Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитофизиологические последствия ультрафиолетового микрооблучения центросомы в клетках культуры ткани

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Цитофизиологические последствия ультрафиолетового микрооблучения центросомы в клетках культуры ткани"

московский государственный университет

им. М. В. ЛОМОНОСОВА

.,. . С, '

^ биологический факультет

N

На правах рукописи

неверова анна леонидовна

удк 576.353:576.311

ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО МИКРООБЛУЧЕНИЯ ЦЕНТРОСОМЫ в КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

03.00.11

эмбриология, гистология, цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского (директор - академш РАН В. П. Скулачев) Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Воробьев И.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Онищенко Г.Е. доктор биологических наук, Надеждина Е.С.

Ведущее учреждение: Институт Биологии Развития РАН

Защита диссертации состоится в часов на заседании специализированного биологического совета 053.05.68 в Московском государственном университете им. М. Ломоносова по адресу: 1 19899, Москва, Воробьевы горы, Биологическ! факультет МГУ, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическо! факультета МГУ.

Автореферат разослан <£<£> о^-т^^^л 19Э§ г

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Б. Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Цитоплазма животной клетки пронизана сетью филаментов - белковых нитей различной толщины, которые в совокупности составляют цитоскелет клетки. Внутриклеточный транспорт, поддержание формы клетки и способность клетки увеличивать площадь обеспечиваются цитоскелетом.

Одним из компонентов цитоскелета является система микротрубочек, принимающая активное участие как в митозе, так и в интерфазных процессах в клетке. Центром организации и нуклеации микротрубочек в клетке является центросома - особая структура, обычно расположенная вблизи ядра в геометрическом центре клетки. Существует ряд данных, указывающих на то, что функции центросомы в клетке не ограничиваются организацией и нуклеацией микротрубочек. Показано, что положение центросомы и ее перемещение во многих клетках закономерно и зависит от типа клетки, направления ее движения или движения потока окружающей клетку среды (Euteneuer, Schliwa, 1982; Rogers et al., 1985; обзор Vorobjev, Nadezhdina, 1987). Центросома и система микротрубочек составляют основу цитоскелета и, видимо, играют ключевую роль в определении формы клеток (обзоры Kellog et al., 1994; Raff, 1996). Центросома может определять направление движения клеток по субстрату (Koonce et al., 1984). Существуют экспериментально обоснованные предположения о возможной роли центросомы как регулятора внутриклеточного транспорта (Freed, Lebowitz, 1970; Wiemer et al., 1997; Грирорьев и др., 1997).

В исследовании функций центросомы важными являются прижизненные эксперименты. Основной прием таких экспериментов - своего рода выключение центросомы, частично или полностью, из внутриклеточных событий и наблюдение реакции клетки на такое выключение. В нашей работе для инактивации центросомы в живых клетках культуры ткани использовалось ультрафиолетовое ммкрооблученпе полюса митотического веретена.

Целью настоящей работы было изучить роль центросомы в интерфазных клетках в культуре инактивируя ее с помощью ультрафиолетового микрооблучения.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Проследить судьбу дочерних клеток, у материнской клетки которых в анафазе был облучен один из полюсов веретена.

2. Выявить цитофизиологические параметры, по которым клетка, получившая в результате деления облученную центросому, отличается от сестринской клетки, получившей необлученную центросому.

3. Выяснить, как изменяются с течением времени различия между сестринскими клетками, одна из которых получила облученную центросому.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В работе получены новые данные об участии центросомы в основных процессах интерфазы: регуляции синтеза ДНК и РНК и росте клеток.

В ходе прижизненных наблюдений над клетками, содержащими облученную центросому, и в клетках, фиксированных на различных сроках после облучения центросомы, с последующим иммуноцитохимическим исследованием, изучено поведение в интерфазе клеток, несущих облученную центросому.

Прослежена динамика распластывания клеток, содержащих облученную центросому. Показано, что такие клетки не способны увеличивать свою площадь после первичного распластывания в раннем С1-периоде.

Анализ сальтаторных движений гранул показал, что с течением времени, прошедшего после облучения центросомы, усиливаются различия в характере движений гранул в клетках, содержащих облученную центросому, по сравнению с их сестринскими клетками. Число треков сальтаторных движений гранул в клетках, содержащих облученную центросому, увеличивается, а их средняя длина существенно не меняется.

Показано, что в клетках, содержащих облученную центросому, снижен синтез РНК. Выявлено аномальное распределение ядрышкового белка В23 в таких клетках.

Показано, что клетки, содержащие облученную центросому, не вступают в Б-период за время, вдвое превышающее длительность нормального в!-периода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы докладывались на семинарах отдела электронной микроскопии. Апробация диссертации проходила на расширенном заседании кафедры цитологии и гистологии. Результаты работы были представлены на 9 Европейском Цитоскелетном Форуме (Dundee, 1994), на Международной Конференции по УФ и синему свету (Marburg, Germany, 1996), на 7 Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (Stresa, Italy, 1997).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток и прижизненные наблюдения В качестве объекта исследования использовали клетки культуры ткани СПЭВ (почка эмбриона свиньи). Клетки выращивали на круглых кварцевых покровных стеклах. Для культивирования использовали среду 199 с 10% сыворотки плодов коровы с добавлением 100 мкг/мл гентамицина. Клетки использовали для наблюдений на 2-3 день после посадки.

Покровные стекла с выращенными клетками монтировали в модифицированную камеру Дворака-Штоттлера для прижизненных наблюдений (Узбеков, Воробьев 1991а). Прижизненные наблюдения клеток осуществляли в фазовом контрасте через объективы "Plan-Neofluar" 40/0.9 и "Planapochromat" 63/1.4, ("Opton", ФРГ). Клетки фотографировали с помощью микрофотонасадки МФН-12 на пленку Микрат-300 ("Тасма"), а также проводили запись при помощи CCD видеокамеры (R.O.C., Taiwan) на цейтраферный видеомагнитофон (Panasonic AG-6730).

Микрооблучение

Для микрооблучения применяли специальную установку, подробно описанную ранее (Узбеков, Воробьев 1991а). Облучение проводили через интерференционный светофильтр = 280 нм) с помощью кварцевого

объектива "Ultrafluar" 100/1.25, ("Opton", ФРГХ глицериновая иммерсия.

Диаметр светового УФ пучка в фокальной плоскости объектива составлял около 1.6 мкм. Плотность мощности облучения составляла 4x10"2 эрг/(мкм2.с).

