Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функций белков, ассоциированных с микротрубочками, с помощью специфических антител

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функций белков, ассоциированных с микротрубочками, с помощью специфических антител"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи РОДИОНОВ ВЛАДЮР ИВАНОЗЙЧ

УЖ 576.353

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ БЕЛКОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ШРОТРУНЖАМИ. С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТЕГЕЯ

03.00.25 - Клеточная биология

Автореферат диссертации ка соискание ученой степени доктора биологических наук в ферте научного доклада

Косква - 1993 г.

Работа выполнена в Институте физико-химической биолог им. А.Н.Белозерского МГУ и в Институте бедка РАН.

Официальные оппоненты: член-корреслондент РАН Л.М.Чайлахян доктор биологических наук И.А.Воробьев доктор медицинских наук Ю.А.Ровенский Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта,

Защита диссертации состоится "-^у*' 1УОг.

в ^часов на заседании Спевдшизированного совета Д.053.05.68 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическое факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь совета

кандидат биологических наук Е.Н.Калистратовг

.ir

зааюэтш, .

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Микротрубочки - фибриллярные клеточные структуры, широко распространенные в клетках эукариот. Вместе с микрофиламентами и промежуточными филаментами, микротрубочки образуют цитоскелёт. Микротрубочки участвуют в поддержании формы клеток, важны для их направленной миграции и даже могут непосредственно участвовать в движении клеток, являясь основным компонентом ресничек и жгутиков. Кроме того, микротрубочки участвуют в разнообразных процессах внутриклеточного транспорта в митотических и интерфазных клетках. Именно микротрубочки являются основным компонентом митотического веретена, а работы последних лет прямо предполагают их участие и в транспортных процессах в интерфазных клетках.

В состав цитоплазматических входит белок тубулин, образующий их стенки, и так называемые ассоциированные белки (или MAP, аббревиатура ОТ английского microtubule associated proteins). MAP, ПО-видимому, чрезвычайно важны как для самосборки микротрубочек, так и" для их функционирования. Различают 2 группы MAP - структурные НАР и белки-транслокаторы. Структурные MAP соочищаются с микротрубочками в циклах сборки-разборки и стимулируют полимеризацию очищенного тубулина, что указывает на их важную роль в регуляции сборки микротрубочек в клетках. Кроме того, судя по данным электронной микроскопии, они образуют "выступы" на стенках микротрубочек и, вероятно, опосредуют взаимодействие микротрубочек с другими внутриклеточными структурами и органеллами. В препаратах микротрубочек из мозга млекопитающих была выявлены 3 белка, обладающих перечисленными свойствами - MAPI, МАР2 и тау.

Другую группу ассоциированных с микротрубочками белков составляют белки-транслокаторы. Эти белки являются механохимическими АТФазами, способными перемещать частицы вдоль микротрубочек или сами микротрубочки вдоль субстрата. В цитоплазме зукариотических клеток наиболее расспрастранены 2 сиовных зависших от микротрубочек белка-транслокатора - кинезин и цитоплазматический динеин. Оба этих транслокатора были очищены и охарактеризованы в работах последних лет. Анализ двигательных свойств транслокаторов in vitro показал, что.кинезин должен перемещать цитоплазматические органел-

лы от центра клетки к ее периферии, а цитоплазматический динеин в обратном направлении.

Таким образом, накопленные к моменту начала нашей работы дан ные предполагали важную роль MAP в самосборке и функционировав микротрубочек. Вместе с тем, многие вопросы, связанные с MAP, ос тавались открытыми. Так, субъединичная структура MAP из мозга млекопитающих была исследована слабо, а об аналогах структурных MAP 1 клетках, отличных от нейронов, мало что было известно. Хотя свойства кинезина, выявленные при исследовании транслокатора in vitro и его локализация на мембранных органеллах предполагали его непосредственное участие во внутриклеточном транспорте, неясно'было, в каких конкретно транспортных процессах в клетке кинезин принимает участие. Неясным оставался и вопрос о том какими свойствам должна обладать система микротрубочек в клетках для того, чтоб! эффективно поддерживать внутриклеточный транспорт: могут ли микротрубочки оставаться динамичными или они должны быть стабилизированы; должны ли микротрубочки быть свободными от структурных MAP, или молекулы этих белков, декорирующие стенки микротрубочек, не препятствуют транспортным процессам. Бее вышесказанное и'определило цель и непосредственные экспериментальные задачи настоящей работы.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование функций' и свойств белков, ассоциированных с микротрубочками: структурных MAP и белка-транслокатора на примере кинезина. При этом в качестве основного инструмента исследования были использованы антитела, специфичные к белкам микротрубочек.

Экспериментальные задачи работы состояли в следующем:

1. Получить набор моноклональных антител к структурным MAP из мозга крупного рогатого скота и использовать полученные антитела для выявления аналогов MAP в культивируемых клетках.

2. Получить поликлональные антитела к кинезину, подавляющие его двигательную активность.

3. Использовать полученные антитела к кинезину для выяснения роли кинезина и подобных ему белков во внутриклеточном транспорте: движении меланосом в меланофорах, в распределении цитоплаз-

матичесих органелл в фибробластах и в митотическом делении эпителиальных клеток негодом микроинъекций.

4. Применить метод микроинъекции антител к кинезину для выяснения его роли в определении формы и псевдоподиальной активности фиб-робластов. '

5. Исследовать свойства системы микротрубочек в меланофорах -клетках, специализирующихся на зависимом от кинезина внутринле-точном транспорте: выяснить насколько динамичны микротрубочки в таких клетках и изучить вопрос о том препятствуют ли структурные MAP взаимодействию гранслскагороз с микротрубочками.

Научная новизна работы В настоящей работе впервые проведено систематическое исследование функций структурных MAP и кинезина. Получен набор моноклональных антител к структурным MAP из мозга крупного рогатого скота. Охарактеризованы моноклональные антитела RN17, реагирующие с антигенной детерминантой общей для MAPI и МАР2, и узнающие в экстрактах культивируемых клеток белок с молекулярной массой 100 кД. Исследована внутриклеточная локализация 100кД-белка и показано, что он связан в фибробластах и эпителиальных клетках как с микротрубочками, так и с промежуточными филаментами и с окаймленными пузырьками, что впервые доказывает существование белков, способных взаимодействовать с разными внутриклеточными структурами одновременно.

Впервые доказано, что MAPI является субъединичным белком: с помощью моноклональных антител EI2 34кД-подипептид препэрата MAP из мозга крупного рогатого скота идентифицирован как легкая цепь MAPI.

Получены моноспецифичесие антитела к моторному домену кинезина, подавляющие зависимое от кинезина движение микротрубочек in vitro. С помощью микроинъекций этих антител впервые проведено систематическое исследование функций кинезина в культивируемых клетках. В частности обнаружено, что кинезин участвует в диспергировании ме-ланосом в меланофорах рыб и определяет внутриклеточное распределение митохондрий в фибробластах. Показано также, что иммунологичес-ки родственный кшезину белок важен для образования или поддержа-

ния структуры митотического веретена.

Показано, что в меланофорах рыб - в клетках, специглюирующихся на опосредованном кинезином внутриклеточном транспорте - микротрубочки отличаются высокой динамичностью. Это означает, что сборка и разборка микротрубочек в клетках является нормальным процессом и вряд ли оказывает заметное влияние на внутриклеточный транспорт. Показано, что с микротрубочками меланофоров связаны структурные MAP, которые, однако, не препятствуют движению меланосом, так как транслокаторы и структурные MAP связываются с разными участками на молекулах тубулина.

С помощью микроинъекций антител к кинезину продемонстрирована важная роль этого транслокатора в определении формы фибробластов и их псевдоподиальной активности. Это наблюдение позволяет в корне изменить представление о "цитоскелетной" функции микротрубочек и показывает, что они определяют форму клеток участвуя во внутриклеточном транспорте.

Научно-практическая ценность работы

Работа относится к числу фундаментальных научных, исследований. Полученные в ней данные позволяют расширить и конкретизировать представления о роли микротрубочек в процессах клеточной жизнедеятельности. Выявленные в работе функции кинезина и структурных MAP вносят существенных вклад в исследования биологии клетки.

Использованный в настоящей работе метод получения моноспецифических антител к зкспрессированному в е. сои полипептиду с последовательностью аминокислот, соответствующей моторному домену кинезина, может быть широко использован для исследования функций как отличных от кинезина механохимическях АТФаз, так и других ферментов. .

Данные об участии родственных кинезину белков в митозе открывают новые преспективы для поиска цитостатиков на основе ингибиторов кинезиноподобных транслокаторов.

Полученные моноклональные антитела к структурным MAP из мозга крупного рогатого скота могут быть использованы для дальнейшего • изучения роли этих белков в жизнедеятельности клеток.

Разработанный метод соосаздения белков с . обработанными субти-г лизином микротрубочками является одной из первых возможностей

классификации белков микротрубочек ка структурные MAP и белки-транслокаторы. Его успешне использование было продемонстрировано в

работе (Karasev et al., 1992, FEBS lett., 304:12-14).

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на iv и v Всесоюзных совещаниях по немышечным формам подвижности (Чернигов, 1984, 1983), на XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984), на рабочем совещании по молекулярным аспектам цитоскелета (Тбилиси, 1987), на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), на vin Европейском нейрохимическом конгрессе (Лейпциг, 1990), на 29, 30 и 31 Ежегодних конгрессах американского общества клеточных биологов (Хьюстон, 1989, Сан-Диего, 1990, Бостон, 1991) и на il Советско-Израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва, 1992).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I.I. Материалы. Фосфоцеллюлоза была получена от фирмы Whatman (Великобритания). Субтилизин (бактериальная протеаза, тип vin) -от фирмы sigma (США). Таксол был любезно предоставлен доктором М.саффнесом (Natural Products Branch, NIH, США). ОСТЭЛЬНЫе реаКТИВЫ были получены ОТ фирм Signa (США), Serva (ФРГ) И Merck (ФРГ).

1.2. Получение тубулина, структурных MAP, кинезина и цитоплазмати-ческого динеина. Препарат микротрубочек получали из мозга крупного рогатого скота в буфере А содержавшем 50 мМ имидазол-Hci, рн 6,8, 50 мМ ко!, 0,5 мМ Mgci2, 0,1 мМ ЭДГА, I мМ 2-меркаптоэтанол с помощью метода, основанного на циклах полимеризации-деполимеризации микротрубочек как описано в работе (Shelanski et al., Ргос• Natl. Acad.. Sei. USA, 1973, 70:765-768) С НвбОЛЫШИМИ МОДИфИКаЦИЯМИ (Kuznetsov et al., FEBS lett., 1978, 95:339-342). ТубулИН И СТруКтурные MAP разделяли с помощью ионообменной хроматографии на фос-фоцеллшозе (Weingarten et al., Ргос. Natl. Acad. Sei. USA, 1975, 72:1858-1862). При этом тубулин не связывался с ионообменником, а

MAP элшровали буфером А, содержавшем 0,5 M kci. Раствор MAP диа-лизовали против фосфатного буферного раствора и использовали в качестве антигена для получения моноклональных антитез, или диали-зовали против буферного раствора А и использовали в экспериментах по конкуренции с кинезином. Очищенный тубулин использовали для получения стабилизированных таксолом микротрубочек.

