Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация нового белка, ассоциированного с центросомой, ядром и микротрубочками в животных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация нового белка, ассоциированного с центросомой, ядром и микротрубочками в животных клетках"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

- 6 ДПР 1593

На правах рукописи

ЗИНОВКИНА Людмила Андреевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОГО БЕЛКА, АССОЦИИРОВАННОГО С ЦЕНТРОСОМОЙ, ЯДРОМ И МИКРОТРУБОЧКАМИ В ЖИВОТНЫХ КЛЕТКАХ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в отделе функциональной биохимии биополимеров НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и в группе клеточной биологии Института Белка РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Е.С. Надеждина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Ю.С. Ченцов доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан февраля 1998 года.

Защита состоится

апреля 1998 года на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение и характеристика моноклонаяьных антител SN2-3D2.

В 1992 году Е.С. Надеждиной с коллегами была получена библиотека монАТ к центросомам сперматозоидов вьюнов Misgurnus fossilis (неопубликованные данные). Одно из таких AT - монАТ SN2-3D2 - при иммунофлуоресцентном окрашивании культивируемых клеток китайского хомячка СНО-К1 связывается с центросомой. Ядра клеток монАТ SN2-3D2 не окрашиваются. Наблюдается также слабое волокнистое окрашивание цитоплазмы, изменяющееся (становится зернистым) при действии на клетки нокодазола. Поскольку при действии на клетки нокодазола происходит разрушение сети микротрубочек, возникло предположение о том, что часть антигена SN2-3D2 ассоциирована с микротрубочками в культивируемых клетках. На иммуноблоте тотального гомогената клеток СНО-К1 монАТ SN2-3D2 узнают один белок с молекулярной массой около 210 кДа. Охарактеризованные таким образом AT использовали для дальнейших экспериментов, последовательность которых представлена на рис. 1.

2. Определение первичной структуры фрагмента белка рЗР2

С целью определения последовательности ДНК, кодирующей антиген монАТ SN2-3D2 (в дальнейшем p3D2), был проведен скрининг фаговой экспрессионной библиотеки кДНК клеток СНО-К1 Uni-ZAP XR (Stratagene) с помощью монАТ SN2-3D2. В ходе скрининга были выявлены два клона (клон 5 и клон 8), которые при индукции ИПТГ продуцировали белки, реагирующие с монАТ SN2-3D2. кДНК этих клонов были переклонированы для дальнейшего анализа в аналитический вектор pBluescript SK. Методом секвенирования по Сэнгеру была определена первичная структура кДНК обоих клонов по двум цепям ДНК в каждом случае.

Точная длина кДНК клона 5 составляет 1255 п.н, клона 8 - 1921 п.н. Оба клона имеют протяженный общий участок в 1189 н.п., при этом клон 5 длиннее на 66 н.п. с 5'-конца, а клон 8 - на 666 н.п с З'-конца. Очевидно, кДНК обоих клонов были получены с одинаковых молекул мРНК. Объединенная последовательность нуклеотидов обоих клонов сдана в банк структур ДНК (номер AF002245 в GenBank).

проведен сравнительный анализ p3D2 и его предположительных гомологов из других организмов (человека, крысы и дрозофилы). Впервые различными современными методами показана ассоциация p3D2 с МТ, ядром и центросомой.

Вероятно, p3D2 вовлечен в регуляцию сборки/разборки МТ и/или зависимых от них процессов, т.к. в настоящей работе показано, что он теряет сродство к МТ уже через 5-10 мин. после обработки разрушающими МТ агентами. Это уникальное свойство белка p3D2 не описано в литературе ни для одного из белков, ассоциированных с МТ и/или центросомой.

Таким образом, описанный в работе новый белок, ассоциированный с МТ во всех тестированных линиях клеток, обладает рядом уникальных особенностей, позволяющих предположить, что p3D2 вовлечен в регуляцию таких зависимых от МТ процессов, как деление, внутриклеточный транспорт, передача сигнала. Исследование молекулярных механизмов этих процессов -одна из важнейших задач современной биологии клетки. В связи с этим описание p3D2 открывает широкие перспективы для дальнейших исследований роли этого белка в регуляции жизнедеятельности животной клетки.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании Ученого совета НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. Ломоносова 3 марта 1997 г. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на международных конференциях: 11th meeting of the European Cytoskeletal Forum, Маастрихт, Нидерланды, 1996; European Congress for Molecular Cell Biology, Брайтон, Англия, 1997; 12th meeting of the European Cytoskeletal Forum, Сиена, Италия, 1997; 37th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology, Вашингтон, США, 1997.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", список цитированной литературы включает более 200 публикаций. Работа изложена на 162 страницах и содержит 35 рисунков и 2 таблицы.

Эти данные указывают на то, что, вероятно, центросома выполняет в клетке * и некоторые другие функции, не связанные непосредственно со сборкой МТ. В пользу участия центросомы в регуляции многих клеточных процессов свидетельствует тот факт, что подавляющее большинство белков центросомы локализованы в ней лишь в определенные периоды клеточного цикла и/или локализованы и в других клеточных структурах (Kalt and Schliwa, 1993) - чаще всего на МТ и в ядре. Характеристика белков центросомы с такой локализацией может привести к описанию новых функций центросомы, которая до сих пор остается "центральной загадкой клеточной биологии" (Wheatley, 1982).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была идентификация и характеристика нового белкового компонента центросомы. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Характеристика специфичности моноклональных антител (монАТ) SN2-3D2, полученных к одному из компонентов центросом сперматозоидов рыб.

2. Идентификация антигена монАТ SN2-3D2 на молекулярном уровне -определение первичной структуры белка/белков, выявляемого при скрининге библиотеки кДНК культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНО-К1 монАТ SN2-3D2.

3. Анализ первичной структуры идентифицированного на молекулярном уровне антигена/антигенов монАТ SN2-3D2.

4. Получение поликлонапьных антител (полАТ) к идентифицированному с помощью монАТ SN2-3D2 белку/белкам.

5. Характеристика с помощью полАТ антигена/антигенов монАТ SN2-3D2: исследование внутриклеточной локализации, определение молекулярной массы, изучение распространенности в других клеточных линиях и тканях.