Облучение клеток проводили в ранней анафазе, не более чем через 1.5 мин после начала расхождения хромосом. В эксперименте облучался полюс веретена, а в контрольных опытах проводилось аналогичное облучение участка цитоплазмы, удаленного от хромосом на расстояние, примерно равное расстоянию между хромосомами и полюсом (рис. 1).

Илшупофлуоресцептные исследования Для иммуноцитохимической локализации белка В23 клетки промывали в физиологическом фосфатном буфере (PBS), фиксировали 20 мин 3%-ным формальдегидом на PBS, лизировали I мин в 1%-ном растворе Triton-X-100 на PBS при комнатной температуре, препарат промывали в PBS и обрабатывали мышиными антителами против белка В23 и далее антимышиными антителами коньюгированными с Texas red.

Для иммуноцитохимической окраски на тубулин клетки промывали в PBS, затем лизировали 1 - 2 мин в следующей смеси: 1% по весу Triton Х-100, 4% по весу полиэтиленгликколя на гипотоническом буфере (50 шМ имидазола, 50 шМ KCl, 0.1 М ЭДТА, I шМ ЭГТА, 1 гпМ MgC12, 0,1 шМ меркаптоэтанола). Фиксировали клетки 1%-ным глутаральдегидом на PBS в течение 10 мин, промывали в PBS и обрабатывали свежеприготовленным 0.2%-ным раствором боргидрида натрия на PBS дважды по 10 мин. Затем промывали PBS, обрабатывали мышиными антителами против тубулина ("Sigma") и далее антимышиными антителами, коньюгированными с Texas red. Для выявления центров нуклеации микротрубочек мы подвергали клетки воздействию холода ( 20 мин при 0°С ), вызывающего деполимеризацию микротрубочек. После воздействия холода камера с клетками помещалась в термостат (37 °С) на 5 мин. Затем клетки фиксировали и окрашивали антителами к тубулину, как описано выше.

Рисунок 1. Районы клеток, которые подвергались облучению. 1 - полюс митотического веретена; 2 - участок цитоплазмы на расстоянии полуверетена от хромосом и в стороне от полюса веретена.

Наличие синтеза ДНК в клетках определяли по включению 5-бромодезоксиуридина (BrdU), выявляемого впоследствии моноклональными антителами. BrdU вводили в среду культивирования через 6-8 часов после облучения центросомы в концентрации 2 мкг/мл. Затем клетки продолжали инкубировать в камере до 24 часов. По окончании инкубации клетки фиксировали спирт-уксусной кислотой (3:1) и споласкивали 70° спиртом. Затем проводили гидролиз в 4N HCI (10 мин при комнатной температуре), препарат промывали в PBS и обрабатывали антителами против BrdU ("Serva"), а затем вторичными FITS-конъюгированными антителами ("Sigma").

Препараты заключали в глицерин, содержащий 2.5% DABCO. Флуоресценцию Texas red и FITS наблюдали при длинах волн более 540 нм и 250 нм соответственно на фотомикроскопе "Opton-3" ("Opton", ФРГ) и фотографировали на пленку РФ-3 ("Тасма"). Параллельно в фазовом контрасте фотографировали эти же клетки на пленку Микрат-300 ("Тасма").

Регистрация синтеза РНК Уровень синтеза РНК в клетках определяли методом радиоавтографии. Клетки в конце наблюдения помещали в среду, содержащую 3Н-уридин (уд. активность - 400 кБк/мл) и фиксировали через различное время смесью этанола и уксусной кислоты в объемном соотношении 3:1. Затем клетки споласкивали 70°-ным этанолом, высушивали, обрабатывали 10 мин 5%-ной трихлоруксусной кислотой, промывали и покрывали эмульсией типа "М" (НИИХИМФОТОПРОЕКТ). Экспозиция составляла 7 дней. Автограф проявляли, после чего препарат докрашивали гематоксилином Караччи.

Оценка степени распластывания Измерение площади клеток в процессе распластывания проводили с помощью видеомикроскопии. Фазовоконтрастное изображение клетки выводилось на горизонтальный экран монитора, где конечное увеличение составляло 6000. Собранные на нескольких оптических срезах контуры клеток зарисовывались на прозрачной пленке, после чего переносились на белую бумагу. Изображения клеток вводили в компьютер с помощью телекамеры высокого разрешения (500 линий) и аналого-цифрового преобразователя (формат кадра 512x480 пикселов). Измерения площадей проводили при помощи оригинальной компьютерной программы, написанной М.С. Вотчалом.

Регистрация сальтаторных движений гранул Для визуализации сальтаторных движений гранул в цитоплазме клеток изображение клеток в фазовом контрасте записывалось в реальном времени на цейтраферный видеомагнитофон (Panasonic AG-6730) при помощи видеокамеры через объектив "Plan-Neofluar" 40/0.9 ("Opton", ФРГ, глицериновая иммерсия). Каждая видеозапись длилась 5 мин. Видеозаписи просматривались на горизонтальном экране монитора, где конечное увеличение составляло 6000. В каждом видеофрагменте мы прорисовывали треки сальтаторных движений гранул на экране монитора. На полученных прорисовках измеряли общее число треков и их длину. Кроме того, подсчитывали общее число гранул в каждой клетке и вычисляли приведенное число треков на сто гранул в клетке.

Электронная микроскопия Клетки промывали в фосфатном солевом буфере (рН 7.2-7.4) при 37° С, затем фиксировали в 2.5%-ном глутаровом альдегиде на фосфатном солевом буфере, дофиксировали 1%-ным OsO-i, контрастировали уранилацетатом, обезвоживали в спиртах и заключали в Эпон-812 ("Serva", Германия) по стандартной методике. Ультратонкие срезы изготавливали на микротоме LKB-3 ("LKB", Швеция), монтировали на бленды, покрытые формваровой пленкой, окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу, просматривали и фотографировали на электоронных микроскопах HU-11, HU-12 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Один из полюсов веретена деления клеток культуры ткани СПЭВ был подвергнут ультрафиолетовому микрооблучению в течение 15 с в ранней анафазе. После облучения хромосомы полуверетена, содержащего облученную центросому, в большинстве случаев не двигались по направлению к полюсу, оставаясь на месте. В отдельных клетках они в первые 1-2 мин

проходили небольшое расстояние в сторону полюса, а затем останавливались. Хромосомы полуверетена, содержащего необлученную центросому, продолжали свое движение к полюсу вплоть до начала формирования перетяжки между клетками. С началом формирования перетяжки начиналась деконденсация хромосом обоих полуверетен. В отдельных случаях хромосомы полуверетена, содержащего облученную центросому начинали деконденсироваться на 3 - 5 мин позже, чем хромосомы полуверетена, содержащего необлученную центросому.