MAPI получали ПО методу (Kuznetsov et al., FEBS lett., 1981, 135:237-2-10).

Кинезин получали как описано в работе (Kuznetsov and Gelfand, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, 83:8530-8534). ДЛЯ ПОЛучеНИЯ цитоплазматического динеина пользовались методом (Paschal et al., J. Cell Biol., 1987^ 105:1273-1282).

1.3. Получение стабилизированных микротрубочек, их обработка субтилизином и использование для соосаждения MAP и кинезина. Для получения стабилизированных микротрубочек раствор хроматографичес-ки очищенного тубулина инкубировали в присутствии I мМ ГТФ и 10 мкМ таксола в течение 30 мин при 37°С. Для получения морфологически нормальных микротрубочек, состоящих из субъединщ тубулина, лишенных С-концевых регуляторных доменов, обработанные таксолом микротрубочки инкубировали в присутствии субтилизина (20 мкг/мл) в течение 12 часов при 37°С. Протеолиз останавливали инкубацией смеси с 2 мМ фенилметилсулъфонил фторидом I час при комнатной температуре. Для экспериментов по соосаждению суспензию интактных или обработанных субтилизином микротрубочек смешивали с раствором MAP или кинезина, а затем центрифугировали через слой 4M глицерина, приготовленного на буфере А при 120 OOQxg в течение 40 мин. Белковый состав осадков анализировали методом электрофореза.

1.4. Тест на двигательную активность кинезина. Для выявления способности кинезина опосредовать движение микротрубочек по стеклу раствор кинезина (0.2 мг/мл) помещали на покровные стекла, инкубировали 3 мин., удаляли избыток неадсорбщхдашшегося белка, а затем помещали на стекла суспензию стабилизированных таксолом микротрубочек и добавляли АТФ до- концентрации I мМ. За движением микротрубочек наблюдали с помощью Dic-микроскопии с электронным усилением видеосигнала. Для этого использовали микроскоп "Axiophot" ("op-ton", Германия), оснащенный видеокамерой çhainicon 2400-01 и-процессором изображения "Argus 100" ("Haraamatsu", ЯПОНИЯ).

1.5. Получение моноклональных антител к структурным MAP. • Для получения моноклональннх антител мышеи линии balb/c иммунизировали внутрибрюшинно I мг препарата MAP, смешанного с полным адьювантом Фрейда. Через 3 недели мышам вводили внутривенно еще по I мг препарата MAP, а еще через 3 дня животных забивали и сливали 10® клеток селезенки с I07 клеток миеломы рзхез Ags.653 с помощью обработки полизтиленгликолем 1500. Гибридные клетки выращивали на модифицированной среде Игла с модификацией Дальбекко, содержавшей эмбриональную телячъы шшротку (15%), ruiioixuia^i. ■-uu.:.;..1.,.,^ и тимидин. Клоны, продуцировавшие антитела к MAP, отбирали с помощью иммуноферментного анализа, реклонировэли 3 раза в селективной среде и анализировали специфичность продуцируемых ими антител с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, иммуноэлектронной микроскопии и иммуноблоттинга.

1.6. Получение моноспецифических антител к моторногу домену ки-незина. В качестве антигена для получения поликлональных антител к кинезину использовали полипептид, соответствовавший глобулярной N-Концевой части тяжелой цепи кинезина Drosophila melanogaster, полученный экспрессией в е. coli плзамиды pet-hd, любезно предоставленной доктором Л.Гольда?ейном и М.деКювье (Гарвардский университет, США). Фрагмент тяжелой цепи кинезина очищали из экстрактов бактерий препаративным электрофорезом в денатурирующих условиях и использовали для иммунизации кроликов. Моноспецифические антитела получали аффинной хроматографией иммуноглобулинов на колонке с ковалентно привязанным антигеном. Очищенные антитела концентрировали и использовали для микроинъекций и иммуноблоттинга. Преиммунные иммуноглобулины очищали из сыворотки крови осаждением 40% сульфатом аммония и хроматографией на Протеин А-Сефарозе.

1.7. йммунофлуоресцентная и .¿ммуноэлектронная микроскопия. Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки промывали фо-фатным буфером, пермеабилизировали раствором, содержавшем 1% или 0.1% Тритон Х-100 и фиксировали раствором глутарового альдегида или А% раствором формальдегида. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано В работе (Rodionov et al., Exptl. Cell Res., 1985, 159:377-387). Использовались полученные в работе моноклональные антитела, моноклональные антитела к тубулину (dmia, предоставленные доктором М.киршнером, University of California at San

Francisco, США), моноклональные антитела к виментину, а также поликлональные антитела к тубулину и виментину, полученные и охарактеризованные в Институте физико-химической биологии им. А.Н.Бе-лоьерского МГУ. В качестве.вторичных антител использовались антитела к иммуноглобулинам кроликов или мышей, конъюгированные с родамином или флуоресцеином. Окрашенные препараты просматривали и фотографировали с помощью Фотомикроскопа ш (opton,- Германия).

Для иммуноэлектронной микроскопии клетки фиксировали глутаровым альдегидом, как описано выше, последовательно обрабатывали первичными антителами и вторичными антителами, конъюгированными с частицами КОЛЛОИДНОГО золота, как описано В работе (Frens et al., 1972), заливали в Эпон и готовили ультратонкие срезы. Готовые препараты просматривали и фотографировали с помощью электронных микроскопов Hitachi HU11 ИЛИ Hitachi HU12 Прй ускоряющем НЭПрЯЖеЮШ 75 кв.

1.8. Культуры клеток. В работе использовались перевивные культуры клеток FBT (Machatkova and Pospisil, Folia Bio'ogica, 1975,

21:117) и cvi, а также первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов и нормальных человеческих диплоидных фибробластов (предоставлены В.И.Кухаренко, Медико-генетический научный центр АМН). Кроме того, в работе использовались первичные культуры мела-нофоров аквариумной рыбы тернеЦИИ (Gymnocorymbus ternetzi). ДЛЯ получения культур неланофоров чешуйки помещали в раствор коллаге-назы (I мг/мл) и,.после 30-60 мин. инкубации при 3Q°C, меланофоры смывали струей раствора Рингера из автоматической пипетки. Клетки помещали на напыленные углеподом покровные стекла и культизировали в модифицированной Дальбекко среде Игла с 20% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 12-18 часов при 30°С. Агрегацию меланосом в меланофорах вызывали добавлением в культуральную среду адреналина (Ю-5 M), а для диспергирования пигмента клетки помещали в раствор Рингера содержавший кофеин (5 мМ).

1.9. Микроинъекции. Для микроинъекций пользовались методом,

i

описанным в работе(Graessmann and Oraessmann, Proc. Natl. Acad, sei. usa, 1976, 73:366-370).- Антитела предварительно диализовали против буфера, содержавшего И4 шм ксх, з тм Mgci2 и з тм Naii2Po4, pH 7,0. Концентрация бел^а в растворах адхатсл составляла 3-18 иг/мл.

Меченный Х-родамином тубулип, использовавшийся для микроинъекций получали как описано ранее (Sammak and Borisy, Cell motil.

Cytoskel., 1988, 10:238-245).

I.10. Аналитические методы. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили В системе буферных растворов (Laernli, Nature, 1970 , 227:4406-4412).

Для иммуноблоттинга использовали метод полусухого электрофоре-тического переноса белков из полиакриламидных гелей на нитроцел-лялозные фильтры, которые далее окрашивали антителами как описано

В работе (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979 , 76:4350-4354).

АТФазную активность определяли по количеству неорганического фосфата, который освобождался в течение 30 минутной инкубации при 37°С. Концентрацию фосфата определяли модифицированным методом Дельсаля. (Panusz et al., nal. Biochem., 1970, 35:490-504).

Концентрацию бежа определяли по методу Лоури (Lowry et ai., j.

Biol. Chem., 1951, 193:265-275) ИЛИ ПО МвТОДУ БреДфОрДЭ (Bradford, Anal. Biochem., 1976, 72:248-254) ИСПОЛЬЗУЯ В Качестве Стандарта

бычий сывороточный альбумин.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ СТРУКТУРНЫХ MAP С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЫШХ

АНТИТЕЛ.

2.I.I. Идентификация 100кД-белка, иммунологически родственного MAPI и МАР2, ассоциированногв культивируемых клетках с мтсротру-бочками, промежуточными филаментами и окаймленными пузырьками.

Для исследования функций МаР нами был получен набор монокло-нальных' антител к MAP из мозга крупного рогатого скота. Полученные антитела были затем использованы для иммунофлуоресценгного окрашивания культивируемых клеток.

Антитела, которые продуцировал клон rni7, один из полученных клонов гибридом, при двойном иммунофлуоресцентном окрашивании выявляли в мышиных эмбриональных фибробластах, экстрагированных буфером с 0,1% Тритоном Х-100,тонкие фибриллы, плотность которых была более высокой в районах клеточных ядер. Многие из этих фиб-

рилл доходили до краев клеток. Кроне того, при большом увеличении в окрашенных антителами rwi7 фибробластах можно было видеть многочисленные флуоресцирующие точки. Аналогичным образом антителами rn'7 окрашивались человеческие диплоидные фибробласты и клетки эпителия трахеи быка.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами rn17 и антителами к тубулину показало,, что по крайней мере часть фибрилл, узнававшихся антителами rn17 соответствовала микротрубочкам.В ми-тотических клетках антитела реагировали с митотическими веретенами. Внутриклеточное распределение антигена rn17, однако, не полностью соответствовало внутриклеточному распределению тубулина.Это различие легко выявлялось при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток, обработанных колцемидом и другими агентами, вызывавшими деполимеризацию микротрубочек. В таких клетках антитела knit выявляли систему промежуточных филаментов, коллапсировавших вокруг клеточных ядер. Кроме того, антитела rni7 окрашивали фибриллы и в клетках, которые были последовательно экстрагированы буферами, содержавшими Тритон Х-100 и 0.6 м kci. Такая экстракция приводит к деполимеризации и микротрубочек и микрофиламентов, но оставляет промежуточные филаменты интактными. Таким образом, в клетках с разрушенными микротрубочками, распределение антигена rn17 совпадало с распределением промежуточных филаментов. Хотя нельзя было исключить, что антиген rn17 связывался с промежуточными филамента-ми уже после деполимеризации микротрубочек, более правдоподобным представлялось, что антитела rn17 связывались не только с микротрубочками, но и с промежуточными филаментами, а разрушение микротрубочек лишь облегчало выявление связанного с промежуточными филаментами антигена.