Научная новизна и практическая ценность работы. При выполнении настоящей работы идентифицирован (определена первичная структура С-концевого фрагмента, состоящего из 629 аминокислотных остатков) новый белок p3D2 культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНО-К1, предположительно являющийся серин-треониновой протеинкиназой. Впервые

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микротрубочки (МТ) - один из компонентов цитоскелета эукариотических клеток. От них зависят различные клеточные процессы, такие как морфогенез, деление и некоторые виды цитоплазматического транспорта молекул и органелл. Динамика и расположение МТ в животных клетках контролируется центросомой, которая состоит из пары центриолей и окружающего их аморфного перицентриолярного материала.

Основной и наиболее изученной функцией центросомы является организация МТ как в интерфазе, так и в митозе (Vorobjev and Nadezhdina, 1987). Молекулярные механизмы этих процессов становятся понятными лишь сейчас, хотя структура центросомы была детально описана еще в 1960-70-е гг. В последнее десятилетие одним из наиболее распространенных и плодотворных подходов к исследованию функций центросомы стала идентификация и характеристика отдельных центросомных белков.

К настоящему времени накоплены данные о нескольких десятках белков, локализованных в центросоме. В районе центросомы показано присутствие белков с самыми разными функциями, у-тубулин наряду с еще несколькими белками образует затравку для роста МТ (Zheng at al, 1995). Организации МТ вокруг центросомы в "звезду" и ориентации их минус-концом к центросоме, возможно, способствуют моторные белки, концентрирующиеся в центросоме (Sellitto et al, 1992; Kuriyama et al, 1995; Shroer and Sheetz, 1991; Blangy et al, 1995; Boleti et al, 1996; Gill et al, 1997).

В перицентриолярном материале наблюдается скопление фибриллярных альфа-спиральных белков, которые, вероятно, выполняют структурную функцию (Doxsey et al, 1994; Steffen et al, 1994; Krauss et al, 1997). В центросоме присутствуют белки, разрезающие МТ (Baron and Salisbary, 1992; Shiina et al, 1994; McNally et al, 1996); белки теплового шока (Brown et al, 1996); регуляторные белки - протеинкиназы (Baily et al, 1989; Golsteyn et al, 1995; Gopalan et ai, 1997; Kimura et al, 1997; Fry and Nigg, 1997; Kidd and Raff, 1997), фосфатазы (Brewis et al, 1993; Sontag et al, 1995), циклины (Tournier and Bornens, 1994), p53 (Morgan and Kastan, 1997).

Выделение обогащенной фракции цен тросом из сперматозоидов М/здигпиэ /овв/'/«

Получение моноклонального антитела вМ2-302

Скрининг кДНК библиотеки клеток СНО-К1, отбор позитивных клонов

Определение первичной структуры полученных клонов

Компьютерный анализ первичной структуры полученных клонов

Экспрессия полученных клонов в Е. coli

4-

Получение поликпональных антител к экспрессированным в С, coli фрагментам p3D2

А

Исследование p3D2 с помощью пол изслональных антител

Рис. 1. Схема экспериментов по идентификации и характеристике p3D2.

С помощью компьютерного анализа показано, что кДНК клона 8 в одной лз трех возможных ОРС имеет на З'-конце стоп-кодоны и далее фрагмент ^транслируемой области, а кДНК клона 5 в той же ОРС не содержит стоп-содонов. Таким образом, кДНК обоих клонов представляют собой неполные отсутствует 5'-концы и З'-конец для клона 5) фрагменты ОРС одного белка <ультивируемых клеток СНО-К1, названного р302.

3. Анализ первичной структуры фрагмента белка рЗР2. Для того, ■1тобы определить, действительно ли р302 является новым, не описанным эанее белком, аминокислотная и нуклеотидная последовательности С-«знцевого фрагмента рЗЭ2 (в дальнейшем - Тр302) были подвергнуты «эмпьютерному анализу (использовали пакет программ вепеВее (Brodsky е1 а1, 1990)). Была выявлена высокая гомология (около 72% идентичности) с вероятными серин/треониновыми протеинкиназами - К1АА0204 из чиелобластов человека (номер 086959 в СепВапк) и Р?а18К2 из лимфоцитов <рысы (номер АВ003357 в СепВапк) (рис.2). Функции этих белков не изучались, известны только первичные структуры их кДНК.

KIAA0204

( 1 ) MSFFS FJU<XFKLGSEKKKKQYEHVKRDIJTPEOF^ŒXXGELODC!AFGKVYKAOI7KETS VIA

RatSK2

(1) MSFFÏSFRKXFKLGSEKKKKQYEHVKKDLNPEE, FHEXXGELGDGAFGKVYKAQJRKETN VLA

(61) AAKVXIXrKST1l^IJ2D¥MVEXDXLASCDHPNXVKLLDAFYYENNLWXLI2£FCAGGAVDAVM (61) ÄÄKVXDTK£EEEI^D^MVEXDXL^CD^NXVKLIXAFYyXI^LWXLXEFC^GGAVI>AVM

(121) IXLШ^LTESQIQVVCKQTLÏlЛI^УЫЮЯKXIШЮIXAGNXLFTLIЗGDXKLЗiDFSVSAIaT (121) I^LEBPLTESQIQVVCKQTLEAL^IJmNICCimWIJüíC^XLFTLDGDIKIJWFGVSAKtT

(181) TR TXQRRDSFXGTPYWMÄPEVVMCETSKDRPYDYKADVWSLGX TL XEKAE IEPPHHELNP (181) TRTXQRRDSFXGTPYWMAPEVVMCETSKDRPYDyKñX)VWSLGXTLXEMAETEIPPHHELNP

(241) MRVXIJOÄKSirPrMCPSÄJfSSZiFKDFIJCKCIJÄNVI^M'

(241) ^VLLKIAKSEPPTI^PSRWSSNFKDFLKKCLEÍQrVDAKWTTSQLLQHPFVTVDSNK^

p3d2 (1) GASSDLSXASSEEDKLSQNA.CIL (301) BEL XAEAKAEVTEEVEDGKEEDE E ЕЕГЕЫ S X¿>XPASK¿JLSSDLSXASSEEDKLSQNACIL (301) KELXJŒ2AKAB^TKEVEDGIŒJEDÛÛÛETESALPXPJiliKx1^ASSDLSXASSEEDKLSQNACXL