В телофазе не наблюдалось особых отличий движения хромосом в сестринских клетках. Во время образования перетяжки между дочерними клетками группы хромосом передвигались к центрам образующихся клеток. Это движение могло быть быстрым, скачкообразным, в одной клетке и медленным, плавным, в другой, но характер движения не зависел от того, содержит ли клетка облученную центросому. Формирование перетяжки происходило всегда точно посередине между двумя группами хромосом. В результате цитокинеза клетки, содержащие облученную центросому, в большинстве случаев оказывались крупнее сестринских после первичного распластывания в раннем О периоде.

Особенности нуклеологенеза в клетках, содержащих облученную центросому.

Параллельно с цитотомией начиналась деконденсация хроматина, а затем формирование ядер сестринских клеток. Через 40-60 мин. после облучения в ядрах клеток, содержащих облученную центросому, и в ядрах сестринских клеток формировалось множество мелких плотных телец, называемых проядрышками, среди которых нельзя было выделить на световом уровне истинные ядрышки. Распределение белка В23 в клетках, содержащих облученную центросому, и в сестринских к ним клетках не отличалось от распределения этого белка в интактных клетках в ранней С|-фазе. Белок В23 был диффузно распределен в цитоплазме, а также располагался в цитоплазме в виде крупных и мелких скоплений; в ядрах клеток белок полностью отсутствовал.

Через 2 - 4 ч после облучения в ядрах сестринских клеток, содержащих необлученную центросому, число проядрышек уменьшалось до одного-двух и формировались истинные ядрышки, имевшие на ультраструктурном уровне выраженную нуклеолонемную структуру. В ядрах клеток, получивших облученную центросому, ядрышки с нормальной структурой не формировались. Среди множества плотных телец в ядрах таких клеток выделялось несколько более крупных, которые выглядели более плотными, чем ядрышки, типичные для данной культуры. На этих сроках после облучения распределение белка В23 в клетках сестринских к облученным не отличалось от распределения этого белка в интактных клетках: наблюдалось яркое иммуноцитохимическое окрашивание ядрышек, в то время как в кариоплазме и в цитоплазме окрашивание отсутствовало. В ядрах клеток, содержащих облученную центросому, ядрышки были окрашены значительно слабее, чем в сестринских клетках; кроме того, наблюдалось довольно интенсивное окрашивание кариоплазмы. Включение 3Н-уридина в ядра клеток, содержащих облученную центросому, было значительно ниже, чем в ядра сестринских клеток.

Через 4 - 8 ч после облучения проядрышки в ядрах сестринских кеток, содержащих необлученную центросому, полностью исчезали, сформированные ядрышки заметно увеличивались в размерах, на ультраструктурном уровне в них выявлялись многочисленные гранулы и мелкие фибриллярные центры, окруженные непрерывным слоем плотного фибриллярного компонента. Ядрышки в клетках, содержащих облученную центросому, были практически полностью лишены гранул, содержали один крупный фибриллярный центр, смещенный на периферию, и гипертрофированный плотный фибриллярный компонент. На световом уровне они выглядели гораздо плотнее, чем нормальные ядрышки. Локализация белка В23 в сестринских клетках, содержащих необлученную центросому, оставалась неизменной. В клетках, содержащих облученную центросому, сохранялось слабое окрашивание кариоплазмы, а ядрышки преимущественно окрашивались по периферии. Включение 3Н-уридина в ядра клеток, содержащих облученную центросому, было значительно ниже, чем в

ядра сестринских клеток. В интактных клетках на одно ядро в среднем приходилось 134+20 зерен серебра, в клетках, содержащих облученную центросому, - 48+8 зерен, в их сестринских клетках, содержащих необлученную центросому, - 98+20 зерен. Таким образом, облучение центросомы в митозе приводило к снижению синтеза РНК в клетках, получивших облученную центросому, более чем на 50% (р<0.05).

В течение всего времени наблюдения (до 24 ч) в ядрах клеток, содержащих облученную центросому, сохранялись аномальные ядрышки и несколько проядрышек.

Можно предположить, что одной из возможных причин формирования аномальных ядрышек в ядрах клеток, получивших облученную центросому, является отсутствие радиальной сети микротрубочек и связанное с этим повреждение системы внутриклеточного транспорта (Узбеков, Воробьев, 1991). Для проверки этого предположения мы провели прижизненные наблюдения клеток СПЭВ, которые в конце телофазы были помещены в среду, содержащую нокодазол в концентрации 1 мкг/мл, запрещающей рост микротрубочек в цитоплазме клеток СПЭВ. В этих условиях формирование ядрышек проходило так же как в интактных клетках данной культуры: размер ядрышек увеличивался, проядрышки в кариоплазме клеток исчезали через 2 -4 часа после митоза. Следовательно, мы можем заключить, что нарушения нуклеологенеза в клетках, содержащих облученную центросому, не связаны с отсутствием нормальной системы микротрубочек.

Общая морфология ядер клеток, содержащих облученную центросому, указывает на то, что в них происходят процессы, аналогичные тем, которые вызываются действием актиномицина О или инъекцией антител к РНК-полимеразе-1, а именно: сегрегация ядрышковых компонентов, резкое обеднение гранулами и белком В23, аномально длительное присутствие проядрышек, подавление синтеза РНК (БсЬеег, ВепауегЦе, 1990). Поскольку облучение района цитоплазмы, удаленного от хромосом на то же расстояние, что и полюса митотического веретена, не приводило к изменениям в ходе нуклеологенеза, можно предположить, что в центросоме в митозе располагается фактор или факторы, которые влияют на сборку ядрышек.

Одной из причин аномального нуклеологенеза может быть повреждение облучением центросомного пула белка В23, который каким-то образом оказывается вовлеченным в восстановление ядрышек в митозе.

Сеть МТ в клетках, содержащих облученную центросому.

Для того, чтобы выяснить, присутствует ли в исследованных клетках единый центр организации микротрубочек, формирующий радиальную сеть микротрубочек, мы подвергали клетки воздействию холода, а затем, после перенесения клеток в нормальную температуру, наблюдали начало восстановления сети микротрубочек в клетках, окрашивая клетки антителами к тубулину.

Через 3-5 ч после облучения в клетках, содержащих облученную центросому, микротрубочки возникали разрозненно, в то время как в их сестринских клетках, содержащих необлученную центросому, микротрубочки росли от единого центра. Через 6-7 ч после облучения выявлялся центр организации микротрубочек в клетках, содержащих облученную центросому, так же как и в их сестринских клетках.