Для более детального исследования распределения антигена RN17 была использована иммуноэлектронная микроскопия. Мышиные гмбрио-нальнке фибробласты, пермеабилизированные детергентом, обрабатывали антителами rn17 и вторичными антителами, конъюгированными с 5 нм частицами коллоидного золота, заливали в Эпон, и готовили ультратонкие срезы. Для сравнения клетки обрабатывали также антителами к тубулину. Электронная микроскопия полученных препаратов' показала, что в клетках, обработанных антителами к тубулину, частицы золота равномерно распределялись вдоль микротрубочек. В то же

т?.

время, в обработанных антителами RN17 клетках, частицы золота были связаны не только с микротрубочками, но и с промежуточными фила-ментами, а также с везикулами диаметром около 0.1 мкм, которые, по-видимому, представляли собой окаймленные пузырьки, так как на их поверхности имелась оболочка характерной ультраструктуры толщиной примерно 15 нм. Эти везикулы, с которыми связывались антитела RN17, вероятно,соответствовали тем светящимся точкам, которые выявлялись при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток.

Чтобы выяснить, действительно ли антитела rn17 реагировали с окаймленными пузырьками, было использовано их характерное свойство - участие в рецептор-опосредованном зндоцитозе. В качестве маркера использовался белок плазмы крови «¿-макроглобулин,поступающий в клетки путем рецептор-опосредован- ного эндоцигоза. Мышиные эмбриональные фибробласты инкубировали с а2-макроглобулином, конъюгиро-ванным с частицами коллоидного золота диаметром 10 нм, а затем фиксировали, пермеабилизировали буфером с Тритоном Х-100, и обрабатывали антителами rn17 и вторичными антителами, конъюгированными с частицами коллоидного золота диаметром 5 нм. Электронная микроскопия показала, что частицы коллоидного золота диаметром 5 нм были связаны с окаймленными пузырьками и рецептосомами, содержавшими 10 нм-частицы, связавшие «¿-макроглобулин и, следовательно, антиген hni7 локализовался на мембранных органеллах, участвующих в рецептор-опосредованном эндоцитозе.

Иммуноблоттинг показал, что антитела rn17 узнавали в препаратах белков микротрубочек из мозга крупного рогатого скота высокомолекулярные белки MAPI и МАР2. В то же время, в экстрактах культивируемых клеток (мышиных эмбриональных фибробластов и клеток эпителия трахеи быка) антитела узнавали полипептид с молекулярной массой около 100 кД.

Таким образом, антитела RN17 позволили впервые идентифицировать белок с молекулярной массой 100 кД, связанный в цитоплазме одновременно с несколькими внутриклеточными структурами - с микротрубочками, с промежуточными филаментами и с окаймленными пузырьками и рецептосомами. Возможно, обнаруженный в настоящей работе 100 кД-белок относится к так называемым белкам clip (cytoplasmic linker proteins, Pierre et al., Cell, 1992, 70:887-890). ЗамаНЧИВО

предположить, что 100 кД-белок участвует ао внутриклеточном транс-

порте окаймленных пузырьков и непосредственно занят в зндоцитозе, однако это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.

2.1.3. Идентификагчя 34кД-полилептида препарата микротрубочек как

легкой цепи MAPI.

Другой клон гибридомы, El2, продуцировал антитела, которые, по данным иммуноблоттинга реагировали с белком препарата микротрубочек из мезга крупного рогатого скота, имевшем молекулярную массу 34 кД. Поскольку полипептид с такой же молекулярной массой соочи-щался С тяжелой цепью MAPI (Kuznetsov et al., FEBS lett., 1981, 135:241-244; Vallee and Davis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, 80:1342-1346), можно было предположить, что MAPI является субъединичным белком и 34кД-полипептид представляет собой его легкую цепь. Действительно, результаты иммуноблоттинга показали, что антитела EI2 узнавали 34кД-белок и в очищенных препаратах MAPI. Чтобы удостовериться в том, что 34кД-белок является легкой цепью MAPI, был получен препарат, обогащенный высокомолекулярными белками, ассоциированными с микротрубочками, который был последовательно проинкубирован с антителами EI2 и с моноспецифическими кроличьими антителами против иммуноглобулинов мышей. Полученные преципитаты были собраны центрифугированием и проанализировамы с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Результаты электрофореза показали, что тяжелая цепь MAPI,, но не тяжелая цепь МАР2, специфично включалась в преципитат.

Было известно, что тяжелая цепь MAPI гетерогенна и при элект-рофоретическом анализе препаратов MAPI в градиентных гелях удается выявить 3 компонента, названные, соответственно, MAPIA, MAPIB и

MAPIC (Bloom et al., J. Cell Biol., 1984, 98:320-330). АНЭЛИ? П0-

лученных преципитатов в градиентном геле показал, что в них содержались 2 типа тяжелых цепей MAPI: MAPIA и MAPIB. Таким образом, результаты этих экспериментов показали, что 34 кД-полипептид препарата микротрубочек действительно представляет собой легкую цепь MAPI, связанную с тяжелыми цепями 2 типов (MAPIA и MAPIB).

Различают 2 участка тяжелой цепи MAPI - участок, обеспечиваю-' щий контакт с молекулами тубулина, составляющими стенку микротрубочки, и участок, образующий выступ на поверхности

микротрубочки.Такие выступы хорошо видны в электронный микроскоп

(Kuznetsov et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 119:173178; Vallee and Davis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, 80:13421346). Было интересно выяснить, с каким из этих участков тяжелой цепи связывалась легкая цепь MAPI. Для ответа на этот вопрос был использован метод ограниченного протеолиза. Очищенные препараты MAPI инкубировали с альфа-химотрипсеном в течение разных промежутков времени, а затем анализировали их полипептидаый состав электрофорезом. Результаты этих экспериментов показали, что после 1-2 минут инкубации 6 мкг MAPI с 0.03 мкг альфа-химотрш ;ина при комнатной температуре легкая цепь MAPI оставалась интактной, а тяжелая цепь расщеплялась с образованием 120кД-фрагмента. Как 120кД-фрагмент тяжелой цепи, так и легкая цепь соосаадались со стабилизированными таксолом микротрубочками. Электронная микроскопия ультратонких срезов осадков таких микротрубочек показала, что выступы на их поверхности были значительно более короткими по сравнению с выступами на поверхности микротрубочек, полученных в присутствии MAPI, не подвергавшегося протеолизу.

Результаты этих экспериментов предполагали, что легкая цепь МАРГ взаимодействовала со 120 кД-фрагментом тяжелой цепи, обеспечивавшего связывание молекул MAPI с микротрубочками. Альтернативное объяснение полученных данных, однако, состояло в том, что легкая цепь MAPI и фрагмент его тяжелой цепи связывались с микротрубочками независимо. Чтобы выбрать между этими возможностями, были поставлены эксперименты по иммунопреципитации аналогичные тем, которые были описаны выше, но вместо препаратов интактного MAPI в них были использованы препараты MAPI, обработанного альфа-химотрипсином. Результаты этих экспериментов убедительно показали, что 120кД-фрагмент тяжелой цепи MAPI включался в преципитаты, и, следовательно, образовывал комплекс с легкой цепью.

Таким образом, с помощью антител EI2 было показано, что MAPI является субъединичным белком и в состав его молекул кроме 350 кД-тяжелой цепи входит еще и легкая цепь с молекулярной массой 34 кД, которая связывается со 120 кД--фрагментом тяжелой цепи, взаимодействующей со стенкой микротрубочки.

Т5

2.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ КИНЕЗИНА С ПОМОЩЬЮ МИКРОИНЪЕКЦИИ МОНОСПЕ-

ЦИФКЧЕСКИХ АНТИТЕЛ. 2.2.1. Получение антител к кинезину, подавляющих его двигательную

активность.

Кинезин является механохимической АТФазой, способной in vitro перемещать частицы' (в том числе, например, частицы латекса или стекла) по микротрубочкам или сами микротрубочки по субстрату

(Vale, Annu. Rev. Cell Biol., 1987, 3:317-378! Gelfand, Curr.

opin. cell Bioi., 1:63-66). Опосредуемое кинезином движение отличается строгой направленностью. Каждая микротрубочка является полярной структурой, так как концы ее различаются по динамическим свойствам. Кинезин вызывает движение от так называемого минус-конца микротрубочки к ее так называемому плюс-концу. Поскольку большинстве клеток минус-концы связаны с локализованной у клеточного ядра центросомой, а плюс-концы обращены к плазматической мембране, то кинезин in vivo должен обеспечивать движение орГанелл от центра клетки к ее периферии (см. рис. I).

Рис. I. Схематичное изображение транспорта мембранных органелл по микротрубочкам. МТ - микротрубочка; О - мембранные органеллы; MAP - структурные MAP, связанные со стенкой микротрубочки; Т - белковые транслокаторы.

Молекулы кинезина состоят из 2 тяжелых и 2 легких цепей (Bloom

et al., Biochemistry, 1988, 27:3409-3416; Kuznetsov et al. , EHBO j., 1988, 7:353-357). Молекулярные массы тяжелой и легкой цепи кинезина составляют соответственно 120 кД и 62 кД. На N-конце каждой тяжелой цепи локализован так называемый моторный домен, содержащий участок связывания АТФ и участок, отвечащий за взаимодействие С микротрубочками (Yang et al., Cell, 1989, 56:879-889). Mo-торный домен кинезина может поддерживать движение микротрубочек in

vitro" (Yang et al. , Science, 1990, 249:42-46). МОНОКЛОНЭЛЬНЫе ЭН-

титела к этомудомену подавляют вызываемое кинезином скольжение микротрубочек ПО субстрату (Ingold et al., J.Cell Biol., 1988, 107:2657-2667).

Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемых клеток антителами к кинезину выявило его локализацию на мембранных органеллах, что предполагает участие кинезина во внутриклеточном транспорте

(Pfister et al., J.Cell Biol., 1989, 108:1453-1463). ДеЙСТВИТвЛЬ-HO, В работе (Hollenbeck and Swanson, Nature, 1990, 346:864-866)

было показано, что внутриклеточное рапределение лизосом в макрофагах зависит от кинезина. Однако систематически вопрос о функциях кинезина к началу настоящей работы не был исследован.

Для изучения функций кинезина и выяснения его роли во внутриклеточном транспорте мы получили моноспецифические антитела против глобулярного N-концевого домена тяжелой цепи кинезина Drosophiia. Результаты иммуноблоттинга показали, что полученные антитела реагировали с кинезином, выделенным из мозга крупного рогатого скота и, следовательно, не были видоспецифичными.