(24) ESVSHlI^NTPGI3KFSNiWJ^IERPrTDEPGK7lLKGVNEHMGZ3SNLESMAELSDQTVGIH (361) ESVSEKTERSNSEJXLNSICIZNEKPTTDEPEXRVEDINEHITZIRQZEñMTELHDRTñVIK (361) ESVSERTíHNTSGIOTSNKVLSEKPrpEGPEKrV-DVDGPANEVNiEIVAEPNDQAVGFK

( 84 ) E ! GKE- KRPK.LEN PPDTEDQQ L VDIN S VREGS' E E NX- VT ¿E-LNT ;; К - VKPEED?. E KEH QZ (421) iNEIffi-i^PKLENLPDiraJßETVDINSVSEGKENWImlTI^JnEHr.IJCSJEEEKDQjEKGQ (420) i^Gi?E)cKRPQI£SQPI?32Z15ßQTVDVNLVGE®JDS2iX-VIJiEn?2?TDC-LKPjEEDRNEENßE

(141) IPENXZRQ SEEXKDMN I QTtWLVSQETGETEAD FQAVDSEVGi'TKkDGQEKLRKDD.I TQK (480) MFENKLIKSEEXKDIILQTJDLVSQETGEKEAÎlI ßAVZJSEVCLI7CEDTßEKLGEDDKTCK (478) IIENKLTQSEEIKDIHÍQTt-¡DLVSQETGEKEADFQAlrX<EVGcTKEF,TQEKLGKDDKTí{K

(201 ) VVINDRXSEWJ^EM-DVAEJQU^3SSiKmQSADGKEAVEGTßKZ.TEKPTEGPEaGSAE (540) DV^SNTSDVIGTCEAADVAQKVDEDSA-EOTQSNDGKBVVEVGCKilNKPMVGPEaGGTK (538) VVXSDITSEVGTDEPPGDTQ.K5AEQSQ—DAEGGAGEEAPJEPAßTLTEKATEGPEaHGAE

(261) EEPSAQGRVENKEVHQQSAVCEGDGßFI STSVTTQAT PEEPGIDEVEQVSESHSTEEREP

(559) EVP-IKEIVEMNEIEEGKN----KEßAINSSENIMDINEEPGZTEGEEITESSSTEEMEV

(596) raPRSGERVKJKQLEQQSAVCEGEGßVTSTSESTRATTEEPETDEVDQVSESNSIEELE-

(321) SPVSGGAEEQPGSEAVAAAAEVELEGREAAQEVP—VKAEPEAPAASPSNEPHLIiXPSX ( 654 ) RSVVADTDQtCALGSEVQDASKVTTQIDKEKKEIPvsIKKEPEVTWSQPTEPQPVIlPSX (655) RLGVTGAEEQALGSKGEAATELDLEREENAQELP—VXAEPQAPAASQASEPPPVLXPSX

(379 i NINSENTENXGELGD-P.KTE3XLPPXrPENEKi)NDIDSGTGST7i:¥^SSDLNLSXSSFLSK (714) NXN SDSGENKEEI GS L SKTET XLPPESENPKENLRIDSGTGST&Ü'T SSXDI2?LSXSSFLSK (713) WIH^NTENKGEMGMPKPEIXIJPEPiarcKGjrorDSGrGSrVENSSSDbirXSXSSFiSK

(438) TKDSGSl^SLQETKRQKKTIJ<KrPXFXVDGVEVSVTTSKXVTDSDSKTEELBFLIiRQELRE (774) TKVSGS1 SLQETRRQKKTXjKKTRKFXVDGVEVSVTTSKXVTDSDSKTEELXiFLRRQELRE (773) TKDSGS'J SLQETlUtQKKTIJGCriUtFXVDGVEVSVTTSKIVTDSDSKTEEIJZFIJZRQELKE

(493) IЙЬЕ

(834) IttLQFШQ!№QQQШSKLQQQKEQIFKRFEQEtЫSm&QYDQElШIЖQQKQTl ЕЗЬЕ (833) ыа.ъокЕЕОКАОооия(жьооокЕ:ошютбвеме. ЗККЯОГООЕ1Е1ТШЗ<ООКОТ1 енпз

(558) хккххек Р. ао

(894) ОЕНТт&ВПЕЯтП(аЕаЕКЕ13КГ01М1КШККЕЕаЕГУЗКОООЕ1.Г1СЗ ыосхтоа О КА

(893) ШКИОЪ О КА

(618) ЗИЬ-ХЪЯЕЗУ--------------------------------------------------

(954) Е Ь АМ1Е КЕС ЬШГКООПтЫШААХШ Т.ККНЯЬСЕКН0Ь1К001ЖР0У1Т42ЯН(>1.Ы<КШ1К

(953) Е ЬАИ

(627) ------------------------------------------------------------

(1014) ЕТЕЙМЕНУУСКЬ TI^LKmQTQERAIa^KIQRSEAKTRM¡ШFr^SIЯINSTATPrlЗIЖDK (1013) ЕТЕОМаят0ВЪ1Ш1КтаТ0ЕВАЯГРК10^ЕА1т^МА}Ша<В1^ШЗТАТР1^ПЯЕК

(627) ------------------------------------------------------------

(1074) 2К2г-ААСЕгза?скиЕнмдснокнЕы G^^£^ьocкaжа^IJг^ЬQHEKcяI.xvEHEГcкE

(1073) XKQFAЛQE£KP.QЮ7ERMAQHQKHEZ 0МПВ1<2Ь0СЕЛ1ГШЕЬЯд1^2ЖЕКСНЬ1УЕНЕТ2КЬ

(627) ------------------------------------------------------------

(1134) КЕиЖЕШ------------В1ЯБУЕИЕ1ЕТ-----------------------------

(1133) КЕХРСТ?НЗде1кеигек1грДККТиЕЕЕАКк1дедеу£Гкш!дезес1прзадзгдс1д

(627) --------------

(1153) --------------

(1193) tshpsstrapawag

Рис. 2. Сравнение первичных структур белков К1ДА0204, Яа13К2 и рЗй2. Подчеркнуты консенсусные для протеинкиназ последовательности. Идентичные аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

Белки fpЗD2, К1АА0204 и Ва13К2 имеют "усредненный" аминокислотный состав и лишь несколько обогащены глутамином и глутаминовой кислотой. При сравнении этих трех белков можно выделить три отдельных домена: практически полностью совпадают аминокислотные последовательности Ы- и С-концевых участков, а средняя часть имеет лишь 51% идентичных аминокислот и 7% консервативных замен. При этом fpЗD2 более близок к белку крысы Ва18К2, чем к белку человека К!АА0204. Все три белка имеют несколько разную длину за счет своей С-концевой части, которая у белка р302 заметно короче, чем у двух других (рис. 3). Можно предположить, что р302, К1АА0204 и Яа1ЭК2 являются видовыми вариантами или близкими изоформами одного белка.

