Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к коллагенам человека и их использование в иммуноферментных тест-системах для изучения обмена коллагенов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к коллагенам человека и их использование в иммуноферментных тест-системах для изучения обмена коллагенов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ К Н Ц

На правах рукописи

СИМОВА Людмила Петрова

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К КОЛЛАГЕНАМ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОБМЕНА КОЛЛАГЕН С®

03.00.04. - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени « кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра РАМН

Научные руководители: проф. док. биол. наук Ермолин Г. А.

канд. биол. наук Домогатский С.1 П.

Официальные оппоненты: проф. док. мед. наук Насонов Е. Л.

канд. биол. наук Пономарева А. М.

Ведущее учреждение - НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, РАМН

- • '

Защита диссертации состоится 1 " > \ >~

в на заседании специализированного совета (К 00i.22.02.)

при КНЦ РАМН (Москва, 3-я черепковская ул. д. 15а)

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

/•; 1 . д—1 Венгерова Т. И.

Л* п

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Интерес к исследованию обменных процессов коллагенов закономерен и связан с черезвычайно пирокой распространенностью, важностью выполняемых функций и участием этих белков во многих нормальных физиологических, защитно-репаративных и патологических процессах. Сдвиги в синтеза и/или распаде коллагенов сопровождают многие распространенные заболевания, такие как: атеросклероз, гипертония, диабет, злокачественные опухоли, коллагенози. Изменения в обмене коллагенов наступают на раннем этапе, еще до появления клинических признаков заболеваний, а независимое прослеживание обмена отдельных типов коллагенов может дать информацию об эффективности лечения и благоприятном или неблагоприятном прогнозе развития заболевания, например о необратимом фиброзном перерождении ткани.

Возможное диагностическое и прогностическое значение информации об обмене коллагенов ставит вопрос о методических возможностях его исследования. Существуют два альтернатияных направления:

- биопсия и гистологическое исследование бноптатов. Хотя это исследование информативно, видна лишь статическая морфологическая картина уже произошедших изменений. Иногда биопсии проти-вопоказно делать, а также их невозможно часто повторять; - поиск специфических маркеров в биологических жидкостях, отражающих обменные процессы коллагенов. Это либо ферменты, специфические для метаболизма коллагенов, либо сами коллагены и их фрагменты (пропептиды проколлагенов, фрагменты трехспиральной структуры коллагенов). Высокая информативность этого направления исследования состоит в возможности прослеживания обмена коллаге-

нов в динамике. Однако здесь существуют методические проблемы, касающиеся чувствительности тестов и возможности оценить в отдельности синтез либо распад отдельных типов коллагенов.

Исследование, активности или иммунореактивности ферментов, участвующих в метаболизме коллагенов, дает информацию в отдельности как о синтезе, так и о распаде, однако не касается обмена конкретных типов коллагенов. Биохимическое определение белок-связанного гидроксипролина - специфической модифицированной аминокислоты коллагенов и других белков с трехспиральной структурой - мало информативно из-за невозможности дифференциации отдельных типов коллагенов; кроме того, сказывается интерференция со стороны других белков плазмы, содержащих трехспиральную структуру (с1ч комплемента и наннозосвязывагаций белок). Иашунохимичаское определение коллагенов позволяет-избежать эту интерференцию. Тест-системы для определения пропептидов проколлагенов обладает высокой чувствительностью и типоспецифичностыо, но неоднозначно отражают синтез либо распад коллагенов. Фрагменты трехспиральной структуры коллагенов отражают прежде всего процесс распада. Учитывая, что механизмы клиренса пропептидов проколлагенов и фрагментов коллагенов независимые, имеет смысл разработать тест-системы для определения фрагментов трехспиральной структуры коллагенов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось конструирование иммуноферментних тес г-систем на основе моноклональных антител к коллагенам человека для определения различных типов коллагенов в растворе и применение разработанных тестой к сыворотке и плазме крови.

