; Вольф, Рансберг, 1976; Ткачук и сотр., 1997), в медицине как противовоспалительные агенты, фибринолитические, неполитические, канцеростзтические и цитотохсическне вещества, в заместительной терапии при нарушениях пищеварения (Вольф, Рансберг, 1976; Веремеенко, 1971), в про?,шшленности: в дубильных процессах, для обработки шса, для получения белковых гидролизатоз и питательных сред, вакцин (Вольф, Рансберг, 1976; Ратушный, 1976).

Однако, серьезным тормозом в широком применении ферментных препаратов является их дефицит и высокая стоимость. Традиционным источником получения трипсина н хнмотрипсшга является поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней, ресурсы которых ограничены, так как основная масса их используется для выработки гормональных и ферментных медицинских препаратов . В связи с этим актуальным является поиск дополнительных источников ферментного сырья.

Известно, что птица обладает большей интенсивностью роста в сравнении с другими сельскохозяйственными животными, что обеспечивается наличием в организме системы биологически активных веществ. Содерзкание некоторых из них в расчете на единицу массы значительно выше, чем у других животных. Ц. Батоев (1993) отмечает необычайно высокую активность,амилазы, липазы и протеаз в панкреатическом соке у кур, уток и гусей в сравнении с млекопитающими. Кроме того, известные нам сведения о протенназах поджелудочной железы кур, свидетельствует о том, что последняя содер-.хит несколько изоферм трипсина и химотрипсина. С.А. Ryan, JJ. Ciary, Y.

Tomimatsu (1965) исследовали свойства одного химотрипсина. R. Zelicson, R. Eiliam, R. Kulka (1971) методом ионообменной хроматографии исследовал количество изоферментов. В 1990 году М.Н. Pubols используя также ионообменную хроматографию, определял соотношение пищеварительных ферментов, М.Т. Проскуряков (1973) исследовал главные формы трипсина и химотрипсина. Отмечая теоретическую и практическую ценность работ перечисленных авторов, а также принимая -во внимание данные о существовании нескольких изоформ трипсина и химотрипсина можно отметить, что необходимо их комплексное исследование. Кроме этого, изучение строения и свойств гомологичных ферментов, выделенных из разных источников, дает дополнительные сведения об их строении и эволюции (Колодзейская, Пивненко, 1988), и с этой точки зрения курица представляется нам интересным объектом исследования, как представитель класса птиц.

Анализ литературы по - выделению, свойствам и применению протеолитических ферментов различных животных показал, что родственные ферменты различались по специфической активности, стабильности и другим свойствам.

Следовательно, изучение свойств протеолитических ферментов является основой их рационального практического использования в промышленности и медицине.

A.C. Ратушный (1976) отметил высокую эффективность ферментов экстракта поджелудочной железы кур как размягчителен жесткого мяса по отношению к соединительнотканным белкам мяса.

Это, а также факт дефицита ферментного сырья побудили нас к данной работе.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось исследование физико-химических свойств всего спектра изоформ протеолитических ферментов кур и изучение возможности получения ферментного препарата из . поджелудочной железы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка протеолитических ферментов га поджелудочной железы кур в гомогенном состоянии (трипсина, химотрипсина, коллагеназы и эластазы);

2. Исследование физико-химических свойств этих протеолитических ферментов (молекулярная масса, количество изоформ и изоточки, оптимумы стабильности и активности, взаимодействие с ингибиторами);

3. Сравнение протеолитических ферментов кур с соответствующими ферментами других животных крупного рогатого скота и других животных;

4. Получение ферментного препарата и изучение его свойств в плане возможности практического применения.

Научная новизна. Впервые методом изоэлехтрофокусирования проведено исследование всего спектра нзоферментов трипсина и химотрипсина поджелудочной железы кур. Разработаны способы получеши в гомогенном состоянии трех химотрипсинов и одного трипснна с использованием ионообменной и аффинной хроматографии. Изучены основные физико-химические свойства ферментов. Найдены значения молекулярных масс всех изучаемых ферментов, рассчитаны оптимумы рН стабильности и активности. Проведено сравнительное изучение специфической активности выделенных ферментов и соответствующих кристаллических ферментов быка. Дан сравнительный анализ взаимодействия с синтетическими и природными ингибиторами ферментов кур и кристаллических ферментов быка. Впервые установлено, что протеиназа кур с изоточкой 9,9 ± 0,05 помимо химотрипсиновой и эластолитической активности обладает и мощной коллагенолитичйской активностью.