5-3D2 8-3D2

fp3D2

337

963

KIAA0204

1

365

730 :

1140: 1153

RatSK2

1206

Рис. 3. Предполагаемая доменная структура белков ЮАА0204, RatSK2 и p3D2. Сплошной черной заливкой показаны N- и С-концевые домены, имеющие высокую степень гомологии (более 85% идентичных аминокислот). Серой заливкой выделен срединный домен, содержащий 51% идентичных аминокислот. Тонкими линиями сверху показано относительное расположение клонов 5 (5-3D2 к 8 (3-3D2). Цифры обозначают номера аминокислотных остатков.

N-концевой домен белков KIAA0204 и RatSK2 содержит характерные для протеинкиназ участки первичной структуры (подчеркнуты на рис. 2). К сожалению, в fp3D2 эти участки N-концевого домена отсутствуют. N-концевые домены KIAA0204 и RatSK2 гомологичны нескольким описанным в литературе протеинкиназам (рис. 4): р21-активируемой р65-РАК крысы (Manser et а!, 1995), протеинкиназам дрожжей PAK/Snk1, SHK2, STE20, CLA4, NRK1 (N-Ricn Kinase) (Johnston et al, 1994) и NRK2 (Levedakou et al, 1994), a также протеинкиназам дрозофилы ninaC (Porter and Montell, 1993) и fused.

Вне протеинкиназного домена имеют гомологию с KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 только NRK1 (Johnston et al, 1994) и NRK2 (Levedakou et al, 1994). При этом KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 не обогащены аспарагином, как NRK, и не имеют характерных для NRK полиаспарагиновых последовательностей. В составе консенсусных протеинкиназных последовательностей между KIAA0204, RatSK2 и NRK также имеется ряд отличий (рис. 4). Гомология (27% идентичных аминокислот) во всех участках молекул (рис. 4, 5) наблюдается и

при сравнении KIAA0204 и RatSK2 с протеинкиназой дрозофилы LK6 (Kidd and Raff, 1997).

KIAA0204 (79) NRK1 (69)

NRK2 (53)

P 6 5-PAK (314) EILVMRENi£~NEtöi^^

LK6 (163) EVETraHCQGHLGiiQJ^iEFFED^-KKYL^ffKIN^ELSRIQE

N1— ,____ ____ ________________------—--------- _

NRK2 (98)

P65-PAK (358)

LK6 (207) H IQ— FS 2KE P S Q1IXEIAS GLDF—liÖKKGSJÄRßtföSii ¿¿CVK

KIAA0204 (165) LI3OT—------SR%IQK3ä)SF—

NRK1 (153) ------NQ3iSLRRQ!$4—

NRK2 (141) RTNI—S?VGÖLÖfiiRVL------ENHCDMASTL-HT&RS^Sei

P65-PAK (398) M@3S—'VK^f^FCSÖI------

LK6 (249) ^SLCPltl^HpLGSGiKFTTDlSSPAATPQLLTPVifeÄEi"'

КIAA0204 (201)

NRKl (189) VH$------EGVY^T^lW^SiTyBiiiTESNpgXCDVEAS

NRK2 (177) LFS-----

P65-PAK (434) ЩТ------R- "'"**" " """

LK6 (295) VÄDILFVGEA-E

Рис. 4. Сравнение первичной структуры N-концевого домена KIAA0204 с первичными структурами некоторых протеинкиназ. Цифры в скобках обозначают номера аминокислотных остатков. Заштрихованы идентичные аминокислотные остатки.

С-концевые домены KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 практически не содержат серина, треонина, глицина и пролина, но обогащены аргинином и глутамином и состоят из несовершенных аминокислотных повторов. С-концевые домены KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 имеют значительную гомологию с цитоскелетными фибриллярными белками (рис. 5): структурным белком АТ1-46 лимбической и ольфакторной системы мозга крыс (Schaar et al, 1996), грихогиалином - бел ком, ассоциированным с кератиновыми филаментами в клетках волосяных луковиц (Lee et al, 1993), перицентрином - одним из

основных компонентов перицентриолярного материала (Doxsey et al, 1994), МАР1А и MAPI В - белками, ассоциированными с микротрубочки мозга (Garner et af, 1990; Noble et al, 1989). Можно предположить, что по крайней мере одной из функцией С-концевого домена KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 является ассоциация с микротрубочками.

fp3D2 (531) оЕщз^отаокшрж--щ--^щ^гетжш^ш^сшск

KIAA0204 (865)

МАР1А (404)

МАР1В (680) ----------KEXKKEÎKfi—ЕЕ---RKËEKKDAKKDEKRKiTKPE

PERI (918) ADLELAQGEGKALRDApRRLLDL—FGDTLKAAVTLKS^ISEGßGL

L Кб (713)----IMRNDAQTEENKIMQ—---DËËKK^mQQDDVDGAKKQ

TRICHO (284) ОШ-RRERQEEEC^QQKC^EQQLRR^feSRÎÎQQEERSEQQËRRE

fp3D2 (573) ?-----шштщщят-------шщввкщтшя®

KIAA0204 (907) £------------ШЫСЕНЙЁКУСКСХЮЕЬ:

MAP IB (446) VjS^pÎVK^iÔSPKÎkEI---IÇKXSS>XI(ήTPQSI>TÇKPSÂÏÎ

kap1a (711) v^ls - к pdlkp ft pevrkte— y^akapgrvrvdkgraargekeïj

peri (962) l£dh$^daadtsdarlaaap3^dmwsdegllei.drtlpegaetssv

LK6 (749) GPSSDISATTITDNNKLQTPV---MTTTHINNWQTGDAIEDDDVKG

tricho (330) qqser-reqqlrreqeerreq-qlrreqeeerreqqlrreqesrre

Рис. 5. Сравнение первичной структуры С-концевых доменов ЮАА0204 и p3D2 с первичными структурами некоторых цитоскеле тных белков. Цифры в скобках обозначают номера аминокислотных остатков. Заштрихованы идентичные аминокислоты. РЕЙ/ - перицентрин, WIHO - трихогиалин.