Для достижения поставленной цели предстояло последовательно решить нескольких задач:

1. Получить инструмент иммунохимического анализа - монокло-нальные антитела к коллагенам человека, обладающие типовой специфичностью для коллагенов II, III и IV типов.

2. Накопить из асцитов антитела гз необходимом для дальнейшей работы количестве. Аффично очистить из антисывороток кроличьи по-ликлоналыше антитела с типовой специфичностью для коллагеноп человека.

3. Охарактеризовать полученные и ухе имеющиеся антитела к коллагенам человека применительно к их использованию в иммунофер-ментном анализе (специфичность, аффинность).

4. Сконструировать иммуноферментные тест-системы в ингибитор-ном и сэндвич вариантах для определения коллагеновых белков в растворе. Оптимизировать тесты по чувствительности.

5. Исследовать биораспределение коллагенов в крови in vitro, учитывая их взаимодействие с форменными элементами и с белками крови, в свою очередь имеющими сродство к коллагенам (фибронек-тин, clq системы комплемента).

Научная новизна работы. Нами впервые исследованы особености гуморального иммунного ответа к разным типам коллагенов человека у Balb/c линии мышей, рутинно используемой для получения гибридом Выявлены ограничения в применении этой линии для получения типо-специфических моноклональных антител к коллагенам человека, обладающих высокой аффинностью. При этом впервые получек штамм гибри-домных клеток - продуцентов антител, узнагицих центральную детерминанту (только в денатурированной форме) коллагена человека IV типа. Впервые исследовано биораспределение коллагена в цельной крови in vitro и поведение коллагенов как крио- и эуглобулинов

плазмы. Показано, что взаимодействие с фибронектином плазмы не является помехой для определения коллагена с помещью высокочувствительных тест-систем.

Практическая значимость работы. Результаты исследований могут послужить основой для дальнейших разработок Е направлении мониторинга обменных процессов коллагенов путем анализа биологических жидкостей. Получены типоспецифические моноклоналыше антитела к коллагенам человека, которые могут быть использованы для решения задач, где первостепенной является типоспецифичность - иммуногис-тохимия, аффинная очистка отдельных типов холлагенов, структурные исследования. Антитела к денатурированной форме коллагена IV типа могут быть полезными для выяснения локализации в тканях областей деградации этого типа коллагена. Тесттсистема в сэндвич-вариантс для определения коллагена I типа может быть использована при оценке его синтеза в культуре клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены па XII научной конференции болгарских аспирантов с международным участием (Москва, 1990г. ), на II всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москпа, 1990г.) и на межлаборатерной конференции Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.

Публикации. По теме диссертации имеются 2 публикации.

Обьрм ц структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, вызодов и списка литературы (264 ссылок, из которых 243 зарубежных). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 3 рисунками и 10 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методы экспериментов Препараты коллагена человека типов I-V получены путем пепсиновой экстракции и дифференциальной солевой преципитации в кислых и нейтральных растворах NaCl согласно Sage Н..Bornstein Р.,1979. Препараты денатурированного коллагена получали инкубацией в течении S минут при 90°С на водяной бане с последующим быстрым охлаждением и немедленным использованием. Нативность коллагенов оценивали при pH 7-8,5 осаждением 50%(о/о) диоксаном. При иммунизации использовали и коллаген, полученный без экстракции пепсином.

Гибридомные штаммы, продуцирующие моноклональных антител к коллагенам человека, были получены на основе иммунных клеток селезенки мышей линии Balb/c и миеломной линии X63.AgS.653, субклон Р^0|. Двухмесячные самки, группы по 5-10 животных, иммунизировали внутрибрюшинно введением по 50 мкг коллагенов отдельных типов в нативной+денатурированной форме / мышь, в 0,1М СН^СООН, эмульгированныеные 1:1 (о/о) с полным адъювантом Фрейнда. Мыши получали внутрибрюшинно 3 дополнительных иньекций (одна в полном и две в неполном адъюванте) теми же дозами коллагенов. Интервалы времени между иммунизациями нарастали (10, 20 и 30 дней). После паузы 2-7 меряцев мышей подготавливали для гибридизации введением внутрибрюшинно коллагена без адъюванта ежедневно в течение 3 дней непосредственноно перед слияниями. Клетки киеломы и гибридом культивировали в в средах DMEM или RPMI 1640, содержащих 5-2056 фетальной или нормальной сыворотки крупного рогатого скота, с добавками 2 мМ глутамина, 100 ед/мл пеницклина и 10 мкг/мл стрептомицина. При скрининге иммунофермеитным методом на