Мы проверили влияют ли полученные антитела на вызываемое кинезином скольжение стабилизированных таксолом микротрубочек по субстрату in vitro. Для этого кинезин из мозга крупного рогатого скота, в концентрации 0,2 мг/мл, адсорбировали на покровных стеклах, промывали стекла буфером для удаления избытка несвязав-шегося белка, и использовали их для 2 серий экспериментов. В первой серии стекла с сорбированным кинезином преинкубировали с антителами.. взятыми в концентрации 0,1-0,5 мг/мл, наносилисуспензию стабилизированных микротрубочек и АТФ и измеряли скорости движения мшсротрубочек по субстрату с помощью микроскопии с электронным усилением видеосигнала. Во второй серии экспериментов на покрытые

кинезином стекла помещали вначале смесь стабилизированных микротрубочек и АТФ, а затем добавляли антитела, взятые в разных концентрациях, и, как и в первой серии, измеряли скорости движения микротрубочек. Результаты анализа движения микротрубочек и измерения скоростей движения показаны в таблице I.

Таблица I. Влияние антител к кинезину на скорость скольжения микротрубочек по покрытому кинезином субстрату.

Скорость скольжения микротрубочек, мкм/сек при разных концентрациях антител

0 мг/мл 0,3 мг/мл 0,4 мг/мл 0,5 мг/м

Антитела, затем микротрубочки е 0,86-0,07 0,8^0,08 нет прикрепленных микротрубочек.

Микротрубочки, затем антитела 0,85-0,08 0,91-0,10 0 -

Преиммунные igG, затем микротрубочки. - - - 0,97-0,0

Прочерк означает, что значение скорости в этих условиях не определяли.

Как видно из таблицы, результаты исследований движения микротрубочек показали, что если стекла с сорбированным кинезином обрабатывали антителами, то при концентрации антител 0,4-0,5 мг/мл микротрубочки не прикреплялись к субстрату, вероятно, потому, что кинезин терял способность с ними взаимодействовать. Если же антитела добавляли вслед за микротрубочками, то они не оказывали вли-. яния на прикрепление микротрубочек, но подавляли их скольжение по' субстрату, вероятно, индуцируя образование ригорных комплексов между микротрубочками и кинезином. Преиммунные иммуноглобулины не

J В

оказывали влияния на скольжение микротрубочек вне зависимости от порядка их внесения в инкубационную смесь. Таким образом, результаты этих экспериментов показали, что нами были получены антитела к кинезину, которые не были видоспецифичными и подавляли двигательную активность кинезина in vitro. Полученные антитела были затем использованы для изучения с помощью микроиньекций функций этого белка в различных клетках.

2.2.2. Роль кинезина в движении меланосом в меланофорах.

В качестве первой модели для исследования функций кинезина мы выбрали меланофоры рыб. Дермальные меланофоры - специализированные клетки, в цитоплазме которых имеются тысячи меланосом, представляющих собой мембранные органеллы, содержащие черный пигмент меланин. У многих животных, в том числе у рыб, меланосомы в цитоплазме меланофоров способны направленно двигаться в ответ на нейрогума-ральные стимулы: они или перемещаются к центру клетки, где собираются в плотный сферический агрегат, или равномерно диспергируют по всей цитоплазме, У меланофоров в культуре агрегацию меланосом можно вызвать обработкой адреналином, а диспергирование - обработкой кофеином (см. Рис. 2). Эти движения меланосом в меланофорах имеют очевидное приспособительное значение, так как служат для изменения интенсивности окрашивания кожных покровов животных. У рыб меланосомы способны двигаться особенно быстро: скорость их движения во время агрегации может достигать нескольких десятков микрометров в секунду (СМ. обзоры: Schliwa, Cell and Muscle Motility, 1984, 5:182; McNiven and Porter, J. Cell Biol., 1984, 99:152з-158s).

Интересно, что движение меланосом удается вызвать и во фрагментах меланофоров, полученных микрохирургическими методами (McNiven et al., Cell, 1984, 37:753-758). НЭМИ бЫЛО ПОКаЗЭНО, ЧТО способность к перемещению пигмента сохранялась и в таких фрагментах меланофоров, которые были получены фрагментацией клеток с диспергированным пигментом лучом лазера.

Хорошо известно, что во внутриклеточном транспорте участвует цитоскелет (Schliwa, Cell and Muscle Motility, 1984, 5:1-82). ЦИ-тоскелет меланофоров представлен микрофиламентами, сосредоточенными в кортикальном слое (Schliwa et al., J. Cell Biol., 1981, 89:267-275), И раДИаЯЬНО ОрГаНИЗОВаННЫМИ микротрубочками (Schliwa

? j.j кп \

\

ft

1 -Ь

t

■Л I.X >L _ _ В Г ; f^KKS

Fhc. 2. Вызванная адреналином агрегация меланосом в меланофорах тернеции; А - меланофор с _диспергированным пигментом; Б -та же клетка через 15 нин. после добавивши адреналина.

et ai., J. Coil Biol., 1378, 75:220-23G). 0 TOM ИМ0ЮТСЯ ЛИ В КЗЛа

нофорах третий компонент цитоскедета - промежуточные филаменты, однако, ничего не било известно. Нам удалось показать, что при иммунофлуорзсцентном окрашивании моланофоров тернеции моноклональ-¡ше и поликлональше антитела к виментину выявляли радиальную сеть фибрилл, устойчивых к обработке 0,6 М kci и покодазолом, то есть обладающих теми свойствами, которые были известны для промежуточных филаментов (Рис. 3). Более того, фибриллы с диаметром близким к диаметру промезкуточ1шх филаментов (100 А) были видны при электронной микроскопии ультратонких срезов моланофоров. Иммуноблотгинг выявил присутствие белка промежуточных филаментов пыментина в ли-затах меланофоров. Таким образом, результаты нашего исследования показали, что в неланофорах имеется радиальная сеть швдоптккозих промежуточных филаментов.

Исследование роли отдельных элементов цитоскелета в транспорте меланосом в мелаиофорах показало, что пи агрегация кп дцепергкро-вание пигментных гранул на подавлялись после разреши сети октановых микрофиламзцтов и, следовательно, не зависели от актомиози-

—-----ц

/8/frJ .. h

* V - VM '

> - _ I . ? - •

I ■ ■ , К

Рис. 3. Двойное геадунофлуоресцентное окрашивание промежуточных

филаментов (А) и микротрубочзк (Б) в культивируемом мела-нофоре с агрегированными меланосомами.

на. В настоящей работе мы инъецировали в меланофоры антитела к виментину, которые связывались с промежуточными филаментами в цитоплазме меланофоров. Декорирование промежуточных филаментов антителами, однако, не оказывало никакого влияния на движение мелано-сом. В то же время, показано, что разрушение микротрубочек подавляло как агрегацию, так и диспергирование пигмента (schiiwa, international ceil Biology I980-I98I, 1981, 275-285). Следователь-но,транспорт пигмента в меланофорах зависит от микротрубочек, а не от других компонентов цитоскелета. Поэтому возник естественный вопрос участвуют ли в.нем белки-транслокаторы и, в частности,кине-зин.

Чтобы выяснить, имеется ли кинезин в меланофорах, был поставлен иммуноблоттинг с экстрактами меланофоров тернеции. Результата И№1уноблотпшга показали, что полученные нами антитела к кинезину реагировали в лизатах меланофоров с единственным полипептидом, имевшим молекулярную массу 135 кД. Таким образом, в меланофорах имелся кинезин и-полученные нами антитела с ним реагировали.'

Мы ввели затем антитела к кинезину в меланофоры с диспергированными меланосомами, ■ и, через 1-2 часа индуцировали агрегацию меланосом адреналином, а после завершения агрегации отмыли клетки от адреналина раствором Рингера и вновь редиспергировали пигмент

кофеином. Для контроля меланосомы инъецировали преиммунными иммуноглобулинами, взятыми ь той же концентрации, что и антитела к кинезину.

Результаты такого эксперимента показали, что уже через 5 минут после добавления адреналина меланосомы полностью агрегировали как в неинъецированых клетках, так и в клетках, инъецированных преиммунными igG и антителами к кинезину. В инъецированных клетках, однако, движение меланосом выглядело замедленным. Иногда на промежуточных стадиях агрегации в инъецированых меланофорах меланосомы собирались в кольцо вокруг центра клетки, но в конце концов агрегация пигмента доходила до конца. Поскольку аналогичным образом вели себя и меланосомы в меланофорах, инъецированных буфером, мы заключили, что замедление агрегации пигмента было неспецифическим эффектом самой микроинъекции. Иммунофлуоресцентное окрашивание моноклональными антителами к тубулину показало, что ни микроинъекции антител к кинезину, ни микроинъекции преиммунных ige, ни иикроинъекщш буфера не влияли на количество и распределение цито-плазматических микротрубочек.

Действие антител к кинезину на диспергирование пигмента было намного более специфичным. В неинъецированых клетках на ранней стадии диспергирования агрегат меланосом сначала становился менее плотным, затем меланосомы начинали двигаться к периферии, и через 15 минут достигали краев клеток. В меланофорах, инъецированных антителами к кинезину, после обработки клеток кофеином агрегат пигмента также становился более рыхлым, но скорость последувдего перемещения меланосом была очень низкой так что они не достигали краев меланофоров. В то же время, диспергирование пигмента в клетках, инъецированных преиммунными iiG, не отличалось от диспергирования пигмента в контрольных, неинъецированных меланофорах.

Мы измерили затем скорости агрегации и диспергирования пигмента в инъецированных и неинъецированных'клетках. Результаты этих измерений показаны в Таблице 2. Как и предполагалось исходя из результатов приведенных выше наблюдений, инъекции замедляли скорость агрегации пигмента, но этот эффект был одинаковым как в случае меланофоров, инъецированных преиммунными igQ, так и в случае' меланофоров, инъецированных антителами к кинезину. В то же

Таблица 2. Влияние инъекций антител к кинезшу на скорость диспергирования меланосом в меланофорах.

Скорость мкм/мин

Агрегация Диспергирование

Неинъецированные меланофоры 60,2 13,7 (п=16) 18,5 3,3 (n=II)

Меланофоры, инъецированные преиммунными IgG (12 МГ/МЛ) 35,5 8,5 (п=24) 20,1 G,5 (п=31)

Меланофоры, инъецированные антителами к кинезину (6 мг/мл) 36,4 9,8 <п=24) 4,0 0,8 (п=31)

Меланофоры, инъецированные антителами к кинезину (12 да/мл) 31,7 17,9 (п=15) 1,3 0,6 (п=16)

время, диспергирование меланосом сильно и специфично подавлялось инъекциями антител к кинезину, но не преиммунных igG. Э'Хфект инъекций антител к кинезину зависел от концентрации; после введения антител, взятых в концентрации. 12 мг/мл диспергирование меланосом замедлялось заметно сильнее, чем после введения антител, взятых в концентрации 6 мг/мл.