Теоретическая и практическая ценность работы. В рабЪте показано, что по ряду свойств протеолитические ферменты поджелудочной железы ¡сур занимают промежуточное положение между аналогичными свойствами протеиназ млекопитающих и рыб. К этим свойствам относятся: оптимумы рН

активности и стабильности, удельная активность, характер взаимодействия с ингибиторами.

Разработана лабораторная схема получения комплексного ферментного препарата из поджелудочной железы кур.

Проведено сравнение препарата с кристаллическими трипсином и химотрипсином быка. Препарат обладает высокой химазной, протеолитической, эластолитической и коллагенолитической активностью. По химазной и протеолитической активности препарат превосходил бычий кристаллический химотрипсин.

Наличие высокой эластолитической и коллагенолитической активности поджелудочной железы является предпосылкой для использования в обработке жестких сортов мяса с целью повышения качества.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. По ряду физико-химических свойств протеолитические ферменты кур занимают промежуточное положение между ферментами рыб и млекопитающих;

2. Трипсин и химотрипсин поджелудочной железы кур по данным ингибиторного анализа и при прямом сравнении обладают большей молярной активностью, чем ферменты млекопитающих;

3. Поджелудочная железа кур является перспективным сырьем для получения как ферментного препарата протеолитического действия, так и отдельных протеолитических ферментов;

4. Полученный препарат по ферментному составу является комплексным и обладает высокой протеолитической, химазной, эластолитической и коллагенолитической активностью.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, июль 1996 г.), на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем

южных и центральных регионов России" (Краснодар, 1997), на 4 симпозиуме "Химия протеолитнческих ферментов" (Москва, 21-23 апреля 1997 г.).

Публикация материалов. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания метериала и методов исследования, результатов, их обсуждения , заключен!«, выводов, списка литературы, включающего 251 наименование, в том числе 169 иностранных. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 31 рисунок.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служила поджелудочная железа 7-8 недельных цыплят - бройлеров.

При выделении и очистке ферментов кур использозали следующие методы: кислотная экстракция, фракционирование сульфатом аммония, гель-хроматогрзфию на сефадексе, аффинную хроматографию, изозлектрическую фокусировку в градиенте плотности сахарозы. Для определения чистоты использовали диск-электрофорез в полпакрнламидном геле.

Изоточки ферментов определяли методом изоэлектрического фокусирования, молекулярную массу - электрофорезом в полиакрил амндном геле с додецнлсульфатом натрия.

Активность ферментов определяли по природным и синтетическим субстратам: трипсин по казеину, по гидролизу И-бензоил-В, Ь -аргинин-п-шпроанилида (БАШ 1А); химотрипсин - по створаживанию мол очно-ацетатной смеси (МАС),' по гидролизу К'-сукциннл-Ь-фенилаланин-и-риггроанилнда (СФНЛ); зластазу по эластину; коллагеназу по азсколлагенуГ- ~

Концентрацию белка определяли методом Лоурн, а в процессе очистки по поглощению при >.=280 нм (А;И).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка пищеварительных ферментов из поджелудочной железы кур.

Экстракция, фракционное высаливание сульфатом аммония, обессоливание и лиофильная1 сушка были начальными этапами очистки протеолитических ферментов поджелудочной железы кур. Характеристика начальных этапов очистки, ферментов приведена в таблице 1. За единицу принята степень очистки ферментов в железе. Выход ферментов также оценивали по отношению к железе, количество единиц активности в которой принято за 100%.

В качестве экстрагирующей жидкости использовали, серную кислоту. Оптимальная концентрация составила 0,0725 н, так как при этом удельная активность ферментов в экстракте и скорость фильтрации максимальны. В экстракте мы обнаружили активность трипсина, активность химотрипсина, эластолитическую активность и коллагенолитическую активность. Из таблицы видно, что при сернокислой экстракции после фильтрации через складчатый фильтр выход ферментов составил для химотрипсина 73%, а для трипсина 66%.

Ферменты из экстракта осаждали кристаллическим сульфатом аммония при 0,6 насыщения. Степень очистки ферментов составила: для трипсина 4,4, для химотрипсина 3. Выход ферментов на этом этапе очистки составил по химазной активности 61%, по БАПАзной - 68%, по белку 22,5%.

Конечный выход составлял 10 - 15 г сухого вещества - из ] кг поджелудочной железы, содержащего весь спектр химотрипсинов и трипсина, присущий поджелудочной железе кур.