планшетках были идообилизоааии либо смеси коллагенов I-V типов, по 0,4 мкг/лунку для каждого типа, либо коллаген каждого из пяти, типов в отдельности, no 1 мкг/лунку; о нативной или денатурированной форме. Продукцию моноклональных антител клетками контролировали с помощьо ИФА..

Очистку монокяональных антител из асцитов проводили осаждением полиэтиленгликсотем бООО до конечной концентрации 10% для IgM и 16% для IgG. Для IgM следовала гель-фильтрация на носителе Sepha-cryl S-400 в буфере 100 мМ борат натрия, рН 8,0, содержащий 200 мМ NaCl. Для IgC применяли ионообменную хроматографию на обменнике DEAE-Sepharose CL-2B. Буфер для нанесения образца содержал 10 мМ фосфата натрия рН 8,1, элюция проводилась непрерывным градиентом 0-160 мМ NaCl в том же буфере. Аффинную очистку кроличьих поликлональных антител проводили на сорбентах с иммобилизованными коллагенами, антитела олюировали 0,5М CHjCOOH рН 3,0, содержащей 0, 5М NaCl.

Концентрацию белков определяли либо спектрофотометрически при длине волны 28С нм (для коллагенов 232,5 нм), либо по микрометоду Bradford. Электрофорез в додецилсульфате Na проводили по Laemmli, в 109S разделяющем и 3% концентрирущем полиакриламидном геле для иммуноглобулинов, в градиентном 5-15% разделяющем и 3% концен-рирующсм геле для коллагенов. Модификации состоялись в применении дитиотрейтола вместо -меркаптоэтанола при восстановлении S-S связей, а SH-групп блокировали йодацетзмидом.

Были использованы 3 варианта конструкции твердофазного имму-ноферментного анализа (ИФА) - прямой, ингибиторный и сэндвич. В прямом варианте ИФА на твердой фазе были сорбированы разные типы коллагенов или другие белки, "вторым этажом" служили антитела к

коллагенам, "третим этажом" - конъюгат пероксидазы с анти-имму-ноглобулиновыми антителами. В ингибиторном варианте ИФА на твердой фазе сорбировали антигены. Второй этаж - антитела, либо заранее прединкубированные с антигеном в растворе (последовательное насыщение), либо внесенные одновременно с тем же антигеном (равновесное насыщение). При этом происходило связывание части центров антител с антигеном в растворе и части - с иммобилизованным антигеном. Третий этаж - как п прямом варианте ИФА. В сэндвич-конструкции ИФА на твердой фазе сорбировали "захватывающие" антитела, вторым этажом служил антиген, а третий и четвертый этаж занимала "индикаторная система". В случае коллагена как антиген это были антитела к нему, но другого видового происхождения по сравнению с захватывающими, и конъюгат, специфически узнающий антитела третьего этажа. Буфер для иммобилизации коллагена - 100 мМ карбонат-бикарбонат натрия рН 9,6, для других белков - 10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl рН 7,2-7,4. Для устранения слабых взаимодействий использовали твин-20 в концентрации 0,05% (о/о) . Проявление пероксидазной активности проводилось в 20 мМ цитрате натрия рН 4,7, субстратами ортофенилендиамином и H^Oj.

Радиоактивное мечение коллагенов осуществляли с помощью окислителя - йодогена согласно Fraker P. J г, J. S. Speik.