В меланофорах, как и в большинстве других клеток, плюс-концы микротрубочек обращены jt периферии, а их минус-концы связаны с

ЦеНТрОСОМОЙ (Euteneuer bnd Mcintosh, Ргос. Natl. Acad. Sei. USA, 1981, 372-376), так что кинезин, известный как транслокатор, транспортирующий частицы к плюс-концами микротрубочек (Vale et al., cell, 1985, 43:623-632), должен перемещать меланосомы к краям клеток, то есть отвечать за диспергирование пигмента. Именно диспергирование меланосом и подавлялось в результате микроинъекций анти-

тел к кинезину в наших экспериментах. Таким образом, полученные в нашей работе результаты доказываю участие кинезина в транспорте меланосом в меланофорах.

2.2.3. Свойства системы микротрубочек меланофоров.

2.2.3.1. Динамичность микротрубочек меланофороЕ.

Итак, меланофоры - клетки, специализирующиеся на внутриклеточном транспорте, одна из составлящих которого обеспечивается зависимым от микротрубочек белком-транслокатором кинезином. Представляется важнымисследоватъ свойства микротрубочек в этих клетках и определить какие из них существенны для выполнения микротрубочками транспортных функций.

Одно из основных свойств микротрубочек - их динамичность, способность к быстрому обмену димеров тубулина, входящих в состав полимера, на дкмеры тубулина из растворимого пула (Gelfand and

Bershadsky, Ann. Rev. Cell Biol., 1991, 7:93-116). В ИНТерфЭЗНЫХ

клетках динамические свойства микротрубочек варьируют и зависят от типа клеток и степени их дифференцированности. Так, например, диф-фзренцировка мышечных клеток сопровождается стабилизацией микротрубочек (Gundersen et al., J. Cell Biol., 1989, 109:2275-2288). В одной отдельно взятой клетке обычно можно выявить субпопуляции микротрубочек, отличающиеся по своим динамическим свойствам. Такие субпопуляции обнаружены В эпителиальных клетках (Pepperkok et al., J. Cell Biol., 1990, 110:3003-3012), В МОНОЦИТЭХ (Cassimeris et al., J. Cell Biol., 1986, 104:9-18) И В фИбрОблаСТЗХ (Schulze and Kirschner, J. Cell Biol., 1987, 10S:2167-2177). СтабИЛЬНЫе МШфО-трубочки обычно обогащены посттрансляционно модифицированным (де-тирозшшрованным И ацетилированным) o-тубулином (Kreis, EMBO J.,

1987, 6:1007-1019; Schulze et al., J. Cell Biol., 1987,105:21672177; Webster and Borisy, J. Cell Biol., 1989, 92:57-65).

Молекулярные механизмы и функциональное значение различий в стабильности микротрубочек неясны. Имеется, однако, определенная корреляция между стабильностью микротрубочек и их участием во внутриклеточном транспорте. Так, пучки стабильных не связанных с центросомой микротрубочек, найденные в клетках MDCK (Baccalao et al.,

J.Cell Biol., 1989, 109:2817-2832), ПО-ВИДИМОМУ участвуют BO ВНУТриклеточном транспорте, так как доставка материалов к апикальной клеточной поверхности нарушается после их разрушения нокодазолом

(Brietfield et al. , J. Cell Biol., 111:2365-2375), СТабИЛЬННМИ

являются и микротрубочки аксонов, участвующие в аксональном транспорте (Baas et ai., J. Neurochem., 1990, 52:1708-1723),

Чтобы выяснить вопрос о необходимости стабилизации микротрубочек для их участия во внутриклеточном транспорте, мы исследовали динамические свойства микротрубочек меланофоров с помощью инъекций экзогенного тубулина, флуоресцентно меченного Х-родамином. Изображения микротрубочек, включившее меченный тубулин, были затем получены с помощью чувствительной телевизионной камеры (ccD-камеры) через разные промежутки времени после инъекций. Были поставлены 3 типа экспериментов. Во-первых, мй сравнили кинетику включения флуоресцентно меченного тубулина в микротрубочки меланофоров с агрегированным и диспергированным пигментом. Во-вторых, wj прямо проследили за полимеризацией и деполимеризацией микротрубочек, получив серии их последовательных изображений в клетках с агрегированными меланосомами. И, наконец, для количественного измерения скорости обмена тубулина в составе иикротрубочек, мы использовали метод восстановления флуоресценции после фэтобличинга.

Для исследован:ш кинетики включения флуоресцентно-меченного тубулина в микротрубочгаь в клетки с диспергированным и агрегированным пигментом вводили Х-родамин-тубулин, лизировали их через разные промежутки времени после инъекции, фиксировали, и окрашивали антителами к тубулину и вторичны™ антителами, меченными флу-оресцеином. Изображения микротрубочек, включивших меченный родамином тубулин, сопоставляли затем с изображениями окрашенных антителами микротрубочек. Результаты этих экспериментов показали, что микротрубочки в меланофорах с агрегированными и диспергированными меланофорами включали меченный тубулин с приблизительно одинаковой скоростью: через 3 минуты после инъекции меченными оказывались лишь концы некоторых микротрубочек, через 20-30 - минут большая часть микротрубочек включала родамин-тубулин по всей длине, однако полностью микротрубочки метились через 45-60 минут. Таким образом, микротрубочки меланофоров оказались достаточно динамичными, и их динамика в клетках с агрегированным и диспергированным пигментом

не различалась.

Чтобы подтвердить динамичность микротрубочек в меланофорах, мы попытались прямо проследить за их полимеризацией и деполимеризацией в живых клетках. Меланофоры инъецировали родамин-тубулином и оставляли на 60-120 минут при комнатной температуре для того, чтобы все микротрубочки н"лючили меченный тубулин. Затем получали .серии изображений микротрубочек, расположенных на периферии клеток, разделенных интервалами в 12 секунд.Анализ полученных серий изображений микротрубочек подтвердил, что их концы быстро укорачивались и удлинялись и, следовательно, микротрубочки меланофоров действительно были способны к быстрой полимеризации и деполимеризации.

Рис. 4. Кинетика восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания микротрубочек, вкльчивпшх меченный родамином тубулин. Цифра под каждым профилем интенсивности флуоресценции означает время (в мин.), прошедшее после фатообесцве-члвания в узкой зоне микротрубочек вспышкой света лазера.

Для количественной оценки динамичности микротрубочек был использован метод измерения скорости восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Клетки, инъецированные родамин-тубулином, оставляли на 2 часа для включения меченного тубулина в микротрубочки, а затем облучали лучом лазера с длиной волны 514 нм, соответствовавшей длине волны поглощения родамина, сфокусированным в узкую (4x57 мкм) полоску, которую раполагали отступя от края клетки поперек радиалыю ориентированных микротрубочек. Усло-

вия микрооблучения были подобраны тагам образом, чтобы связанный с тубулином родамин полностью обесцвечивался, а микротрубочки при этом не разрушались. После микрооблучения мы получали последова-телыше изображения обесцвеченной зоны, которые использовали для количественного измерения восстановления флуоресценции как описано

В работе (Gorbsky at ad., J. Cell Biol., 1987, 104:9-18)/ ПрофИЛИ интенсивности флуоресценции в обесцвеченной зоне, полученные в одном из таких экспериментов, показаны на рис. 2. Флуоресценция всегда полностью восстанавливалась за 30 минут. Время восстановления 50% интенсивности флуоресценции составило 10 минут. Эти данные были получены с использованием клеток с агрегированными меланосо-мами. Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания оказался неприменимым к неланофорам с диспергированным пигментом, так как меланосомы поглощали лазерное излучение, что приводило к необратимым повреждениям клеток.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что микротрубочки в мэланофорах динамичны и их динамические свойства не зависят от того агрегированы меланосомк в центре клетки или они диспергароваш по всей щгоплазме. Проведеншз нш количественные измерения указываю? на тсо, что субъединицы тубулина обмениваются в мцкротрубочках ¡'зланофоров почти так :ке быстро, как в мнкротру-

бОЧКаХ ДРУП1Х КуЛЬТКВИруемиХ КЛеТОК МЛеКОПИМПЦИХ (Saxton et ai., J. Cell Biol., 1984, 99:2175-218G), ПОСКОЛЬКУ ВреМЯ ЗЭ Которое

обменивается половина субъедишщ j микротрубочках иеланофоров сравнимо со временем, требуемым для никла агрегации и диспергирования пигмента, можно заключить, что движимые кинезииом меланоссмы перемещаются в цитоплазме меланофоров вдоль постоянно собиращихся и разб1фающихся микротрубочек. Сис-тема микротрубочек в меланофо-рах, вероятно, характеризуется избыточностью, ток что в каждый данный момент времени иеланосома контактирует более чем с одной млкротрубочкой." Тогда в случае деполимеризации одной ипфотрубочки мелоносома может продолжить движение по оставшимся.

2.2.3.2. Присутствие на микротрубочках меланофоров структурных ассоциированных белков.

Другое важное свойство микротрубочек - способность связывать структурные оссоцшфованшз белки, такие как MAPI., МАР2 и тау. Как

указывалось выше, структурные ассоциированные с микротрубочками белки из мозга млекопитающих декорируют стеши микротрубочек, образуя характерные выступы и, казалось бы, должны препятствовать обеспечиваемому транслокаторами транспорту органелл вдоль микротрубочек в клетках. В этой связи было важно выяснить, связаны ли структурные белки с микротрубочками в меланофорах. Мы окрасили меланофоры тернеции поликлональными и моноклональными (MAOI и МА02) антителами к МАР2. Такое окрашивание выявило в цитоплазме меланофоров радиальные фибриллы, распределечие которых не отличалось от распределения микротрубочек. Таким образом, результаты иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что МАР2 ассоциирован с микротрубочками меланофоров.

Чтобы понять почему структурные MAP не препятствуют транспорту меланосом по микротрубочкам, мы исследовали более детально вопрос о соотношении сайтов связывания структурных ассоциированных с микротрубочками белков и белков-транслокаторов на молекуле тубулина, использовав в качестве модельюй системы микротрубочки и ассоциированные с ниш белки, очищенные из мозга крупного рогатого скота.

Как было известно из литературы, структурные ассоциированные с микротрубочками белки,взаимодействуют с С-концевыми "регуляторны-ми" фрагментами субъединиц тубулина. Отщепление этих фрагментов с помощью ограниченного протеолиза (например, субтализином) приводит к тому, что тубулин начинает легче полимеризоваться, причем для его полимеризации не требуются структурные MAP, которые в обычных условиях стимулируют Сборку микротрубочек (Serrano et al., Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1984, 81:5989-5993). Продуктом ПОЛИМбрИЗацИИ протеолизированного тубулина являются аберрантные структуры - незамкнутые микротрубочки и слои из протофиламентов. При этом структурные MAP в образующиеся полимеры не включаются (Serrano et al., Biochemistry, 1984, 23:4675-4681),

Мы изменили метод протеолиза тубулина и обрабатывали субтили-зином не димерный тубулин, а стабилизированные таксолом микротрубочки. После завершения протеолиза микротрубочки осаждали центрифугированием через слой 4 М глицерина. Электронная микроскопия срезов осадков полимеров показала, что обработанные субшпизином микротрубочки сохраняли нормальную морфологию. В то же время, при

электрофоретическом анализе таких микротрубочек в полиакриламидном гелз было хороао видно, что полоса тубулина смещалась вниз примерно на 4 кД, что свидетельствовало об отщеплении С-концевых фрагментов его субъединиц.