Отсутствие единого центра организации микротрубочек в клетках, содержащих облученную центросому, свидетельствует о том, что после перехода таких клеток в интерфазу, центросома в них остается инактивированной. Выявляемый через 6-7 ч центр организации микротрубочек может либо иметь центросомное происхождение, либо возникать независимо от центросомы. Так как мы показали, что аномалии, возникающие в клетках, содержащих облученную центросому, не только не исчезают к 7-8 ч после облучения, но усиливаются с течением времени, можно предположить, что возникающий центр организации микротрубочек не несет всех функций центросомы и, вероятно, возникает независимо от нее. Возможно, что в клетках, лишенных центросомы, происходит самоорганизация системы микротрубочек подобно тому, что было описано в регенерирующих кариопластах (Магмой, ЗсЫма, 1991) и во фрагментах меланофоров (ЯосНопоу, Вошу, 1997).

Способность к распластыванию клеток, содержащих облученную центросому.

После выхода из митоза распластывание клеток, содержащих облученную центросому, и их сестринских клеток шло синхронно, но завершалось на 20-30 мин позже, чем в норме. После первичного распластывания площадь клеток, содержащих облученную центросому, обычно оказывалась больше площади сестринских клеток, что происходило из-за неравномерности цитотомии. Позже сестринские клетки постепенно увеличивали площадь, а клетки, содержащие облученную центросому, прекращали распластывание и иногда несколько поджимались. Известно, что рост клеток в культуре происходит непрерывно и линейно (Dunn, Zicha, 1995), поэтому для выявления общей тенденции в динамике площадей различных пар клеток мы воспользовались методом регрессионного анализа. Путем регрессионного анализа зависимости площади клеток от времени, прошедшего после облучения центросомы (анализировали 29 пар клеток), было установлено, что площадь дочерних клеток, содержащих необлученную центросому, за 7 ч увеличивается в среднем на 40% (рис. 2). При сохранении такой скорости роста клетки удвоят свою площадь через 20 ч - время, не превышающее длительность клеточного цикла СПЭВ. Следовательно, сестринские клетки, содержащие необлученную центросому, растут нормально. В то же время площадь клеток, содержащих облученную центросому, не только не растет, но даже несколько уменьшается (рис. 2).

При инкубации клеток СПЭВ, начиная с ранней G1 фазы, в среде с нокодазолом в концентрации 1 мкг/мл, запрещающей рост микротрубочек, площадь клеток в среднем оставалась постоянной (рис. 3).

Таким образом, клетки, содержащие облученную центросому, несмотря на наличие сети микротрубочек, не способны увеличивать свою площадь так же как и клетки, не имеющие микротрубочек. Это говорит о том, что для поддержания формы клетки необходима организованная сеть микротрубочек с центром в центросоме. Клетки, содержащие облученную центросому, имеют тенденцию к уменьшению площади в отличие от постоянной в среднем площади клеток, инкубированных в среде с нокодазолом. Это различие можно объяснить тем, что клетки, содержащие облученную центросому, не

г

х 2

т ь:

ь? о н ш

л га

3 о с; с:

3000 2500 2000 1500 1000 500

.. 0 ........1............1......................[......................

0

1 1 <? ! .............!.................1..................о............._.....;........_...........

? ^ 1 ? ? : 0 « о Л О 8 „ а ? .......0..............8.................0..................

........ 1..............§......... 1.........1................*..............8..........

.............:.....: Г' я 1......о- г ^

8 8 I § § 8 8 8 ? 8 О 0 О

А

1 2 3 4 5 6 7 8 Время, прошедшее с момента облучения, ч

2500

1 2 3 4 5 6 7 8 Время, прошедшее с момента облучения, ч

1сунок 2. Динамика распластывания клеток культуры СПЭВ после мито-, в анафазе которого была облучена центросома; А - клетки с облученной итросомой, Б - их сестринские клетки с необлучепиой центросомой. По и абсцисс - время, прошедшее после облучения, ч; по осп ординат - площадь еток, мкм. Точки - площади отдельных клеток; сплошная линии - график нейлон регрессии, пунктирная линия - 95%-ныи доверительный интервал.

I 800

ш

I 600

0 i-

<D

§ 400 л Ц. га

1 200

с; С

0

012345678 Время, прошедшее с момента начала анафазы, ч

Рисунок 3. Динамика распластывания клеток, инкубированных в среде с нокодазолом (1 мкг/мл), начиная с ранней О фазы. Точки - площади отдельных клеток; сплошная линия - график линейной регрессии, штриховые линии - 95%-ный доверительный интервал.

способны сопротивляться давлению соседних клеток, которые имеют нормальную систему микротрубочек с интактной центросомой, а клетки, инкубированные в среде с нокодазолом, не имеют системы микротрубочек так же как и соседние с ними клетки.

Салътаторпые движения гранул в клетках, содержащих облученную центросому.

Мы наблюдали за гранулами, видимыми в световой микроскоп, в клетках, содержащих облученную центросому, и в сестринских к ним клетках. Размер гранул составлял 0.3 - I мкм. Наблюдения показали, что приведенное

Рисунок 4. Соотношение числа сальтаторных движений гранул в клетках, содержащих облученную центросому и в их сестринских клетках в зависимости от времени, прошедшего с момента облучения. По оси X - время, прошедшее с момента облучения, ч; по оси Ъ - среднее число сальтаторных движений гранул в клетках, содержащих облученную центросому, деленное на среднее число сальтаторных движений гранул в их сестринских клетках.

число треков сальтаторных движений гранул в клетках, содержащих облученную центросому, и в сестринских к ним клетках зависит от времени, прошедшего после облучения центросомы. Оотношение числа треков в клетках, содержащих облученную центросому, к числу треков в их сестринских клетках со временем увеличивается. Число треков в клетках, содержащих облученную центросому, через б ч после облучения в среднем вдвое превышает число треков в их сестринских клетках (рис. 4).

Разные пары клеток сильно отличаются по числу треков сальтаторных движений гранул. Поэтому, чтобы представить себе более точно динамику изменений сальтаторных движений гранул мы проследили за отдельно взятой парой сестринских клеток, образовавшихся в результате деления материнской

I 10

1 2 3 4.3 6.6 клетка

Время, прошедшее с момента облучения, ч

Рисунок 5. Изменение средней длины треков сальтаторных движений гранул в отдельно взятой паре клеток. По оси абсцисс - время, прошедшее с момента облучения; по оси ординат - средняя длина треков в клетке, содержащей облученную центросому (левые столбцы), и в сестринской к ней клетке (правые столбцы). Штрихи указывают стандартное отклонение.