Для экспериментов по биораспределению коллагена in vitro использовали свежую цитратную кровь из вен индивидуальных доноров (из Центра переливания крови КНЦ). Инкубацию крови с требуемым количеством коллагена и в течении определенного времени проводили в термостате при 37°С. Плазму получали центрифугированием при 11 000 об. /мин. Сыворотку получали из" плазмы добавлением CaClj до конечной концентрации 50 мМ.

Криоглобулиновую фракцию плазмы получали путем медленного размораживания на холоду (в течении 24-48 часов) заранее заморо-женой плазмы. Эуглобулиновая преципитация происходила при диализе плазмы против 5 мМ ЕДТА pH 7,2 на холоду.

Достоверность различий в распределении коллагена в крови определяли согласно t-критерию Стъюдента-Фишера.

Результата ЧССЛЗДРВаииЙ И Ш обсуждение При получении моноклопальных антител к коллагенам человека в качестве иммунохимических реагентов для исследования обмена коллагенов направленность отбора была: узнавание антителами детерминант, специфических для отдельных типов коллагена, сохранение узнаваемых детерминант при денатурации коллагена, высокая аффинность антител. Исследовали и возможности повышения отмечаемого в ряде экспериментов невысокого выхода специфических гибридом.

Учитывая факт, что линия мышей Balb/c наиболее часто используется как источник лимфоцитов для гибридизации, и отсутствие данных об особенностях гуморального ответа у этой линии на основные типы коллагена человека, иммунизировали группы мышей с коллагенами I-V типов с цель» выявления различия в ответе на основные типы коллагенов. Как видно из результатов (табл.1), наилучший ответ в плане специфичности, с минимальными перекрестами на другие типы коллагенов имелся для IV и V типов. Типы 1,111 занимали промеждуточное положение, а для II отпет по предложеной схеме иммунизации был плохим и, кроме того, узнавались детерминанты преимущественно конформационмого типа (встречающиеся только в нативной форме коллагена). Использование необработанного пепсином интерстициального коллагена (1,111 типов) для иммунизации не дало

преимущества перед схемой с повышенным удельным весом секвенциальных детерминант в отношении титра антител. Узнавались конфор-мационные детерминанты.

Таблица 1

Оценка специфичности гуморального ответа на разные типы коллагена человека в пуле сывороток мышей (N«5) при разведении, дающего половину максимальной оптической плотности в ИФА ++ - ОП49д>Зх фона; + - ОП4д0>2х фона; ± - 2хфона>ОП4др>фона

имму-ноген развед. сыворотки ++ антигены для + которых:

Кнп 1:500 Кнат: нп,I,II,III,IV Кден: Кнат: V.XI Кден: I, II, III, IV, V

KI нат/ден 1: 1000 Кнат: нп, I,II,III, IV, V,XI Кден: IV Кнат: Кден: I, II, III, V,XI

KII нат/ден 1:500 Кнат: нп, 1,11, III,IV, XI Кден: Кнат: V Кден: I,II,III,IV,V,XI

KIII нат/ден 1:1000 Кнат: нп,I,II,III,IV Кден: III,IV Кнат: V.XI Кден: I, II, V, XI

KIV нат/ден 1: 1000 Кнат: IV Кден : IV Кнат: III Кден: • III Кнат: нп, I.II, V.XI Кден: I,II,V,XI

KV нат/ден 1:1000 Кнат: IV, V Кден: Кнат: Кден: IV, V Кнат: нп.I,II,III. XI Кден: 1,11,III,XI

Кнат - коллаген в нативной форме, Кден - в денатурированной форме Кнп - коллаген, полученный экстракцией без применения пепсина

Таким образом, у мышей линии Ва1Ь/с установлены четкие отличия в гуморальном ответе на разные типы коллагена человека. Эта линия может быть рекомендована для получения ¡.юноклональных антител к V и IV типам коллагена человека. Для II типа целесообразно использовать другие линии, например по данным литературы хороший ответ на коллаген II типа имеется у линии мышей ЕВА/1I.