Мы попытались затем выяснить, взаимодействует ли с обработанными субтилизином микротрубочками кинезин. В качестве критериев взаимодействия использованы: (I) способность кинезина соосаждаться с микротрубочками в отсутствие но не в присутствии ЛТФ; (2) стимуляция АТФазной активности кинезина микротрубочками; (3) способность кинезина вызывать ЛТФ-зависимое скольжение микротрубочек по субстрату.

Для исследования соосаждения препарат кинезина смешивали с суспензией контрольных ют; обработанных субтилизином микротрубочек, инкубировали в присутствии или з отсутствие 2,5 мМ' АТФ и освкдали никротрубочкк центрифугированием чарзз слой 4 M глицерина. В контрольном опыте к обоим типам микротрубочек добавляли препарат тотальных MAP. Электрофорез осадков показал, что высокомолекулярные ассоциированные с кикротрубочкага белки HAPI и HAPZ,' kstc и предполагалось, соосаедались л®ь с контрольный!! шжротрубэч-кани. В то же время, кинозин соосаядался и с контрольный! и с об-работангалш субтилизином микротрубочксни, причем его соосаздениз подавлялось в присутствии 2,5 нМ ЛТФ, что показквзлл, что кинезин. связнвался с |«шфотру<5очкш® спещфнио.

Ma сравнили затем стимул-тдоэ АТФазной акт'пзности кинезина контрольными п обработашшми субтилизином микротрубо^ка:«. В отсутствие никрспрубочзк АХФазная активность кинегина составляла при 3?°С монсв 0,05 мкЧ Р^гкл/нг. При добавлзкш контролъа.вс :;г:кро-трубочек (концентрация тубуякнэ 1,0--Г,5 кг/рл) АТФагная аптхгеность стимулировалась примерно в 20 раз и достигала знвчзю&г 1,12-0,31 мкМ Pj/мяи/нг. Добавление гсхого жз количества обработанных субтп лизином шжротру бочек стаиулиропало АТФазнуэ стиеность ккнезкно примзрио в 8 раз, до значешш 0,4*0,12 i.tM Pi/iiim/Kr. тгам образом, хотя обработан^«) субтшдозвнен 'ад'ротрубочшг стимулировал АХФззнуп активность. гашозина в моньетч ст-лздт, чей контровдше,

ОЧОВИ.ЩЮ, ЧТО ПОСЛЗ обработки (фбТШШГ.'ЮН ЭТО CBQîiCTEO инфстгу" бочок сохранялось.

Основной свойство кинезича - способность ющппрост. в прп-

а б

Рис. 5. Соосаждение структурных MAP и кинезина с нормальными (дорожки а, в, г) и обработанными субтализином (б, д, е) микротрубочками; а,б - соосаждение структурных НАР; в-е - соосаждение кинезина в отсутствие (в,д) и в присутствии (г,е) АТФ; КИП -кинезин, Т - тубулин.

мкМ Р./мин/мг. Добавление такого же количества обработанных субти лизином микротрубочек стимулировало АТФазную активность кинезина примерно в 8 раз, до значения 0,4^0,12 мкМ Р1/мин/мг. Таким образом, хотя, обработанные субтилизином микротрубочки стимулировали АТФазнув активность кинезина в меньшей степени, чем контрольные, очевидно, что после обработки субтилизином это свойство микротрубочек сохранялось.

Основное свойство кинезина - способность индуцировать в присутствии АТФ движение частиц вдоль микротрубочек и перемещение самих микротрубочек по субстрату. Мы попытались выяснить, способен ли кинезин вызывать АТФ-зависимое движение микротрубочек, обработанных субтилизином. Результаты наблюдений с помощью микроскопии с злоектронным усилением видеосигнала показали, что обработанные субтилизином микротрубочки перемещались по покрытому кинезином субстарту. Результаты измерений показали, что скорости движения интактных и обработанных субтилизином микротрубочек практически не различались: средняя скорость движения контрольных микротрубочек

составила 0,22^0,09 мкм/с (n=69), а средняя скорость движения обработанных субтилизююм микротрубочек - 0,20^0,05 im/c (n=4S). Таким образом, обработка микротрубочек субтилизином не оказывала влияния на iix способность к зависимому от кинезина движению по субстрату.

Приведенные выше данные показали, что участки связывания кинезина и структурных MAP на молекуле тубулина различаются. Мы проверит затем, взаимодействует ли цитоплазматический динеин с микро-трубочкани, лишенными участков связывания структурных MAP. Для этого мы очистили цитоплазматический динеин из мозга крупного рогатого скота и исследовали его соосаждение с обработанными субтилизином микротрубочками. Результатты этих экспериментов показали, что цитоплазматический динеин, как и кинезин, соосаждался с обработанными субтилизином микротрубочками, причем такое соосаждекие было специфичным, так как подавлялось AT© (2,5 мМ).

Таким образом, результаты приводенных вше экспериментов показали, что участки связывания старуктурных ?МР и белков-транслокато-ров на молекулах тубулина, составляющих стенку микротрубочек, различаются. В меланофорах, как и в других клетках

(Drubin et al., J. Cell Biol., 1985, 101:1799-1807), КИКрОТрубОЧ-

ки, вероятно, насыщены структурным! MAP. Существовшше особых участков связывания транслокаторов на молекулах тубулина объясняет каким образом по микротрубочкам, покрытым структурными MAP, могут перемещаться меланосомы, движимые кинезином.

2.2.3. Участке кинезина в опредзлешш зкутриклеточной локализации мембранных органелл.

Хорошо известно, что внутриклеточное рапределения многих мембранных органелл зависит от микротрубочек, так как нарушается после деполимеризации микротрубочек колхицином или его аналогами Так, показано, что эндоплазнатический ретикулум, который удается выявить с помощью специфичного флуоресцентного -красителя 3,3'дигексилкарбоцианин иодида (DiOCg) (Terasaki- ct al., Cell, 1984," 38:101-100), выглядит как подвияная сеть ветвящихся мембранных трубочек, доходящая почти до гфзев ламеллч, которая, однако, собирается в центре клетки после деполимеризации микротрубочек

Н0К0ДЭ30Л0М (Lee and Chen, "Cell, 1988, 54:37-46; Lee et al., J. Cell Biol., 1989, 108:2045-2055). ПОСКОЛЬКУ образование ПОДОбНОЙ сети удавалось наблюдать в присутствии кинезина in vitro (Debora

and Sheetz, Cell, 1988, 54:27-3í>), МОЖНО бЫЛО ПреДПОЛОЖИТЬ, ЧТО

именно кинезин отвечает за распределение зндоплазматического ретику лума в цитоплазме. Для проверки этого предположения мы ввели полученные нами антитела к кинезину в клетки cvi и окрасили их затем Dioc6. Результаты такого окрашивания показали, что инъекции антител на распределение эндоплазматического ретикулума никакого влияния не оказывали. Более того, если антитела вводили в обработанные нокодазолом клетки, а затем нокодазол отмывали, то распределение эндоплазматического ретикулума полностью восстанавливалось несмотря на присутствии антител к кинезину в цитоплазме. Этот результат показал, чтовнутриклеточное распределение эндоплазматического ретикулума, по всей видимости, обеспечивается не кине-зиком.

Примером еще одного типа органелл, распределение которых в

КЛеТКаХ ЗаВИСИТ ОТ МШфОТрубОЧеК, ЯВЛЯЮТСЯ МИТОХОНДРИИ (Ball and Singer, Ргос. Natl. Acad. Sei. USA, 79:123-126). ОкраЛПВЭНИе МИТОхондрий в нормальных человеческих диплоидных фибробластах (линия 1036) родамином 123 показало, что они выглядят как вытянутые структуры, расходящиеся от центра клетки и доходящие почти до краев ламеллы. Аналогичным образом выглядели и митохондрии в фибро-бластах, инъецированных преиммуиными tea. В то же время, введение в клетки антител к кинезину, взятых в концентрации 8-12 мг/мл, вызывало разительное перераспределение митохондрий, которые концентрировались около центра клетки, образуя агрегат. Периферия клеток при этом оказывалась свободной от митохондрий. Этот эффект антител к кинезину оказался хорошо воспроизводился и наблюдался практически во всех инъекцированных антителами клетках. В то же время,' окрашивание таких клеток антителами к тубулину показало, что инъекции антител к кинезину не оказывали влияния на распределение микротрубочек.Таким образом, внутриклеточное распределение митохондрий в фибробластах обеспечиватся кинеэином.

2.2.4. Роль гомологичных кинсзину транслокаторов в митотическом

делении клеток.

Приведенные выше результаты показывают, что кинезин участвует в движении органелл в интерфазных клетках._Мы попытались также выяснить, участвуют ли' родственные кинезину транслокаторы, в митозе.

Митотическое веретено - сложная-структура, основными компонентами которой являются микротрубочки, полюса и хромосомы. Образование веретена включает последовательные движения полюсов веретена друг относительно друга и хромосом относительно полюсов. Так, после разрушения ядерной мемо'раны в прометафазз, хромосомы прикрепляются к микротрубочкам и движутся к ближаЯаемуползосу; затем хромосомы перемещаются к экватору, а в анафазе сестринские хроматиды разделяются и расходятся к'полюсам веретена. В свои очередь', полюса, которые часто бывают расположены близко друг к другу, расходятся после разрушения ядерной мембраны. Расхождение полюсов веретена ЛрОДОЛЖаеТСЯ Затем 3 анафазе МИТОЗа (Mcintosh and Koence, Science, 1989, 246:622-628; Mitchison, Curr. Opin. Cell Biol., 1989, 1:67-74; ilieder, Cuir. Opin. Cell Biol., 1991, 3:59-66).

Хотя молекулярные механизмы движения хромосом и полюсов веретена до сих пор неясны, становится все более очевидным, что в митозе участвуют зависимые от микротрубочек белки-траислокаторы. Так, например, недавно было реконструировано движение микротрубочек по кинетохорам выделенных митотических хромосом in vitro, что прямо указывает на локализацию зависимых от микротрубочек транслокаторов в кинетохорах (Hyman and Mitchison, Nature, 1991, 351:206211).

