Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деления

Балашова, Елена Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деления
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деления"

На правах рукописи

БАЛАШОВА Елена Евгеньевна

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ТУБУЛИНА В СИСТЕМЕ МИКРОТРУБОЧЕК КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ХОДЕ СТАНДАРТНОГО МИТОЗА И ПРИ ПАТОЛОГИИ

ДЕЛЕНИЯ

03 00 25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003161ЭТи

Москва - 2007

003161970

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Научный руководитель

доктор биологических наук Ю А Романов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Г Е Онищенко

кандидат биологических наук РВ Лацис

Ведущая организация

Институт биологии развития им НК Кольцова РАН

Защита состоится «12» ноября 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208 073 02 в ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий»

по адресу 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, д 15 А

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий

Автореферат разослан «10» октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ТИБ енгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Патологические митозы, связанные с нарушением в организации митотического аппарата, описаны как в нормальных тканях при дифференцировке различных клеток, так и при патологических процессах, таких как воспаление, вирусная инфекция, опухолевый рост, а также при апоптозе Кроме того, при культивировании клеток in vitro нередко наблюдается спонтанное появление патологических митозов, что представляет определенные проблемы из-за широкого использования различных клеточных и тканевых культур в качестве моделей для фундаментальных исследований и в биотехнологическом производстве

Известные на сегодняшний день факты, позволяют утверждать, что появление патологического митоза, связанного с формированием аномального веретена деления - важное звено в цепи событий, ведущих к переключению клеточной программы с нормальной пролиферации на опухолевую трансформацию или апоптоз (Bnnkley, 2001, Castedo et al, 2004) На настоящий момент, особенности функционирования митотического аппарата в ходе патологического митоза изучены недостаточно, и сравнительное исследование структурной и функциональной организации системы микротрубочек (МТ) и центросомы при биполярном и многополюсном митозах имеет научный и практический интерес

Одной из причин различий в функционировании системы МТ в биполярном или многополюсном митозах могут являться постгрансляционные модификации тубулина (ПТМ) Известно, что МТ с различным набором ПТМ их тубулиновых субъединиц, различаются по скорости и степени обновления (Rosenbaum, 2000) Но механизм действия модификаций тубулина на функции МТ пока неизвестен Однако установлено, что ПТМ могут влиять на динамику МТ через связывание МТ с многочисленными белками, ассоциированными с МТ (Rosenbaum, 2000)

В то же время, ПТМ тубулина в составе МТ центриолей (Piperno et al, 1987, Bre et al, 1987, Bobinnec et al, 1998b) могут влиять на взаимодействие центриолей в составе центросомы с белками перицентриолярного матрикса Молекулярные механизмы, составляющие суть такого взаимодействия также изучены недостаточно Однако имеются данные, касающиеся особенностей организации центросомы в ходе многополюсного митоза по сравнению со стандартным биполярным делением, которые позволяют предполагать, что такое взаимодействие может лежать в основе регуляции митоза (Онищенко, 1993)

Таким образом, выявление особенностей функционирования МТ при патологическом митозе, в частности, путем анализа ПТМ тубулина в составе митотического веретена и центриолей, является актуальным

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей распределения посттрансляционно-модифицированого тубулина в составе центшолярных и цитоплазматических микротрубочек в ходе стандартного и многополюсюл о митоза в нормальных и трансформированных клетках, а также в клетках при индукции апог тоза Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Исследовать особенности распределения ацетилированного и тирозинированного а-тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в интерфазе и в ходе двухполюсного и многополюсного митоза диплоидных клеток ЗТЗ и т/морогенных гетероплоидных клеток SV40-3T3 методом иммунохимического окрашивания

2 Изучить динамику митотического цикла и организацию многополюсного митотического аппарата при индукции апоптоза этопозидом в культуре клеток СНО-Ь 1 методами иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии

3 Сравнить особенности распределения ацетилированного и тирозинированного а-тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в ходе двухполюсного и многополюсного митоза клеток СНО-К1 до и после обработки этопозщом методом иммунохимического окрашивания

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были отработаны методические приемы, позволяющие на электронно-микроскопическом уровне охарактеризовать распределение ПТМ тубулина в МТ центриолярного ци шндра Для электронно-микроскопического исследования был использован пероксида ный метод иммуноокрашивания, позволяющий исключить проблемы, связанные с про шкновением антител, меченных коллоидным золотом, в центросому клеток ш situ Данный метод дал возможность провести полуколичественную оценку уровня связывания ант стел с МТ, ориентируясь на различия в интенсивности окрашивания Данная работа впер !ые выявила различия в организации двухполюсного митотического веретена в диплоидной и туморогенной гетероплоидной клеточных линиях Показано, что характер ацетилирования и тирсзинирования а-тубулина в составе МТ центриолей и веретена подвергается закономерным и стабильным изменениям в ходе митоза в клетках ЗТЗ, в отличие от трансформированных клеток SV40-3T3 Впервые установлено, что различия в характере ацетилирования и тирозинирования МТ веретена и центриолей наблюдаются между клетками с двухполюсным и многополюсным аппаратом деления, формирующимся в предапоптотический период в культуре СНО-К1, обработанной противоопухолевым препаратом этопозидом При формировании многополюсных митотических веретен наблюдается гетерогенность иммуноокрашивания микротрубочек полюсов одного и того же веретена антителами к тирозинир званному а-

тубулину, что также сопровождается вариабельностью в структурной организации полюсов Полученные данные указывают на то, что формирование митотического веретена регулируется по-разному при реализации различных клеточных программ, таких как дифференцировка, опухолевая трансформация, апоптоз, и непосредственное участие в этой регуляции, вероятно, принимает ПТМ а-тубулина в составе МТ центриолярного цилиндра и митотического веретена

Таким образом, полученные результаты расширяют современные представления о цепи событий, ведущих к переключению клеточной программы с нормальной пролиферации на опухолевую трансформацию или апоптоз

Апробация работы Результаты работы были представлены на 6-м Международном конгрессе по клеточной биологии и 36-й Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Сан-Франциско, декабрь, 1996), на 40-й Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Сан-Франциско, декабрь, 2000), межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (Москва, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликованы три статьи, два тезисных сообщения, две статьи находятся в печати

Структура и объем работы Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» Работа изложена на 125 страницах и включает 18 рисунков, 1 таблицу и список литературы, содержащий 267 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культуры клеток. Исследование проводилось на культурах мышиных диплоидных клеток Balb/c-ЗТЗ (клон А-31), полученных из АТСС (США), туморогенных гетероплоидных вирус-трансформированных клеток SV40-3T3, любезно предоставленных отделом клеточной биологии РКНПК, клеток китайского хомячка СНО-К1, для которых существует модель индукции апоптоза после воздействия противоопухолевого препарата этопозида (Lock and Ross, 1990а), любезно предоставленных А А Мининым (группа клеточной биологии Института белка РАН)

Постановка экспериментов Экспоненциально растущие культуры клеток ЗТЗ и SV40-3T3 и покоящуюся популяцию клеток ЗТЗ (Tucker et al, 1979) исследовали методом иммунофлуоресцентной и иммуноэлекгронной микроскопии Экспоненциально растущую культуру клеток СНО-К1 обрабатывали раствором этопозида для индукции апоптоза и исследовали с помощью методов световой, иммунофлуоресцентной и электронной

микроскопии до и в течение двух суток после добавления агента

Индукция апоптоза и выявление апоптотических клеток В качестве индуктора апоптоза использовался этопозид - полусинтетический противоопухолевый препарат, УР-4'-диметил-эпиподофиллотоксин-9-(4,6-о-этилен-р-гликопиронозид) Раствор этопозида в ДМСО добавляли в культуральную среду на 1 ч в концентрации 25мкМ (концентрация ДМСО составляла 0 04%) Чтобы визуализировать апоптотические клетки, концы фрагментированной ДНК метили биотинилированными нуклеотидами (dUTP), связанными с флуоресцеином, с помощью фермента концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы - TdT-mediated dUTP шск-end labeling (TUNEL, Apoptosis Detection System) по методу, рекомендованному изготовителем Определение митотического индекса Для определения митотического индекса клетки СНО-К1 окрашивали карболовым фуксином Контролем служили клетки, обработанные ДМСО в концентрации 0 04%, соответствующей его содержанию в среде с этопозидом Иммунофлуоресцентное окрашивание. Окрашивание проводилось по стандартному методу Клетки фиксировали 0 4% раствором параформальдегида, приготовленном на буфере, стабилизирующем МТ, и инкубировали с моноклональными антителами против а-тубулина (клон В-5-1-2), ацетилированного (клон 6-11В-1) или тирозинированного (клон TUB-1A2) а-тубулина или у-тубулина (клон GTU-88) Связывание антител визуализировали с помощью козьих биотинилированных антител к иммуноглобулинам мыши и авидина, конъюгированного с ФИТЦ Часть препаратов клеток СНО-К1 через 48 ч после обработки этопозидом фиксировали холодным метанолом, затем последовательно обрабатывали антителами против у-тубулина и козьими антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с ФИТЦ

Для визуализации клеточных ядер и хромосом, все препараты докрашивали ДНК-красителем DAPI, заключали в Moviol, анализировали и фотографировали с помощью флуоресцентного фотомикроскопа Opton III

Стандартная электронная микроскопия. Дня изучения ультраструктуры полюсов веретена в клетках СНО-К1, делящихся через 14 и 48 ч после добавления этопозида был применен стандартный метод электронной микроскопии Препараты клеток заливали в Эпон 812 Серийные ультратонкие срезы последовательно анализировали и фотографировали с помощью электронного микроскопа JEM-100 СХ

Иммунопероксидазное окрашивание для электронной микроскопии Для сравнения уровня посттрансляционных модификаций а-тубулина в отдельных участках митотического веретена, использовали собственную модификацию (Vinogradova et al, 2005) метода иммуноэлектронной микроскопии (Calarco-Gillan et al, 1983, Bre et al, 1987) Клетки фиксировали 0 25% раствором глутарового альдегида, приготовленным на буфере, стабилизирующем МТ, затем

инкубировали с мышиными антителами либо против ацетилированного, либо против тирозинированного а-тубулина Моноклональные антитела визуализировали с помощью биотинилированных козьих антител к иммуноглобулинам мыши и комплекса авидин-биотин, конъюгированного с пероксидазой хрена (ABC-kit) Субстратом служил раствор диаминобензидина Образцы дофиксировапи 1% глутаровым альдегидом и 1% OsOî, дегидратировали в серии спиртов возрастающей концентрации (при этом 70%-ый этанол содержал 2% уранилацетата) и заливали в Эпон 812 В качестве негативного контроля служили образцы, окрашенные мышиными неспецифическими антителами

С помощью фазово-контрастной микроскопии выбирали клетки (а) разных стадий клеточного цикла в культурах ЗТЗ и SV40-3T3 и (б) разных стадий митоза в контрольной культуре СНО-К1 и в культуре, фиксированной через 48 ч после добавления этопозида Выбранные клетки изучали на серийных ультратонких срезах толщиной 400-500 Â Мечение митотических хромосом с помощью BrdU. Чтобы выяснить, какое количество митотических делений после выхода из интерфазного блока прошли клетки СНО-К1, изучаемые через 14, 24 и 48 ч после добавления этопозида, были проанализированы закономерности разведения метки после насыщения ДНК аналогом тимидина - 5-bromo-2-deoxyundine (BrdU) Для этого клетки инкубировали с BrdU (10 мкг/мл) в течение 14 ч, что соответствует длительности клеточного цикла клеток СНО-К1 (Кириллова и др, 1989), и затем обрабатывали этопозидом по описанной выше схеме Клетки фиксировали в 70% этаноле и последовательно инкубировали с антителами против BrdU (клон SB 18) и ФИТЦ-конъюгированными козьими антителами к иммуноглобулинам мыши Препараты докрашивали DAPI, заключали в Moviol и анализировали с помощью флуоресцентного фотомикроскопа Opton III