Начальная этапы очистки протсолитичсских ферментов из поджелудочной железы кур

Таблица I

Этап очистки Объем, мл Активность Белок, ед Удельная активность Степень очистки Выход, %

МАС, сд БАПНА, мкмолъ/ мин МАС, ед/ед БАПНА, мкчоль/мин/ ед МАС БАПНА МАС БАПНА Белок

Железа ¡000 18500 2160 140000 0.13 0.0154 1 1 100 100 100

Сернокислая экстракция 3300 16000 1800 133000 0.12 0.0135 0.92 1.37 81 33 82

Фильтрация 3100 13440 1454 109000 0.12 0.0133 0.92 1.37 73 65 78

Осадок 0-0.6 насыщения 45 12600 1323 31500 0.4 0.042 3 4.4 68 61 22.5

Надосадочлал жидкость 3600 450 90 76500 0.005 0.001 - - 2.4 4.14 55

Диализ 250 12000 1200 30400 0.4 0.04 3 4.1 65 58 21.7

Лиофильная сушка 15 11500 1150 30400 0.38 0.039 2.9 4 62 53 21.7

Перед очисткой отдельных ферментов до гомогенного состояния мы провели анализ ферментного состава полученого высола с помощью фракционирования методами гель-хроматографии (по молекулярной массе), изоэлектрической фокусировкой и ионообменной хроматографией (по заряду белков). .

При гель-хроматографии белков осадка на сефадексе G-75 "superfine" профиль элюции состоит из 5 четко дифференцированных белковых пиков . Ферментативной активностью обладали только элюаты второго и третьего пиков. Как видно из рис. 1 химазной активностью обладали второй и третий пики. Третий пик обладал также эластолитаческой и коллагенолитической активностями (не показано на рисунке).А пик БАПАзной активности трипсина находился между химотрипсиновыми пиками, правда все же ближе к первому. Последний химотрипсиновый пик совпадал с пиком эласто - и

Номер фракции (объем 5 ил)

Рис. 1. Гель - хроматография на сефадексе С -75 белков препарата. Колонка 1,9x75 см, злюирование 0,02 М ацетатным буфером рН4,2, содержащим 0,1 МЯаС1, со скоростью 12 мл/ч. Нанесено 400 ед белка, а) показаны белок, БАПАзная и химатая активности.

Степень очистки ферментов при использовании гель-хроматографии на

сефадексе СЗ-75 повышалась незначительно в сравнении с наносимым осадком.

При изоэлектрофокусировании осадка, мы обнаружили 4 пика химазной

активности химотрипсина с р1 4,6 ± 0,1, 5,6 ± 0,1, 6,9 ± 0,1 и 9,9 ± 0,05

(рис. 2). Белковый пик с изоточкой 9,9 ± 0,05, химазной активности

содержал эластолитическую (субстрат - эластин) и кодлггет.'йиштческую (субстрат - азоколлаген) и БАПАзную активность.

фржцмм {С$°Ь*1* 2.5 кг.)

Рис. 2. Изоэ.чектрофокусироека белког, осажденных га экстракта поджелудочной железы к)'Р сульфатом алшония при 0.6 насыщения. Колонка ¡.КЗ 8100-1. Начальное напряжение 300 вольт (3 часа), конечное напряжение 800 ссяът (30 часов). Градиент рН 3,5 • И.О. Нанесено 25 ед. белка

Применяя метод изоэлектрического фокусирования, нам удалось не только > определить изоточки ферментов и, следовательно, выявить количество изоформ ферментов, но и выяснить их соотношение. Однако, из-за денатурирующего действия высокого напряжения не удавалось существенно повысить удельную активность ферментоп.

Используя аналитическую хроматографию на катионо- и анионообменниках как и в случае изоэлеюгрического фокусирования мы обнаружили и разделили 4 изоформы химотрисина и 2 изоформы трипсина. Наилучшим ионообменником при фракционировании препарата оказался ДЭАЭ-тойопеарл.Отдиализованный осадок, растворенный в 0,015 М трис-НС1 буфере рН 8,5, содержащим 0,025 М ЫаС1, наносили на колонку с

" V

ионообменником. Результаты хроматографии представлены на рис.3. Элюат первого пика составляли белки, не адсорбирующиеся на сорбенте, так как они заряженны в данных условиях положительно. Он обладая химотрипсиновой,

эластазной, коллагеназной и трипсиновой активностями, которые соответствовали белковому пику фокусировки с изоточкой 9,9. При градиентном элюировании белков, адсорбировавшихся на ионообменнике, получено 6 пиков анионных белков (рис. 3 пики 2 - 6). Пик 2 обладал химазной активностью и соответствовал химотрипсину с р1 6.9. Пики 3 и 4 обладали также химазной активностью и принадлежали химотрипсинам с р! 5,6 и 4,7 соответственно. Пятый пик обладал трипсиновой (по БАПНА) активностью, которая как видно на рис. 3 сосредоточена в правой части пика. Элюат 6 пика не обладал активностью какой-либо из исследоваемых протеиназ.