Средняя часть белков KIAA0204, RatSK2 и fp3D2 не имеет выраженных гомологии ни с одним из белков в базах данных. Наблюдается лишь некоторое сходство с протеинкиназами LK6, NRK1 и NRK2, а также с рядом аполипопротеинов и белков, связывающих нуклеиновые кислоты. Средняя часть KIAA0204, RatSK2 и p3D2 может быть функционально незначима, что и привело к сильной дивергенции. Возможно, наоборот, этот срединный домен выполняет какие-либо видоспецифические функции, например, ответственен за связь с другими белками, которые могут отличаться у человека, крысы и китайского хомячка.

Таким образом, белки KIAA0204, RatSK2 и p3D2 представляют собой, по всей видимости, химерный белок, состоящий из протеинкиназного домена, сопряженного через вариабельную часть с "цитоскелетным" доменом. Здесь просматривается аналогия с белком дрозофилы ninaC, который является

лиозиноподобным белком, несущим, помимо АТФазного домена миозина, фотеинкиназный домен (Johnston et al, 1994).

4. Исследования свойств рЗР2 с помощью поликлональных жтител.

4.1. Получение поликпональных антител к fo3D2

Клоны 5 и 8 были экслрессированы в Е. coli в векторе pQE в форме ¡литного белка, содержащего последовательность из 6 остатков гистидина на J-конце. Молекулярная масса продуктов экспрессии, определенная по !лектрофорезу в системе Лэммли, для клона 8 составила 116 кДа, а для лона 5-30 кДа (рис. 6). Оба экспрессированных продукта были очищены с юмощью аффинной хроматографии на Ni-HTA-агарозе (рис. 6). Продукт клона I использовали для иммунизации кролика с целью получения поликлональных Л" к p3D2. Полученную сыворотку очищали двумя способами - используя для [ффинной очистки продукт клона 8 - AT пол302, и истощая AT пол302 1родуктом экспрессии клона 5 - AT пол8-302.

В случае очистки продукта экспрессии клона 5 на Ni-HTA-агарозе ;вязывается не только белок с массой 30 кДа, но и ряд белков с юлекулярными массами в области от 50 до 30 кДа. Вероятно, продукт клона 5 репрессируется как белок с молекулярной массой 50 кДа, но деградирует с >бразованием продуктов с меньшими молекулярными массами. Для проверки ¡того предположения был проведен иммуноблоттинг продуктов экспрессии тона 5 с поликлональными аффиноочищенными AT к продукту экспрессии лона 8 (AT пол302).

4.2. Изучение специфичности поликлональных антител к рЗР2

AT полЗР2 узнают на иммуноблоте продукты экспрессии и клона 5 несколько белков с молекулярными массами от 50 до 30 кДа), и клона 8, гаскольку оба клона имеют протяженный общий участок. Эти результаты юдтверждают предположение о деградации продукта клона 5. AT пол8-Зй2 'знают только продукт клона 8, т.к. получены при истощении AT полЗй2 :родуктом клона 5 (рис.6). Таким образом, продукт клона 8 имеет резко [номальную электрофоретическую подвижность (рассчитанная по структуре его ДНК молекулярная масса составляет 70 кДа), в то время, как клон 5

экспрессирует балок с молекулярной массой, совпадающей с расчетной. Это можно объяснить тем, что продукт клона 8 включает в себя С-концевой домен, в то время, как продукт, клона 5 - только'срединный домен (рис. 3). Именно С-концевой домен р302 имеет гомологию с фибрилярными цитоскелетными белками (рис. 5), для которых характерна аномальная элекгрофоретическая подвижность.

116 -97 -66 -

45 -

29 -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 6. Электрофорез в 6-12% градиентной ПААГ (дорожки 1-3 и В-10) и иммуноблоттинг с паликлональныии антителами к рЗй2 полЗОг (дорожки 6, 7) и пол8-302 (дорожки '4/ 5) жспрессированных в £ со//' продуктов клонов 5 и 8. Клон 8 экспрессирует белок с кажущейся молекулярной массой 116 кДа, клон 5-50 кДа. Антитела поя302 узнают продукты обоих клонов, а антитела пол8-302 • только продукт экспрессии клона 8. На гель наносили: 1, 4, 6 -лизат бактерий, несущих вектор рОЕ-31 со встройкой клона 8, после 3-4-часовой индукции ИПТГ;2 - лизат тахже бактерий, не индуцированных ИПТГ; 3 " продукт экспрессии клона 8 после очистки на М-НТА-агарозе; 8 • продукт экспрессии клона 5 после очистки на М-НТА-агарозе; 5, 7, 9-лизат бактерий, несущих вектор рОВ-32 со встройкой клона 5, индуцированных ИПТГ; 10 - лизат тех же бактерий, не индуцированных ИПТГ.

На иммуноблоте тотального гомогената клеток СНО АТ пол302 и пол8-302 реагируют с одним белком с молекулярной массой около 210 кДа, что совпадает с результатами, полученными с использованием монАТ (рис. 7). В ряде случаев в гомогенате клеток СНО-К1 обоими АТ узнается не один, а два или более антигена с молекулярными массами 210 и около 180 кДа (рис. 7).

Предположительно, это связано с частичной деградацией р302 при изготовлении и хранении гомогената.

кР

не

97 -6645 -29-

1 2 3 4 5 6

Рис. 7. Иммуноблогтинг различных фракций клеток СНО-К1 с моноклональными и политональными антителами к рЗР2. На 6-12% градиентный ПААГ наносили: 1-4 - гомогенат клеток СНО-К1; 5 - ядерную фракцию; 6 - фракцию белков, растворимых в 1% Тритоне Х-100. В качестве первых антител использовали; 1 - моноклональные АТ 5Ы2-302; 2 -поликлональные антитела пол8-302. 3-6 - поликлональные антитела пол302. Дорожки 1-3 проявлены с использованием пероксидазного конъюгата, дорожки 4-6 - с использованием фосфатазного конъюгата. Все антитела ' реагируют с белком молекулярной массы 210 кДа и в некоторых случаях с предполагаемым продуктом его деградации - белком 180 кДа.