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Распределение посттрансляционно-модифицированного а-тубулина в нормальных клетках ЗТЗ (А31) и туморогенных клетках SV40-3T3

Биполярные и многополюсные митозы изучали в культуре диплоидных мышиных клеток Balb/c-ЗТЗ (клон А-31) и гетероплоидных клеток SV40-3T3, трансформированных вирусом обезьян 40 и способных формировать опухоль при введении мышам (Stephenson et al, 1973, Smith et al, 1976, Gluck et al, 1993)

Характер распределения ацетилированного (ацет-) и тирозинированного (тир-) а-тубулина в ЗТЗ и SV40-3T3 клетках (световая микроскопия) Поскольку из двух использованных нами клеточных культур лишь в отношении одной, а именно ЗТЗ, имелись предварительные сведения о характере распределения тир- и ацет-МТ во время митоза

(ОшкЬгееп апё Ви11шк1, 1986, Рфегпо е1 а1, 1987) - было проведено сравнительное исследование распределения тир- или ацет-МТ в ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ клетках методом иммунофлуоресцентного окрашивания после фиксации параформальдегидом и методом иммунопероксидазного окрашивания после фиксации Глухаревым альдегидом В результате было установлено, что в обеих клеточных культурах характер окрашивания системы МТ не зависит от способа визуализации антигена антителами к тир- и к ацет-тубулину

В клетках ЗТЗ наблюдался сходный характер окрашивания для тир- и ацег-тубулина в ходе митоза, во всех деталях совпадающий с описанным ранее в клетках млекопитающих (Оипёегееп ап<! Ви11Ш!к1, 1986, Рфегпо е1 а1, 1987, \Votf апс! ЗрапеЬВогочгек!, 1995) По сравнению с клетками ЗТЗ, в клетках 5У40-ЗТЗ выявлялась намного большая вариабельность по интенсивности окрашивания митотических веретен (слабо или сильно окрашенные) как для тир-, так и для ацет-тубулина в ходе одной и той же стадии митоза Никакой зависимости между числом полюсов митотического аппарата и интенсивностью окрашивания митотических МТ антителами как к тир-, так и к ацет-тубулину, выявлено не было как сильно, так и слабо окрашенные клетки были видны и среди двухполюсных, и среди многополюсных митозов Электронно-микроскопическое распределение ацет- и тир-тубулина в цитоплазматических МТ. С помощью электронной микроскопии было изучено распределение тир- и ацет-МТ в клетках ЗТЗ и вУ40-ЗТЗ в ходе клеточного цикла Как правило, интенсивность иммунопероксидазного окрашивания цитоплазматических МТ антителами как к тир-, так и к ацет-тубулину варьирует в широких пределах в отдельной клетке в обеих клеточных культурах

В интерфазных клетках ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ наблюдается сходный характер окрашивания системы МТ Наиболее интенсивно окрашенные антителами к тир-тубулину МТ обнаруживаются в непосредственной близости от плазматической мембраны (рис 1, а) В других участках цитоплазмы, включая район центросомы, МТ всегда окрашены намного слабее (рис 1, а) Наиболее интенсивно окрашенные антителами к ацет-тубулину МТ, напротив, часто видны в районе центросомы (рис 1, б)

В митотических клетках ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ обнаружен сходный характер распределения цитоплазматических МТ разной интенсивности окрашивания антителами к тир- или ацет-тубулину В профазных и прометафазных клетках частота встречаемости МТ, наиболее интенсивно окрашенных антителами к тир-тубулину, возрастает по мере удаления от центриолей (рис 1, в), в то время как частота встречаемости МТ, интенсивно окрашенных антителами к ацет-тубулину, снижается (рис 1, г) В метафазных клетках МТ, интенсивно окрашенные антителами к тир-тубулину, наиболее многочисленны по периферии веретена (рис 1, д), в то время как МТ, интенсивно окрашенные антителами к ацет-тубулину, с одинаковой частотой распределяются по всему веретену (рис 1, е) У кинетохоров, МТ всегда

окрашена антителами против тнр-тубулина намного слабее, чем перицентрнолярные МТ (рис. I, ж, з), в то прем я как, по крайней мерс, у части МТ, связанных с кинетохорами, интенсивность окрашивания антителами к ацет-тубулину совпадает с перицентржшярными.

Рисунок 1. Электронно-микроскопическое распределение тирозин и ро на н ною (а,в,д,ж,э) и ацетилированкого (б,г,е) а-тубулина в интерфазкых (а,б) н митотическнх клетках (в-з) ЗТЗ и 5У40-ЗТЗ (нммунопероксидазное окрашивание). Увеличение: х 12000.

После анафазы в митотическнх клетках наблюдается сходный характер распределения МТ, интенсивно окрашенных антителами к тир- или ацет-тубулину, В телофазе знтнтела к тир-тубулину и к ацет-тубулину окрашивают часть МТ как в полярной, так и в интерзональной области, а в ходе цитокинеза окрашивают как МТ в районе центросомы, гак н МТ остаточного тельца, В отличие ог клеток ЗТЗ, в клетках 5У40-ЗТЗ наблюдается варьирующий образец

окрашивания остаточного тельца антителами к тир- и ацет-тубулину, что говорит, вероятно, о различиях в механизмах завершения митоза в двух клеточных линиях Во всех исследованных клетках ЗТЗ в ходе цитокинеза остаточное тельце выглядит гомогенно интенсивно окрашенным, тогда как в клетках 8У40-ЗТЗ встречаются такие же остаточные тельца и окрашенные менее интенсивно В некоторых клетках 8У40-ЗТЗ на стадии цитокинеза, содержащих реконструированное ядро, остаточное тело вообще не обнаружено Электронно-микроскопическое распределение ацет- и тир-тубулина в МТ центриолярного цилиндра. С помощью электронной микроскопии показано, что в культуре ЗТЗ интенсивность иммунопероксидазного окрашивания центриолей антителами к тир-тубулину изменяется в ходе клеточного цикла (рис 2) В пределах одной клетки центриоли окрашиваются одинаково

Среди интерфазных клеток, изученных в пролиферирующей культуре, центриоли окрашены на уровне негативного контроля только в тех клетках, в которых найдено по две диплосомы В одной из таких клеток обнаружена окрашенная первичная ресничка В клетках с в 1-конфигурацией центриолей или с процентриолями, центриоли окрашены интенсивно В покоящихся ЗТЗ клетках центриоли окрашены интенсивнее, чем первичная ресничка

Среди изученных митотических клеток только в профазных клетках показана вариабельность по степени окрашивания центриолей В одной из профазных клеток центриоли почти не отличаются от негативного контроля, в двух других окрашены неравномерно -имеются не отличающиеся от негативного контроля и окрашенные участки, а в 3-х - центриоли были окрашены интенсивно и равномерно Во всех остальных исследованных клетках центриоли не отличаются по степени окрашивания от сильноокрашенных профазных клеток или от окрашенных интерфазных клеток

В культуре 8У40-ЗТЗ, в отличие от клеток ЗТЗ, интенсивность иммунопероксидазного окрашивания центриолей антителами против тир-тубулина не изменяется в ходе клеточного цикла (рис 2) Интенсивно окрашенные центриоли обнаружены во всех исследованных интерфазных клетках Характер окрашивания центриолей в исследованных митотических клетках был такой же, как в интерфазных Более двух диплосом обнаружено, по меньшей мере, в одной из клеток на каждой из стадий митоза Были изучены клетки, содержащие как хорошо, так и слабо окрашенный митотический аппарат

В культуре ЗТЗ интенсивность иммунопероксидазного окрашивания центриолей антителами против ацет-тубулина также изменяется в ходе клеточного цикла (рис 2)

В ходе митоза, во всех исследованных профазных, прометафазных, метафазных и анафазных клетках центриоли интенсивно окрашены, однако центриоли в телофазных клетках лишь незначительно отличаются от негативного контроля

ЗТЗ

Тир-тубулин

Ацет-тубулин

■в □□ Б-ог 1ш Ива

_ИЛИ_Ш1И— Уа » Ни ПРОФАЗА □□

Шш ПРОМЬГАФАЗА 1т

Вшз МПАФАЗА 1н

1и АНАФАЗА Ни

Вш ТЕЛОФАЗА СЬ

% цитокиш-з (РАННИЙ 01) пилипилив %

8У40-ЗТЗ

Тир-тубулин

Ацет-тубулин

Рисунок 2 Схема изменения

иммунопероксидазного окрашивания

центриолей антителами к тирозинированному и ацетилированному а-тубулину в ходе клеточного цикла клеток ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ

Окрашивание центриолей в ходе цитокинеза варьирует в широких пределах В 4-х клетках обе центриоли окрашены так же, как в телофазе, в 3-х других клетках одна центриоль неокрашена, а другая окрашена, в одной клетке интенсивно окрашены обе центриоли Следует отметить, что характер окрашивания центриолей всегда одинаков в сестринских клетках Падение интенсивности окрашивания центриолей в ходе митоза клеток ЗТЗ всегда сопровождается резким падением числа интенсивно окрашенных МТ в непосредственной близости от центриолей

В ходе интерфазы центриоли окрашены как в клетках в 1-периода, так и в клетках с процентриолями или с диплосомами Центриоли также окрашены в покоящихся клетках Первичная ресничка в них окрашена интенсивнее, чем центриоль

В культуре 8У40-ЗТЗ, в отличие от клеток ЗТЗ, интенсивность иммунопероксидазного окрашивания центриолей антителами против ацет-тубулина не изменяется в ходе клеточного цикла (рис 2) В 8У40-ЗТЗ клетках центриоли интенсивно окрашены в клетках всех стадий митоза вне зависимости от числа диплосом в этих клетках или от степени окрашивания митотических МТ Также окрашиваются центриоли и в интерфазных клетках Первичная ресничка всегда окрашена интенсивнее, чем центриоли

Таким образом, было обнаружено, что характер иммуноокрашивания центриолей антителами как к ацет-, так и к тир-тубулину закономерно изменяется в ходе клеточного цикла контрольной диплоидной клеточной линии ЗТЗ (А31), в отличие от туморогенной

1в 1в 8-02 Вв Шт

П ИЛИ и ПРОФАЗА Шш

1иа ПРОМЕТАФАЗА Шш

МГТАФАЗА Шш

АНАФАЗА 1м

Иш 11ШОФАЗА ■ш

ЦИ ГОКИНЬЗ (РАННИЙ 01) %

о 01-5

В - окрашенная процентриоль

1 П Ш " центриоли с разной интенсивностью

окрашивания ® О ♦ - первичные реснички с разной интенсивностью окрашивания

гетероплоидной клеточной линии SV40-3T3 (рис 2) В клетках ЗТЗ высокий уровень окрашивания центриолей антителами к тир-тубулину наблюдается на всех стадиях клеточного цикла за исключением периода подготовки к митозу (рис 2), в то время как высокий уровень интенсивности окрашивания антителами к ацет-тубулину наблюдается на всех стадиях клеточного цикла за исключением периода завершения митоза (рис 2) Наши данные впервые указывают на то, что МТ центриолярного цилиндра претерпевают зависимые от митотического цикла изменения, коррелирующие со структурной реорганизацией центросомы

2 Распределение посттрансляционно-модифицированного а-тубулина в митотических клетках СНО-К1 в период, предшествующий апоптозу