«Я

о

I?

г е-г «

гI

- Активность хиы&припсина.вйил -ятивность трипсина мтопь/иинА/л ж 10 ■ Градиент №0

"Белое

- Активность элестазыед/ип

21 11 41 51 61

Номер фракции (объам 5 мл)

3

.4 5

Рис, 9. Хроматография препарата наДЭАЭ - тойопеаря. Колонка 1,4 х 12 см уравновешена 0,015 М трис - НС1 буфере рН 8,5, содержащим 0,025 М N00. Скорость ззюции 25 мл/ч. Градиент ЫаС10,025-0,2 М. Нанесено 200 ед. белка

Однако, полученные ферменты не были гомогенными по ..данным

электрофореза. Следовательно, была необходима дополнительная очистка.

Получение ферментов в гомогенном состоянии

Мы получили в практически гомогенном состоянии 4 химотрипсиноподобных фермента кур (с изоточками 6,9, 5,6 и 4,6, 9,9) и

мажорный трипсин. Для поисков условий очистки использовали данные изоэлектрофокусирозання и фракционирования ионообменной хроматографией. На рис. 4 представлена обздаа схема получети протеолитических ферментов поджелудочной железы кур.

минорный трипсин с р19,9

Рис. -I.Схема очистки протеолитических ферментов поджепудочной железы кур.

Экстракция, высаливание и препаративная хроматография на ДЭАЭ-тойопеарл при рн 9.0 были общими этапами очистки ферментов поджелудочной железы кур. Дальнейшая очистка химотрипсииоподобной протеиназы с р1 9.9 состояла из трех этапов: 1) гель-хроматография на сефадексе С-25; 2) ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе; 3) аффинная хроматография ка иммобилизованном утиным овомукоиде. В таблице 2 дана характеристика очистки химотрипсииоподобной протеиназы с р1 9.9. Выход фермента оценивали по отношению к железе, количество единиц активности в которой принято за 100%.

Таблица 2

Количественная характеристика очистки химотрипсиноподобной протеиназы ср19.9

Этап очистки Объем Белок, Активность по. Удельная Очистка, раз Выход,%

активность

МЛ ед МАС, ед Эластину, ед МАС ед./ед. Эластин ед./ед. МАС Эластин МАС Эластин

1. Жепаэа 21 3035 410 700 0.135 0.23 1 1 100 100

2.Экетракт 75 2ВВ0 345 575 0.12 0.2 0.9 0.9 84 81

ЗФильтрат 68 2000 260 440 0.13 0.22 1 1 63 62

4 Осадо« 1 682 245 А2* 0.36 0.62 2.7 2.6 59 60

S. Диатчат 5.4 658 210 . 330 0.32 0.58 2.4 2.5 51 54

6. Препарат 0.32 650 200 350 0 31 0.54 23 2.4 49 50

7.Хроматография на ДЭАС-Тойопадрл 120 205 20.5 305 0.1 1.5 0.74 6.5 5 44

8. Гмьфильтрация на сефэдексе 6-25 60 66 13 195 0.2 3 • 1.5 13 3 28

9. Хг рматографчя на KM-t еллюлив 45 32 8 140 0.28 43 2.1 18.7 2.2 20

10, Аффинная хроматография 32 21 6.7 120 . 5.5 2.4 24 1.6 17

Используя препаративную хроматографию на ДЭАЭ-тойопеарл при рН 9.0 мы отделили резко катионные химотрипсиноподобную протеиназу и минорный трипсин с р1 9,9 (в элюате первого пика) от остальных исследуемых ферментов (в злюате второго пика) (рис.5).