Показано, что кинезин не участвует в митозе по крайней мере в

КЛеТКаХ Drosophila raelanogaster (Saxton et al., Cell, 1991,

64:1093-1102). В последнее время, однако, были идентифицированы кинезиноподобные транслокаторы, имеющие глобулярный моторный домен с аминокислотной последовательностью чрезвычайно близкой к последовательности N-Концевого глобулярного домена кинезин'а (Endow, Tibs, 1991, 16:221-225). Мы предположили, что вследствие высокого сходства в последовательностях полученные нами антитела к кинезину должны реагировать и с кинезиноподобными белками и использовали эти антитела для исследования возможной роли кинезикоподобных бел-

ков в митозе.

Мы инъецировали 25 клеток PtKj в прометафазе непосредственно перед разрушением ядерной оболочки или сразу после ее разрушения антителами к кинезину, взятыми в концентрации 20 мг/мл, и просле-" дили за их делением. Для контроля мы инъецировали 25 клеток преим-мунными igG, взятыми в той же концентрации, что и антитела к кинезину. Наконец, для того, чтобы получить представление о длительности отдельных стадий митоза во время нормального деления клеток ptK1, мы проследили также за делением 25 неинъецированных клеток.

Результаты этих экспериментов показали, что почти все клетки (23 из 25), инъецированные преиммунными igG делились, тогда как у большинства клеток (18 из 25), инъецированных антителами к кинезину, митоз оказывался нарушенным. Редкие нарушения митоза, наблюдавшиеся после контрольных инъекций, отличались от нарушений, наблюдавшихся у клеток, инъецированных антителами к кинезину. Митоз у инъецированных антителами к кинезину клеток блокировался на стадии образования метафазной пластинки, а у клеток, инъецированных преиммунными igG - на более поздних стадиях.

В норме во время митоза при 37°С у клеток PtKj метафазная пластинка образовывалась через 15-20 минут после разрушения ядерной мембраны, анафаза наступала через 30-35 минут, а через 40-45 минут появлялась борозда дробления. Продолжительность отдельных стадий митоза у клеток, инъецированных преиммунными igG, мало отличалась от их продолжительности у неинъецированных клеток. В то же время, после введения антител к кинезину, хромосомы не образовывали метафазную пластинку и через 15-20 минут после разрушения ядерной мембраны оказывались беспорядочно разбросанными по всей цитоплазме. Через 30-40 минут хромосомы часто располагались в виде розетки. Иногда хромосомы начинали двигаться со скоростью 1,8-2,0 мкм/мин. Это движение хромосом напоминало анафазное движение, с той разницей, что все хромосомы двигались в одну сторону. В конце концов клетки, инъецированные антителами к кинезину, не делились, их хромосомы деконденсировались, и они входили в новый клеточный цикл.

Чтобы понять в чем состоит нарушение митоза, вызываемое антителами к кинезину, мы проследили за поведением хромосом и за распределением полюсов веретена в инъецированных клетках. Сразу после

разрушения ядерной мембраны хромосомы как в инъецированных, так и в интактных клетках, ориентировались своими кинетохорами к полюсам веретена. Как в контрольных, так и в инъецированных клетках иногда можно было наблюдать быстрое перемещение хромосомы к ближайшему полюсу, свидетельствующее о прикреплении астральных микротрубочек к кинетохору vHayden et al., J. Cell Biol., 1990, 111:1039-1045). Таким образом, в клетках после введения антител к кинезину, как и в интактных, устанавливались контакты между микротрубочками и кинетохорами хромосом. Однако, в отличие от неинъецированных клеток, после инъекций антител к кинезину на более поздних стадиях митоза локализовать полюса веретена оказывалось невозможным, и через 30 минут после разрушения ядерной мембраны хромосомы оказывались расположенными в виде розетта. Окрашивание антителами к тубулину 15 клеток, зафиксированных на этой стадии, показало, что у II'из них биполярное веретено отсутствовало и вместо него имелась единственная звезда из микротрубочек. Наиболее вероятное объяснение этого наблюдения ссостоит в том, что полюса веретена в инъецированных антителами к кинезину клетках сходятся вместе или не могут разойтись.

Этот эффект антител к кинезину не зависел от того проводилась инъекция перед разрушением ядерной мембраны или сразу после её разрушения. Инъекции антител к кинезину, взятых в более низкой концентрации (10 мг/мл), на митоз не влияли (7 инъекций). Антитела к кинезину даже будучи взятыми в высокой концентрации (20 мг/мл) не вызывали нарушений митоза, если их вводили в клетки на стадам метафази.

Для объяснения действия антител было важно локализовать антиген в митотическом веретене. Поскольку полуверетена взаимодействуют друг с другом через перекрывающиеся микротрубочки, отходящие от полюсов, и через кинбтохорные микротрубочки, а введение антител вызывает образование монополярного веретена, было интересно выяснить, связан ли антиген с микротрубочками веретена и с кинетохорами хромосом. Имнунофлуоресцентное окрашивание митотических клеток ptKj показало, что антитела к кинезину реагировали с районом веретена,' но фоновое окрашивание цитоплазмы, связанное, по-видимому, с окрашиванием антителами мембранных органелл, мешало более детальной локализации антигена в веретене. Характер окрашивания митоти-

ческих клеток не менялся поЬле экстракции мягкими детергентами -0,5% бриджем 58, 0,01% дигитонинох, или 0,02% сапонином перед фиксацией.

Чтобы выяснить, окрашивают ли антитела к кинезину микротрубочки веретена и кинетохоры хромосом, мы выделили затем митотические веретена из клеток сно, которые можно нарастисть в количествах, достаточных для препаративной работы. Стабилизированные таксолом митотические веретена были получены после лизиса синхронизированных клеток детергентом (np-40) и центрифугированием в сахарозном градиенте (Kuriyanm et al., J. Cell Sei., 1984, 66:265-275). ДВОЙное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к тубулину и антителами к кинезину показало, что антитела к кинезину реагировали с микротрубочками веретен.

В митотических веретенах, полученных описанным выше методом, сохранялись кинетохоры хромосом, которые можно было выявить имму-нофпуоресцентным окрашиванием специфической аутоиммунной сывороткой крови людей с сresт—синдромом. Двойное окрашивание показало, что антитела к кинезину не реагировали с кинетохорами в полученных нами препаратах веретен. Возможное объяснение этого факта состояло в том, что локализованный на кинетохорах транслокатор мог отмываться, поскольку для выделения веретен использовался жесткий метод, включавший экстракцию детергентом. Мы попытались использовать более мягкие уссловия, чтобы выделить хромосомы отдельно от веретен И использовали метод, описанный В работе(Mitchlson and

Kirschner, J. Cell Biol., 1985, 101:755-765). КпеТКИ He ЭКСТраГИровали детергентом, а помещали в буфер низкой ионной силы, после чего разрушали гомогенизацией. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что антитела к кинезину реагировали с кинетохорами выделенных таким способом хромосом. Хотя кинетохоры лишь примерно 25% хромосом окрашивались антителами к кинезину, это окрашивание было специфичным: преиммунные igG, взятые в той же или даже в более высокой концентрации с кинетохорами никогда не взаимодействовали. Присутствие предполагаемого кинезинового транслокатора на кинетохорах вряд ли можно объяснить его неспецифической сорбцией на ту-булин, так как известно, что с кинетохорами хромосом, выделенных описанным способом, тубулин не связан (Mitcnison and Kirschner, J. Cell Biol., 1985, 101:755-765).

Для идентификации полипептидов, которые узнавали антитела к кинезшу, мы использовали иммуноблоттинг. В экстрактах клеток PtKx и сно основным полипептидом с которым реагировали антитела была 120 кД-тяжелая цепь кинезина. Кинезин также содержался в препарате митотических веретен клеток сно, но основной"белок с которым реагировали антитела в таком препарате имел' молекулярную массу 135 кД. В препарате хромосом единственным компонентом, который узнавали антитела был ЗСО кД-полипептид.

Таким образом, кинезиновый транслокатор, являщийся кипенью действия наших антител может локализоваться на микротрубочках веретена или в квдетохорах хромосом. Из наших данных нельзя сделать окончательный вывод о его локализации. Полученные результата свидетельствуют о важной роли кинезиновых транслокаторов для морфогенеза веретена.

2.2:5. Значение.кинезиновых транслокаторов в определении формы и псевдоподиальной активности фибробластов.

Микротрубочки вместе с микрофиламентами и промежуточными фила-ментами обычно ОТНОСЯТ к цятоскелету (Du3tin, "Microtubules", 1984, Springer Verlag, Berlin). Представление О ЦИТОСКелеТНОЙ ФУНКЦИИ ншсротрубочек основывается на результатах экспериментов по их разрушения специфическими агентами. Такое разрушение микротрубочек приводит к потере клетками асимметричной форта. Так, например, фибробласты, имеющие вытянутую форму, после деполимеризации микроТрубОЧеК КОЛХИЦИНОМ ОКРУГЛЯЮТСЯ (Vasiliev and Gelfcnd, Cold Spring Harbor Conf. Cell Prolif., 1935, 3:279-304). ДруГОв СЛеДСТВИЗ раз-

РУЕЗШ1Я микротрубочек состоит в том, что клетки теряют поляризацию псевдоподиальной активности: на активном крае псевдояодиальная активность снижается, и, в то же Бремя, стабильные зоны на краях клеток пропадают и края становятся активными по всему периметру.

(Bershadsky et aj . , Cell Motil. Cytositel., 1991, 8:274-283).

Мы исследовали вопрос о том не связан ли контроль формы фибробластов и поляризация их псевдоподиальной активности с функционированием кинезиновых транслокаторов, которые, как можно предполо-яить, должны участвовать в транспорте мембранных органелл к активно^ краю движущихся клеток.

Для изучения вопроса о роли кинезиновых транслокаторов в опре-

делении формы клеток нормальные диплоидные фибробласты человека (линия 1036) инъецировали полученными нами антителами к моторному домену кинезина; через 3-4 часа клетки фиксировали, фотографировали и анализировали их контуры с помощью компьютерной программы, позволявшей рассчитать значения 2 параметров, успешно употреблявшихся ДЛЯ описания формы клеток - дисперсии и элонгации (Dunn and Brown, J. Cell Sei., 1986, 83:313-340, Brown et al., Cell Biol, int. Rep., 1989, 13:357-366), Эти параметры можно определить следующим образом. Если представить себе клетку в виде тела, имепдего вид плоскости единичной толщины, то всегда можно построить единственный эллипс с толщиной меньше единичной, масса которого и моменты инерции вокруг любой оси совпадают с массой и моментами инерции тела, соответствующего клетке. Элонгацию можно определить как log, отношения осей эллипса, а дисперсию - как log, отношения площади эллипса к площади соответствуюцей клетке плоскости. И элонгация и дисперсия показывают какая часть общей "массы" описывающей клетку плоскостиудалена от ее центра тяжести, но элонгация является мерой того, какая часть "массы" может быть возвращена к цен^у тяжести сжатием, а дисперсия - мерой того, какая часть "массы" останется. Для сравнения мы измерили также значения дисперсии и элонгации для контрольных неиньецированных клеток, для клеток, инъецированных преиммунными igG, и для клеток, обработанных нокодазолом, взятым в концентрации I мкг/мл в течение 15 часов. Результаты этих измерений представлены в таблице 3.