Второй моделью для изучения ПТМ тубулина в составе МТ при многополюсном митозе являлась культура клеток СНО-К1, обработанная этопозидом, индуцирующим апототическую гибель клеток, которой предшествует накопление в культуре многополюсных митозов (Lock, Ross, 1990а) Так как особенности структурной организации многополюсного митотического аппарата в предапоптотический период в литературе не описаны, то значительная часть работы посвящена изучению формирования и ультраструктурному анализу многополюсных митозов в культуре СНО-К1, обработанной этопозидом

Пролиферативная активность и накопление апоптотических клеток в культуре, обработанной этопозидом В клетках СНО-К1 после обработки этопозидом наблюдается динамика изменения митотического индекса и числа апоптотических клеток сходная с той, которая была описана ранее для культуры СНО (Lock, Ross, 1990а, 1990b) Митотический индекс падает более чем в 20 раз в течение двух часов после добавления препарата (рис 3), а через 14 ч вновь возвращается к исходному уровню (рис 3) Число апоптотических клеток возрастает примерно в 25 раз через 48 ч после добавления агента (рис 3) Иммунофлуоресцентное окрашивание митотического веретена Структура митотического веретена в клетках контрольной культуры и после добавления этопозида, была изучена с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания антителами против а-тубулина, тир-тубулина и ацет-тубулина Исследование показало, что в клетках, делящихся в разное время после обработки препаратом, характер иммуноокрашивания для данных антигенов различается

В контрольной культуре, в большинстве митотических клеток окрашивается стандартное двухполюсное веретено деления при использовании антител как к а-тубулину, так и к модифицированному тубулину

В культуре, обработанной этопозидом, иммуноокрашивание а-тубулина выявляет существенное возрастание числа клеток с многополюсной организацией митотического аппарата, по сравнению с контролем Более чем в половине клеток на стадии профазы окрашивается больше двух точек, соответствующих полюсам, уже через 14 ч после обработки

агентом, а через 48 ч таких клеток большинство (рис. 4, а, а'), причем количество точек в отдельных клетках достигает 20-ти (рис, 4, б, б').

Рисунок 3. Изменение м»готического индекса и числа апоптотических клеток в культуре клеток СНО-Ю в течение 48 ч после обработки этопозидом или ДМСО. Число апоптотических клеток и митотическии индекс

Определяли при подсчете 2500 Щеток на каждый срок фиксации (среднее значение * сшанд. откл.). Диаграмма представляет собой результаты трех параллельных экспериментов

Примерно н 75% прометафазных клеток через 14 ч после обработки этопозидом окрашиваются точки рилом с полюсами двухполюсного веретена (рис. 4, в, в'), а через 24 ч и популяции прометафаз преобладают клетки с многополюсным веретеном (рис. 4, г, г'). Однако через 48 ч в большинстве прометафазных клеток видно только множество слабоокрашенных точек и единичные МТ, и лишь в некоторых клетках окрашивается митотическое веретено, как правило, двухполюсное. В клетках на стадии метафазы через 14 ч поите обработки этопозидом окрашивается двухполюсное веретено деления, а через 24 ч и 48 ч примерно в половине мстафаз антитела к о. тубулину окрашивают точки рядом с полюсами двухполюсного веретена (рис. 4, д, д'}. Через 48 ч после добавления агента в некоторых клетках на стадии прометафазы и метафазы резко ослабевает интенсивность окрашивания МТ веретена (рис, 4, е, е'). В большинстве клеток на стадии анафачы и телофазы на протяжении всего эксперимента окрашивается двухполюсное веретено деления. редких клетках на стадии анафазы через 24 или 48 ч после обработки этопозидом антитела окрашивают точки рядом с полюсами двухполюсного веретена (рис. 4, ж, жт).

Иммуноокрашннанне ацет-тубулина после обработки этопозидом также выявляет существенное возрастание числа клеток с многополюсной организацией м итот и чес ко го аппарата, по сравнению с контролем. Через 14 ч после обработки этопозидом около половины профазных клеток содержат более двух окрашенных точек, соответствующих полюсам, а через 24 и 48 ч таких клеток большинство (рис. 4, л, л'). Примерно в половине прометафазных клеток через 14 ч после обработки этопозидом окрашивается двухполюсное веретено деления,

□ ДМСО/митоз □ этопозид/митоз ДМСО/агтогттоз ■ згоггоиед'аггопгаз

14 18 24 ¿0

ВРЕМЯ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ, ч

а остальные клетки содержат либо дополнительные точки рядом с полюсами двухполюсного веретена, либо многополюсное веретено Через 24 и 48 ч клетки с многополюсным веретеном составляют большинство в популяции промегафазных клеток (рис 4, м, м') В клетках на стадии метафазы через 14 ч после обработки этопозидом окрашивается двухполюсное веретено деления Около половины метафазных клеток, появляющихся через 24 ч и 48 ч после добавления агента, содержат дополнительные точки рядом с полюсами двухполюсного веретена В большинстве ана- и телофазных клеток на протяжении всего эксперимента окрашивается двухполюсное веретено деления

Оказалось неожиданностью, что иммуноокрашивание для тир-тубулина выявляет меньшее количество клеток с многополюсной структурой веретена в культурах, обработанных этопозидом, по сравнению с иммуноокрашиванием для а-тубулина Возможно, причиной этого являются различия в содержании модифицированного тубулина в составе микротрубочек отдельных полюсов многополюсного веретена Через 14 ч после добавления этопозида характер окрашивания клеток всех стадий митоза антителами против тир-тубулина не отличается от контрольной культуры Только через 24 ч среди клеток на стадии профазы иммуноокрашивание выявляет единичные клетки более чем с двумя центрами схождения МТ К 48 ч таких клеток больше половины Обнаружено стандартное двухполюсное веретено в половине прометафазных клеток через 24 ч после обработки этопозидом Остальные промегафазные клетки либо лишены окрашенного веретена, либо содержат дополнительные центры схождения МТ или окрашенные точки (в дополнение к двухполюсному веретену) такие же по морфологии как при окрашивании ацет-тубулина Даже через 48 ч в большинстве прометафазных клеток антитела к тир-тубулину окрашивают два центра схождения МТ (рис 4, з, з') Редкие промегафазные клетки содержат множественные центры схождения МТ (рис 4, и, и')

Примерно в половине клеток на стадии метафазы через 24 ч после обработки этопозидом, отмечается ослабление окрашивания митотического веретена при использовании антител к тир-тубулину Через 48 ч число таких клеток большинство (рис 4, к, к') На стадии ана- и телофазы обнаружены клетки только с двухполюсным веретеном деления на протяжении всего эксперимента

Рисунок 4. Митотические клетки в культуре СНО-К1 через 14, 24 и 48 ч после обработки этопозидом (1ч, 25мкМ) Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к а-тубулину (а-ж), тирозинированному а-тубулину (з-к) или ацетилированному а-тубулину (л,м) и ядерным красителем ОАР1 (а'-м')

(а, б), (л) - профаза, (в,г), (з,и), (м) - прометафаза, (д,е), (к) - метафаза, (ж) - ана-телофаза Стрелки указывают на митотические клетки Увеличение х 2700

Иммуноокрашивание у-тубулина в митотических клетках Чтобы охарактеризовать особенности распределения у-тубулина после обработки этопозидом, выполнено иммунофлуоресцентное окрашивание клеток СНО-К1, фиксированных параформальдегидом или метанолом

В контрольной культуре в большинстве митотических клеток всех стадий антитела окрашивают по две точки, соответствующие центросомам, что согласуется с данными, описанными ранее для клеток млекопитающих (Joshi et al, 1992) Окрашивание не зависит от способа фиксации

При анализе препаратов, фиксированных параформальдегидом через 14 ч после обработки этопозидом, в большинстве клеток на стадии профазы, прометафазы и метафазы, также как и в контроле, обнаруживается по две точки Через 24 и 48 ч после добавления этопозида наблюдается ослабление интенсивности иммуноокрашивания у-тубулина большинство профазных, промета- и метафазных клеток неокрашено, лишь в редких клетках можно увидеть от 2-х до 6-ти точек В ана- и телофазных клетках окрашивание ослабевает уже через 14 ч после обработки этопозидом, а через 48 ч отсутствует

При метанольной фиксации показано, что через 48 ч после обработки этопозидом в большинстве клеток на стадии профазы и прометафазы и примерно в половине клеток на стадии метафазы окрашивается множество точек такой же интенсивности, как и клетки контрольной культуры В большинстве клеток на стадии ана- и телофазы окрашиваются две точки или скопления точек по разные стороны от хромосом

Различия в окрашивании после двух способов фиксации клеток связаны, вероятно, с конформационными изменениями у-тубулина в некоторых полюсах многополюсного митотического аппарата при индукции апоптоза

Ультраструктура митотических клеток. Чтобы выяснить, приводит ли обработка этопозидом к изменению ультраструктурной организации полюсов митотического веретена, проведен сравнительный электронно-микроскопический анализ митотических клеток в контрольной культуре СНО-К1 и после обработки этопозидом Показано, что в клетках, делящихся после интерфазного блока, вызванного обработкой этопозидом, наблюдаются существенные нарушения ультраструктуры полюсов как двухполюсного, так и многополюсного митотического аппарата

Во всех изученных клетках контрольной культуры в геометрическом центре схождения митотических МТ располагается пара центриолей, образующих диплосому В одной профазной и в одной метафазной клетке найдено больше двух диплосом

В культуре, фиксированной через 14 ч после обработки этопозидом, половина изученных клеток не отличается по структуре полюсов от контроля Остальные клетки отличаются от контроля либо по числу диплосом, либо по структуре центриолей В них

помимо стандартных диплосом обнаружены одиночные центриоли, и диплосомы, в которых дочерняя центриоль короче материнской

В культуре, фиксированной через 48 ч после обработки этопозидом, лишь в одной прометафазе и одной телофазе наблюдается такая же структура полюсов, как в контроле Одна из прометафазных клеток отличается от контроля только по числу найденных в ней диплосом Все остальные изученные клетки отличаются от контроля по числу центриолей, а также по их структуре и микроокружению В этих клетках найдены диплосомы, в которых материнская центриоль лишена фибриллярного гало, а также одиночные центриоли, окруженные или не окруженные фибриллярным гало, длиной от 0,4 до 0,8 мкм

Электронно-микроскопическое распределение ацет- и тир-тубулина в МТ веретена С

помощью электронной микроскопии изучено распределение тир- и ацег-МТ в митотических клетках СНО-К1 контрольной культуры и делящихся через 48 ч после обработки этопозидом Как и в клетках ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ, интенсивность иммунопероксидазного окрашивания МТ веретена антителами к каждому из указанных антигенов варьирует в широких пределах в каждой изученной клетке

В отличие от клеток ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ, в клетках СНО-К1 наиболее интенсивно окрашенные МТ часто наблюдаются и в районе центросомы, и при значительном удалении от нее не только при окрашивании антителами к ацет-, но и к тир-тубулину на всех стадиях митоза, включая цитокинез, как до, так и после обработки этопозидом

В митотических клетках контрольной культуры разные полюса одного веретена не различаются по интенсивности окрашивания ни на одной из стадий митотического деления при окрашивании антителами как к тир-тубулину (рис 5, а, б - прометафаза), так и к ацет-тубулину (рис 5, в, г - прометафаза) Через 48 ч после обработки этопозидом, напротив, интенсивность окрашивания МТ в разных полюсах одного веретена различается в двух из трех изученных прометафазных клеток при использовании антител к тир-тубулину (рис 5, д, е) В каждой клетке МТ одного из полюсов окрашены интенсивнее (рис 5, д), чем МТ 3-х других полюсов (рис 15, е) Следует отметить, что в митотических клетках СНО-К1, в отличие от клеток ЗТЗ и 8У40-ЗТЗ, не наблюдается разницы в характере окрашивания метафазных веретен антителами к тир- или ацет-тубулину как до, так и после обработки этопозидом наблюдаются веретена, в которых наиболее интенсивно окрашиваются МТ на периферии, и веретена, в которых наиболее интенсивно окрашенные МТ распределяются по всему веретену МТ у кинетохоров окрашиваются с той же интенсивностью, что и МТ у полюсов

В телофазе антитела к ацет- и тир-тубулину окрашивают часть МТ в полярной и интерзональной области в контрольной культуре Через 48 ч после добавления агента окрашенные интерзональные МТ наблюдаются только в части клеток при окрашивании антителами к ацет-тубулину, а антитела к тир-тубулину практически не окрашивают

цитоплазматические МТ. В холе цитокинеза и контрольной культуре остаточное тело гомогенно окрашивается антителами как к тир-, так и к ацет-тубулину.