4.3. Исследование распространения белков, гомологичных оЗР2. в разных линиях культивируемых клеток и органах крнсы.

Мы имеем право называть рЗР2 только белок клеток СН0-К1. Однако ясно, что белки К1АА0204 и ЯЫЭКг также должны узнаваться АТ пол302; далее их и подобные белки мы будем называть "белки, гомологичные р302". При иммуноблоттинге гомогенатов клеток Не1_а (человек), ЗТЗ (мышь) и СПЭВ

(свинья) АТ полЗЭ2 окрашивают две полосы: одну - соответствующую бет той же молекулярной массы (210 кДа). что и в клеткгх СНО-К1, вторую соответствующую белку с молекулярной массой около 300 кДа (рис. 8 Вероятно, что в клетках человека АТ полЗй2 выявляют белок К1АА020-который должен - иметь.кажущуюся по электрофорезу молекулярную масс около 300, а не около 210. кДа, поскольку он заметно длиннее р302 на С конце. В клетках млекопитающих других видов, вероятно, также выявляютс белки, гомологичные р302.

ло i«e-

87-М-

4528-

• 1 234

Рис. 8. Имиуноблоттинг гомогвнатов культивируемых клеток с поликлональными антителами nan3D2. На 6• 12% ПААГ наносили гомогенаты: 1 - клеток культуры ¡ СНО-К1, 2 - клеток СПЭВ, 3 • клеток HeLa, 4 г фибробластов ЗТЗ. Во всех линиях клеток окрашивается два полосы с молекулярными массами 210 и 300 кДа.

Возникновение второй, более низкомолекулярной, полосы на иммуноблотах можно объяснить двояко. Возможно, в перечисленных выше культивируемых клетках белки, гомологичные p3D2, существуют в виде двух изоформ. Но вероятно также, что белки, гомологичные • p3D2, деградируют, образуя полосу в облает^ 210 кДа, как и сам p3D2 деградирует, образуя полосу в области 180 кДа.

Насколько распространены белки, гомологичные p3D2, в тканях in situ? AT пол302 на иммуноблотах мозга, печени, селезенки, надпочечников и семенников крысы окрашивают нескольких высокомолекулярных полос (210 кДа и чуть ниже) (рис. 9). Полосы меньшей, чем 210 кДа, массы присутствуют

не всегда и вероятно, образуются за счет протеолиза. Наибольшее содержание белка, гомологичного р302, отмечено в мозге и семенниках -тканях с большим содержанием микротрубочек,. в которых экспрессируются

ч '

белки, ассоциированные с микротрубочками. Интересно, что р302 не выявляется в сердечной мышце, мало его и в селезенке - тканях, бедных микротрубочками. Вероятно, в тканях крысы присутствует белок РЫЭКг, но ' нельзя исключить наличие и других гомологичнь*х белков.

1169766-

4529-

1

3 4 5 6 7

Рис. 9. Иммуноблоттинг гомогенатов органов самца крысы с политональными антителами пол302. На 6-12% ПААГ наносили гомогенаты: 1 - мозга, 2- печени, 3 - селезенки, 4- надпочечника, 5 - почки, 6-семенника, 7 - сердца. Во всех органах, кроме сердца, присутствует белок, гомологичный ЗП2, с молекулярной массой 210 кДа.

Таким 06pa30Mj белки, узнаваемые AT к p3D2 и сходные с ним по молекулярной массе, распространены повсеместно в культивируемых клетках и в тканях млекопитающих in situ. Можно предположить, что эти белки либо представлены изоформами в каждом типе клеток, либо легко деградируют in vitro.

4А. Исследование внутриклеточной локализации P3D2 и гомологичных ему белков.

С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием AT non3D2 была исследована локализация p3D2 или гомологичных ему белков в культивируемых клетках четырех разных линий: СНО, HeLa, ЗТЗ и СПЭВ (рис.

10). Во всех случаях получена очень сходная картина иммунофлуоресцентного окрашивания. Антиген локализован в ядре (окрашивание в виде ярких пятен), на микротрубочках и в центросоме клеток, причем вне зависимости от типа использованной процедуры фиксации. Интересно, что центросомное окрашивание практически отсутствует в клетках Не1_а.

Рис. 10. Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемых клеток поликлональными антителами полЗй2: а - ЗТЗ, б - Нв1а, в - СПЭЗ, г - СНО-К1. Во всех культурах антитела полЗР2 окрашивают центросому, ядро и микротрубочки. Масштабная линейка - 10 мкм.

В отличие от монАТ 8№-302, полАТ окрашивают ядра клеток; это можно объяснить маскированием эпитопа, узнаваемого монАТ, в ядрах. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания АТ полЗР2 и монАТ БС35 к маркерному белку интерхроматиновых районов ядра показано, что р302 и гомологичные ему белки локализованы в ядрах в интерхроматиновых районах.

С помощью иммуноэлектронной микроскопии показано, что АТ полЗЭ2 действительно связываются с микротрубочками, а не с другими фибриллярными цитоскелетными структурами. На рис. 11 видно, что частицы

золота в клетках СНО-К1 отсутствуют на промежуточных филаментах и на других структурах в цитоплазме, но их много на микротрубочках.

С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии проведено изучение клеточной локализации р302 и гомологичных белков на различных стадиях митоза в клетках Не1_а. Во всех фазах митоза АТ полЗЭ2 окрашивают веретено деления. Интересно, что, несмотря на то, что в телофазе ядра дочерних клеток уже практически сформированы, р302 и гомологичные белки начинают выявляться в ядрах только в самом конце телофазы.

Рис. 11. Иммуноэлектронная микроскопия клеток СНО-К1 с поликлональными антителами пол302. Частицы золота взаимодействуют с микротрубочками.

4.5. Исследование влияния различных воздействий на распределение рЗР2 и гомологичных белков в культивируемых клетках.