клетки, один из полюсов веретена которой был подвергнут ультрафиолетовому микрооблучению в анафазе. Существенные отличия между клетками появлялись через 4 ч после облучения. К этому сроку приведенное число треков в клетке, содержащей облученную центросому, более чем вдвое превышало приведенное число треков в сестринской клетке. Средняя длина треков в сестринской клетке, содержащей необлученную центросому, с течением времени увеличивалась, а в клетке, содержащей облученную центросому, оставалась на прежнем уровне (рис. 5).

Если в первые часы после облучения практически незаметны различия в сальтаторных движениях гранул между клетками, содержащими облученную центросому, и их сестринскими клетками, то через 6 - 7 ч после облучения

наблюдаются существенные различия как в числе треков сальтаторных движений гранул, так и в средней длине этих треков. Сопоставляя эти результаты с возникновением в клетках, содержащих облученную центросому, единого центра нуклеации микротрубочек через 6 - 7 ч после облучения, можно заключить, что возникающая в них радиальная система микротрубочек не способна обеспечивать нормальное движение гранул по микротрубочкам. Полученные результаты говорят в пользу того, что центросома в интерфазной клетке контролирует сальтаторные движения гранул. Контроль со стороны центросомы может выражаться в увеличении времени жизни микротрубочек, что может удлиннять пробег гранулы по микротрубочке.

Вступление в Б-фазу

Учитывая все отмеченные аномалии, характерные для клеток, содержащих облученную центросому, интересно было выяснить, способны ли эти клетки продвигаться по клеточному циклу и, в первую очередь, вступают ли они в Б-период. При изучении способности клеток, содержащих облученную центросому, к репликации ДНК мы исследовали включение клетками ВгОи через 17-24 ч после деления, при этом максимальное время наблюдения (24 ч после деления) примерно вдвое превышало расчетную длительность С1-периода.

Ни одна из клеток, получивших в результате деления облученную центросому, не включила ВгОи за это время, тогда как их сестринские клетки включали ВгОи, и спустя 24 ч после деления метка обнаруживалась в большинстве сестринских клеток с необлученной центросомой (см. таблицу). Все клетки, получившие облученный в анафазе участок цитоплазмы, спустя 24ч после облучения также включили ВгБи (см. таблицу), т.е. вступили в период.

Наблюдаемая остановка клеток, содержащих облученную центросому, в С1 периоде может являться прямым следствием облучения - результатом фотоповреждения протеинкиназы р34, локализованной в полюсах веретена в момент облучения (ВаШу ег а1., 1992). Остановка в О! периоде может

Таблица. Включение ВЮи в клетки, содержащие облученную центросому, и в их сестринские клетки.

Общее число исследованных клеток Время, прошедшее от облучения до фиксации клеток

менее 17ч 17-21 ч 21-24 ч

Клетки с облученной центросомой 29 число клеток, включивших ВгОи 0 0 0

число клеток, не включивших ВгОи 10 10 9

Их сестринские клетки с необлученной центросомой 32 число клеток, включивших ВгОи 0 4 9

число клеток, не включивших ВгОи 10 7 2

Клетки с облученной цитоплазмой 9 число клеток, включивших ВгОи 6 2

число клеток, не включивших ВгОи _ 1 0

Их сестринские клетки с необлученной цитоплазмой 9 число клеток, включивших ВгОи 5 3

число клеток, не включивших ВгОи 2 0

возникать в результате неспособности клеток увеличивать свою площадь, что в свою очередь блокирует синтез ДНК (А$5оу1ап, 1997).

Подводя итог всему сказанному, можно заключить, что облучение центросомы в анафазе вызывает не только мгновенный морфологический эффект, но и отдаленные по времени изменения в тех дочерних клетках, которые получают облученную центросому. Морфологические изменения, возникающие в ходе митоза в результате инактивации одной из центросом, не являются катастрофическими и не препятствуют выходу клетки из митоза. При переходе клеток в интерфазу облученная центросома остается инактивированной. Отсутствие выраженных различий между сестринскими клетками с облученной и необлученной центросомами в начальный срок после выхода из митоза можно рассматривать как подтверждение предположения о том, что программа поведения клеток в этот период определяется процессами, начавшимися до анафазы митоза материнской клетки.

Полученные данные показывают, что УФ-микрооблучение центросомы в анафазе вызывает специфические и, по-видимому, необратимые повреждения дочерней клетки, получившей облученную центросому. Эти повреждения проявляются спустя определенное время после вступления дочерней клетки в интерфазу и усиливаются с течением времени, прошедшего после облучения. Широкий спектр и постоянство аномалий, зафиксированных нами в клетках, получивших облученную центросому, позволяют говорить о тесной связи центросомы с другими структурами клетки. Мы можем заключить, что центросома является не только центром и регулятором процессов, непосредственно связанных с микротрубочками, таких как сальтаторные движения гранул и поддержание распластанной формы клеток на субстрате. Инактивация центросомы блокирует важнейшие события интерфазы: клетки, содержащие инактивированную центросому, формируют аномальные неактивные ядрышки, такие клетки не вступают в Б период и не способны продвигаться далее по клеточному циклу.

выводы

1. Клетки, содержащие облученную центросому, нормально распластываются при переходе в интерфазу, но, в отличие от сестринских и интактных клеток, не увеличивают свою площадь после начального распластывания в раннем С1 периоде.

2. Клетки, содержащие облученную центросому, не формируют в раннем О! периоде радиальную сеть микротрубчек. Центр нуклеации микротрубочек формируется в клетках, содержащих облученную центросому, через 6 - 7 ч после облучения.

3. Клетки, содержащие облученную центросому, не способны формировать нормальные ядрышки. Синтез РНК в них снижен вдвое по сравнению с сестринскими клетками, они характеризуются аномальным распределением ядрышкового белка В23. Проядрышки в таких клетках сохраняются в течение всего времени их жизни.

4. Число треков сальтаторных движений гранул в цитоплазме клеток, содержащих облученную центросому, через 5-7 ч после анафазы значительно превышает число треков в сестринских клетках. Средняя длина треков в клетках, содержащих облученную центросому, короче, чем в сестринских клетках.

5. Клетки, перешедшие в интерфазу с облученной центросомой, не способны вступать в 5 период. Их сестринские клетки и клетки, облученные в такой же дозе в цитоплазму, вступают в Б период.

6. Различия в цитофизиологических параметрах между клетками, содержащими облученную центросому, и их сестринскими клетками усиливаются с течением времени, прошедшего после завершения митоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Uzbekov R.E., A.L. Neverova and I.A. Vorobjev. Ultrastructure and functional activity of the centrosome after UV microirradiation. Cell Biol. Intern., 1994, V.18, N5, p.422.