Рисунок 5. Электронно-микрйскопическое распределение тироэинированного (а,б,д,е) и ацетилированного (в,г) а-тубулина в нрометафазных клетках контрольной культуры (а,б,в,с) СИ О-КI и через 48 ч (д,е) мосле обработки этопозидом (иммунопероксидазное окрашивание). Увеличение: х 12000.

Электронно-микроскопическое распределение ацет- и тир-тубулнна в МТ центр н оля рн о го цилиндра. С помощью иммуноперо ксидазного окрашивания проведено сравнение на электронно-микроскопическом уровне содержания тир- и ацет-тубулнна в центр нол нрных и пер к центр пол ирных МТ долящихся клеток в культуре СНО-КК необработанной этопозидом (контроль), и через 48 ч после обработки агентом.

В контрольной культуре клетки разных стадий митоза различаются по интенсивности окрашивания МТ центркомрного цилиндра антителами к акет-ту&улииу, которая постепенна нарастает от профазы к мета-анафазе (рис, 6). Интенсивность окрашивания иентриолярных МТ, как правило, соответствует интенсивности окрашивания МТ, расположенных вокруг Этой иентриоли.

СНО-К1

Контроль

Тир-тубулин

Ацет-тубулин

Рисунок 6 Схема изменения

иммунопероксидазного окрашивания центриолей антителами к тирозинированному и ацетилированному а-тубулину в ходе митоза клеток СНО-К1 контрольной культуры и через 48 ч после обработки этопозидом

Через 48 ч после обработки этопозидом

Тир-тубулин

Ацет-тубулин

В культуре, обработанной этопозидом, интенсивность окрашивания МТ центриолярного цилиндра антителами к ацет-тубулину не изменяется в зависимости от стадии митоза (рис 6) Интенсивность окрашивания перицентриолярных МТ нарастает от профазы к анафазе, так же как и в клетках контрольной культуры Но на стадии метафазы и прометафазы обнаружены клетки, как со слабо, так и с сильно окрашенными перицентриолярными МТ Обнаруженные одиночные центриоли не отличаются по интенсивности окрашивания антителами к ацет-тубулину от центриолей, образующих диплосому в тех же клетках

В контрольной культуре в клетках разных стадий митоза не обнаружено различий по характеру и интенсивности окрашивания МТ антителами к тир-тубулину (рис 6) На всех стадиях МТ как перицентриолярной области, так и центриолярного цилиндра интенсивно окрашены Центриоли разных полюсов одного веретена не различаются по интенсивности окрашивания

В культуре, обработанной этопозидом, интенсивность окрашивания перицентриолярных и центриолярных МТ антителами к тир-тубулину различается в клетках разных стадий митоза (рис 6) В профазных клетках МТ окрашены намного слабее, чем в профазных клетках контрольной культуры Интенсивность окрашивания МТ в прометафазных клетках варьирует в широких пределах, причем центриоли в пределах одной клетки всегда окрашены одинаково Однако в метафазных и телофазных клетках перицентриолярные и центриолярные МТ окрашены так же слабо, как в профазе Одиночные центриоли обнаружены не были

СЬ ПРОФАЗ Л □а

□оили1- ПРОМ ЕТАФАЗ А

□□ МГТАФАЗА

1Ь АНАФАЗА

□□ ТЕЛОФАЗЛ □а

ЦИТОКИНЕЗ (РАННИЙ О!)

| д - центриоли с разной интенсивностью окрашивания

Таким образом, электронно-микроскопический анализ митотических клеток СНО-К1 показал, что в период, предшествующий апоптотической гибели после воздействия этопозида, наблюдается ослабление окрашивания как ацет-, так и тир-тубулина в МТ центриолярного цилиндра на всех стадиях деления (рис 6)

Мечение митотических хромосом с помощью ВгсШ Изложенные выше результаты показали, что структура митотического аппарата различается в клетках СНО-К1, делящихся в разные сроки после обработки этопозидом Чтобы выяснить различаются ли эти клетки по количеству делений, которые они прошли от момента выхода из интерфазной задержки, индуцированной этопозидом, были проанализированы закономерности разведения метки после насыщения ДНК аналогом тимидина (ВгсШ) непосредственно перед добавлением этопозида

В культурах, фиксированных сразу после насыщения ВгсШ, все найденные на препаратах митотические клетки оказались мечеными Во всех митотических клетках картина окрашивания хромосом с помощью антител против ВгсШ совпадает с картиной окрашивания ОАР1

В культурах, фиксированных через 14 ч после добавления этопозида, все митозы меченые, и характер окрашивания хромосом оставался таким же, как в контроле Через 24 ч мечеными по-прежнему оставались все делящиеся клетки, но около половины митозов содержат полностью меченые хромосомы, а остальные - частично окрашенные Через 48 ч -митозы с полностью мечеными хромосомами и полностью немеченые митотические клетки являются редкостью В большинстве делящихся клеток окрашивается только часть хромосом

Полученные данные по разведению метки (вплоть до ее исчезновения) впервые позволили предположить, что после выхода из интерфазной задержки, за время, предшествующее накоплению в культуре апоптотических клеток (34 ч), большинство делящихся клеток успевают пройти, по крайней мере, два митотических цикла Часть же клеток продолжает все это время находиться в длительном интерфазном блоке, о чем свидетельствует наличие полностью меченых хромосом

выводы

1 Характер иммунохимического окрашивания центриолярных микротрубочек антителами к ацетилированному и тирозинированному а-тубулину изменяется в ходе клеточного цикла диплоидной линии ЗТЗ в отличие от гетероплоидной туморогенной линии 8У40-ЗТЗ Выявление тирозинированного а-тубулина минимально в период подготовки к митозу, а ацетилированного - при его завершении

2 Окрашивание микротрубочек веретена антителами к ацетилированному и тирозинированному а-тубулину стабильно изменяется в ходе митоза диплоидной клеточной линии ЗТЗ в отличие от гетероплоидной линии 8У40-ЗТЗ, в которой наблюдается вариабельность окрашивания клеток в ходе митоза

3 В интерфазных клетках ЗТЗ и ЗУ40-ЗТЗ наибольшая интенсивность окрашивания антителами к тирозинированному а-тубулину обнаруживается в цитоплазматических микротрубочках, расположенных в непосредственной близости от плазматической мембраны, а антителами к ацетилированному а-тубулину, напротив, расположенных в районе центросомы

4 В многополюсных митотических веретенах клеток СНО-К1, обработанных этопозидом, наблюдаются различия в иммуноокрашивании микротрубочек отдельных полюсов одного и того же митотического аппарата антителами к тирозинированному а-тубулину

5 В период, предшествующий апоптотической гибели клеток СНО-К1 после воздействия этопозида, наблюдается снижение интенсивности иммунохимического окрашивания как антителами к ацетилированному, так и к тирозинированному а-тубулину в микротрубочках центриолей на всех стадиях митоза

6 Клетки линии СНО-К1, обработанные этопозидом, проходят как минимум два митотических деления до начала апоптотической фрагментации ДНК Первое и второе деление различаются по иммуноокрашиванию микротрубочек антителами к посттрансляционно-модифицированному а-тубулину и структурной организации полюсов митотического аппарата

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Bystrevskaya V В , Balashova Е Е . Makarova N Е , Kushch A A The alteration of centrosome structure in cells infected with human cytomegalovirus 6th International Congress on Cell Biology and 36th American Society for Cell Biology Annual Meeting, December 7-11, 1996, San Francisco, California Molecular Biology of the Cell, 1996, v 7 (suppl), p 563a

2 Bystrevskaya VB, Balashova EВ. Smirnov VN Pattern of centriole lmmunostainmg for acetylated or tyrosmated tubulin changes during mitosis m 3T3(A-31) cells but not m SV403T3 cells 40th American Society for Cell Biology Annual Meeting, December 9-13, 2000, San Francisco, California Molecular Biology of the Cell, 2000, v 11 (suppl), p 372a

3 Vmogradova T M , Balashova E E . Smirnov V N, Bystrevskaya V В Detection of the centriole tyr- or acet-tubulm changes in endothelial cells treated with thrombin using microscopic immunocytochemistry Cell Motility and Cytoskeleton, 2005,62 1-12

4 Балашова E E. Ряскина С С, Виноградова Т М, Быстревская В Б Иммунофлуоресцентное окрашивание тубулина митотического веретена в клетках СНО-К1, обработанных этопозидом Деп В ВИНИТИ 20 04 07 № 440-В2007

5 Балашова Е Е . Ряскина С С , Виноградова Т М, Быстревская В Б Организация полюсов митотического аппарата в клетках СНО-К1, обработанных этопозидом Деп В ВИНИТИ 20 04 07 № 441-В2007

6 Балашова Е Е. Ряскина С С, Виноградова Т М, Быстревская В Б Реорганизация митотического аппарата в клетках СНО-К1, обработанных этопозидом, предшествует апоптотической гибели Цитология (в печати)

7 Балашова Е Е . Ряскина С С , Виноградова Т М , Быстревская В Б Организация полюсов митотического аппарата в клетках СНО-К1, обработанных этопозидом Цитология (в печати)

Подписано в печать 08 10 2007 г Исполнено 09 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 856 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Балашова, Елена Евгеньевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Аномалии митотического деления клеток высших животных in vivo и in vitro.

1.1 Классификация патологических митозов.

1.2. Встречаемость и биологический смысл патологических митозов.

2. Организация митотического аппарата в ходе стандартного митоза и при патологии деления.

2.1. Биполярный митоз.

2.1.1. Структурная организация митотического аппарата соматических клеток млекопитающих.

2.1.2. Белки, ассоциированные с микротрубочками.

2.1.3. Динамика структурных преобразований митотического аппарата.

2.2. Патологические митозы.

2.2.1. К-метафазы.

2.2.2. Многополюсные митозы.

2.3. Последствия нарушений митоза.

3. Центросома в нормальном митозе и при патологии деления.

3.1. Структура и состав центросомы.

3.2. Роль центросомы в клеточном цикле и митозе.

3.3. Редупликация центросомы.

3.4. Организация центросомы при патологии деления.

4. Посттрансляционные модификации тубулина в составе микротрубочек митотического аппарата.

4.1. Посттрансляционные модификации а-тубулина.

4.2. Посттрансляционные модификации МТ веретена и центриолей в ходе стандартного митоза.

5. Участие системы МТ в регуляции различных клеточных программ

5.1. Роль центросомы в формировании злокачественных опухолей.

5.2. Особенности организации системы МТ при индукции апоптоза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деления"

Различные варианты нарушений митоза играют важную роль в физиологии человека и животных, обеспечивая изменение уровня плоидности в ходе дифференцировки различных типов соматических клеток, в том числе гепатоцитов и мегакариоцитов (Бродский и Урываева, 1981). Вместе с тем, аномалии деления являются неотъемлемой частью злокачественного перерождения клеток - патологического процесса, включающего в себя нарушение дифференцировки и неконтролируемое размножение (Алов, 1978, Казанцева, 1981). Считается, что высокий уровень многополюсных митозов в этом случае ведет к генетической нестабильности и анеуплоидии опухолевых клеток. Запуск программы апоптоза в культивируемых клетках, как правило, также связан с накоплением в культуре сходных нарушений митоза, а именно, многополюсных митозов, в период, предшествующий клеточной гибели (Watanabe et al., 2000; Abal et al., 2001; Castedo et al., 2004; Rello-Varona et al., 2006).