Для повышения выхода специфических гибридом была предпринята .■зссированная стимуляция иммуногеном в днях непосредственно перед гибридизацией (-4,-3,-2,-1 день), рекомондованая в литературе для других белков. Наблюдалась высокая (80-91%) общая эффективность слияния, выражаемая как количество лунок с ростом гибридных клеток в процентах от общего числа лунок с клетками. Специфическая эффективность слияния, выражаемая как процент лунок с положительным ответом на коллаген при скрининге первичных популяций из общего числа лунок с ростом гибридных клеток, оставалась низкой (0,7-2,6®). Конечный выход стабилизировавшихся клонов не зависел от типа коллагена, использованного для иммунизации, и составлял в среднем 1 клон на гибридизацию. Не выявлена также зависимость от интервала времени между иммунизацией и гибридизацией (от двух до семи месяцев). Можно предположить, что массированная стимуляция коллагеном вызывает неспецифическую поликлональную активацию лимфоцитов, а клонов В-клеток, специфически узнающих коллаген, изначально мало. Вопрос нуждается в дальнейшем изучении.

При проведении 4 новых гибридизаций проанализировали развитие узнавания коллагена (типоспецифнчность, конформацконные особенос-тп узнаваемых детерминант) в первичных популяциях гибридом. Как видно на рис. 1, с увеличением интервала времени между иммунизаци-

ей и гибридизацией от трех до семи месяцев наблюдалось увелич-ениетипоспецифичности антител. Спектр узнаваемых детерминант менялся от преимущественно трехспиральных (встречающихся в нативной либо нативной и денатурированной форме коллагенов) к центральным (встречающиеся только в денатурированном коллагене).

Несмотря на длительности поддерживания иммунного ответа практически все стабилизировавшиеся клоны (клонированы были после двухкратной проверки п ИФА все первичные популяции, положительные для антител к коллагенам) были с IgM-изотипом продуцируемых антител. Возможно, к секвенциальным детерминантам коллагена либо к денатурированной форме образуются антитела преимущественно IgM изотипа. Ожидаемое переключение класса не имело места.

Полуденные гибридомы продуцировали моноклональные антитела со специфичностями: к нативной форме коллагенов V и XI типа (гибридизация N1, иммуноген коллаген II типа, перерыв между иммунизацией и гибридизацией 3 месяцев); к секвенциальным детерминантам коллагенов III и IV типов; к детерминанте, встречающейся только в денатурированной форме коллагена IV типа (гибридизация N4, перерыв между иммунизацией и гибридизацией 7 месяцев). При проверке специфичности использовали следующие антигены: коллагены человека типов 1,11,111,IV,V,XI в нативной и денатурированной форме, фибронектин, clq системы комплемента, фибриноген, иммуноглобулин** ч альбумин человека.

Концентрации коллагенов, необходимые для полуингибирования взаимодействия антител с коллагенами, иммобилизованными в условиях высокой плотности, были в диапазоне мкг/мл для всех полученных моноклоналышх антител кроме одного, для которого ингибирова-ние о растворе не наблюдалось.

N 1 N 2

КН---- £ К К1У -- £ К

Кнат о о 0 о X 1*1 Кнат о X о о X

о о о 1x1 X X X о О X

Кден Кден о X

N 3

К111---£ к

Кнат

Кден

X

ш X

N 4

К1V —-Н К-К1V

Кнат

Кден

0

ш X о

_ X ы X

Рис.1. Анализ результатов первичного скрининга. Символом "о" обозначены слабые ответы (ОП^до<2х фона), символом "х" - хорошие ответы (ОП49ф>2х фона). Квадратом ограждены стабилизировавшиеся клоны. По горизонтали - специфичность ответа (ось Ктип -£К), крайние положения соответствуют узнаванию только конкретного типа коллагена либо только £. коллагена. По вертикали - конформационные особенности узнаваемых детерминант (ось Кнат - Кден). Крайнее верхнее положение соответствует узнаванию только нативной формы, крайнее нижнее - только денатурированной.

С уменьшением плотности адсорбированного коллагена на порядок для всех антител кроме одного наблюдался сдвиг в уровне максимальной оптической плотности при 4 90 ни, в наклоне или месте кривой титрования (рис.2). Судя по этим данным, моноклональные антитела к коллагенам как правило не отличались высокой аффинностью.