2. Uzbekov R.E., S.R. Speranskaya, A.L. Neverova and I.A. Vorobjev. Effects of UV microirradiation of the centrosome on cell behaviour. 9th Annual Meeting of the European Cytoskeleton Forum. Dundee, 7-12 September 1994. p. 11.

3. Неверова А.Л., Узбеков Р.Э., Вотчал M.C., Воробьев И.А. Влияние УФ-микрооблучения центросомы на поведение клеток. IV. Синтетическая активность, распластывание и рост клеток с инактивированной центросомой. Цитология. 1996. Т. 38. N 2. с. 145-154.

4. Neverova A.L., R.E.Uzbekov, and I.A.Vorobjev. UV-microirradiation of the centrosome: distant cell events. International Meeting on UV/Blue Light: Reception and responses in plants and microorganisms. August 25-31, 1996, Philipps University, Marburg, Germany, p.96.

5. Neverova A.L., R.E.Uzbekov, and I.A.Vorobjev. Centrosome photoinactivation results in changes of spreading and granules saltatory movements. -Abstr. of 7th Congress of the European Society for Photobiology. Stresa, Italy, 1997, p. 115.

6. Uzbekov R.E., A.L. Neverova, M.S. Votchal, and I.A. Vorobjev. Postmitotical reconstuction of nucleoli in culture cells with photoinactivated centrosome. Abstr. of 7th Congress of the European Society for Photobiology. Stresa, Italy, 1997, p.l 18.

7. Неверова А.Л., Узбеков Р.Э., Вотчал M.C., Зацепина О.В., Воробьев

И.А. Постмитотическая реконструкция ядрышек в клетках с центросомой,

фотоинактивированной УФ микрооблучением. Биологические мембраны, 1998,

Т. 15, N 6. с. 639-647._

Гарнитура Times. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л 1,0 Усл. печ. л 1,5. Тираж ЮОэкз.

"Биоинформсервис", 117984, Москва, ул. Вавилова 32. Отпечатано с готового оригинал-макета.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Неверова, Анна Леонидовна, Москва

московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

НЕВЕРОВА Анна Леонидовна

УДК 576.353:576.311

ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО МИКРООБЛУЧЕНИЯ ЦЕНТРОСОМЫ В

КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

Специальность 03.00.11 эмбриология, гистология, цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук И.А. ВОРОБЬЕВ

Москва, 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение 4

2. Обзор литературы 6

2.1 Центросома в интерфазе. 6

2.2 Центросома включает в себя сайты нуклеации микротрубочек. 7

2.3 Система микротрубочек в интерфазной клетке: различные взгляды 10

2.4 Роль центросомы и системы микротрубочек в поддержании формы клеток. 15

2.5 Роль центросомы и системы микротрубочек во внутриклеточном транспорте. 16

2.6 Центросома в митозе. 18

2.7 Переход клетки из митоза в интерфазу. 24

2.8 Дальнейшее продвижение по клеточному циклу и переход в 8 период. 25

2.9 Использование метода микрооблучения для изучения свойств центросомы. 27

3. Материалы и методы 34

3.1 Культивирование клеток и прижизненные наблюдения 34

3.2 Микрооблучение 34

3.3 Иммунофлуоресцентные исследования 37

3.3.1 Визуализация белка В23 37

3.3.2 Визуализация системы микротрубочек 37

3.3.3 Регистрация синтеза ДНК 40

3.4 Регистрация синтеза РНК 40

3.5 Оценка степени распластывания 41

3.6 Регистрация сальтаторных движений гранул 41

4. Результаты 42

4.1 Ближайшие эффекты УФ микрооблучения центросомы. 42

4.2 Особенности нуклеологенеза в клетках, содержащих облученную центросому. 45

4.2.1 Формирование ядрышек в клетках, содержащих облученную центросому. 45

4.2.2 Уровень синтеза РНК в клетках, содержащих облученную центросому. 51

4.2.3 Распределение ядрышкового белка В23 в клетках, содержащих

облученную центросому. 53

4.3 Сеть МТ в клетках, содержащих облученную центросому. 55

4.4 Способность к распластыванию клеток с облученной центросомой 55

4.5 Сальтаторные движения гранул в клетках с облученной центросомой 61

4.6 Продвижение клеток, содержащих облученную центросому,

по клеточному циклу. 73

5. Обсуждение 79

5.1 Фотоинактивация центросомы препятствует формированию нормальных функционирующих ядрышек. 79

5.2 Фотоинактивация центросомы задерживает формирование радиальной сети микротрубочек после выхода из митоза. 82

5.3 Фотоинактивация центросомы приводит к изменению характера сальтаторных движений в клетке. 84

5.4 Фотоинактивация центросомы препятствует увеличению площади клеток после начального распластывания в ранней G1 фазе. 86 5.6 Фотоинактивация центросомы блокирует вступление клетки в S-фазу. 87

6. Выводы 91

7. Список литературы 92

8. Благодарности 112

1. ВВЕДЕНИЕ

Цитоплазма клетки пронизана сетью филаментов - белковых нитей различной толщины: актиновых микрофиламентов, промежуточных филаментов и микротрубочек. Все они в совокупности составляют цитоскелет клетки. Центром организации микротрубочек в клетке является центросома - особая структура, обычно расположенная вблизи ядра в геометрическом центре клетки. Центросома присутствует практически во всех животных клетках. Морфологически центросома включает в себя две центриоли и перицентриолярное пространство.

Наверное, не найдется другой такой клеточной структуры, о роли которой существовали бы столь противоречивые мнения, как о роли центросомы в животной клетке: от предоставления ей более чем скромного места пассивного "пассажира" в клеточных процессах до представлений о центросоме как о структуре, координирующей и программирующей внутриклеточные процессы на всех этапах клеточного цикла.

В последние годы центросома активно изучается в биохимическом плане. В составе центросомы сейчас описывают все новые и новые белки с различными свойствами, находящиеся там постоянно или в какой-либо промежуток клеточного цикла. Этот подход многое может прояснить в функциях центросомы. В то же время он подобен сложной мозаике - целостный взгляд может быть сформирован только при наличии большого числа мелких фрагментов. Но для собирания этой подробной картины нужно иметь некий предварительный план, общее понятие о функциях всей структуры в целом, возможность выделить основные направления, по которым можно двигаться в поисках отдельных фрагментов.