В настоящее время, данные об особенностях организации и функционирования митотического аппарата, включающего в себя центросому и систему митотических микротрубочек, в ходе многополюсного митоза по сравнению со стандартным биполярным делением, ограничены. Показано, что дополнительные полюса веретена формируются не только за счет увеличения числа центриолей, но и за счет образования безцентриолярных полюсов (Ходяков и др., 1986; Keryer et al., 1984). Это предполагает, что подготовка к многополюсному делению сопровождается нарушением механизма воспроизведения центриолей и механизма взаимодействия центриолей с окружающими их центросомальными белками. Действительно, экспериментальное разрушение центриолей в животной клетке приводит к разнообразным аномалиям в распределении белков центросомального матрикса и организации митотического веретена (Bobinnec et al., 1998а), позволяя предполагать, что в основе системы регуляции митоза лежит некое специальное взаимодействие центриоли с белками перицентриолярного матрикса. Какой молекулярный механизм составляет суть такого взаимодействия все еще неизвестно.

В последнее время появляется все больше данных о том, что уровень посттрансляционных модификаций тубулина - основного белка в составе микротрубочек - определяет взаимодействие цитоплазматических микротрубочек с различными ассоциированными с ними белками (Rosenbaum, 2000). Известно, что микротрубочки центриолярного цилиндра подвергаются, по крайней мере, трем типам посттрансляционных модификаций: детирозинированию (Bre et al., 1987), ацетилированию (Piperno et al., 1987) и глутаминированию (Bobinnec et al., 1998). Тот факт, что опухолевая прогрессия сопровождается инактивацией одного из ферментов, обеспечивающих посттрансляционную модификацию тубулина, а именно тир-лигазы (Lafanechere et al., 1998), позволяет предполагать, что в основе нарушений митоза опухолевых клеток может лежать накопление модифицированного тубулина в составе митотических микротрубочек. Однако в настоящее время нет данных о том, различается ли содержание детирозинированного и ацетилированного тубулина в микротрубочках центриоли в ходе стандартного митоза нормальных и трансформированных клеток. Сведения о закономерностях распределения посттрансляционных модификаций тубулина как в центриолярных, так и в цитоплазматических микротрубочках в ходе многополюсного деления, также отсутствуют.

Сегодня принято считать, что многополюсные митозы, возникающие при запуске апоптоза или при делении опухолевых клеток, являются результатом сходных нарушений в организации центросомы и системы митотических микротрубочек. Однако завершение митотического деления может существенно различаться в двух этих случаях. Так, при индукции апоптоза подавляющее большинство многополюсных митозов не завершается цитокинезом - идет реконструкция ядерной мембраны в отсутствие остаточного тельца и затем в формирующихся многоядерных клетках начинается межнуклеосомное нарезание ДНК (Lock and Ross, 1990b;

Demarcq et al., 1994; Johnson et al., 1999; Sato et al., 2000a). В опухолевых клетках, напротив, подавляющее большинство многополюсных митозов завершается цитокинезом - образуется одно или несколько остаточных телец, и в результате деления в большом количестве появляются анеуплоидные одноядерные и многоядерные клетки (Алов, 1978; Казанцева, 1981). Таким образом, имеющиеся данные позволяют предполагать, что механизм функционирования системы микротрубочек различается в многополюсных митозах, возникающих при индукции апоптоза и в ходе клеточной трансформации. Однако до настоящего времени сравнительные исследования системы микротрубочек и центросомы в многополюсных митозах, различающихся по механизму завершения деления, не проводились.

Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей распределения посттрансляционно-модифицированного тубулина в составе центриолярных и цитоплазматических микротрубочек в ходе стандартного и многополюсного митоза в нормальных и трансформированных клетках, а также в клетках при индукции апоптоза.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности распределения ацетилированного и тирозинированного а-тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в интерфазе и в ходе двухполюсного и многополюсного митоза диплоидных клеток ЗТЗ и туморогенных гетероплоидных клеток SV40-3T3 методом иммунохимического окрашивания.

2. Изучить динамику митотического цикла и организацию многополюсного митотического аппарата при индукции апоптоза этопозидом в культуре клеток СНО-К1 методами иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии.

3. Сравнить особенности распределения ацетилированного и тирозинированного а-тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в ходе двухполюсного и многополюсного митоза клеток СНО-К1 до и после обработки этопозидом методом иммунохимического окрашивания.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Балашова, Елена Евгеньевна

выводы

1. Характер иммунохимического окрашивания центриолярных микротрубочек антителами к ацетилированному и тирозинированному а-тубулину изменяется в ходе клеточного цикла диплоидной линии ЗТЗ в отличие от гетероплоидной туморогенной линии SV40-3T3. Выявление тирозинированного а-тубулина минимально в период подготовки к митозу, а ацетилированного - при его завершении.

2. Окрашивание микротрубочек веретена антителами к ацетилированному и тирозинированному а-тубулину стабильно изменяется в ходе митоза диплоидной клеточной линии ЗТЗ в отличие от гетероплоидной линии SV40-3T3, в которой наблюдается вариабельность окрашивания клеток в ходе митоза.

3. В интерфазных клетках ЗТЗ и SV40-3T3 наибольшая интенсивность окрашивания антителами к тирозинированному а-тубулину обнаруживается в цитоплазматических микротрубочках, расположенных в непосредственной близости от плазматической мембраны, а антителами к ацетилированному а-тубулину - в микротрубочках, расположенных в районе центросомы.

4. В многополюсных митотических веретенах клеток СНО-К1, обработанных этопозидом, наблюдаются различия в иммуноокрашивании микротрубочек отдельных полюсов одного и того же митотического аппарата антителами к тирозинированному а-тубулину.

5. В период, предшествующий апоптотической гибели клеток СНО-К1 после воздействия этопозида, наблюдается снижение интенсивности иммунохимического окрашивания как антителами к ацетилированному, так и к тирозинированному а-тубулину в микротрубочках центриолей на всех стадиях митоза.

6. Клетки линии СНО-К1, обработанные этопозидом, проходят как минимум два митотических деления до начала апоптотической фрагментации

ДНК. Первое и второе деление различаются по структурной организации полюсов митотического аппарата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балашова, Елена Евгеньевна, Москва

1. Алов И А. 1972. Цитофизиология и патология митоза // М., Медицина,264 с

2. Алов И.А., Аспиз М.Е., Старосветская Н.А. 1974. Механизмы обратимости К-митоза // Общ биол 35: 895-903

3. Алов И.А., Аспиз М.Е., Запара О.М. 1976. Механизм обратимости К-митоза, индуцированного колцемидом // Бюл экспер биол мед 82: 874-876

4. Алов И.А. 1978. Особенности деления клеток в опухолях // Вестник АМН СССР 1:66-68

5. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. 1973. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток // М., Медицина, 267 с

6. Бродский В.Я., Урываева И.В. 1981. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка // М., Наука, 259 с

7. Гольцман JI.JI. 1965. Некоторые аномалии митотического деления клеток на поверхности инородного тела в брюшной полости // Арх. патол. 8: 72-73

8. Зиновкина J1A., Надеждина Е.С. 1996. Белки центросомы // Биохимия 61: 1347-1365

9. Казанцева И А. 1981. Патология митоза в опухолях // Новосибирск,144с

10. Кисурина-Евгеньева О.П., Брянцева С.А., Стил А.А., Онищенко Т.Е. 2006. Антитубулиновые агенты могут инициировать различные пути апоптоза // Биофизика 51: 875-879

11. Онищенко Г.Е., Волкова JI.B. 1983. Центриолярный комплекс в гибридах соматических клеток (мышь и китайский хомячок) // Цитология 25: 508-513

12. Онищенко Г.Е. 1993. Центриолярный и центросомный циклы при дифференцировки и патологии // М., Наука

13. Ходяков A.JL, Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. 1986. Распределение хромосом и центриолей в трехполюсных метафазах, индуцированных 2-меркаптоэтанолом в культуре клеток китайского хомячка // ДАН СССР 290(1): 225-227

14. Aaronson S.A., Todaro G.J. 1968. Development of ЗТЗ-like lines from Balb-c mouse embryo cultures: transformation susceptibility to SV40 // J Cell Physiol 72: 141-148

15. Abal M., Souto A.A., Amat-Guerri F., Acuna A.U., Andreu J.M., Barasoain I. 2001. Centrosome and spindle pole microtubules are main targets of a fluorescent taxoid inducing cell death // Cell Motil Cytoskeleton 49: 1-15

16. Abdel-Moneim I., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z., Corczyca W. 2000. Proliferation and apoptosis in solid tumors. Analisis by laser scanning cytometry // Anal Quant Cytol Histol 22: 393-397

17. Andersen S.S.L 1999a. Balanced regulation of microtubule dynamics during the cell cycle: a contemporary view // BioEssays 21: 53-60

18. Andersen S.S.L. 1999b. Molecular characteristic of the centrosome // International Review of Cytology 187: 51-109

19. Arce C.A., Barra H.S. 1985. Release of C-terminal tyrosine from tubulin and microtubules at steady state // Biochem J 226: 311-317

20. Arce СЛ., Rodriguez J A., Barra H.S., Caputto R. 1991. Incorporation of L-tyrosine, L-phenylalanine and L-3,4-dihydroxyphenylalanine as single units into rat brain tubulin // Eur J Biochem 59: 145-149

21. Argarana C.E., Arce C.A., Barra H.S., Caputto R. 1977. In vivo incorporation of I4C.tyrosine into the C-terminal position of the alpha subunit of tubulin // Arch Biochem Biophys. 180: 264-268

22. Argarana C.E., Barra H.S., Caputto R. 1978. Release of 14C.tyrosine from tubulinyl-[14C]tyrosine by brain extract. Separation of a carboxypeptidase from tubulin-tyrosine ligase // Mol Cell Biochem 19: 17-21

23. Argarana C.E., Barra H.S., Caputto R. 1980. Tubulinyl-tirosine carboxypeptidase from chicken brain: properties and partial purification // J Neurochem. 34: 114-118

24. Balczon R., Bao L., Zimmer W.E., Brown K., Zinkowski R.P., Brinkley B.R. 1995. Dissociation of centrosome replication events from cycles of DNA synthesis and mitotic division in hydroxyurea-arrested Chinese hamster ovary cells //J Cell Biol 130: 105-115

25. Blank M., Shiloh Y. 2007. Programs for cell death: apoptosis is only one way to go // Cell Cycle 6: 686-695

26. Bloom G.S., Brashear T.A. 1989. A novel 58-kDa protein associates with the Golgi apparatus and microtubules // J Biol Chem 264: 16083-16092

27. Bobinnec Y., Moudjou M., Fouquet J.P., Desbruyeres E., Edde, Bornens M. 1998b. Glutamylation of centriole and cytoplasmic tubulin in proliferating non-neuronal cells // Cell Motil Cytoskeleton 39: 223-232

28. Bobkova K., Otova В., Marinov I., Mandys V. et al. 2000. Anticancer effect of PMEDAP-monitoring of apoptosis // Anticancer Res 20:1041-1047

29. Bonnet C., Boucher D., Lazereg S., Pedrotti В., Islam K., Denoulet P., Larcher J.C. 2001. Differential binding regulation of microtubule-associated proteins MAPI A, MAP IB, and MAP2 by tubulin polyglutamylation // J Biol Chem 276: 12839-12848