Исследовали возможности применения моноклональных антител к коллагенам человека (новых и уже имеющихся) в конструировании иммуноферментных тест-систем для определения различных типов коллагена в растворе. Оптимизировали в плане чувствительности две конструкции тестов - ингибиторный и сэндвич ИФА. Оптимизация ингибиторного варианта включала:

- выбор между одновременным и последовательным насыщением активных центров антител. При последовательном насыщении кривые ингибирования были смещены в сторону меньших значений концентрации коллагена в растворе;

- кинетические исследования, необходимые для подбора условий максимального взаимодействия в растворе при минимальном нарушении установленого равновесия на втором этапе, при инкубации пробы с адсорбированным коллагеном. Исследовали кинетику диссоциации комплекса коллаген - антитело при разных температурах, при заранее обеспеченном равновесии в точке полного ингибирования; кинотику образования комплекса на границе фаз при разных концентрациях моноклональных антител в растворе в зависимости от температуры и количества иммобилизованного коллагена;

- влияние уменьшения количества иммобилизованного коллагена на концентрацию коллагена в растворе, необходимую для ингибирования фиксированной концентрации моноклональных энтител.

оп

490

0, 8

О, 6

О, 4

0,2

ОП

490 О, 8

0,6

0,4

0,2

ОП

а) СН1 2 3

490 О, 8

О, 6

О, 4

О, 2

б)СН14

\

10 2 0,4 0, 08 0, 016 мкг/мл 10 2 0,4 0,08 0,016 монАт

в)СН5

ОП

490 О, 8 О, 6 О, 4 О, 2

г)СН4

10 2 0,4 0,08 0,016 1 мкг/мл монАт

.10 2 0,4 0,08 0,016 Рис.2. Кривые титрования моноклональных антител в зависимости

от количества коллагена, адсорбированного на твердой фазе. В буфере для адсорбции соответственно: д - 10 мкг/мл, х - 1,25 мкг/мл и о - 0,15 мкг/мл коллагенов типов а) - I, б, г) - IV, в) - V. Общая концентрация коллагенов в буфере для адсорбции 10 мкг/мл (дополнена типами, не узнаваемыми антителами). По оси абсцисс -концентрация моноклональных антител

В табл.2 показаны основные параметры чувствительности тестов после оптимизации. Типоспецифйческие моноклональ'ные антитела в ингибиторном варианте ИФА определяли концентрации коллагена в растворе в области мкг/мл. Наблюдалось менее выраженное ингибиро-ванио. взаимодействия антител с адсорбированным коллагеном (в % СП.макс - ОПмин / ОПмакс), соотношение ОПмакс / ОПмин как показатель чувствительности было неудовлетворительным. Единственное антитело, пригодное для конструирования тест-системы с чувствительностью определения коллагенов в области нг/мл, узнавало секвенциальную детерминанту, общую для коллагенов 1,11 и III типов (было получено до начала этой работы). Достигнутая чувствительность тсстов после оптимизации соответствовала изменениям в кривых титрования ант?«тел при уменьшении количества иммобилизованного коллагена и отражала скорее всего недостаточно высокое сродство. Разграничение моноклональных антител по аффинности согласно картине изменения кривых титрования с уменьшением количества адсорбированного коллагена применимо на этапе подбора подходящих клонов (анализ в культуральных средах).

Таблица 2

Чувствительность ИФА в ингибиторном варианте с монАт к К

коя тип опреде- диапазон опред, ОПмакс ОПмакс - ОПмин % монАт ляемого К концентраций К ОПмнн ОПмакс

СН123 ICI, 11, III 16-125 нг/мл 11 S5-94

СН14 KIV 400-1000 нг/мл 8 82-89

СН4 KIV 6-50 мкг/мл 2,5 60-71

СН5 XV, XI 3-12 мкг/мл 3,5 63-77

Типоспсцифические тести на основе нетипоспецифичсских монокло-палышх антител можно было бы получить, только комбинируя их с типоспецифичсскимн антителами против коллагена в сэндвич-конструкции ИФА. Для этой цели использовали аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела. Оптимизация сэндвич-варианта ИФА включала:

- исследование -влияния рН и ионной силы буфера для адсорбции на количество иммобилизованных антител;

- зависимость количества иммобилизованных антител от времени, температуры и их концентрации в буфере для адсорбции;

- влияние повышения концентрации захватывающих и индикаторных антител на чувствительность.

При сопоставлении чувствительности сэндвич - ИФА в прямой и перевернутой конструкции чувствительнее оказалась тест-система с нетипоспецифическими моноклональными антителами в качестве захватывающих (табл.3).

Таблица 3

Чувствительность ИФА в сэндвич-варианте для определения К1

захватывающие Ат индикаторные Ат определяемые концентрации К1

полиАт к К1 монАт СН123 15-500 нг/мл

монАт СН123 полиАт к К1 4-250 нг/мл -

Применение типоспецифических моноклональных антител в комбинации с аффинно очищенными поликлональными антителами к соответствующим типам коллагенов в сэндвич-ИФА дало чувствительность тестов в области мкг/мл. При комбинации двух моноклональных антител к коллагену IV типа кооперативных эффектов не было.

Необходимом следующим этапом работы были модельные эксперименты по биораспределени» коллагенов в крови in vitro. Цель была выяснить, в какой степени происходит взаимодействие с формеными элементами и с белками крови и насколько это могло бы повлиять на доступность коллзгена для определения. Эксперименты проводили независимо от ИФА, с радиоактивно мечеными коллагенами. Исследовали распределение коллагена между форменными элементами и плазмой в зависимости от концентрации коллагена и времени инкубации с кровью, уход в сгусток, крио- и эупреципитат (табл.4а,б.в).

Таблица 4а

Распределение К1 между форменными элементами и плазмой е зависимости от времени инкубации - % срм, х, р

фракция время: ЗОмин. бОмин. 9 Омин. 120мин.

плазма 80, 3% 80, 6% 81,8% 77, 8%

промывные растворы 13,4% 12, 5% 11,5% 14,9%

форменные элементы 6, 3% . 6, 9% 6, 7% 7, 3%

ЗОмин.-120мин. плазма р>0, 1 - разница недостоверна

ЗОмин. -120мин. форменные элементы р>0, 1 - разница недостоверна

Таблица. 46

Распределение К1 между форменными элементами и плазмой в зависимости от концентрации коллагена

фракция концентрация К1: 100нг/мл 1мкг/мл 10мкг/мл

плазма 79,1% 15,2% 75,7%

промывные растворы 15% 15% 13,3%

форменные элементы 5,9% 6,3% 11%

достоверность разницы: форменные элементы 0,1-1мкг/мл К - р>0,1; 1-10мкг/1-л К - 0,01>о»0,001; 0.1-10мкг/мл К - р<0,001 плазма 0, 1-Ъ.:кг/мл К р>0,1; 1-10мкг/мл К - р>0,1

Таблица 4в

Сопоставление распределения К1 в плазме и сыворотке из цельной крови, уход в сгусток

фракция %срм фракция ®срм

плазма 80, 9% | сыворотка 72%

промывные растворы ' 11,за | промывные растворы 11,4% /'

форменные элементы 7,8% | сгусток 16,6%

достоверность разницы: плазма - форменные элементы р<0,001; сыворотка - сгусток ре 0,001; плазма - сыворотка р а 0, 01 ; форменные элементы - сгусток р<0,01

Как видно, взаимодействие коллагена с форменными элементами слабо выражено для ожидаемых концентраций коллагена в биологических жидкостях. За интервал времени 2 часа, намного превышаг"ччй время клиренса коллагена в норме, этот белок оставался преимущественно в плазме и в сыворотке. По сравнению с плазмой в сыворотке было обнаружено меньше коллагена за счет ухода в сгусток.