В формировании такого общего понятия о функциях центросомы очень важными являются прижизненные эксперименты. Основной прием таких

экспериментов - своего рода выключение центросомы, частично или полностью, из внутриклеточных событий и наблюдение реакции клетки на такое выключение. Примером подобных экспериментов могут служить инъекции антител к центросомным белкам, микрохирургическое удаление центросомы, фотоинактивация центросомы. В нашей работе мы использовали метод фотоинактивации центросомы ультрафиолетовым микрооблучением. Целью настоящей работы явился поиск связи центросомы с клеточным циклом, выяснение роли центросомы в процессах, происходящих в интерфазной клетке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Центросома в интерфазе.

Центросома - это клеточная органелла, которая давно привлекает внимание ученых. Центросома, или клеточный центр, в животных клетках включает в себя две центриоли, материнскую и дочернюю, и околоцентриолярное пространство. Многочисленными исследованиями показано, что у многоклеточных животных центросома является основным центром организации микротрубочек во время деления и в интерфазе (Brinkley et al., 1975; Osborn and Weber, 1976; Sharp et al., 1981). В интерфазных клетках центриоли иногда образуют первичную ресничку, вблизи них обнаруживаются исчерченные корешки и свободные фокусы схождения микротрубочек (обзор Brinkley, 1980; Peterson and Berns, 1980; Воробьев, Надеждина, 1987). Детальное исследование ультраструктуры клеточного центра показало, что микротрубочки прикрепляются не непосредственно к центриолярным цилиндрам, а к специальным структурам - головкам перицентриолярных сателлитов или к свободным фокусам в интерфазе, либо к митотическому гало в митозе (Peterson and Berns, 1980; Воробьев, Надеждина, 1987). Кроме прикрепленных микротрубочек в районе центросомы наблюдаются также микротрубочки, обращенные к центросоме свободными концами (Alieva et al., 1992).

Центросома не случайно названа центральной загадкой клеточной биологии (Wheatley, 1982). Показано, что положение центросомы и ее перемещение во многих клетках закономерно и зависит от типа клетки, направления ее движения или движения потока окружающей клетку среды (Euteneuer, Schliwa, 1982; Rogers et al., 1985; обзор Vorobjev, Nadezhdina, 1987). Центросома и система микротрубочек составляют основу цитоскелета и, видимо, играют ключевую роль в определении формы клеток (обзоры Kellog et al., 1994; Raff, 1996). Центрросома может

определять направление движения клеток по субстрату (Koonce et al., 1984) Существуют экспериментально обоснованные предположения о возможной роли центросомы как регулятора внутриклеточного транспорта (Freed, Lebowitz, 1970; Wiemer et al., 1997; Грирорьев и др., 1997).

В то же время известны различные примеры бесцентросомных делений в животных клетках (Dietz, 1966; Brenner et al., 1977; Debec et al., 1982; Steffen et al., 1986; Schatten et al., 1986). Более того, существует линия бесцетриолярных клеток (Szollosi et al., 1987). Существуют данные о том, что сборка микротрубочек в интерфазной клетке или клеточном фрагменте может происходить в отсутствие центросомы (Karsenti et al., 1984; McNiven, Porter, 1988; Maniotis, Schliwa, 1991), a также в присутствии центросомы, но вне связи с ней (Vorobjev et al., 1997).

2.2 Центросома включает в себя сайты нуклеации микротрубочек.

На центросоме происходит сборка микротрубочек de novo из тубулина -гетеродимера а-тубулина и ß-тубулина. Все гетеродимеры в микротрубочке имеют одинаковую ориентацию, в результате чего микротрубочка оказывается полярной структурой с плюс- и минус- концами, названными так по разнице скоростей присоединения тубулина (Bergen, Borisy, 1989). Микротрубочки способны к самосборке in vitro в отсутствие центров организации микротрубочек, если концентрация тубулина превышает критическую; в то же время, в присутствии центров организации микротрубочек нуклеация начинается при значительно меньшей концентрации тубулина (Mitchison, Kirschner, 1984а).

В последние годы изучение процесса нуклеации микротрубочек от центросомы явилось очень популярной темой в клеточной биологии (обзор Raff, 1996). Предположение о существовании специальных затравок для формирования микротрубочек на центросоме подтвердилось результатами исследований

ультраструктуры микротрубочек, полимеризованных in vitro (Evans et al., 1985). При полимеризации микротрубочек в присутствии центров организации микротрубочек формируются микротрубочки, состоящие из 13 протофиламентов. Именно такие микротрубочки присутствуют с живых клетках. Полимеризация чистого тубулина приводит к формированию микротрубочек, состоящих из 12-16 протофиламентов (Amos, 1982; Evans et al., 1985). Таким образом, затравки для формирования микротрубочек на центрах нуклеации определяют число протофиламентов в микротрубочке.

В 1989 г был открыт белок g-тубулин, имеющий гомологию как с а-тубулином, так и с ß-тубулином (Oakley, Oakley, 1989). Было показано, что g-тубулин сконцентрирован в центрах организации микротрубочек и присутствует во всех эукариотах (Oakley et al., 1990; Stearns et al., 1991; Zheng et al., 1991). Было высказано предположение,. В предложенной модели Oakley что кольцо у-тубулина служит шаблоном для роста микротрубочек, число молекул у-тубулина определяет число протофиламентов микротрубочек, а способность у-тубулина связываться только с а-тубулином (или только с b-тубулином) определяет полярность микротрубочек (Oakley et al., 1990; Oakley, 1992). Многочисленными исследованиями было показано, что у-тубулин действительно играет принципиальную роль во взаимодействии центров организации микртрубочек с микротрубочками (Horio et al., 1991; Joshi et al., 1992; Raffet al., 1993; Stearns, Kirschner, 1994; Felix et al., 1994; Li, Joshi, 1995; Sunkei et al., 1995)

На ооцитах Xenopus было показано, что цитоплазматический g-тубулин входит в состав высокомолекулярного комплекса (Stearns, Kirschner, 1994). Изолированные и очищенные, такие комплексы способны связываться с минус-концом готовой микротрубочки, а также резко понижать концентрацию, необходимую для полимеризации чистого тубулина in vitro (Zheng et al., 1995). Ha

электронном уровне комплексы у-тубулина выглядят как спиральные открытые кольца того же диаметра, что и микротрубочки. Поэтому они получили название кольцевых комплексов у-тубулина. Каждый такой комплекс содержит помимо у-тубулина еще не менее семи компонентов, два из которых - а-тубулин и ß-тубулин (Zheng et al., 1995). Таким образом, модель Oakley была модифицирована: в состав затравок входят нетубулиновые компоненты, формирующие спиральный каркас, на котором располагаются 13 молекул у-тубулина. Предполагалось, что в состав комплекса входит также тубулиновый димер, связанный с торцем каркаса, причем одна из молекул димера связана с крайней молекулой у-тубулина (Zheng et al., 1995; Mandelkow et al., 1995; Arnos, 1995).