30. Bre M-H., Kreis Т.Е., Karsenti E. 1987. Control of microtubules nucleation and stability in MDCK cells: the occurrence of noncentrosomal, stable detyrosinated microtubules//J Cell Biol 105: 1283-1296

31. Brinkley B.R., Stubblefield E., Hsu T.C. 1967. The effects of colcemid inhibition and reversal on the fine structure of the mitotic apparatus of Chinese Hamster Cells in vitro// The Ultrastructure Res 19: 1-18

32. Brinkley B.R., Cartwright J. 1971. Ultrastructural analysis of mitotic spindle elongation in mammalian cells in vitro. Direct microtubule counts // J Cell Biol 50: 416-431

33. Brinkley B.R., Cox S.M., Pepper D.A., Wible L., Brenner S.L., Pardue R.L. 1981. Tubulin assembly sites and the organization of cytoplasmic microtubules in cultured mammalian cells // J Cell Biol 90: 554 562

34. Brinkley B.R. 1985. Microtubule organizing centers // Annu Rev Cell Biol 1: 145-172

35. Brinkley B.R., Goepfert T.M. 1998. Supernumerary centrosomes and cancer: Boveri's hypothesis resurrected // Cell Motil Cytoskeleton 41: 281-288

36. Brinkley B.R. 2001. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division // Trends Cell Biol 11:18-21

37. Brust-Mascher I., Scholey J.M. 2002. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of early Drosophila embryos // Mol Biol Cell 13: 3967-3975

38. Bulinski J.C., Borisy G.G. 1980. Immunofluorescense localization of HeLa cell MAPs on microtubules in vitro and in vivo IIJ Cell Biol 87: 792-801

39. Buster D.W., Zhang D., Sharp D.J. 2007. Poleward tubulin flux in spindles: regulation and function in mitotic cells // Mol Biol Cell 18: 3094-3104

40. Calarco-Gillan P.D., Siebert M.C., Hubble R., Mitchison Т., Kirschner M. 1983. Centrosome development in early mouse embryos as defined by an autoantibody against pericentriolar material // Cell 35: 621-629

41. Camplejohn R.S., Schultze В., Maurer W. 1980. An in vivo double labeling study of the subsequent fate of cells arrested in metaphase by vincristine in the JB-1 mouse ascittes tumour// Cell and Tissue Kinet 13: 239-250

42. Caron J.M. 1997. Posttranslational modification of tubulin by palmitoylation: I. In vivo and cell-free studies // Mol Biol Cell 8: 621-636

43. Castedo M., Perfettini J.L., Roumier Т., Andreau K., Medema R., Kroemer G. 2004. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition // Oncogene 23: 2825-2837

44. Chang P., Giddings Т.Н., Winey M., Stearns T. 2003. Epsilon-tubulin is required for centriole duplication and microtubule organization // Nat Cell Biol 5: 71-76

45. Chretien D., Buendia В., Fuller S.D., Karsenti E. 1997. Reconstruction of the centrosome cycle from cryoelectron micrographs // J Struct Biol 120: 117-133

46. Ciciarello M., Mangiacasale R., Lavia P. 2007. Spatial control of mitosis by the GTPase Ran // Cell Mol Life Sci Epub ahead of print.

47. Compton D.A. 2000. Spindle assembly in animal cells // Ann Rev Biochem. 69: 95-114

48. Connolly J.A., Kalnins V.I. 1980. The distribution of tau and HMW MAPs in different cell types // Exp Cell Res 127: 341-350

49. De Brabander M., Geuens G., Nuydens R. et al. 1980. The effect of metabolic inhibitors on the nucleated assembly of microtubules in living mitotic and interphase cells // Eur J Cell Biol 22: 303

50. DeFoor P.H., Stubblefield E. 1974. Effects of actinomycin D, amethopterin, and 5-fluro-2'-deoxyuridine on procentriole formation in Chinese hamster fibroblasts in culture // Exp Cell Res 85: 136-142

51. Demarcq C., Bunch R.T., Creswell D., Eastman A. 1994. The role of cell progression in cisplatin-induced apoptosis in CHO cells // Cell Growth Differ 5: 983-993

52. Dewey W.C., Highfield D.P. 1976. G2 block in Chinese Hamster Cells induced by X-irradiation, hyperthermia, cycloheximide or actinomycin D // Radiation Res 65: 511-528

53. Doxsey S.J., Stein P., Evans L., Calarco P.D., Kirschner M. 1994. Pericentrin, a highly conserved centrosome protein involved in microtubule organization // Cell 76: 639-650

54. Doxsey S., Zimmerman W., Mikule K. 2005. Centrosome control of the cell cycle // Trends Cell Biol 15: 303-311

55. Drewinko В., Barlogie В. 1976. Survival and cycle-progression delay of human lymphoma cells in vitro exposed to VP-16-213 // Cancer Treat Rep 60: 1295-1306

56. Duensing S. Munger K. 2002. Human papillomaviruses and centrosome duplication errors: modeling the origins of genomic instability // Oncogene 21: 6241-6248

57. Dulic V., Lees E., Reed S.I. 1992. Association of human cyclin E with a periodic Gl-S phase protein kinase // Science 257: 1958-1961

58. Edde В., Rossier J., Le Caer J.P., Desbruyeres E., Gros F., Denoulet P. 1990. Posttranslational glutamylation of alpha-tubulin// Science 247: 83-85

59. Eigsti O.J., Dustin P. 1955. Colchicine in agriculture, medicine, biology and chemistry // The Jowa State College Press, Ames, Jowa.

60. Elmore S. 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death // Toxicol Pathol 35:495-516

61. Ersfeld K., Wehland J., Plessmann U., Dodemont H., Gerke V., Weber K. 1993. Characterization of the tubulin-tyrosine ligase //J Cell Biol 120: 725-732

62. Euteneuer U., Mcintosh J.R. 1981. Structural polarity of kinetochore microtubules in PtKl cells // J Cell Biol 89:338-345

63. Fant X., Merdes A., Haren L. 2004. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA // Int Rev Cytol 238: 1-57

64. Fu J., Bian M., Jiang Q., Zhang C. 2007. Roles of Aurora kinases in mitosis and tumorigenesis // Mol Cancer Res 5:1-10

65. Fukasawa K., Wiener F., Vande Woude G.F., Mai S. 1997. Genomic instability and apoptosis are frequent in p53 deficient young mice // Oncogene 15: 1295-1302

66. Gadde S., Heald R. 2004. Mechanisms and molecules of the mitotic spindle // Curr Biol 14: R797-805

67. Ganem N.J., Upton K., Compton D.A. 2005. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux // Curr Biol 15: 1827-1832

68. Gardner M.K., Odde DJ. 2006. Modeling of chromosome motility duringmitosis // Curr Opin Cell Biol 18: 639-647

69. Gatti M., Pecci L., Olivieri C. 1976. "Spontaneous" endoreduplication in Chinese Hamster Cell cultures. 1. Effect of growth conditions // Caryologia 29: 155-175

70. Geuens G., Gundersen G.G., Nuydens R., Cornelissen F., Bulinski J.C., DeBrabander M. 1986. Ultrastructural colocalization of tyrosinated and detyrosinated alpha-tubulin in interphase and mitotic cells // J Cell Biol 103: 18831893

71. Gluck U., Kwiatkowski D.J., Ben-Ze'ev A. 1993. Supression of tumorigenicity in simian virus 40-transformed 3T3 cells transfected with a-actinin cDNA // Proc Natl Acad Sci USA 90: 383-387

72. Goepfert T.M., Brinkley B.R. 2000. The centrosome-associated Aurora/Ipl-like kinase family // Current Topics in Development Biology 49: 333-341

73. Goulden M.E., Carlson I.G. 1951. Cytological effects of colhicine on the grasshopper heuroblasts in vitro with special reference to the origin of the spindle //ExpCell Res 2:416

74. Greer K., Maruta H., L'Hernault S.W., Rosenbaum J.L. 1985. Alpha-tubulin activity in isolated Chlamydomonas flagella // J Cell Biol 101: 2081-2084

75. Grieder A., Maurer R., Stahelin H. 1974. Effect of an pipodophyllotoxin derivative (VP 16-213) on macromolecular synthesis and mitosis in mastocytoma cells in vitro II Cancer Res 34: 1788-1793

76. Gromley A., Jurczyk A., Sillibourne J., Halilovic E., Mogensen M., Groisman I., Blomberg M., Doxsey S. 2003. A novel human protein of thematernal centriole is required for the final stages of cytokinesis and entry into S phase// J Cell Biol 161: 535-545

77. Grass O.J., Vernos I. 2004. The mechanism of spindle assembly: functions of Ran and its target TPX2 // J Cell Biol 166: 949-955

78. Gunawardane R.N., Lizarraga S.B., Wiese C., Wilde A., Zheng Y. 2000.Gamma-tubulin complexes and their role in microtubule nucleation // Curr Top Dev Biol 49: 55-73

79. Gundersen G.G., Bulinski JC. 1984. Distinct population of microtubules: tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo II Cell 38: 779-789

80. Gundersen G.G., Kalnoski MH, Bulinski JC. 1986. Microtubule arrays in differentiated cells contain elevated levels of a post-transcriptionally modified form of tubulin // Eur J Cell Biol 42: 288-294

81. Gundersen G.G., Bulinski J.C. 1986. Distribution of tyrosinated and nontyrosinated alpha-tubulin during mitosis // J Cell Biol 102: 1118-1126

82. Gundersen G.G., Khawaja S., Bulinski J.C. 1987. Postpolymerization detyrosination of alpha-tubulin: a mechanism for subcellular differentiation of microtubules // J Cell Biol 105: 251-264

83. Gurland G., Gundersen G.G. 1995. Stable, detyrosinated microtubules function to localize vimentin intermediate filaments in fibroblasts // J Cell Biol 13: 1275-1290

84. Haimo L.T., Telzer B.R. 1982. Dynein-microtubule interactions: ATP-sensitive dynein binding and the structural polarity of mitotic microtubules // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 46: 207-217

85. Hartwell L.H., Weinert T.A. 1989. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events // Science 246: 629-634

86. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. 1997. Mdm2 promotes the rapid degradation ofp53 //Nature 387: 296-299

87. Heald, Walkzak. 1999. Microtubule-based motor function in mitosis // Curr Opin Struct Biol 9: 268-274

88. Hinchcliffe E.H., Miller F.J., Cham M., Khodjakov A, Sluder G. 2001. Requirement of a centrosomal activity for cell cycle progression through G1 into S phase //Science 291: 1547-1550

89. Hirokawa N. 1994. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins // Curr Opin Cell Biol 6: 74-81

90. Hirokawa N. 1998. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport // Science 279: 519-526

91. Horio Т., Hotani H. 1986. Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy // Nature 321: 605-607

92. Jensen C., Bajer A. 1973. Spindle dynamics and arrangement of microtubules // Chromosoma 44: 73-89

93. Johnson P.A., Clements P., Hudson K., Caldecott K.W. 1999. A mitotic spindle requirement for DNA damage-induced apoptosis in Chinese hamster ovary cells // Cancer Res 59: 2696-2700

94. Joshi H.C., Palacios M.J., McNamara L., Cleveland D.W. 1992. y-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation // Nature 356:80-83

95. Kalab P., Weis K., Heald R. 2002. Visualization of a Ran-GTP gradient in interphase and mitotic Xenopus egg extracts // Science 295:2452-2456

96. Kalwinsky D.K., Look A.T., Ducore J., Fridland A. 1983. Effects of the epipodophyllotoxin VP-16-213 on cell cycle traverse, DNA synthesis, and DNAinstrand size in cultures of human leukemic lymphoblasts // Cancer Res 43: 15921597