9 «1 13 13 17 19 21 23 25 27 2Э 31 31 Ном»р фракции (объем 10 мл)

Рис. 5. Препаративная ионообменная хроматография на ДЭАЭ-тойопеарл. Колонка 1.9 х 12 см уравновешена 0,015 Мтрис-НС1 буфере рН 9,0, содержащим 0,025 МЫаС1. Скорость элюции 30 мл/ч. Нанесено 600 ед. белка

В результате гель-хроматографии первого пиха наносимый белок разделился на 4 пика. Химазная, эластазная, коллагегшная и трипсизювая активности элю провались со свободным объемом в первом пике. При этом, помимо повышения удельной активности произошел перевод ферментов в( 0,02 М PIPES - буфер рН 7,0, с 0,025 М NaCl. Следующим шагом была хроматография на КМ-целлюлозе. Для этого активные фракции пика 1 гельфильтрации, уже уравновешенные гель-хроматографией против необходимого буфера, объединяли и наносили на колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,02 М PIPES-буфером рН 7,0, с 0,025 М NaCl. При этом удельная активность также повысилась. Результатом аффинной хроматографии было увеличение эластолитической и коллагенолитнческой удельной

активности в 24 раза в сравнении с таковой в железе, тогда как гхимазная

-

активность выросла всего в в 2 раза (табл.2). Этот факт указывает на то, что данная протеиназа обладает незначительной химазной активностью. Трипсиноподобная протеиназа также взаимодействовала с утиным овомукоидом и поэтому ие отделилась от химотрипсина.

При электрофорезе в ПААГ с ДДС-Ыа максимально очищенного препарате; протеиназы после аффинной хроматографии выявились две полосы (основная - 21150 ± 130 и минорная - 21900 ± 130 Да). Используя ингибиторный анализ выяснили, что трипсиновая активность принадлежала минорной - катионной язоформе трипсина с р1 9,9 + 0,005, химотрипсиноподобная протешаза с такой же изоточкой представляет собой щелочную, сериновую протеиназу, способную эффективно гидролизовать эластин и коллаген.

Последующая после препаративноцхроматографии на ДЭАЭ-тойопеарл при рН 9.0 очистка химотрилсинов с р1 4,6, 5,6 и 6,9 и анионного трипсина состояла из двух этапов: 1) разделения по заряду ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-тойопеарл рН 8,5; 2) аффинной хроматографии на иммобилизованном утиным овомукоиде.

Рис. 6. Хроматография пика'2 (см. рис. 4 ) на ДЭАЭ-тойопеарл. Колонка 1,4 х 12 см уравновешена 0,015 M ТРИС-НС1 буфере pH 8,5, содержащим 0,025 M NaCl. Скорость элюции 25 мл/ч. Градиентное элюирование NaCl 0,025 - 0,2 M начато с 37 фракции, закончено на ¡16, ступенчатый градиент 0,25 - 0,5 M NaCl начат с 117 фракции. Нанесено 337 ед. белка

В таблице 3 дана характеристика этапов очистки л^мотрипсинои с pi 4,6, 5,6 и 6,9 и анионного трипсина.

Количественная характеристика очистки химотрипсиноа ср! 4.6, 5,6 и 6,9 и анионного трипсина

Таблица 3

Объем, мл Активность Белок, «Д. Ало Удельная активность Степень очистки, ' !>Я) Выход, %

- МЛС, ®д БЛПНА, мкмоль/мин • лис, ед./еа. БЛПНА, мкмоль/м нн/ед. МАС БАПНА лис БЛПНА

Железд 13 240 28 1820 0,13 0,0154 1 1 100 100

Препарат 0,2 186 23,4 600 0,31 0,039 2,9 2,53 62 53

Хромато|-рафия на

ДЭЛЭТрН 9,0 3 00 117 9,6 160 0,73 0,06 5.6 3,9 48,75 34.3

Хроматография ка

ДЭАЭТрН 8,5:

Химотрипсин с р! 4.6 70 о 30 - 13 0,43 - 3.3 - 12.5 -

5.6 40 22.5 - 43 0,54 - 4,2 - 9,4 -

6.3 85 11.2 69 0,86 - 6,6 - 4,7 -

Трипсин с р1 4,5 70 З.б 10 0,36 23.3 12.9

Аффинная

хроматография

Химотрипсинс р14,6^ 10 7,1 - 4,75 1,5 - 11.5 • 3 -

5,6 ' ■ 10 3,75 - 4.65 0,8 - 6,2 - 1,6 -

6.3 10 6,25 5.5 из - 8.7 - 2,6 -

Трипсин с р! 4,5 б , - 0,09 0,138 - 0.62 - 40,25 0,32

При препаративной хроматографии на ДЭАЭ-тойопеарл при рН 9.0 данные протеиназы были заряжены отрицательно и при ступенчатом элюировании №С1 вышли в элюате второго пика. При этом степень очистки химотрнпсина выросла в 5,6 раз, а трипсина в 3,9 раз в сравнении с железой. Наиболее активные'фракции пика 2 объединяли и использовали в дальнейшей очистке на на колонке с ДЭАЭ-тойопеарл рН 8,5. При градиентном элюировании белок разделился на 6 пиков. Пики 2, 3 и 4 обладали химотрипсиновой активностью. Пятый пик содержал трипсин. Второй пик принадлежал химотрипсину с изоточкой 6,9, третий пик химотрипсину с изоточкой 5,6, а четвертый пик изоточке 4,7. Степень очистки химотрипсинив составила 6,6, 4,2 и 3,3 в сравнении с экстрактом. Для трипсина степень очистки возросла в 23,3 раз.

Наиболее эффективными этапами очистки являются ионообменная хроматография на ДЭАЭ-тойопеарл при рН 8,5 и аффинная хроматография.

Выход трипсина составил 0,32%, а степень очистки трипсина 40,25 раза. Конечный выход химотрипсинов с р1 4,7,5,6 и 6,9, по активности в сравнении с экстрактом составил 3,1,6 и 2,6% соответственно, степень очистки 3,3, 4,2 и 4,6 раз.

Свойства протеолнтнческнх ферментов поджелудочной железы кур

Трипсин поджелудочной железы кур представлен двумя изоформами, мажорной - анионной с р14,5 ± 0,01 и минорной - катионной с р1 9,9 ± 0,005. Анионный трипсин в количественном отношении значительно преобладает в отличие от ферментов млекопитающих, среди которых превалируют катионные формы.

Трипсин кур стабилен при рН 3,5 - 5,0 с максимумом при рН 4,5. Бычий трипсин в тех же условиях давал опти»г;:.: рН 3 - 4, с максимумом стабильности при рН 3,5.

Оптимум рН гидролиза К-бегаоил-ВД^-аргинин-п-нитроанилида для трипсина кур составил рН 8,0 - 8,5, для трипсина быка в том же опыте был также активен при рН 8,0 - 8,5. Этот же субстрат максимально гидролизуется трипсином различных видов рыб в тех же пределах рН. Таким образом, оптимум пептидазной активности трипсина кур находится в слабощелочных значениях рН и не отличается от этого показателя ни от рыб, ни от млекопитающих. При исследовании оптимума рН протеолитической активности для гидролиза казеииа был определен оптимум активности анионного трипсина при рН 8,0 - 8,5. Трипсш^ быка в том же опыте был максимально активен при рН 7,5 - 8,0. Таким образом, по значению рН оптимальных условий протеолитической активности трипсин кур все же ближе к трипсинам млекопитающих, нежели к рыбам.

Максимальная удельная активность бычьего трипсина после очистки составила 0,75 мкмоль/мин/мг. По данным К. 1кепо а1., (1986) бычий трипсин имел удельную активность 0,83 мкмоль/мин/мг. Куриный трипсин в идентичных условиях имел максимальную удельную активность, равную 0.9 мкмоль/мин/мг. Удельная протеолитическая активность трипсина кур (по казеину) составила 7 ТЕ/мг (трипсиновые единицы ). 1 мг бычьего трипсина содержал 5,5 ТЕ (по данным М. Кунитца 6 ТЕ) (Нортроп, Кунитц, Херриот, 1950). То есть протеолитическая активность трипсина кур выше, таковой трипсина быка.

Ингибирование трипсина кур фенилметилсульфонилфторидом позволяет отнести этот фермент к классу сериновых протеиназ, а ингибирование >7-тозил-Ь-лизин хлорметилкетоном является специфичным свойством трипсина.

По данным изоэлектрофокусирования все ~ химотрипсины поджелудочной железы кур имеют изоточки: 4,6 ± 0,1, 5,6 ± 0,1, 6,9 ± 0,1 и 9,9 ±0,005 соответственно.