Как видно из приведенных данных, обработка клеток нокодазолом снижала значения как дисперсии, так и элонгации более чем на 50%. Это г эффект .разрушения микротрубочек на параметры, описывающие форму клеток, был хорошо известен. Контрольные инъекции снижали значение обоих параметров на 15-20%. В то же время, инъекции антител к кинезину вызывали эффект, близкий к эффекту нокодазола, .и снижали дисперсию и элонгацию примерно на 50%. Площадь инъецированных клеток-мало отличаюсь при этом от площади контрольных и обработанных нокодазолом клеток. Таким образом, инъекции антител к кинезину значительно снижали дисперсию и элонгацше и этот эффект нельзя было объяснить неспецифическим действием самой инъекции.

Как указывалось выше, еще один эффект нокодазол& состоит в нарушении направленного движения фибробластов и в снижении псевдо-

Таблица 3. Влияние инъекция антител к кинезилу 'и обработки нокодазслом на параметры, характеризующие форму человеческих фибробластов (линия 1036).

нсинъеци- рованные клетки ПреИМНуН-ные антитела антитела к кинезину (18 мг/мл) обработка нокодазолом (I мкг/мл)

Дисперсия 0,54-0,03 0,43±0,03 0,27-0,02 0,22-0,02

Элонгация 1,94-0,06 1,6?±0,05 I.13-0,04 0,09^0,04

Число проанали- лизированных клеток 229 227 . 289 125-

Рис. 6. Типичные контуры контрольной (А), инъецированной антителами к кинезину (Б), преинмунными антителами (В) или обработанной нокодазолом (Г) клеток. На рисунке представлены контуры фиброрбластоз со значениями дисперсии и элонгации, близкие к тем, которые приведены в таблице 3. с - дисперсия, е .- элонгация.

подаальной активности на переднем крае движущихся клеток. Мы проверили, влияют ли инъекции антител к кинезину на псевдоподиальную активность фибробластов, движущихся в рану монослоя. Мигрирующие в рану клетки инъецировали • антителами к кинезину или контрольными igG, и через 4-5 часов анализировали клетки с помощью Die-микроскопии и записывали изображения их активного края с помощью видеомагнитофона. Для каждой клетки получали пары изображений активного края, разделенные интервалами в 20 секунд. Затем обводили контуры активного края для каждого' изображения, подсчитывали площади протрузий и ретракций' для пар изображений и вычисляли скорости протрузий и ретракций как изменение площади в единицу времени на единицу длины активного края. Полученные значения имели, соответственно, размерность' мкьг/мин х мкм =

МКМ/МИН (Berahadsky et al., Cell Motil. Cytoskel,, 1991, 8:274-283).

Анализ гистограмм скоростей протрузий и ретракций для 10 контрольных неинъецированных клеток, 10 клеток, инъецированных преиммунными антителами и 10 клеток, инъецированных антителами к

Таблица 4. Влияние микроинъекций антител к кинезину на среднюю

скорость протрузий и ретракций на активном крае человеческих фибробластов, движущихся в рану нонослоя..

Средняя скорость протрузий Средняя скорость ретракций

Неинъецированные клетки - 0,900-0,112 0,766-0,070

Клетки, инъецированные преиммунными igG 0,886-0,078 0,670-0,068

Клетки, инъецированные антителами к кинезину 0,418-0,031 0,415- 0,043 »

кинезину показал, что инъекции преиммунных igG мало вдияди на

псевдоподиальную активность, а инъекции антител к кинезину заметно снижали скорости протрузий и ретракций. В таблице 4 приведены средние значения скоростей протрузий и ретракций. Антитела к кинезину снижали среднюю скорость протрузий более чем в 2 раза, а среднюю скорость ретракций - примерно в 1,5 раза.

Таким образом, результаты этой работы показали, что инъекции антител к кинезину влияли как на форму, так и на псевдоподиальнуп активность на переднем крае двигавшихся в рану фибробластов, причем эти эффекты не могли объясняться неспецифическим действием самих инъекций. Действие антител к кинезину сильно напоминало действие на клетки разрушающего микротрубочки агента нокодазола. Как и нокодазол, антитела к кинезину снижали асимметрию фибробластов и псевдоподиальнуп активность их переднего края. В то же время, им-мунофлуоресцентное окрашивание показало, что в отличие от нокодазола, антитела к кинезину не нарушали распределения микротрубочек. Полученные результаты предполагают таким образом, что кинезин или родственные ему транслокаторы важны для поддержания асимметрии клеток и для их псевдоподиальной активности, которая прямо связана со способностью клеток к движению.

В настоящее время неясно, какие органеллы должны транспортироваться к периферии фибробласта для сохранения его асимметричной Форш и высокой псевдополиальной активности. Некоторые гипотезы движения фибробласта предполагают необходимость постоянного включения МеМбраНЫ На еГО аКТИВНОМ Крае (СМ. Напр., Sinßer and Kupfer, Ann. Rev. Cell Biol., 1986, 2:337-365). АНТИТела К КШШЗИНУ, Bepo-ятно, останавливают транспорт мембранных органелл и тем самым ин-гибируют псевдоподиальную активность и подвижность клеток. Другое возможное объяснение состоит в том, что введение антител к кинезину, как уже указывалось, вызывает агрегацию митохондрий, нужных, возможно, для того, чтобы поставлять энергию для образования псевдоподий. В любом случае ма надеемся, что полученные нами данные помогают изменить представление о микротрубочках как о пассивных жестких элементах цитоскелета и подчеркивают, что их основная Функция - участие во внутриклеточном транспорте.

' вывода

1. Получены моноклональные антитела rni7, узнающие в экстракта» _ культивируемых клеток IOO кД-белок, имеющий общие антигенные детерминанты с MAPI и МАР2. Показано, что 100 кД-белок связан в цитоплазме с несколькими типами органелл: с микротрубочками, с промежуточными филаментами и с окаймленными пузырьками.

2. С помощью моноклональных антител е!2 показано, что 34 кД-полипептид препарата микротрубочек из мозга крупного рогатого скота является легкой цепью MAPI. Показано также, что легкая цеш MAPI связывается со 120 кД-фрагментом тяжелой цепи, ответственны* за взаимодействие с тубулипом.

3. Получены поликлональные антитела к моторному домену ктези-на, реагирувдие с тяжелой цепью кинезина из различных источников и подавляющие его двигательную активность in vitro.

4. Показано, что кинезин отвечает за центробежное движешн меланосом в меланофорах рыб.

5. Установлено, что микротрубочки меланофоров динамичны и врет обмена половины субъединиц тубулина в составе микротрубочек сос тавляет 10 минут.

6. Обнаружено, что структурные MAP и белки-транслокэторы связы Баются с разными участками молекулы тубулина.

С

7. Показано, что внутриклеточное распределение митохондрий ' культивируемых фибробластах человека зависит от кинезина.

8. Обнаружено, что в митотическом' делении клеток Pt^ участвуе иммунологически родственный кинезину белок, действующий на стада прометафазы, необходимый для образования или поддержания целост ности митотического Ееретена.

9. Показано, что кинезин важен для поддержания асимметричной формы фибробластов и для псевдоподиалъной активности на их активном крае.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Е.С.Надеждина, В.И.Родионов, Е.А.Вайсберг, В.И.Гельфанд. 1984. Моноклональные антитела к map из мозга связываются с микротрубочками в культивируемых клетках. Тезисы докл. 16 конференции . Федерации Европейских биохимических обществ. Москва.

2. Е.В.Леонова, А.Д.Соркин, Л.В.Тесленко, В.И.Родионов, Е.С.На деясдина, Н.Н.Никольский, В.И.Гельфанд. 1986. 100 кД цито-скелетный белок является комонентом лизосом, участвующих в рецептор-опосредованном эндоцитозе. Цитология т. 28, стр.

I222-1226.

3. Ф.К.Гиоева, Е.В.Леонова, В.И.Родионов, В.И.Гельфанд. 1987. Система промежуточных филаментов в меланоцитах костистых рыб. Цитология т.29, N6, стр. 632-636.

4. А.Г.Варданян, В.И.Гельфанд, В.Ф.Камалов,'В.И.Родионов. IS87. Движение меланосом в меланоцитах, фрагментированных лазерным излучением. Доклады АН.СССР т.239, Ni, стр.215-220.

5. V.I.Rodionôv, Е.S.Nadezhdina, E.V.Leonova, Е.А.Vaisberg,

S.A.Kuznetsov, and V.I.Gelfand. 1985. Identification of a 100 kD protein associated with microtubules, intermediate filaments, and coated vesicles in cultured cells. Experimental Cell Research 159:377-387.

6. S.A.Kuznetsov, V.I.Rodionov, E.S.Nadezhdina, D.B.Murphy, V.I.Gelfand. 1986. Identification of a 34 kD polypeptide as a light chain of raicrotubule-associated protein-1 (MAPI) and its

association with MAPI pe'ptide that binds to microtubules. J. Cell Biol. 102:1060-1066.

7. F.K.Gyoeva, E.V.Leonova, V.I.Rodionov, and V.I.Gelfand. 1987. Vimentin intermediate filaments in fish melanophores. J. Cell Sci. 88:649-655. '

8. V.I.Rodionov, A.Vardanyan, V.F.Kamalov, and V.I.Gelfand. 1987. Movement of uelanosomes in melanophore fragments', obtained by laser microbeau irradiation. Cell Biol. Int. Rep. 11:566-575.

9. V.I.Rodionov, F.K.Gyoeva, A.S.Kashina, S.A.Kuznetsov, and V.I.Gelfand. 1990. Microtubule-assoclated proteins and microtubule-based translocators have different binding sited on tubulin molecule. J. Biol. Chem. 265:5702-5707.

10. V.I.Kodionov, F.K.Gyoeva, and V.I.Gelfand. 1991. Kinesin is responsible for centrifugal movement of pigment in fish melanophores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4956-4960.

11. V.I.Rodionov, V.I.Gelfand, and G.G.Borisy. 1991. Possible role of kinesin-like molecule in spindle formation. J. Cell Biol. 115:2a.

12. V.I.Rodionov, S.-S. Lira, V.I.Gelfand, and G.G.Borisy. 1991. Microtubule dynamics in fish melanophores. J. Cell Biol. 115:348a.

13. V.I.Rodionov, F.K.Gyoeva, G.G.Borisy, and V.I.Gelfand. 1992. Microinjection studies of kinesin functions, in living cells. Abstracts, II Russian-Israel Symposium on Peptides and Proteins' , p. 57.