97. Kasprzak A.A., Hajdo L. 2002. Directionality of kinesin motors // Acta Biochim Pol 49:813-821

98. Karsenti E, Vernos I. 2001. The mitotic spindle: a self-made machine // Science 294: 543-547

99. Keating T.J., Borisy G.G. 1999. Centrosomal and non-centrosomal microtubules // Biol Cell 91: 321-329

100. Keryer G., Ris H., Borisy G.G. 1984. Centriole distribution during tripolar mitosis in Chinese hamster ovary cells // J Cell Biol 98: 2222-2229

101. Khawaja S., Gundersen G.G., Bulinski J.C. 1988. Enhanced stability of microtubules enriched in detyrosinated tubulin is not a direct function of detyrosination level // J Cell Biol 106: 141-149

102. Khodjakov A., Rieder C.L. 1999. The sudden recruitment of y-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules // J Cell Biol 146: 585-596

103. Khodjakov A., Cole R.W., Oakley B.R., Rieder C.L. 2000. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates // Curr Biol 10: 59-67

104. Khodjakov A., Rieder C.L. 2001. Centrosomes enhance the fidelity of cytokinesis in vertebrates and are required for cell cycle progression // J Cell Biol 153:237-242

105. Kline-Smith S.L., Walczak C.E. 2004. Mitotic spindle assembly and chromosome segregation: refocusing on microtubule dynamics // Mol. Cell 15: 317-327

106. Komarova Yu.A., Ryabov E.V., Alieva I.B., Uzbekov R.E., Uzbekova S.V., Vorobjev LA. 1997. Polyclonal antibodies against human gamma-tubulin stain centrioles in mammalian cells from different tissues // Membr Cell Biol 10: 503513

107. Kramer A., Ho A.D. 2001. Centrosome aberrations and cancer // Oncologie 24: 538-544

108. Kreis Т.Е. 1987. Microtubules containing detyrosinated tubulin are less dynamic // EMBO J. 6: 2597-2606

109. Kreitzer G., Liao G., Gundersen G.G. 1999. Detyrosination of tubulin regulates the interaction of intermediate filaments with microtubules in vivo via a kinesin-dependent mechanism // Mol Biol Cell 10:1105-1118

110. Kubbutat M. H., Jones S. N. Vousden K. 1997. Regulation of p53 stability by Mdm2 // Nature 387: 299-303

111. Kumar N., Flavin M. 1981. Preferential action of a brain detyrosinolating carboxypeptidase on polymerized tubulin // J Biol Chem. 256: 7678-7686

112. Kurimura Т., Hirano A. 1980. DNA synthesis and multinucleation of mouse cells infected with SV40 in the presence of cytochalasin В // J Gen Virol 46: 237242

113. Kuriyama R., Borisy G.G. 1981. Microtubule-nucleating activity of centrosomes in Chinese hamster ovary cells is independent of the centriole cycle but coupled to the mitotic cycle // J Cell Biol 91: 822-826

114. Fountain J.R. 1981. Chromosome movement in colcemid-treated cells // J Cell Biol 91: 31 la1.nge B.M., Gull К. 1995. A molecular marker for centriole maturation in the mammalian cell cycle // J Cell Biol 130: 919-927

115. Hernault S.W., Rosenbaum J.L. 1983. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly // J Cell Biol 97: 258-263

116. Hernault S.W., Rosenbaum J.L. 1985a. Reversal of the posttranslational modification on Chlamydomonas flagellar alpha-tubulin occurs during flagellar resorption // J Cell Biol 100:457-462

117. Hernault S.W., Rosenbaum J.L. 1985b. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified by acetylation on the epsilon-amino group of a lysine // Biochemistry 24: 473-478

118. Manning A.L., Compton D.A. 2007. Mechanisms of spindle-pole organization are influenced by kinetochore activity in mammalian cells // Curr Biol 17: 260-265

119. Manning A.L., Ganem N.J., Bakhoum S.F., Wagenbach M., Wordeman L., Compton D.A. 2007. The Kinesin-13 Proteins Kif2a, Kif2b, and Kif2c/MCAK Have Distinct Roles during Mitosis in Human Cells // Mol Biol Cell Epub ahead of print.

120. Marin G., Bender M.A. 1966. Radiation induced mammalian cell death: lapse-time cinemicrographic observations // Exp Cell Res 43: 413-423

121. Marshall W.F., Rosenbaum J.L. 1999. Cell division: The renaissance of the centriole // Curr Biol 9: 218-220

122. Martensen T.M. 1982. Preparation of brain tyrosinotubulin carboxypeptidase // Meth Cell Biol 24:265-269

123. Mattison C.P., Winey M. 2006. The centrosome cycle // Results Probl Cell Differ 42: 111-146

124. Mazia D., Harris P. J., Bibring T. 1960. The multiplicity of mitotic centers and the time-course of their duplication and separation // J Biophys Biochem Cytol 7: 1-20

125. Mcintosh J.R., Cande L., Snyder J. 1975. Studies on the mechanism of mitosis // Ann. N. V. Acad. Sci 253:407-427

126. McNally FJ. 1996. Modulation of microtubule dynamics during the cell cycle//Curr Biol 8:23-29

127. Misra N.C., Roberts D.W. 1975. Inhibition by 4'-demethyl-epipodophyllotoxin 9-(4,6-0-2-thenylidene-beta-D-glucopyranoside) of human lymphoblast cultures in G2 phase of the cell cycle // Cancer Res 35: 99-105

128. Mohri H., Mohri N., Mabuchi I., Yazaki I., Sakai H., Ogawa K. 1976. Localization of dynein in sea urchin eggs during cleavage // Dev Growth Differ 18: 391-398

129. Mogensen M.M., Malik A., Piel M., Bouckson-Castaing V., Bornens M. 2000. Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role of ninein // J Cell Sci 113:3013-3023

130. Mogilner A., Wollman R., Civelekoglu-Scholey G., Scholey J. 2006. Modeling mitosis // Trends Cell Biol 16: 88-96

131. Momand, J., Zambetti, G., Olson, D., George D., and Levine A. 1992. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation // Cell 69:1237-1245

132. Moritz M., Braunfeld M.B., Sedat J.W., Alberts В., Agard D.A. 1995. Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome // Nature 378: 638-640

133. Moritz M., Braunfeld M.B., Guenebaut V., Heuser J., Agard D.A. 2000. Structure of the gamma-tubulin ring complex: a template for microtubule nucleation // Nat Cell Biol 2: 365-370

134. Moss D.K., Betin V.M., Malesinski S.D., Lane J.D. 2006. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation // J Cell Sci 119: 2362-2374

135. Moss D.K., Lane J.D. 2006. Microtubules: forgotten players in the apoptotic execution phase // Trends Cell Biol 16: 330-338

136. Mullins J.M., Snyder J.A. 1981. Anaphase progression and furrow establishment in Nocodasole-arrested PtKi cells // Chromosoma 83:493-505

137. Nedelec F. 2002. Computer simulations reveal motor properties generating stable antiparallel microtubule interactions //J Cell Biol 158:1005-1015

138. Oakley B.R., Oakley C.E., Yoon Y., Jung M.K. 1990. Gamma-tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans // Cell 61: 1289-1301

139. O'connell C.B., Khodjakov A.L. 2007. Cooperative mechanisms of mitotic spindle formation//J Cell Sci 120: 1717-1722

140. Odell T.T., Jackson J.C.W., Reiter R.S. 1968. Generation cycle of rat megakaryocytes // Exp Cell Res 53: 321-328

141. Oftebro R., Wolf J. 1967. Mitosis of bi- and multinucleate HeLa cells // Exp Cell Res 48:39-52

142. Okuda M. 2002. The role of nucleophosmin in centrosome duplication // Oncogene 21:6170-6174

143. Olson K.R., Mcintosh J.R., Olmsted J.B. 1995. Analysis of MAP 4 function in living cells using green fluorescent protein (GFP) chimeras // J Cell Biol 130: 639-650

144. Ou Y.Y., Mack G.J., Zhang M., Rattner J.B. 2002. CEP110 and ninein are located in a specific domain of the centrosome associated with centrosome maturation// J Cell Sci 115: 1825-1835

145. Paintrand M., Moudjou M., Delacroix H., Bornens M. 1992. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations // J Struct Biol 108: 107-128

146. Pan H., Zhou F., Gao S.J. 2004. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induction of chromosome instability in primary human endothelial cells // Cancer Res 64: 4064-4068

147. Paturle L., Wehland J., Margolis R.I., Job D. 1989. Complete separation of tyrosinated, detyrosinated and nontyrosinatable brain tubulin subpopulations using affinity chromatography // Biochemistry 30: 10523-10528

148. Pera F, Rainer B, 1973. Studies of multipolar mitoses in euploid tissue cultures. I. Somatic reduction to exactly haploid and triploid chromosome sets // Chromosoma 42: 71-86

149. Phillips S.G., Rattner J.B. 1976. Dependence of centriole formation on protein synthesis // J Cell Biol 70: 9-19

150. Pihan G.A., Purohit A., Wallace J., Knecht H., Woda В., Quesenberry P., Doxsey S.J. 1998. Centrosome defect and genetic instability in malignant tumors // Cancer Research 58: 3974-3985

151. Piperno G., Fuller M.T. 1985. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of a-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms // J Cell Biol 101: 2085-2094

152. Piperno G., LeDizet M., Chang X-j. 1987. Microtubules containing acetylated a-tubulin in mammalian cells in culture // J Cell Biol 104:289-302

153. Pittman S., Geyp M., Fraser M., Ellem K., Peaston A., Ireland C. 1997. Multiple centrosomal microtubule organising centres and increased microtubule stability are early features of VP-16-induced apoptosis in CCRF-CEM cells // Leuk Res 21: 491-499

154. Popov A.V., Severin F., Karsenti E. 2002. XMAP215 is required for the microtubule-nucleating activity of centrosomes // Curr Biol 12: 1326-1330

155. Porter L.A., Lee J.M. 2001. Alpha-, beta-, and gamma-tubulun polymerization in response to DNA damage // Exp Cell Res 270:151-158

156. Quintyne N.J., Reing J.E., Hoffelder D.R., Gollin S.M., Saunders W.S. 2005. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering // Science 307: 127-129

157. Rao A.P., Rao P.N. 1976. The cause of G2-arrest in Chinese hamster ovary cells treated with anticancer drugs // J Natl Cancer Inst 57: 1139-1143

158. Redeker V., Levilliers N., Schmitter J.M., Le Caer J.P., Rossier J., Adoutte A., Bre M.H. 1994. Polyglycylation of tubulin: a posttranslational modification in axonemal microtubules // Science 266: 1688-1691

159. Rello-Varona S., Gamez A., Moreno V, Stockert J.C., Cristobal J., Pacheco M., Canete M., Juarranz A., Villanueva A. 2006. Metaphase arrest and cell death induced by etoposide on HeLa cells // Int J Biochem Cell Biol 38:2183-2195

160. Rieder C.L., Bajer A.S. 1977. Effect of elevated temperatures on spindle microtubule and chromosome movements in cultured lung cells // Cytobios 18: 201-234

161. Rieder C.L. 1982. The formation, structure and composition of the mammalian kinetochore and kinetochore fiber // Int Rev Cytol 79: 7-58

162. Rieder C.L., Borisy G.G. 1982. The centrosome cycle in PtK2 cells: assymetric distribution and structural change in the pericentriolar material // Biol Cell 44: 117-132

163. Rieder C.L., Salmon E.D. 1994: Motile kinetochores and polar ejection forces dictate chromosome position on the vertebrate mitotic spindle // J Cell Biol 124:223-233