Связь р302 и гомологичных белков с микротрубочками подтверждена также в экспериментах по обработке клеток ядами, влияющими на микротрубочки. При действии на клетки таксола АТ пол302 окрашивают пучки микротрубочек (рис. 12), причем АТ не отмываются от пучков 0.6 М КС1. Окрашивание АТ полЗ02 кристаллов тубулина наблюдается и при действии на клетки винбластина. При воздействии на клетки нокодазола в течение 2 часов (за это время происходит полная разборка микротрубочек) АТ лол302 окрашивают ядра во всех проанализированных типах клеток, но окрашивание фибриллярной сети в цитоплазме отсутствует, что подтверждает связь р302 и гомологичных белков именно с микротрубочками (рис. 12).

При действии на клетки нокодазола в течение 5-30 мин значительное количество микротрубочек еще сохраняется, но при окрашивании таких клеток АТ пол302 микротрубочки не узнаются. Уже через 5-10 мин воздействия нокодазола на клетки СНО-К1 и НеЬа р302 (или гомологичный белок в случае Не1_а) теряет связь с микротрубочками. Сходные данные получены и при разрушении микротрубочек колхицином вместо нокодазола. При восстановлении системы микротрубочек после их полного разрушения нокодазолом рЗЭ2 или гомологичный белок связывается с микротрубочками только через 7-10 мин. Вероятно, в нокодазоле происходит модификация рЗЭ2 или гомологичных белков, что приводит к их временной неспособности связываться с микротрубочками.

Рис. 12. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток СНО-К1 после обработки нокодазолом (а) и таксолом (б) поликлональными антителами полЗР2. а • окрашивается центросома и ядро, окрашивание сети в цитоплазме отсутствует; б - окрашиваются пучки микротрубочех. Масштабная линейка • Юмкм.

4.6. Исследование рЗР2 и гомологичных белков в различных фракциях клеток СНО-К1.

С помощью иммуноблоттинга с АТ полЗР2 показано присутствие р302 во фракции ядер, фракции белков, растворимых в 1% растворе Тритона Х-100, и, наоборот, нерастворимых в Тритоне Х-100 (рис. 7).

Для подтверждения способности р302 связываться с МТ были проведены эксперименты по соосаждению белка рЗЭ2 из экстракта клеток СНО-К1 с МТ мозга быка в различных условиях. Тубулин, выделенный из

иозга быка, инкубировали 30 мин. при 37°С - в этих условиях происходит полимеризация МТ. Далее полученные МТ инкубировали 30 мин. при 25°С с экстрактом клеток СНО-К1, содержащим нативный p3D2, в присутствии гаксола, ГТФ и триполифосфата. В часть проб добавляли 0.8 М KCl. В <ачестве отрицательных контролен использовали МТ мозга, инкубированные три 25°С без добавления клеточного экстракта и клеточный экстракт, инкубированный с нокодазолом. Затем осаждали МТ и связавшиеся с ними белки через подушку, содержащую 4 М глицерин. Полученные осадки исследовали с помощью иммуноблоттинга с AT полЗй2.

p3D2 выявляется в препарате МТ в виде белка с молекулярной массой 210 кДа. На блоте присутствует еще несколько полос в области 180 кДа -вероятно, это продукты деградации белка 210 кДа (рис. 13, дорожки 2, 6). На контрольном блоте (инкубация МТ мозга без добавления клеточного экстракта) p3D2 отсутствует, что указывает на то, что p3D2 нет в МТ мозга, и соосаждается с МТ именно p3D2 из клеток СНО-К1 (рис. 13, дорожки 1, 5). В случае инкубации экстракта с нокодазолом p3D2 отсутствует в препарате так же, как и МТ, что позволяет сделать вывод о том, что p3D2 осаждается именно за счет ассоциации с МТ, а не за счет, например, собственной агрегации (рис. 13, дорожки 3, 7). Отсутствует p3D2 в препарате МТ также и в случае добавления к препарату не менее 0.8 М KCl (рис. 13, дорожки 4. 8). Чувствительность к соли - общее свойство всех описанные в литературе белков, ассоциированных с МТ. Однако многие ассоциированные белки отделяются от МТ уже в 0.2 М KCl. Поэтому связь с МТ p3D2 можно считать очень прочной.

До сих пор из всех протеинкиназ, соосаждающихся с микротрубочками, лишь митоген-активируемая протеинкиназа МАРК обнаружена на микротрубочках методом иммунофлуоресцентной микроскопии. Таким образом, концентрация p3D2 и гомологичных белков на микротрубочках настолько велика, что он обнаруживается на них при иммунофлуоресценнтном окрашивании во всех тестированных линиях клеток.

КО 1169766-

4529-

12 34 56 78

Рис. 13. Соосаждение белка р302 из экстракта клеток СНО-К1 микротрубочками мозга быка. Микротрубочки мозга быка инкубировали экстрактом СН0-К1 при 25оС, затем осаждали через подушку с 4 глицерином и исследовали осадки. 1-4 - электрофорез в 6-12% ПААГ. 5-6 иммуноблоттинг тех же препаратов с поликлональными антителами полЗО 1, 5 - препарат микротрубочек мозга: микротрубочки мозга не содерж. рЗР2; 2, 6 • микротрубочки мозга инкубировали с экстрактом клеток СНО-К р302 соосаждается с микротрубочками мозга в присутствии таксола. 3, 7 -инкубационную смесь добавляли нокодазол: микротрубочки мозга и р31 отсутствуют в препарате после инкубации с нокодазолом. 4, 8 • инкубационную смесь добавляли 0.8 М КС!: в присутствии соли рЗР2 / соосаждается с микротрубочками мозга.

5. Возможная роль рЗР2 в клетке.

К настоящему времени описано около десяти протеинкиназ, которь фосфорилируют белки МТ и/или структурно связаны с МТ. Это во-первы; взаимодействующие кроме МТ, и с другими клеточными органеллами, p34cdc2, РКС (Garcia-Rocha et al, 1997), GSK (Mandrelkow and Mandrelkov

1995), и, во-вторых, ряд специфических для МТ протеинкиназ: киназ семейства polo (Travares et al, 1996; Kidata et al, 1993; Ohkura et al, 1995; Lee < al, 1995; Fode et al, 1994), семейство митоген-акгивируемых протеинкина МАРК (Reszka et al, 1995; Ding et al, 1995; Morishima-Kawashima and Kosit

1996), p110mark (lllenberger et al, 1996), LK6 (Kidd and Raff, 1997), Pk9.7 (Snap and Smith, 1996). Конкретные функции этих протеинкиназ, спект|

фосфорилируемых ими белков и биологический смысл взаимодействия с МТ различны.