Химотрипсины кур обладают рядом особенностей, отличающих их от аналогичных ферментов млекопитающих, рыб и беспозвоночных:

а) оптимум рН стабильности химотрипсинов курицы занимает промежуточное положение между оптимумами химотрипсинов млекопитающих с одной стороны и химотрипсинами рыб и беспозвоночных с другой и вплотную приближается к оптимуму рН их действия;

б) оптимум рН активности химотрипсинов кур при гидролизе Целковых субстратов находится в более щелочной области, чем у химотрипсина быка и занимает промежуточное положение между оптимумами активности млекопитающех и рыб, а характер кривых зависимости активности от рН более пологий у химотрипсинов кур, чем у химотрипсина быка;

в) большая молярная активность и связанное с этим более сильное ингибирование активности природными ингибиторами в сравнении с бычьим а - химотрипсином.

г) химотрипсины с р1 4,6, 5,6 и 6,9 превосходили бычий химотрипсин (дополнительно очищенный аффинно) по химазнон активности в 5,5,2,7 и 4,4. раза соответственно. Только химотрипсиноподобная протеиназа с р1 9,9 обладала меньшей химазной активностью.

В целом можно отметить, что существование 4 химотрипсинов не является неожиданностью для нас. Химотрипсины р1 6,9 и 5,6, вероятно, соответствуют химотрипсиногенам А и В быка, а химотрипсин с р1 4,6 подобен химотрипснногену С млекопитающих. Однако, обращают на себя внимание такие свойства химотрипсинов как более высокая химазная активность, более высокие оптимумы рН стабильности и активности в сравнении с химотрипсином быка. По этим свойствам химотрипсины кур занимают промежуточное положение между химотрипсинами млекопитающих и рыб. 4 "

Особо следует отметить, что химотр:,п<-ину с р1 9,9 присуща эластолитическая и коллагенолитическая активности. По этому свойству эта

протеиназа напоминает эластазу человека (Allan, Zager, Keller, 1970),эластазу 2 свиньи (Ardelt, 1974) и обе эластазы двоякодышащей рыбы (Reek, Neurath, 1972) (у этих животных имеются эластолитические ферменты как обладающие эластолитической активностью, так и лишенные ее) и на химотрипсин карпа с pi 6,8, так же обладающего эластазной и коллагеназной активностью (Хаблюк, 1983). Данный фермент представляет собой щелочную, сериновую протеиназу, способную эффективно гидролшовать эластин и коллаген и створаживать молоко. Подобное свойство может быть объяснено, вероятно, высокой степенью гомологичности расположения аминокислотных остатков в активном центре данной протеиназы с таковыми химотрипсина, эластазы и коллагеназы млекопитающих.

Полученные нами результаты исследований дают возможность использовать в качестве источника для получения протеиназ поджелудочную железу кур. Сульфатаммонийный осадок из активированного кислотного экстракта поджелудочной железы кур, в значительной степени освобожденный от балластных веществ и неактивных белков, содержит практически всю потенциальную активность трипсина, химотрипсина, эластазы и коллагеназы. Отдиализованный и лиофилизованный осадок может быть предложен как комплексный протеолитический ферментный препарат.

Нами проведено изучение некоторых важных свойств препарата, знание которых являются необходимым условием для исследования его конкретного применения в промышленности и медицине.

Сравнивали препарат из поджелудочной железы кур с кристаллическими препаратами трипсина и химотрипсина крупного рогатого скота. Установлено, препарат обладает более высокой протеолитической активностью в сравнении с кристаллическими трипсином'и химотрилсином быка.. Химазная активность препарата выше химазной активности бычьего химотрипсина. Отличительной особенностью препарата в сравнении с ферментами быка является существенная эласто- и коллагенолитическая

активность. Преимущество в активности позволит применить в медицинских целях меньшее количество препарата, а значит и белка, что снизит белковую нагрузку на имунную систему организма.

Таблица 4

Удельная активность препарата и кристаллических ферментов быка

Активность 1 мг препарата

Протеолити-ческоя (казеин), ед. Химазная (МАО, ед. Лептидазная (БАПИА), мкмель/мин Эластолити-ческая (злластин), ед. Коялагеноли-тическая (азоколлаген), ед.

Препарат из поджелудочной железы кур 5 ±0,5 0,8 ±0,25 2 ± 0,75 0,54 ± 0,12 0,44 ±0,07 4 + 1,5 0,35 ± 0,1 - 0,07 ± 0,025 0,04 2± 0,8 - 6,5 ± 2,4 0,04 ± 0,01 0

Бычин кристалличес кий химотрипенн

Бычий кристалличес кий трипсин

Таким образом, 1 г ферментного препарата из поджелудочной железы кур по протеолитической активности соответствует примерно 2 г бычего кристаллического химотрипсина и 1,25 г бычьего кристаллического трипсина. По химазной активности 1 г препарата соответствует примерно 2,5 г кристаллического химотрипсина. Выход кристаллических ферментов из поджелудочной железы крупного рогатого скота составляет не более 4 г из 1 кг железы (Нортроп, Кунитц, Херриогг, 1950). Выход протеолнтичесого ферментного препарата - 9 -12 г на 1 кг поджелудочной железы кур.