164. Rieder C.L. 2005. Kinetochore fiber formation in animal somatic cells: dueling mechanisms come to a draw // Chromosoma 114: 310-318

165. Ring D., Hubble R., Kirschner M. 1982. Mitosis in a cell with multiple centrioles // J Cell Biol 94: 549-556

166. Robbins E., Jentzsch G., Micali A. 1968. The centriole cycle in synchronized HeLa cells // J. Cell Biol 36: 329-339

167. Rosenbaum J. 2000. Cytoskeleton: functions for tubulin modifications at last //CurrBiol 10: 801-803

168. Sankaran S., Parvin J.D. 2006. Centrosome function in normal and tumor cells // J Cell Biochem 99: 1240-1250

169. Saragoni L., Hernandez P., Maccioni R.B. 2000. Differential association of tau with subsets of microtubules containing posttranslationally-modified tubulin variants in neuroblastoma cells // Neurochem Res 25: 59-70

170. Sato C., Nishizawa K., Yahara I. 1980. Abnormal organization of mitotic spindles in cultured mammalian cell after X-irradiation as visualized with anti-tubulin antibody// Cell Struct and Funct 5: 93-103

171. Sato Ch., Kuriyama R., Nishizawa K. 1983. Microtubule organizing centres abnormal in number, structure and nucleating activity in X-irradiation mammalian cells // J Cell Biol 96: 776-782

172. Sato N., Mizumoto K., Nakamura M., Nakamura K., Kusumoto M., Niiyama H., Ogawa Т., Tanaka M. 1999. Centrosome abnormalities in pancreatic ductal carcinoma // Clin Cancer Res 5: 963-970

173. Sato N., Mizumoto K., Nakamura M., Ueno H., Minamishima Y.A., Farber J.L., Tanaka M. 2000a. A possible role for centrosome overduplication in radiation-indusedcell death// Oncogene 19: 5281-5290

174. Sato N., Mizumoto K., Nakamura M., Tanaka M. 2000b. Radiation-induced centrosome overduplication and multiple mitotic spindles in human tumor cells // Exp Cell Res 255:321-326

175. Saunders W. 2005. Centrosomal amplification and spindle multipolarity in cancer cells // Semin Cancer Biol 15:25-32

176. Schmid W. 1966. Multipolar spindles after endoreduplication // Exp Cell Res 42:201-204

177. Schnackenberg B.J., Palazzo R.E. 1999. Identification and function of the centrosome centromatrix // Biol Cell 91:429-438

178. Scholey J.M., Rogers G.C., Sharp D.J. 2001. Mitosis, microtubules, and thematrix // J Cell Biol 154: 261-266

179. Schroer Т.A. 1994. Structure, function and regulation of cytoplasmic dynein // Curr Opin Cell Biol 6: 69-73

180. Schultze B. 1981. Double labeling autoradiography. Cell kinetic studies with 3H- and 14C-thymidine // J Histochem and Cytochem 29: 109-116

181. Schulze E., Asai D.J., Bulinski J.C., Kirschner M. 1987. Posttranslational modification and microtubule stability // J Cell Biol 105: 2167-2177

182. Sharp G.A., Osborn M., Weber K. 1981. Ultrastructure of multiple microtubule initiation sites in mouse neuroblastoma cells // J Cell Sci 47: 1-24

183. Sharp D.J., Rogers G.C., Scholey J.M. 2000. Microtubule motors in mitosis //Nature 407: 41-47

184. Sherline P., Shiavone K. 1978. High molecular weight MAPs are part of the mitotic spindle // J Cell Biol 77: R9-12

185. Sherwood S.W., Sheridan J.P., Schimke R.T. 1994. Induction of apoptosis by the anti-tubulin drug colcemid: relationship of mitotic checkpoint control to the induction of apoptosis in HeLa S3 cells // Exp Cell Res 215: 373-379

186. Schiebel E. 2000. y-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation // Curr Opin Cell Biol 12: 113-118

187. Snyder J.A., Mcintosh J.R. 1975. Studies on the centriolar region of mammalian cells at the onset of mitosis // J Cell Biol 70: 368a

188. Snyder J.A., Hamilton B.T., Mullins I.M. 1981. Anaphase onset marks. Loss of centrosomal microtubule initiation capacity//J Cell Biol 91: 313a

189. Sorger P.K., Dobles M., Tournebize R., Hyman A.A. 1997.Coupling cell division and cell death to microtubule dynamics // Curr Opin Cell Biol 9: 807-814

190. Stearns Т., Evans L., Kirschner M. 1991. Gamma-tubulin is a highly conserved component of the centrosome // Cell 65: 825-836

191. Stephenson J.R., Reynolds R.K., Aaronson S.A. 1973. Characterization of morphologic revertants of murine and avian sarcoma virus-transformed cells // J Virol 11:218-222

192. Stein P.A., Toret C.P., Salic A.N., Rolls M.M., Rapoport T.A. 2002. A novel centrosome-associated protein with affinity for microtubules // J Cell Sci 115: 3389-3402

193. Stubblefield E., Brinkley B.R. 1967. Architecture and function of the mammalian centriole. Formation and fate cell organelles // Ed. by Warren. New York-London: Acad. Press, p 175-200

194. Theurkauf W.E. 2001. TACCing down the spindle poles // Nat Cell Biol 3: El 59-161

195. Todorov P.T., Hardisty R.E., Brown S.D. 2001. Myosin VIIA is specifically associated with calmodulin and microtubule-associated protein-2B (MAP-2B) // Biochem J 354: 267-274

196. Trinczek В., Ebneth A., Mandelkow E.M., Mandelkow E. 1999. Tau regulates the attachment/detachment but not the speed of motors in microtubule-dependent transport of single vesicles and organelles // J Cell Sci 112: 2355-2367

197. Tucker R.W., Pardee A.B., Fujiwara K. 1979. Centriole ciliation is related to quiescence and DNA synthesis in 3T3 cells // Cell 17: 527-535

198. Vandecandelaere A., Pedrotti В., Utton M.A., Calvert R.A., Bayley P.M. 1996. Differences in the regulation of microtubule dynamics by microtubule-associated proteins MAP IB and MAP2 // Cell Motil Cytoskeleton 35: 134-146

199. Vandre D.D., Borisy G.G. 1989.Anaphase onset and dephosphorylation of mitotic phosphoproteins occur concomitantly // J Cell Sci 94: 245-258

200. Varmark H. 2004. Functional role of centrosomes in spindle assembly and organization // J Cell Biochem 91: 904-914

201. Vinogradova T.M., Balashova E.E., Smirnov V.N., Bystrevskaya V.B. 2005. Detection of the centriole tyr- or acet-tubulin changes in endothelial cells treated with thrombin using microscopic immunocytochemistry // Cell Motil Cytoskeleton 62: 1-12

202. Vorobjev I.A., Chentsov Y.S. 1982. Centrioles in the cell cycle. I. Epithelial cells // J Cell Biol 98: 938-949

203. Vorobjev I.A., Nadezhdina E.S. 1987. The centrosome and its role in the organization of microtubules // Int Rev Cytol 106:227-293

204. Vorobjev I.A., Svitkina T.M., Borisy G.G. 1997. Cytoplasmic assembly of microtubules in cultured cells // J Cell Sci 110: 2635-2645

205. Walczak C.E., Vernos I., Mitchison T.J., Karsenti E., Heald R. 1998. Model for the proposed roles of different microtubule based motor proteins in establishing spindle bipolarity // Curr Biol 8: 903

206. Wang Q., Hirohashi Y., Furuuchi K., Zhao H., Liu Q., Zhang H., Murali R., Berezov A., Du X., Li В., Greene M.I. 2004. The centrosome in normal and transformed cells // DNA Cell Biol 23: 475-489

207. Watanabe N., Yamaguchi Т., Akimoto Y., Rattner J.B., Hirano H., Nakauchi H. 2000. Induction of M-phase arrest and apoptosis after HIV-1 Vpr expression through uncoupling of nuclear and centrosomal cycle in HeLa cells // Exp Cell Res 258: 261-269

208. Webster D.R, Wehland J., Weber K., Borisy G.G. 1990. Detyrosination of alpha tubulin does not stabilize microtubules in vivo IIJ Cell Biol 111: 113-122

209. Wehland J., Schroeder H.C., Weber K. 1986. Isolation and purification of tubulin tyrosine ligase // Meth Enzymol 134: 170-179

210. Wehland J., Weber K. 1987a. Tubulin-tyrosine ligase has a binding site on beta-tubulin: a two-domain structure of the enzyme // J Cell Biol 104: 1059-1067

211. Wehland J., Weber K. 1987b. Turnover of the carboxy-terminal tyrosine of alpha-tubulin and means of reaching elevated levels of detyrosination in living cells//J Cell Sci 88: 185-203

212. Wiese C., Zheng Y. 2006. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond // J Cell Sci 119:4143-4153

213. Winkelhaus S., Hauser M. 1997. Ortho-vanadate affects both the tyrosination/ detyrosination state of spindle microtubules and the organization of XTH-2 spindles // Eur J Cell Biol 73: 306-315

214. Witt P.L., Ris H., Borisy G.G. 1980. Origin of kinetochore microtubules in Chinese hamster ovary cell // Chromosoma 81:483-505

215. Wittmann Т., Hyman A., Desai A. 2001. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors // Nat Cell Biol 3: E28-34

216. Woehlke G., Schliwa M. 2000. Walking on two heads: the many talents of kinesin // Nat Rev Mol Cell Biol 1: 50-58

217. Wolf K.W., Spanel-Borowski K. 1995. Acetylation of a-tubulin in different bovine cell types: implications for microtubule dynamics in interphase and mitosis // Cell Biology International 19: 43-52

218. Wordeman. L. 2005. Microtubule-depolymerizing kinesins // Curr Op Cell Biol 17: 82-88

219. Xia L., Hai В., Gao Y., Burnette D., Thazhath R., Duan J., Bre M.H., Levilliers N., Gorovsky M.A., Gaertig J. 2000. Polyglycylation of tubulin is essential and affects cell motility and division in Tetrahymena thermophila // J Cell Biol 149: 1097-106

220. Yih L.H., Tseng Y.Y., Wu Y.C., Lee T.C. 2006. Induction of centrosome amplification during arsenite-induced mitotic arrest in CGL-2 cells // Cancer Res 66:2098-2106

221. Yvon A.M., Wadsworth P. 1997. Non-centrosomal microtubule formation and measurement of minus end microtubule dynamics in A498 cells // J Cell Sci 110: 2391-2401

222. Zeng C., He D., Brinkley B.R. 1994. Localization of NuMA protein isoforms in the nuclear matrix of mammalian cells // Cell Motil Cytoskeleton 29: 167-176

223. Zhai Y., Kronebusch P.J., Simon P.M., Borisy G.G. 1996. Microtubule dynamics at the G2/M transition: abrupt breakdown of cytoplasmic microtubules at nuclear envelope breakdown and implications for spindle morphogenesis // J Cell Biol 135:201-214

224. Zheng Y., Jung M.K., Oakley B.R. 1991. Gamma-tubulin is present in Drosophila melanogaster and Homo sapiens and is associated with the centrosome //Cell 65:817-823

225. Zhou Y., Ching Y.P., Chun A.C., Jin D.Y. 2003. Nuclear localization of the cell cycle regulator CDH1 and its regulation by phosphorylation // J Biol Chem 278: 12530-12536

226. Zieve G.W., Turnbull D., Mullins M. et al. 1980. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use the reversible microtubule inhibitors nocodasole. Nocodasole accumulated mitotic cells // Exp Cell Res 126: 397-405

Информация о работе

Балашова, Елена Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деления - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы