Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных

Верховский, Олег Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных"

На правах рукописи

'о;

с) : ' 1

\ "

Верховский Олег Анатольевич

ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В АНАЛИЗЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА, СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЖИВОТНЫХ

03.00.04 - биохимия 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Федоров

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Л.П.Дьяконов (ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко)

Член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор А.М.Егоров (МГУ им. М.В.Ломоносова)

доктор биологических наук,

профессор Р.Х.Кармолиев (МГАВМиБ им, К.И.Скрябина)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

_1998 года в

Защита диссертации состоится заседании диссертационного совета Д.020.28.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, г.Москва, Кузьминки,ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Автореферат разослан « » Г-с*'/Ь** 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.А.Трондина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бурное развитие научных и научно- прикладных направлений иммунологии и молекулярной биологии коренным образом изменило методологические подходы в разработке диагиостикумов и вакцин нового поколения. К середине 1980-х годов новые идеи в иммунодиагностике и иммунопрофилактике были

> I ■ I

подготовлены прогрессом в изучении элементарных единиц иммунологической активности, «—о привело к материализации антигенной детерминанты, или эпитопа, как простейшей структуры, определяющей иммунологические свойства белка. Развитие новых подходов к предупреждению инфекционных болезней, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, в основе которых лежат современные, представления об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимают отношения в системе антиген-антитело (Р.В.Петров, 1982, 1988; Э.Я.Грен, П.П.Пумен, 1988; и др.).

Для проведения разноплановых исследований необходим выбор одной из двух форм антительных реагентов: поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела (МкА). Препараты и тех и других получают различными путями с различной целью; выбор между ними осуществляется не произвольно, а в большей степени зависит от соответствия специфичности антител требованиям теста.

При своей ценности использование антисывороток в иммунологических тестах "ограничено. Поликлональные антитела образуются в результате функционирования многочисленных клеточных клонов и, следовательно, гетерогенны на самых разных уровнях: по изотипу, специфичности, активности и аффинности. Поэтому, их очистка до той степени .специфичности, которая необходима для выявления отдельных структур и антигенных различий между молекулами на уровне индивидуального эпитопа, представляется практически невозможной задачей (Д.Кэтти, 1991; и.Вгис1егег е1 а1., 1992).

Разработанный Келлером и Мильштейном (1975) метод получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела заданной специфичности, открыл новую эру в биологической науке. С тех пор моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии. Гибридомная биотехнология является примером не только очень быстрого внедрения науки в практику, но и продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне.

Особая ценность МкА предопределяет их использование для проведения исследований различных антигенов, где их. чувствительность и специфичность способствуют решению множествапроблем, которые не могут бьггь решены с помощью поликлональных реагентов. Являясь реагентами направленного действия, моноклональные антитела позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур, способны значительно упростить многие тесты и значительно расширить число тестируемых молекул (Б.Ф.Фукс с соавт., 1982; С.С.Шишкин, 1997; С.Ногп Л а!.,1996; .Г. \У.Сго<йпд, 1996; аКеЛевг е( а!., 1997 и др.).

В настоящее время современные методы иммунохимического анализа, основанные на применении как поли- так и моноклональных антител, широко используются в диагностике инфекционных и паразитарных болезней, онкологической, сердечно-сосудистой и другой патологии (А.М.Егоров, 1988; А.М.Егоров и др., 1991; Г.М.Ратнер, 1996; 1Р.(3<м1т£ 1990; \У.ЕХее е1 а1., 1993; ¿.Кигапд « а1„ 1995; Н.го1а 61 а1., 1995; О-Р-БШев е1 а1., 1997 и др.). Как в медицине, так и в ветеринарии, особая роль при этом отводится углубленно^, характеристике иммунного статуса здоровых и больных людей и животных (В.В.Новиков, 1994; Р.В.Петров с соавт. 1997; Д.КХшпеу, 1984; ЬХОепЬ-жт й а1., 1995; 1.ВЛ12ак1,1996 и др.).

Анализ гуморальных факторов иммунного ответа играет важную роль в диагностике иммунологической недостаточности н напрямую связан с определением количественных соотношений иммуноглобулинов и распределением изотип/субизотип- специфических антител в биологических жидкостях организма (Ю.Н.Федоров, 1984; Л.Ф. Мерингова с соавт., 1997; ХМа&с -Л а1., 1995; РХш<1 е1 а1., 1997 и др.). Несмотря на то, что за последние годы сделаны значительные успехи в изучении иммуноглобулинов, остаются недостаточно рассмотренными вопросы, связанные с определением роли различных изотопов/ субизотипов ^ при многих иммунодефицитных. состояниях, изучением эпитопной структуры и их субъединиц, иммунохимичесхой природы специфических антител и их функциональных свойств у многих видов животных. В связи с этим, возникает необходимость разработки разноплановых диагностических тест- систем на основе поли- и моноклональных антител для оценки состояния гуморального звена иммунитета, иммунодиагностики и эпитопного картирования субьединиц что представляет значительный интерес не только в прикладных аспектах, но и для фундаментальной науки в целом.

Цель работы. Анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-/субизотип- специфического распределения антител и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней и собак на примере ряда

болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также приопределении антигенных и иммунногенных свойств вакцинных препаратов. Изучение и характеристика эпитопов иммуноглобулинов свиньи я некоторых других видов животных и человека.

Основные задачи исследований.

1. Унифицировать методы выделения, очистки и идентификации различных изотипов иммуноглобулинов животных и их структурных субъединиц.

2. Получить панель поли- и моноклональных антител к различным изотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак. Дать иммунохимическую характеристику полученным и имеющимся в нашем распоряжении антителам и испытать их в качестве иммунодиагностических реагентов.

3. Разработать и внедрить в ветеринарную практику тест- системы на основе различных вариантов ИФА и РИД с использованием поли- и моноклональных антител для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов различных изотипов в биологических жидкостях организма животных,

4. Изучить общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и человека, провести исследования по эпатопному картированию цепи свиньи и детально охарактеризовать специфичность формирующих ее эпитопов.

5. Провести анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации , .ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза, а также изучить их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных.

6. Провести количественную оценку уровня ¡¡¡М н ^А в сыворотке крови собак ,, при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с

показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных.

7. Используя поли- и монокяональные антитела к основным, структурным белкам аденовируса собак 1 серотипа (СА\М), сконструировать диагностические иммунофермент-ные тест- системы, предназначенные для одновременной детекции гексона САУ-1 и антител к нему и с их помощью изучить взаимосвязь в цепи вирус- гуморальный иммунный ответ.

Научная новизна работы. Получены и охарактеризованы моноклоиальные антитела к ^М, в^А, к- и Х- легким цепям свиньи, а также охарактеризованы МкА,

направленные к различным изотипам ^ крупного рогатого скота и человека. На гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к ^О, ^М и легким цепям ^ свиньи получены

Патенты РФ: № 2093572 «Штамм гибридных культивируемых клеток Миз.тизсиЫэ Ь., используемый для получения моноклональных антител к Ь-цепям иммуноглобулинов свиньи»; № 2093573 «Штамм гибридных культивируемых клеток Миз.тшсиЫз Ь., .используемый для получения моноклональных антител к ^М свиньи» и № 2093574 «Штамм гибридных культивируемых клеток Ми5.тшси1из Ь., используемый для получения моноклональных антител к свиньи» от 20 октября 1997 г. .ч, , С использованием полученных и охарактеризованных поли- и моноклональных .: антител к различным изотипам/субизотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак разработано девять диагностических тест- систем на основе различных вариантов ИФА и РИД.

Впервые проведено эпитопное картирование у1- цепи свиньи и детально охарактеризована специфичность семи ее эпитоцов.

Показана принципиальная возможность использования моноклональных антител к межвидовым эпитопам иммуноглобулинов или их структурных субъединиц для разработки разноплановых иммунохимических методов (различные варианты ИФА и РИД) по выявлению специфических антител и/или количественному определению уровня ^ в биологических жидкостях организма нескольких видов животных и человека.

Впервые изучена роль антител, содержащих различные типы легких цепей, в формировании иммунитета слизистых при трансмиссивном гастроэнтерите свиней и проведен анализ ¡распределения (к)- и (?.)- антител в иммунном ответе к ВТГС.

Получены, гибридомы, продуцирующие моноклоналыше антитела к основным структурным белкам СА\М и на основе МкА разработаны тест- системы с использованием различных вариантов ИФА для диагнортюрг, инфекционного гепатита плотоядных и изучения гуморальных факторов иммуногенеза,при данном заболевании. На «Штамм гибридных клетрк МиздщзсиЬ^Ь.,, продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собаки первого, серотица (СА\М) получен Патент РФ № 2095411 от 10 ноября 1997 г.

Получены нозые данные по количественной характеристике ^О, ^М и ^А в сыворотке крови сс>бак при различных формах демодекоза и дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии.

, Практическая значимость исследований. Материалы исследований по получению,

характеристике и использованию поли- и моноклональных антител к различным изотипам ^ , животных вошли,в нормативно-техническую документацию (НТД) на:

«Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней методом радиальной иммунодиффузии» ТУ № 93880038-00008064-96; Временное наставление по применению № 13-7-2/618. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96.;

«Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии» ТУ № 9388-0039-00008064-96; Временное наставление по применению № 13-7-2/617. Утв. Департаментом ветеринарии МСХйП РФ oi2i.0S.il6.'

На примере ряда болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также "при определении антигенных и иммунногенньй свойств вакцигшых препаратов, 'показана возможность использования препаратов Поли- и моноклональных антител - для иммунодиагностики и оценки изотип-/субизотип- специфического распределения' антител " и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических Жидкостях * организма животных. 1 .ОлЧ

Результаты научных исследований использованы при оформлении НТД и выпуске коммерческих иммунотерапевтическях и иммуномодулирующего препаратов:1-

«Сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная» ТУ № 08064-19-66-95; Наставление по применению № 13-4-2/405. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 28.09.95.;,

«Гамма- глобулин (иммуноглобулин) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных» ТУ № 9382-08-11472788-96; Временное наставлением По .применению № 13-4" 2/739. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 1648,9$!;; ^ш-.г .¡К' ил,

«Препарат "Рнботан" для регуляции иммунной системы, организма.: животных (иммуномодулятор)» ТУ Лг2 9365-082-95; Временное наставление г по применению №134-2/496. Утв. Департаментом ветеринарии^МСХиП РФ от 28.12.95^ ? г

Положения, выносимые на защиту. Полученные « экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: '-и-,., -г ■ -'"л г»

* Получение, кммунохимическая характеристика поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам животных и их использование в качестве иммунодиагяостических реагентов в разработанных тест- системах на основе различных вариантов ИФА и РИД;

* Определение роли изотипов, субизотипов, к- и к- цепей иммуноглобулинов в формировании гуморального иммунного ответа на иммуногены различной природы у свиней и собак;

* Характеристика эпитопов иммуноглобулинов и их структурных субъединиц. Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:

• Пленарном заседании секции «Биохимия сельскохозяйственных животных» Московского отделения Всесоюзного Биохимического общества АН СССР, 1991 г.;

• Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии (С.-Петербург, Пушкин, 1994г.); ... . ,,.

• 4 Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии (Дэвис, США, 1995 г.);

• 9 Международном конгрессе по иммунологии (Сан-Франциско, США, 1995 г.);

• Европейской шкс(ле по иммунологии (Прага, Чехия, 1995 г.);

• Заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1995 г.); .

• Итоговом годичном собрании Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1996 г.); .

• Углубленном курсе и симпозиуме по иммунологии (Пекин, Китай, 1996 г.);

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ..1998 г.

Результаты по отдельным разделам работы были рассмотрены и опубликованы в материалах 3 Международногосимпозиума. цо ветеринарной иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1993 г.); 8 Международного; симпозиума по, ветеринарной лабораторной диагностике. (Иерусалим, Израиль, . '1996 г.);1 Конгресса Федерации иммунологов стран Азии-Океании (Аделаида, Австралия, ,1956 г.); 13 Европейского симпозиума по иммунологии (Амстердам, Нидерланды, 1997 Г-); 4 Конгресса по ветеринаркой вирусологии (Эдинбург, Шотландия, 1997 г.), а также в,материалах международных симпозиумов и конференций, проводимых в России и странах СНГ (1990- 1997 гг.). По теме диссертации опубликовано 49 научных работ.. ..

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из , введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Материалы

диссертации иллюстрированы 57 рисунками и 27 таблицами. Список литературы включает 334 источника (56 отечественных н 278 зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛЫ , И МЕТОДЫ

В работе использован комплекс методов исследований: физико-химические, методы гибридомной технологии, иммунологические и иммунохимические.

Ф из и ко- химические методы включали в себя комплекс хромато!рафических методов (гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобная и тиофильная хроматография), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы и CsCl, аналитический и препаративный электрофорез в ПААГ- ДСН, электроэлюцию белков^ определение концентрации белка по Лоурк, а также синтез иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА.

Методы гибридомной технологии использованы для получения моноклональных антител заданной специфичности и включали в себя иммунизацию мышей линия BALB/c, слияние клеток с помощью полиэтиленгликоля, скрининг гибридом на продукцию МкА, клонирование и реклонирование клеточных культур, получение асцитических жидкостей и выделение МкА из мышиных асцитов.

К иммунологическим отнесены методы получения поликлональных антисывороток к выделенным антигенам с использованием кроликов и овец в качестве животных-продуцентов. В процессе выполнения работы получены, охарактеризованы и использованы: моноспецифические антисыворотки к IgG свиньи, IgG мыши, IgG и IgA собак; полиспецифические антисыворотки ко всем белкам сыворотки крови и молозива свиней и собак.

Иммунохимические методы использованы для очистки МкА, определения активности н специфичности полученных поли- и моноклональных реагентов, а также для разработки разноплановых диагностических тест- систем с их использованием и проведения комплекса научных исследований по оценке гуморального иммунного ответа животных в норме и при патологии, а также эпитопному картированию IgG свиньи.

Они включали в себя: иммуноблотгинг (ИБ), иммуноэлектрофорез (ИЭФ), все основные варианты твердофазного ИФА (прямой, непрямой, конкурентный и «сэндвич»), дот- блот ИФА, реакции двойной иммунодиффузяи по Оухтерлони (РДП), радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД), торможения гемагглютинации , (РТГА) и нейтрализации (РН).

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ФРАГМЕНТОВ

1ц02, IgM к б^А выделяли из предварительно обработанных препаратов сыворотки крови или молозива двух- или трехступенчатой хроматографической очисткой. Предварительную очистку иммуноглобулинов свиньи проводили методом ионообменной хроматографии на слабом анионообменнике ОЕАЕ-Тоуореаг1 650(8), используя ступенчатый градиент КаС1. Дополнительную очистку всех изотипов ^ проводили методом гель-фильтрации на 8ерЬасгу1 8-400. При выделении иммуноглобулинов собак оптимальной комбинацией оказалась следующая: первичная очистка осуществлялась гель-фильтрацией, дополнительная- анионообменной хроматографией.

; 1 / Антигенный анализ хроматографических фракций, идентификацию изотипов/ субизотипов.мммуноглобулинов и определение степени их чистоты проводили методами иммуноэлектрофореза и электрофореза в ПААГ-ДСН.

При иммуноэлектрофоретическом анализе полученных фракций отбирали только те, которые давали; одну линию преципитации с антисывороткой к сывороточным белкам молозива. свиньи (собак) характерную для \% определенного изотигта/субизотииа и локализованную в области его миграции. При использовании моноспецифических реагентов к отдельным .'.классам иммуноглобулинов, идентификацию полученных препаратов проводилишо формированию дуги преципитации в области миграции гомологичного и наличию перекрестных реакций (отсутствие дополнительных полос) с другими изотипами.

..... Полученные нами результаты по определению молекулярной мг.ссы тяжелых и легких

цепей! свиньи методом электрофореза в ПААГ-ДСН в значительной степени коррелируют с данными .1.М.11ое е1.а1.(1993) и позволяют'заключить, что молекулярная масса ц.-, а- и у-цепей составляет 75, 53 и 51 КД соответственно. По нашему мнению, молекулярная масса к-и Х- цепей ^ свиньи составляет 25- 26 и 23- 24 кД соответственно, цитированные вьиие авторы определили М.м. общего пула 1- цепей, которая по их данным, равна 23 кД.

Исследования по выделению, очистке и идентификации у 1-цепей свиньи, Р(аЬ)2 -и Рс- фрагментов ^ проводили совместно с к.б.н. Г.К.Юровым (ВНИИСБ).

Для очистки у1-цепей ^ свиньи, иммунохимически чистый препарат подвергали препаративному электрофорезу в ПААГ- ДСН в восстанавливающих условиях,

после чего вырезали полоску геля, содержащую у 1-цепи и извлекали их путем электроэлюции в отработанных условиях (рис.1).

У1-

Рис. 1. Идентификация у 1 -цепей свиньи методом ЭФ в ПААГ-ДСН в «плюс-минус» варианте. 1, 2, 3- препараты у 1-цепей и соответственно. Обозначены зоны мигрени натавной молекулы тяжелых (а- и 71-), легких (Ь-) цепей и секреторного компонента (вС) б^А

Установлено, что полученные у1- цепи сохраняли свои антигенные свойства, присущие ^01 - изотипу, специфически взаимодействуя с антисывороткой и МкА к и не давая перекрестных реакций с МкА к ^М и sIgA свиньи. Впоследствии у1- цепи были использованы в ИФА для подтверждения специфичности полученных моноклонапьных антител к субизотштам Гдй свиньи, проведения опытов по эпитопному картированию у1-цепи, а также как электрофоретические маркеры при идентификации изотипов иммуноглобулинов. Кроме того, нами разработан эффективный метод тиофильной адсорбции для быстрой очистки фрагментов иммуноглобулинов, полученных из асцитической жидкости мышей ВАЬВ/с. В результате опыта выделены и идентифицированы Р(аЬ)г- и Бс- фрагменты МкА изотипа; установлено, что данный метод выделения

позволяет Р(аЬ)2- фрагменту полностью сохранять свою антительную активность и может быть использован для выделения данных фрагментов 1зв1 всех видов животных и человека.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ ЖИВОТНЫХ

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к различным изотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи, были получены после иммунизации мышей линии ВАЬВ/с очищенными препаратами ^М, э^А и слияния иммунных лимфоцитов (клетки селезенки или лимфоузлов) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63-А08.653 или 8р2/О-А0-14.

В результате проведенных экспериментов получены 22 гибридомы, продуцирующие МкА к IgG, IgGl, IgM, slgA, к- и Х- цепям иммуноглобулинов свиньи. Помимо этого, в нашем распоряжении были моноклональные антитела клона 1F4, любезно предоставленные к.б.н. В.К.Сологубом,МкА клонов 7DS и DAS, любезно предоставленные профессором В.М.Чекишевым, а также МкА ряда клонов, полученные ранее в лаборатории. Полный перечень имеющихся в нашем распоряжении МкА составил 36 наименований,

■ Результаты по определению специфичности моноклональных антител в различных иммунохимических тестах представлены в таблицах 1,2.

Разработанный нами метод электрофореза в ПААГ-ДСН в «плюс - минус» варианте с последующим иммуноблотгингом (рис. 2), позволил определить локализацию и структуру эпитопов, находящихся как на полипептидных цепях, так и на нативной молекуле. При этом можно определить специфичность практически всех МкА, имеющих высокую активность в

непрямом ИФА.

Рис.2. Анализ специфичности моноклональных антител

с помощью иммуноблоттинга. А: электрофореграмма и ígM свиньи, В: иммунопероксидазное окрашивание реплик гелей после реакции с МкА: 1-клона 2РЗ(1); 2- клона А4; 3- клона 7В9. В параллельных гелях разделяли иммуноглобулины й иМ я выявляли зоны белков в одном случае путем прямого окрашивания белков в геле AgNOз, а в другом - за счет взаимодействия с МкА. Каждый из исследуемых в "плюс"- дорожке (после термоденатурации при 100 С в присутствии (5-меркаптоэтанола) мигрирует как легкая и тяжелая (ц- или у1- соответственно) цепи а в "минус"-дорожке - как нативная молекула представляя собой зону с замедленной электрофоретической подвижностью. На иммунорепликах с идентичных гелей выявляются только зоны взаимодействия МкА со специфическими эпитопами.

Таблица 1. Характеристика иммунологической специфичности моноклональных антител

к различным изотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи

Код Изотиг Специфичность в ИФА Результаты иммуноблоттинга

МкА- 1в локализация структура

мыши 1Ё01 1802 18М ^¡вА эпитопа эпитопа

А4 + . - у1-,у2- цепи линейная

2в1 + + - у 1-, у2- цепи линейная

Р8-1 1БМ + + - у1-,у2- цепи линейная

Р8-3 + + - у)-, у2- цепи линейная

6С5 + + - нативная молекула 1йО информационная

8ВЗ + + - нативная молекула конформаци-онная

4Н12 + - - у1-цепь линейная

603 1&0\ + - - у1-цепь линейная

А-1 + - - у1-цепь линейная

А-2 \ф\ + - - у1-цепь линейная

+ - - у1-цепь линейная

2РЗ-1 \gG2b - - + - нативная молекула ^М конформаци-онная

2РЗ-2 \zG2b - - + - нативная молекула ^М конформаци-онная

1С4' - - + , - нативная молекула ^М конформаци-онная

1Е4 - - + - нативная молекула ^М конформаци-онная

2?2 - - + - нативная молекула IgM информационная

2Н4 1яС2а - - + - нативная молекула ^М конформаци-онная

Е12 + + + у1-, у2- цепи и нативная молекула ГдМ биспецифи-ческие 1 антитела

9Е7 - - - + нативная молекула з1вА : конформаци-онная

4ЕЗ • №1 + + + + к - цепь линейная

5С2 + + + -1- к - цепь линейная

7В9 + + + ' + X - цепь линейная

Таблица 2. Характеристика иммунологической специфичности моноклональных антител к различным изотипам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и человека

Код МкА Изотип 18 мыши Специфичность МкА* Результаты иммуноблоттинга **

локализация структура эпитопа эпитопа

1Р4 ^М человека ц - цепь линейная

708 к.р.с. нативная молекула конформационная

БАЭ 1ё02Ь э^А к.р.с. нативная молекула б^А конформационная

в9 1$М к.р.с. нативная молекула ^М конформационная

С2 ^М к.р.с. нативная молекула ^М конформационная

С4 IgM к.р.с. нативная молекула 1йМ конформационная

ВЗ к.р.с. ц-цепь линейная

СП ^М к.р.с. ц - цепь линейная

Примечание: *- специфичность была предварительно определена авторами, представившими данные МкА;

**- перед проведением иммуноблоттинга, специфичность МкА была подтвервдена в ИФА с использованием очищенных препаратов IgM, б^А человека и крупного рогатого скота.

Наличие преципитирующей способности является уникальной особенностью каждого конкретного МкА поскольку известно, что моноклональные антитела направлены к одному эпигопу, которой может быть единственным в белковой молекуле. Поэтому, МкА могут формировать прецишггационную решетку в двух случаях: 1) при взаимодействии с эпитопом, представленном в антигене, по крайней мере, в 2-х идентичных повторах; 2) если в системе используется смесь двух МкА, специфичных к различным эпитопам антигена (т.н. олигоклональный реагент). Если в качестве антигена используются иммуноглобулины человека или животных, то возможны обе указанные ситуации.

Использование МкА в иммунопреципитационных методах очень перспективно, поскольку позволяет идентифицировать антигены, строго специфически связавшие антитела, тогда как при использовании ПкА в преципитацию часто вовлекаются посторонние молекулы, ассоциированные с антигеном, что приводит к значительным ошибкам при его

количественном определении. Кроме того, наличие простых тест- систем на основе МкА в арсенале различных лабораторий, способствует стандартизации исследований и получению сопоставимых результатов. Поэтому все имеющиеся у нас МкА были протестированы на наличие преципитирующей активности в РДП и ИЭФ (рис.3).

Рис.3. Анализ специфичности

1 моноклональных антител в ИЭФ.

В лунки внесена сыворотка молозива свиньи. После электрофоретического

разделения белкой в траншеи вносили МкА,

2 полученные из асцитических жидкостей:

(1)- клона 9Е7, (2)- клона 1Р4, (3)- смесь МкА клонов 4Н12 и 7В9.

Рисунок демонстрирует связывание МкА

3 различных клонов с sIgA, ^М и

содержащим Х- цепь соответственно.

В результат? ,проведеннных экспериментов по * определению преципитирующей активности моноклинальных антител было установлено следующее: '

1. Все МкА, полученные к IgM свиньи, IgM крупного рогатого скота и IgM человека обладают преципитирующей активностью в отношении гомологичного антигена в стандартном варианте .. постановки реакции, т.е. без добавления ПЭГ или другого по специфичности МкА. При этом активность МкА в РДП была различной, тйтр антител по отношению к очищенному препарату IgM и нормальной сыворотке крови составлял от 1:81:16 МкА клона 1С4 до 1:64 МкА клонов 2F3-1 и 1F4. ' 1

2. МкА клона 9Е7 специфически взаимодействуют как с очищенным препаратом slgA свиньи, так и с биологическими жидкостями, его содержащими (молозиво, молоко, бронхо-альвеолярные смывы), также в стандартных условиях постановки иммунопреципитационных методов. Титр МкА составил 1:32-1:64 в РДП.

МкА клона DAS обладали преципитирующей активностью по отношению к slgA крупного рогатого скота в стандартных условиях постановки РДП и РИД.

3. Все МкА, полученные к IgG и двум типам L- цепей Ig свиньи, не формируют линий преципитации с Ig- содержащими препаратами без добавления ПЭГ. В присутствии 3-5% (вес/объем) ПЭГа в агароэе, 8 из 14 МкА, образовывали одну линию преципитации с гомологичным антигеном в РДП и ИЭФ. МкА клона 7DS, полученные к IgG крупного рогатого скота, также обладают преципитирующей активностью только в присутствии ПЭГ.

4. Олигоклональные реагенты, полученные при смешивании МкА к ^О и МкА к Ь-цепям свиньи (Х-и к- соответственно) в равных соотношениях'(например 4Н12+ 7В9, 6С5+ 7В9 и т.д.). обладают преципитирующей активностью в РДП и ЙЭФ, при этом их титр составил 1:8-1:16. ..

Наличие преципитирукйцих' МкА к 1дМ и sIgA свиньи позволило отработать метод радиальной иммунодиффузии с их использованием для выявления и количественного определения иммуноглобулинов данных изотипов (рис. 4.)

Рис.4. - -Количественное определение уровня sIgA свиньи методом РИД. С- разведения стандартной сыворотки молозива, в остальных лунках- 1У. испытуемые пробы молозива и молока

супоросных свиноматок.........

В агарозу внесены МкА клона 9Е7 в концентрации 50 мкг/мл.

В исследованиях по изучению межвидовых эпитопов животных и оценки возможности использования специфичных им МкА для создания универсальных тест-систем на основе ИФА и РИД для количественного определения уровня в различных биологических жидкостях нескольких видов животных и человека, был использован набор иммуноглобулинов и глобулиновых препаратов, выделенных из сывороток крови 12 видов животных и человека.

Полученные результаты по перекрестной видоспецифичности моноклональных антител к иммуноглобулинам животных и человека позволяют разделить эпитопы ^ на две группы:

А- Эпитопы, характерные только для данного вида животного (видоспецифические). В наших опытах ими являлись эпитопы, локализованные на нативных молекулах ^О, ^М, у-и Х- цепях свиньи. МкА, направленные к эпгам эпитопам, обладают строгой

видоспецифичностью и не взаимодействуют с ^ других видов животных и человека ни в одном из использованных тестов;

В- Эпитопы, общие для иммуноглобулинов данного изотипа (или легких цепей Щ нескольких видов животных и человека (межвидовые). Наиболее широкое распространение среди этой группы получили эпитопы, представленные на молекулах всех видов жвачных животных. МкА таких клонов как 4Н12 (специфичные цепям свиньи и жвачных), 1И4 (ц-цепям человека, свиньи, собаки и лошади), 09 (1^ жвачных) и др. с одинаковой активностью связывали эпитопы соответствующих антигенов во всех проведенных тестах. За исключением МкА 703, все исследуемые МкА были устойчивы к конъюгированюо и не теряли своей видоспецифичности после окисления.

Изучая феномен перекрестной активности моноклональных антител к различным изотипам иммуноглобулинов и легким цепям свиньи, человека и жвачных, мы установили, что общие (межвидовые) эпитопы могут присутствовать как нанативных молекулах так и на их субъединицах (тяжелых и легких цепях), т.е. могут быть конформационными и линейными.

На основании полученных нами данных, были созданы универсальные тест-системы с использованием вышеупомянутых МкА на основе разноплановых иммуно-химических тестов (ИФА, иммунодиффузия) для определения иммуноглобулинов в различных биологических жидкостях организма нескольких видов животных и человека.

ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ у1-ЦЕПЕЙ СВИНЬИ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Моноклональные антитела, обладая в отличие от поликлональных антисывороток не антигенной, а эпитопной специфичностью, могут служить инструментом цммуноанализа семейств структурно-родственных многодетерминантных белков, таких как изотопы и субизотипы животных и человека. Являясь высокоспецифичными реагентами, МкА необходимы для изучения эпитопной структуры молекул 1§0 и их тяжелых цепей, механизмов их взаимодействия с клеточными рецепторами и гуморальными связывающими факторами. На применении МкА к основаны современные методы диагностики заболеваний человека и животных и ряд приемов очистки и контроля качестра содержащих препаратов.

Основной целью данного раздела работы было определение эпитопной специфичности полученных моноклональных антител к свиньи и проведение

эпитопного картирования тяжелых цепей, входящих в состав молекулы

В исследованиях были использованы 11 гибридом, секретирующих моноклональные антитела к при этом МкА, продуцируемые шестью независимыми клонами, направлены к эпитопам, общим для и ^02, МкА, секретируемые пятью независимыми

гибридомами, распознают субизотип-специфические эпитопы, локализованные на у1-цепях молекулы.

Для проведения эпитопного анализа полученных МкА был разработан конкурентный вариант ИФА, при котором к антигену (^01 свиньи), адсорбированному на поверхности пластика в концентрации 10 мкг/мл, добавляли смесь моноклональных антител: МкА, меченые пероксидазой в предварительно установленном титре и немеченые МкА (исходная концентрация 100 мкг/мл) в двукратных последовательных разведениях и инкубировали 3 часа при легком встряхивании на шейкере. Принцип метода состоит в том, что моноклональные антитела, направленные к одному и тому же эпитопу, конкурируют между собой за связывание с антигеном и происходит полное торможение (ингибирование) реакции при избытке немеченых МкА. МкА, специфичные к разным эпитопам, характеризуются отсутствием конкуренции между собой, т.е. ингибирование реакции полностью отсутствует при любых концентрациях немеченых антител. Частичное ингибирование может свидетельствовать о близком расположении двух разных эпитопов молекулы. По результатам реакции строили кривые титрования: испытуемых моноклональных антител; МкА, взятых в качестве отрицательного (меченые и немеченые МкА одного клона) и положительного (меченые и немеченые МкА, направленные к заведомо разным эпитопам) контролей. После сравнения значения СЮ 492 в аналогичных разведениях определяли процент ингибирования реакции исследуемыми МкА.