В сравнении с кристаллическими трипсином и химотрипсином крупного рогатого скота препарат более термостабилен, имеет более высокий оптимум рН стабильности, приближающийся к оптимуму рН активности, дольше сохраняет высокую активность при физиологических значениях рН.

Совокупность этих свойств дает возможность эффективного использсвния препарата в медицине и промышленности.

ВЫВОДЫ:

1. Методами, включающими кислотную экстракцию, фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрацию на сефадексах, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тойопеарл, КМ-цеяяюлозе, аффинную хроматографию, изоэлектрическую фокусировку в градиенте плотности сахарозы из поджелудочной железы кур выделены и охарактеризованны 2 трипсина и 4 химотрипсиноподобных фермента.

2. Изоточки ферментов лежат при следующих значениях рН: у трипсинов 4.5±0.1 и 9.910.05, у химотрипсинов при 4.6±0.1, 5.6±0, 6.9±0.1,9.9±0.05.

3. Молекулярная масса анионного трипсина, определенная электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях составляет 25170±150. Катионный трипсин кур имел массу 21900±130. Химотрнпсины с изоточками 4.6±0.1, 5.6±0 , 6.9±0.1 и 9.9Ю.05 имели молекулярные массы 21900±150, 27650±170 , 23980±150 и 21250 ±130 Дальтон.

4. Трипсины кур максимально стабильны при рН 4.5. Химотрнпсины отличаются широким оптимумом рН стабильности 3.0-7.0 с максимумом при рН 5.0.

5. Химотрнпсины кур активны в более широком диапазоне рН 7-10, чем химотрнпсины млекопитающих 7-9., Оптимумы рН протеолитической активности ферментов кур лежат в более щелочной области рН, чем у соответствующих ферментов млекопитающих.

6. Активность анионного трипсина и химотрипсинов 4.6, 5.6, 6.9 угнетается природными ингибиторами сериновых протеиназ сильнее, чем активность соответствующих ферментов млекопитающих.

7. Удельная молокосвертываюшая активность химотрипсинов с р1 4.6±0.1, 5.6±0, 6.9±0.1 существенно выше активности бычьего химотрипсина.

8. По некоторым свойствам (оптимумы рН стабильности и активности, преобладание анионных форм, активность) исследованные ферменты кур занимают промежуточное положение между соответствующими ферментами млекопитающих и рыб.

9.Высокая протеолитическая, коллагенолитическая и эластолитическая активность высола из экстракта поджелудочной железы между 0 - 0.6 насыщения сульфатом аммония, превышающие активность кристаллических трипсина и химотрипсина, позволяет нам предложить его в качестве высокоактивного протеолитического препарата для технических и лечебных целей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1.Зозуля Л.В., Нечепуренко В.В., Пустовалова И.В., Проскуряков М.Т. Сравнительная характеристика спектров изоферментов высших и низших позвоночных.-В сб.:Актуальные вопросы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий.'-Ч.2.-Краснодар.-1994.-С.349-353.

2.Нечепуренко В.В., Пустовалова И.В., Проскуряков М.Т. Аффинная хроматография трипсина и ингибитора трипсина кур // Сб. тез.докл. межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных и центральных регионов России" Кубанский госуниверситет, Краснодар, 1996. С. 208-210.

3.Нечепуренко В.В., Пустовалова И.В., Проскуряков М.Т. Получение и некоторые свойства ферментного препарата из поджелудочной железы кур //

Сб. тез. докл. Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, июль 1996. С. 300-301.

4.Нечепуренко В.В., Проскуряков М.Т. Протеолнтические ферменты из поджелудочной железы кур - В кн.: Тезисы IV симпозиума "Химия про теолитических ферментов". -М.-1997. - С.49.

5.Нечепуренко В.В. Протеиназа с широкой субстратной специфичностью из поджелудочной железы кур. Краснодар, 1997, Кубан. ун-т. Деп. в ВИНИТИ 21 апреля 1997, N 1328-В97.