Чаще всего взаимодействующие с МТ протеинкиназы фосфорилируют структурные белки, ассоциированные с МТ, что может влиять на способность этих белков к взаимодействию с МТ и тем самым на стабильность МТ (Ookata et al, 1995). Ассоциация протеинкиназ с МТ может иметь и иной функциональный смысл - ограничивать активность протеинкиназ определенным районом клетки. При этом субстратами для фосфорилирования могут быть не белки МТ, а другие клеточные белки.

p3D2 кроме МТ локализован еще и в интерхроматиновых районах ядра, и в центросоме. Каковы же могут быть функции протеинкиназ с такой локализацией? Вероятно, показанная в наших экспериментах быстрая потеря связи p3D2 с МТ может играть важную роль в их разборке и/или сопряженных с ней процессах. Таким зависимым от МТ процессом, требующим участия множества разных белков, может быть, например, транспорт мРНП по МТ. Существует предположение о том, что транспорт мРНП может осуществляться по МТ в виде "гранул" - комплексов, состоящих из различных молекул мРНК и белков, необходимых для трансляции (Bassell and Singer, 1997). О белках, входящих в состав "гранул" или участвующих в регуляции связывания "гранул" с МТ известно крайне мало. Можно предположить, что p3D2 и гомологичные белки входят в состав мРНП при их выходе из ядра в цитоплазму. При транспорте "гранул" по МТ белок p3D2 может входить в состав "гранул" и/или активировать/инактивировать некие компоненты, участвующие во взаимодействии "гранул" с МТ.

Для подтверждения или опровержения гипотезы об участии p3D2 и гомологичных протеинкиназ в транспорте мРНП по МТ, конечно, требуется гораздо больше данных, чем сведения о локализации белка в клетке. В ходе дальнейших исследований мы предполагаем объяснить функциональный смысл ассоциации p3D2 с ядром, центросомой и МТ.

выводы

1. С помощью моноклонапьных антител из фаговой экспрессионной библиотеки ' кДНК клонирован С-концевой фрагмент (658 аминокислотных остатков в ОРС) белка рЗР2 культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНО-К1, имеющий более 72% идентичных аминокислот с предполагаемыми серинДреониновыми протеинкиназами человека К1АА0204 и крысы Яа18К2.

2. С-концевой домен рЗй2, К1АА0204 и йа15К2 длиной в 233 аминокислотных остатка является высококонсервативным (98% идентичных аминокислот для трех белков). Он гомологичен фибриллярным структурным цитоскелетным белкам; содержащий его фрагмент р302 имеет резко аномальную электрофоретическую подвижность в системе Лэммли.

3. Поликлональные антитела, полученные к экспрессированному в Есо// фрагменту р302, как и моноклональные антитела, использованные для скрининга библиотеки кДНК, реагируют в клетках СНО-К1 с белком молекулярной массой 210 кДа.

4. В клетках СНО-К1 белок рЗЭ2 ассоциирован с микротрубочками и содержится также в интерхроматиновых районах ядер и на центросоме. Такую же локализацию имеют белки с молекулярной массой около 300 кДа, выявляемые поликлонапьными антителами к р302 в культивируемых клетках человека, свиньи и мыши и, по всей видимости, являющиеся гомологами р302.

5. Белок рЗй2 клеток СНО-К1 соосаждается с микротрубочками мозга, и его связь с микротрубочками устойчива к обработке раствором КС1 с концентрацией меньше 0.8 М.

6. При некоторых экспериментальных воздействиях на клетки рЗБ2 или гомологичные ему белки могут утрачивать способность связываться с МТ. Не все интерфазные МТ в интактных клетках ассоциированы с р302 или гомологичными ему белками. Это отличает р302 и гомологичные ему белки от известных структурных белков, ассоциированных с МТ.

7. Белок, гомологичный р302, широко распространен во всех тестированных тканях крысы, за исключением мышечной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Зиновкина Л.А и Надеждина Е.С. Белки центросомы // Биохимия. -996,- т. 61,-С. 1347-1365.

2. Zinovkina L, Solovyanova О.В., Nadezhdina E.S. Isolation and ¡haracterization of loach fish Misgurnus fossilis sperm centrosomes // 11th •uropean Cytoskeleton Forum, Maastricht, The Netherlands. August 31- September I. - 1996. - P. 79.

3. Zinovkina L.A., Poltaraus A.B., Solovyanova O.B, Nadezhdina E.S. Novel jrotein associated with nuclei, microtubules and centrosomes in cultured CHO cells '/ European Congress for Molecular Cell Biology, Brinhton, England, March 22-25. -1997. - P. 29.

4. Zinovkina L.A., Poltaraus A.B., Solovyanova O.B, Nadezhdina E.S. Chinese lamster protein homologous to human putative protein kinase KIAA0204 is associated with nuclei, microtubules and centrosomes in CHO-K1 cells // FEBS .otters. - 1997. - vol. 414.- P. 135-139.

5. Zinovkina L.A., Poltaraus A.B., Solovyanova O.B, Nadezhdina E.S. identification of a novel protein (putative protein kinase) associated with Dentrosomes, nuclei and microtubules in mammalian and human cells // 12th meeting of the European Cytoskeletal Forum, Siena, Italy, September 6-11. - 1997,-P.140.

6. Zinovkina L.A., Poltaraus A.B., Solovyanova O.B, Nadezhdina E.S. High molecular weight putative protein kinase is associated with centrosomes, nuclei and microtubules in mammalian cells // Molecular Biology of the Cell. - 1997. - vol. 8Suppl. - P. 58a.

7. Зиновкина Л.А., Полтараус А.Б., Соловьянова О.Б. и Надеждина Е.С. Предполагаемая новая протеинкиназа млекопитающих, ассоциированная с микротрубочками // Молекулярная биология. - 1998. - т. 32- С. 350-357.