Результаты исследований эпитопной специфичности с помощью конкурентного ИФА (табл. 3) показали, что все нативные МкА полностью ингибировали связывание с гомологичных конъюгатов. Кроме того, анализ полученных данных позволяет считать, что экспрессия всех изотип- и субизотип- специфических эпитопов, выявляемых полученными нами МкА, сохраняется неизменной'при адсорбции на поверхности

■ II

пластика. " ' ' '

По способности ингибировать связывание других конъ'ЮгированнЬк антител, МкА были разделены на три группы. К первой группе относятся МкА клонов Р8-1и Р8-3,6БЗ и А-

Таблица 3. Анализ эпитопной специфичности моноклональных антител к 1§0 свиньи с помощью конкурентного ИФА

МкА Иммуиопероксидазные конъюгаты на основе МкА А4 201 ••'8-1 Р8-3 4Н12 бЬЗ 'А-1 А-2 2Р1 6С5 8ВЗ

А4 + X - - - - - - - -

2в1 X + - - " - - - -

Р8-1 - - + + - X X X - -

Р8-3 - ¡•"г + + X X X - -

4Н12 - - .4 + - - - - -

603 X X + + - -

А-1 - X X - + + - -

А-2 - X X - - + - -

2Р1 - - - - -

6С5 • - ^ - . - - - + +

8ВЗ 1 . - - - + +

Примечание: « + »- полное ингибирование; « х »- частичное ингибирование; «-»-отсутствие ингибирования/ 1

1, 6С5 и 8ВЗ, которые проявили выраженную способность к взаимному ингибированию связывания с антигеном. Это свидетельствует о том, что каждая пара моноклональных антител, продуцируемых независимыми гибридомами, распознает один эпитоп на молекуле антигена. Сопоставление результатов ИФА и иммуноблоттинга позволило заключить, что эпитоп, распознаваемый парой МкА 6С5/ 8ВЗ, является конформационным, остальные локализованы на у1- (бОЗ/А-1) и на у1- и у2- цепях (Р8-1/Р8-3). Ко второй группе были отнесены МкА, частично ингибировавшие связывание с антигеном других антител. Мастичное взаимное ингибирование связывания МкА клонов ШЪ1А-\ и 201, Р8-1/Г8-3 и А1, А2 указывает на топографическое соседство изотип- и субизотип- специфических эпитопов, распознаваемых данными МкА, по крайней мере, при иммобилизации на твердой фазе. В третью группу вошли МкА клонов 4Н12 и 2К1, связывание которых с адсорбированным на пластике 1§01 не препятствует взаимодействию всех остальных меченных МкА с антигеном. Это свидетельствует о топографической удаленности эпитопов,

распознаваемых данными МкА от эпитопов, к которым направлены антитела, секретируемые другими клонами.

Анализ полученных показал, что вероятное расположение эпитопов на адсорбированных молекулах у-1 цепи может быть схематично представлено в виде рисунка(рис.4),: согласно которому эпитопы, распознаваемые МкА клонов 4Н12 и 2Р1, пространственно наиболее удалены друг от друга, а в пределах расположенного между ними антигенного участка локализованы остальные пять сближенных или частично перекрывающихся эпитопов. Из 7 эпитопов, изображенных на рис.4, три являются изотап-специфическими (распознаваемые МкА клонов А4, 201, Р8-1/Р8-3), образованными высококонсервативными участками константных доменов тяжелых цепей свиньи и характерными для всех его субизотипов и четыре- субизотип- специфическими (распознаваемые МкА клонов 2Р1,4Н12,6ВЗ/А-1, А-2), локализованными только на цепях.

Известно, что различные эпитопы, расположенные на белковой молекуле, не равнозначны по своему вкладу в стимуляцию иммунного ответа. Наиболее значимые из них называются иммунодоминантными. Для обнаружения таких эпитопов был проведен опыт по определению способности всех испытуемых МкА иягибировать связывание конъюгированной моноспецифической антисыворотки к свиньи, взятой в рабочем титре.

Результаты опыта показали, что МкА клонов 4Н12, Р8-1, Р8-3 . частично ингибировали связывание конъюгата с в то время как присутствие других немеченых МкА не подавляло реакцию конъюгата. Это свидетельствуют о том, что антитела к двум эпитопам (распознаваемым МкА 4Н12, Р8-1/Т8-3) присутствуют в общем пуле антител моноспецифической антисыворотки в достаточно высокой концентрации, т.е. говорит о более выраженном гуморальном иммунном ответе к этим двум иммунодоминантным (по отношению к другим исследованным) эпитопам.

Все эпитопы на рис.4 также подразделены на две группы, различающиеся на основе свойств, взаимодействующих с ними МкА. К одной группе относятся видоспецифические эпитопы, локализованные на молекулах тяжелых цепей свиньи. В другую группу входят межвидовые эпитопы, общие для ДО нескольких видов животных и человека, к этой же группе относятся эпитопы, общие только для ДО свиньи и жвачных (распознаваемые МкА клонов 4Н12,603/А-1).

Проведение исследований по эпитопному картированию преследовало две основные цели: I) изучение антигенной структуры у1-цепи свиньи и индивидуальных свойств

Рис. 4. Схематическое распределение мштопвв на71-цепях свиньи.

Буквами обозначены олитошЛ,'распознаваемые следующими МкА: А-4Ш2; В- Д4; С- 20!; 1)- 603/А-1; Е- Р8-1/ Р8-3; Г-^Д-,2; С- 2Р1. Из 8 эпитопов, идентифицированных нaígGl молекуле с помощью И независимых МкА. конформацнонньш эпитои (детектируемый МкА 6С5/8ВЗ) не иредставлйГ'йа схеме.

формирующих ее эпитопов; 2) отбор МкА для разработки «сэндвич»- ИФА для выявления и количественного определения уровня в биологических жидкостях организма свиньи.

Основой для разработки «сэндвич» ИФА на основе моноклональных антител для выявления любого растворимого белка служит наличие МкА, направленных к разным эпитопам антигена. При использовании таких МкА в качестве иммуноферментного конъюгата, находящегося в жидкой фазе и в качестве фиксирующих антител, иммобшшзированных на поверхности пластика, происходит одновременное связывание антигена и отсутствует конкуренция между конъюгатом и иммуносорбентом за общие центры связывания. Эффективность метода, в данном случае, зависит от аффинности и специфичности МкА.

Результаты сочеганного применения иммобилизированных и меченных МкА в "сэндвич"-ИФА показали, что наибольшей эффективностью при выявлении обладали сочетания МкА, направленных к топографически удаленным эпитопам: фиксацию антигена на твердой фазе обеспечивали МкА 2Р1, а выявляющим (детектирующим) реагентом служил конъюгат 4Н12 .

Разработанный нами метод оказался эффективным для количественного определения уровня в секретах молочных желез свиноматок при изучении особенностей

гуморального иммунного ответа у животных данного вида.

ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА И ИЗОТИПИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ТРАНСМИССИВНОГО • ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ В СЕКРЕТАХ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ СВИНОМАТОК

Современные исследования по изучению характеристик и анализу гуморального иммунного ответа при различных болезнях животных, неразрывно связаны с развитием двух направлений современной иммунобиотехнологии: (1) изучению генов иммуноглобулинов и экспрессируемых ими продуктов; (2) получению поли- и моноклональных реагентов, необходимых для разработки и эффективного использования методов оценки роли иммуноглобулинов в иммунопатологии инфекционных и инвазионных болезней животных, а также оценки антигенных и иммуногенных свойств традиционных и разрабатываемых вакцин нового поколения.

Известно, что резистентость организма к инфекции не всегда определяется уровнем сывороточных антител. Это относится прежде всего к возбудителям, поражающим

слизистые оболочки, в том числе желудочно- кишечного и респираторного тракта. В этих случаях, иммунитет напрямую связан с защитой поверхностных клеток эпителия и формируется либо в результате пассивной передачи новорожденным антител иммунных матерей с молозивом и молоком, либо в процессе вакцинации взрослых иммунокомпетентных животных.

Наличие у свиней плаценты эпителиохориального типа служит причиной отсутствия трансплацентарной передачи материнских иммуноглобулинов, поэтому молозиво и молоко является единственным источником защиты новорожденных поросят в ранний постнатальный период. Иммуноглобулины класса А имеют наиболее важное значение в формировании местного иммунитета и являются, наряду с одним из

основных изотипов фв в молозиве и молоке свиноматок. Хорошо известно, что наилучшей защитой новорожденных поросят от инфекции, вызываемой вирусом трансмиссивного гастроэнтерита (ВТГС), является иммунизация свиноматок вирулентным (по некоторым данным и аттенуированным) штаммом ВТГС во время супоросности. В этом случае вирус реплицируется в эпителиальных клетках и стимулирует ^А- специфические клетки-предшественники. В период супоросности и лактации эти клетки мигрируют в молочную железу, где дифференцируются в IgA- плазматические клетки, которые секретируют вирус:специфические 1дА- антитела в молозиво и молоко. Пассивный (лактогенный) иммунитет формируется у поросят после передачи материнских антител в процессе вскармливания.

Поскольку эффективная поливалентная (ассоциированная) вакцина должна обеспечивать иммунологическую защиту против . нескольких патогенов, необходим контроль иммуногенности каждого их них.

Целью данного раздела работы является оценка антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза свиней, выявление и оценка распределения в гуморальном иммунном ответе изотип- специфических антител к ВТГС в секретах молочных желез иммунных свиноматок, а также изучение их роли в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных поросят.

Исследования выполнены совместно с сотрудниками ВИЭВ д.в.н. М.Аноятбековым и д.в.н., профессором Б.Г.Орлянкиным, а также с к.б.н.Л.В.Верховской (ВНИИСБ).

Супоросные свиноматки были разделены на две группы (опытная и контрольная) по принципу аналогов. Животных опытной группы двукратно иммунизировали испытуемой

вакциной, вводя ее внутримышечно в дозе 5 мл на 70-75 и 90-95 дни супоросности. Напряженность иммунитета поросят, полученных от свиноматок опытной и контрольной (не вакцинированной) групп, оценивали по результатам контрольного заражения. Контрольное заражение поросят проводили вирулентными штаммами ВТГС и РВ перораяьно в дозе 20001ЛЭя> на 3 день после опороса и вирулентным штаммом Е.соН (078) в дозе 8 млрд. микр.тел сразу же после рождения до получения молозива.

Общий уровень иммуноглобулинов, специфических и изртип- специфических антител определяли в молозиве и молоке свиноматок обеих групп.

Количественное определение уровня .иммуноглобулинов в секретах свиноматок Количественное определение уровня э^А в испытуемых пробах проводили

методом радиальной иммунодиффузии. Для постановки . РИД были использованы моноспецифическая антисыворотка к МкА к 1&М, , МкАкв^ и стандартная сыворотка крови свиней с известным содержанием иммуноглобулинов каждого изотипа. Титры антител к ВТГС . и РВ , : были, определены в РН, проведенной по стандартной методике с использованием соответствующих штаммов вирусов (100 ТЦЦ 50/мл) и монослоя культуры клеток эмбриона свиньи. Стандартная реакция агглютинации (РА) была использована для определения титров антител, специфичных к антигенам (К99, К88аЪ, К88ас, 987Р) Е.соН.

Анализ полученных нами данных показал, что двукратная, вакцинация ассоциированной вакциной ведет к значительному повышению уровня иммуноглобулинов в секретах молочных желез свиноматок (табл.4.).

Таблица 4. Концентрация иммуноглобулинов в секретах молочных желез

свиноматок (мг/мл)

Группа животных Секреты до " я^А

опыт (п=30) молозиво 48,5 3,5 6,7

молоко 9,9 2,8 2,9

контроль (п=30) молозиво 39,6 3,02 4,1

молоко 5,8 1,4 1,4

Примечание: - приведены средние геометрические значения величин

Повышение уровня иммуноглобулинов играет защитную роль при вирусных и бактериальных инфекциях и связано прежде всего с увеличением класс- специфических

вирус-нейтрализующих и агглютинирующих антител вследствие поликлональяой активации [^э- продуцирующих В- лимфоцитов. В наших опытах прирост вирус- нейтрализующих антител составил 44,5- 89% в молозиве и 35,7- 83,3% в молоке иммунизированных свиноматок. Уровень агглютинирующих антител в молозиве животных опытной группы был на 36,8- 85% выше такового в молозиве контрольных свиноматок.

Для выявления изотип- специфических антител был разработан непрямой вариант ИФА с использованием препарата очищенного вируса ТГС и моноклональных антител к различным изотипам свиньи, меченных пероксидазой.

Препарат высокоочищенного вириона ВТГС был получен с помощью ультрацентрифугирования вирус- содержащей суспензии перевиваемой культуры клеток почки эмбриона свиньи в градиенте плотности сахарозы в отработанных нами условиях. Его: антигенная активность и структурный срстаа были определены методом иммуноблоттинга в реакции с поликлональяой ВТГС- специфической антисывороткой. Идентифицированы четыре основных белка вириона с молекулярной массой 220, 90-100, 50-60 и 30 кД. Этот препарат был использован в качестве антигена для определения изотип-специфических антител методом непрямого' твердофазного ИФА в сенсибилизирующей дозе 5 мкг/мл.