! Криопреципитаты оказались обогащенными коллагеном в денатуриров-

анной форме, а в эуглобулиновом преципитате находились 64% коллагена III типа в нативной форме и 86% коллагена того же типа в денатурированной форме. Криопреципитация денатурированных коллагенов могла бы иметь как последствие уход неопределенного их количества в сгусток при свертывании крови на холоду и в криопре-ципитатах при замораживании/оттаивании плазмы.

, Взаимодействие коллагена с фибронектином и clq (наиболее ве-

роятные лиганды при попадании коллагена в кровь) исследовали им! л

муноферментным способом. Качественно выявили комплексы только с

; фибронектином, но их наличие не влияло на узнавание коллагена в

i

i присутствии плазмы и сыворотки для тест-систем с чувстэител-

i

ьностью определения в области нг/мл. Однако уровень эндогенного

коллагена оказался на нижней границе чувствительности сэндвич-ИФА. При разбавлении кривая была намного полосе по сравнении со стандартом - интактным коллагеном I типа. Это предполагает существование эндогенного коллагена преимущественно в форме фрагментов с меньшим, по сравнении с интактным коллагеном, сродством к антителам. Возможно применение разработанного типоспецифического теста для анализа продукции коллагена I типа в клеточной культуре, где в среду выделяется коллаген в виде целых молекул.

ВЫВОДЫ

. 1. Особености гуморального ответа на основные типы коллагена человека у линии мышей Еа1Ь/с заключаются в относительно высоком титре антител с минимальными перекрестами на другие типы для коллагенов IV, V типов. В случае коллагена II типа антителами узнаются детерминанты преимущественно конформационного типа.

2. С увеличением интервала времени между иммунизацией и гибридизацией наблюдается увеличение тнпоспецифичности антител и смещение спектра узнаваемых детерминант от нативной к денатурированной ферме коллагена.

3. Показана принципиальная возможность получения и получены гибридомы, продуцирующие молоклопальные антитела к отдельном типам коллагена человека, преимущественно к секвенциальным детерминантам. Получена гибридсма, продуцирующая антитела к центральной детерминанте в коллагене IV типа. Полученные моноклокальные антитела относятся к ^М изотипу.

4.Предложен способ разграничения моноклональных антител к коллагенам со средней и с высокой аффинностью по картине изменения кривых титрования с уменьшением количества коллагена, адсорбированного на пластике. Способ применим на этапе скрининга для подбора клонов ^ысокоаффинных антител.

5. Исследованные типоспецифические моноклональные антитела к коллагенам определяют в различных конструкциях ИФА концентрации коллагена в растворе в области мкг/мл. Ограничением для чувствительности тестов является недостаточно высокая аффинность типэ-специфических антител.

6. Для одного из исследованных моноклональных антител, узнающего детерминанту, общую для трзх типов коллагена, чувствительность определения коллагена в растворе составляла 16-125 нг/мл для ингибиторного варианта ИФА (суммарно для 1,11,111 типов). В сэндвич-ИФА в комбинацию с аффинно очищенными поликло-нальными антителами к коллагену I типа - 4-250 нг/мл коллагена этого типа.

7. Взаимодействие коллагена с форменными элементами крови слабо выражено для ожидаемых концентраций коллагенов в биологических жидкостях. Взаимодействие с фибронектином не мешает работе тест-системы с чувствительностью определения в области нг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моноклональные антитела к различным типам коллагена человека - получение, характеристика и возможности применения в имму-ноферментных тест-системах // XII научная конференция болгарских аспирантов в СССР с международным участием 'Актуальные проблемы

I

современной науки", Москва,' 14-15 июня 1990, рукопись доклада депонирована в ЦНТБ - София, N депонента 3565/90 // Соавт. Беккерт Ральф, Домогатский С. П.

2. Иммуноферментные тест-системы с применением моноклональных антител для определения растворимых форм коллагена человека // тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва 3-5 дек.1990, с.23 // Соавт. Домогатский С.П. , Беккерт Р., Рудин A.B.