Кольцевые комплексы g-тубулина найдены также в клетках Drosophila и Spisula (Moritz et al., 1995a; Vogel et al.,1997). Связь центросомы с кольцевыми комплексами g-тубулина прямо показана на очищенных центросомах, выделенных из ранних эмбрионов Drosophila. Методом трехмерной реконструкции было показано, что кольцевые комплексы у-тубулина присутствуют в толще перицентриолярного материала (Moritz et al., 1995a,b).

В настоящее время активно изучаются белки, непосредственно связанные с у-тубулином. На разных объектах выделены ряды высоко гомологичных белков, связанных с у-тубулином (Geissler et al., 1996; Moudjou et al., 1996; Tassin et al., 1998; Murphy et al., 1998). Так, гомологи белка spc98p - одного из компонентов полярного тельца дрожжей, тесно связанного с g-тубулином и прининающего участие в нуклеации микротрубочек - найдены в клетках высших растений, насекомых, рыб, земноводных, млекопитающих (Murphy et al., 1998). Степень гомологии этих белков в клетках различных организмов очень высока, что говорит о высокой консервативности компонентов g-тубулинового комплекса. Это позволяет

предположить существование сходного молекулярного механизма нуклеации микротрубочек в клетках различных организмов (Murphy et al., 1998).

Последние исследования показывают, что в перицентриолярном материале присутствуют большие белковые комплексы, обладающие способностью нуклеировать микротрубочки (Dictenberg et al., 1998). Описанный кольцевой комплекс g-тубулина является составной частью такого белкового комплекса (Stearns, Kirschner, 1994; Zheng et al., 1995). Другая его субъедиинца -перицентриновый комплекс, который, вероятно, формирует фибриллярную сеть, связывающую отдельные комплексы между собой. (Dictenberg et al., 1998). Показано, что не все комплексы одновременно нуклеируют микротрубочки, некоторые комплексы являются неактивными (Dictenberg et al., 1998). Возможно, именно они и являются неактивными сайтами нуклеации, которые начинают функционировать в митозе, увеличивая число микротрубочек, нуклеируемых центросомой (Kuriyama, Borisy, 1981).

2.3 Система микротрубочек в интерфазной клетке: различные взгляды.

Представления о сети микротрубочек в клетке начали формироваться после первых электронно-микроскопических исследований, которые показали, что в клетках культуры ткани микротрубочки радиально отходят от центросомы (Porter, 1966). Несколько позже возникло понятие о центре организации микротрубочек в клетке (Pickett-Heaps, 1969). Иммуноцитохимическими исследованиями с использованием антител к тубулину было показано, что клетки, в которых микротрубочки были разрушены колцемидом, при перенесении в чистую среду восстанавливают сеть микротрубочек из одного или двух центров (Brinkley et al., 1975, Osborn and Weber, 1976). Центры восстановления микротрубочек соответствуют точкам расположения центриолей (Sharp et al., 1981). Такое

соответствие подтвердило ранее высказанное предположение, что центросома является не только организующим центром, но и центром нуклеации микротрубочек (Borisy and Gould, 1978). В результате сформировалась ныне доминирующая концепция организации сети микротрубочек в интерфазной клетке: центросома является центром организации и нуклеации микротрубочек в интерфазной клетке, и сеть микротрубочек - это радиальная структура, в которой один конец каждой микротрубочки закреплен на центросоме и неподвижен, а другой обращен к периферии клетки (обзоры Brinkley, 1985; Wade and Hyman, 1997). Такой классической схеме соответствует, например, строение сети микротрубочек в эритроцитах двустворчатого моллюска Añada ovalis. При восстановлении микротрубочек после разборки холодом новые микротрубочки в этих клетках растут только от центриолей и восстановленная система микротрубочек состоит из небольшого числа микротрубочек, идущих от центриолей к периферии клетки, причем число микротрубочек с течением времени не меняется (Nemhauser et al., 1983).

Различными методами было показано, что микротрубочки полярны (Allen and Borisy, 1974; Kirshner, 1980; Mcintosh and Euteneuer, 1984;). Асимметрия микротрубочек основана на асимметрии гетеродимеров а-тубулина ß-тубулина, из которых собираются микротрубочки. В 1984 г была открыта динамическая нестабильность микротрубочек: было показано, что микротрубочки не являются статичными структурами, а находятся в состоянии постоянной сборки-разборки (Mitchison, Kirshner, 1984). Концы микротрубочек были названы "плюс" и "минус" концами. Плюс и минус концы микротрубочек различаются по своим свойствам. Во-первых, скорость сборки-разборки "плюс" конца значительно выше, чем "минус" конца (Horio and Hotani, 1986; Farrel et al., 1987). Во-вторых, свободный "минус" конец более устойчив при разломе микротрубочки. Так, в экспериментах по перерезке микротрубочек облучением ультрафиолетовым пучком было показано,

что растущий от аксонемы "плюс" конец после разрезания быстро разбирается, в то время как растущий "минус" конец после разрезания продолжает расти с прежней скоростью (Walker et al., 1989). Стало ясно, что сеть микротрубочек должна быть лабильной системой. В работах, выполненных на различных объектах, время полужизни отдельной микротрубочки или среднее время нахождения субъединицы тубулина в составе отдельной микротрубочки варьирует от 5 до 10 мин (Saxton et al., 1984 ; Soltys and Borisy, 1985 ; Sammak et al., 1987 ; Sammak and Borisy, 1988b ; Pepperkok et al., 1990 ; Rodionov and Borisy, 1994). Итак, каждая микротрубочка в клетке находится в состоянии динамической нестабильности, живет недолго, и довольно быстро разбирается и заменяется новой.

Полярность микротрубочек проявляется и в свойствах всей системы микротрубочек в целом. Так, в экспериментах по энуклеации микротрубочек на центросоме в эмбриональном экстракте in vitro микротрубочки были обращены к центросоме "минус" концом (Kuriyama, Borisy, 1981). В живой клетке микротрубочки ориентированы так же: "минус" концы обращены к центросоме, а "плюс" концы - к периферии клетки (Euteneuer, Mcintosh, 1981). Последние исследования на свободных микротрубочках in vivo выявили функциональное различие "плюс" и "минус" концов микротрубочек. Показано, что "плюс" конец вносит основной вклад в распространение сети микротрубочек в клетке, а "м