Синтез иммунопероксидазных конъюгатов на основе МкА проводили по отработанной технологической схеме, их рабочее разведение определяли методом прямого ИФА. Перечень МкА, используемых в настоящих исследованиях: МкА клона 4ЕЗ специфичные к- цепям, МкА клона 7В9, специфичные Х- цепям, МкА клона 6С5 распознающие класс- специфический эпитоп ^О, МкА клонов 2И1 и 4Н12, направленные к топографически удаленным эпитопам у1- цепи, МкА клона №4 специфичные ц - цепям и МкА клона 9Е7 к э^А свиньи.

Для проведения ИФА в лунки микропанелей вносили очищенный препарат ВТГС в предварительно подобранной концентрации я инкубировали в течение 18 ч при +4 С. Последовательные разведения испытуемых сывороток молозива или молока (предварительно обработанных хлороформом для удаления липопротеинов) вносили в лунки сенсибилизированных микропанелей по 100 мкл и инкубировали 2 часа при +37 С. После отмывки добавляли в лунки по 100 мкл рабочего разведения конъюгированных МкА и инкубировали в течение 1,5 час. при +37 С. Титр антител в исследуемых препаратах оценивали как конечное разведение, превышающее ОО 492 отрицательного контроля (сыворотка свиньи не содержащая антител к ВТГС) в 2,1 раза.

Результаты опытов по распределению специфических антител в гуморальном иммунном ответе приведены в таблице 5.

Таблица 5. Определение титра антител к ВТГС в секретах молочных желез свиноматок методом непрямого твердофазного ИФА

Группа, животных Секреты ^Ч(к) ДО ДО1

опыт (п=30) молозиво 13,5 ±0,7 10,1 ±0,9 14,1 ± 1,0 - 8,1 ± 1,0. 9,3 ± 0,8

молоко 11,9 ±1,1 9,6 ±1,1 10,5 ± 1,2 - 6,9 ±1,3 8,1 ± 1,3

контроль (п=30) молозиво 10,9 ±0,5 7,3 ± 0,4 9,6 ± 0,8 - - -

молоко 8,07 ±0,2 - 6,8 ±0,3 - - -

Примечание г титры антител выражены в 1о$*2 и приведены как М ± м значений; - ( к ),и ( X )- пул специфических иммуноглобулинов свиньи, в состав которых входят легкие цепи одного из 2 типов (к- или Х- соответственно); прочерк означает, что титр антител данного изотипа (или пула ^'э) в среднем по группе < 1:100, т.е. значения 6,64 ^2.

Роль и его субизотипов « иммунном ответе к ВТГС

Проведенные Нами исследования позволили сделать вывод о том, что антитела изотипа представляют основной класс иммуноглобулинов, участвующих в формировании гуморального иммунного ответа к ВТГС. Преобладание изотип- специфических антител в молозиве" и молоке животных опытной группы отражает доминирование общего количества ДО в секретах молочных желез свиноматок. При этом титр антител изогипа у Животных опытной группы превышает таковой у контрольных'¿вийШаТок на 4,5 1о%2в.молозиве и* на 3,6 ^2 в молоке, концентрация при этом возрастает на 22,5% и 70,6% соответственно.

-*. В ; последние годы немногочисленные Исследования в области изучения гуморалыгого иммунного ответа при некоторых вирусных инфекциях у свиней (в т.ч. и при ТГС) проводились с использовакием реагентов, специфичных к ДО, независимо от их субизотипической принадлежности. При этом вопросы, связанные с определением роли субизотипов ¡ёй в формировании иммунного ответа и экспрессией субизотипических

эпитопов на молекулах, не рассматривались. Поэтому основной задачей данного раздела наших исследований была разработка высокоспецифичных тест- систем на основе полученных МкА для количественной оценки уровня и в секретах молочных желез свиноматок и определение роли антител данного субизотипа в местном иммунном ответе.

Количественное определение уровня ^01 проводили в «сэндвич»- ИФА с использованием МкА, выявляющих два структурно различающихся и топографически удаленных эпитопа у1- цепей ^01 свиньи. Для адекватной оценки содержания и процентного соотношения уровня и использован «сэндвич» ИФА по количественному определению общего ^й на основе МкА 6С5 и моноспецифической антисыворотки к свиньи.

Согласно классическому положению в иммунологии, человека и животных представляет собой совокупность молекул нескольких подклассов (субизотипов), различающихся по антигенной структуре, спектру биологических функций, роли в формировании защитных иммунных реакций и в иммунопатологических процессах. У человека нумерация субизотипов отражает их концентрацию в сыворотке, т.е. в количественном отношения !а<32 > Соответствующие тяжелые цепи у1,

у2, уЗ, у4 являются продуктами разных генов тяжелых цепей и различаются как по аминокислотной последовательности, так и по антигенным свойствам. Вместе с тем, структура у- цепей всех субизотипов характеризуется значительной гомологией (до 95%) в соответствующих доменах. У многих видов животных наблюдается аналогичная закономерность в количественном преобладании ^01 по отношению к остальным подклассам например, у жвачных, с которыми свиньи таксономически отнесены в одну группу.

Результаты наших исследований пб определению общего количества 1$01 (табл.6) показали, что в отличие от крупного рогатого скота и овец, у свинеи 1§и1 не является основным субизотипом ^О, экспрессируемьш в молоке и молозиве испйтуемых свиноматок. Более того, нами установлено, что данный субизотип не участвует в иммунном ответе слизистых к ВТТС. Так, при достоверном увеличении общего уровня ^О и вирус-специфических Г^О- антител в секретах иммунных свиноматок, концентрация 1^01 и уровень ВТГС- специфических антител ^01- субизотипа остаются практически неизменными как в молозиве, так и в молоке опытной и контрольной групп'(р>йс.'5).

Поскольку МкА 6С5 выявляют изотопический эпитоп (^01 + 1§Й2), можно сделать вывод о том, что уменьшение доли в общем пуле вирусспецифических 1§0

Таблица 6. Уровень IgG и IgGl в секретах молочных желез свиноматок

Группа Секреты .......-IgG* IgGl* % IgGl от

животных (мг/мл) (мг/мл) общего IgG

опыт молозиво 38,1 10,8 30,1

(п=20) молоко 8,6 1,5 17,5

контроль молозиво 30,5 10,1 33,4

(п=20) молоко 4,3 - 1,5 33,3

Примечание: * - цриведены средние геометрические значения величин, установленных в «сэндвич» ЙФА.

антител происходит за счет прироста ВТГС- аН-Гител IgG2- субиЗотипа, который, и является доминирующим подклассом IgG, участвующим в гуморальном* иммунном ответе свиноматок и в последующем в формировании лактогенноГо иммунитета против ВТГС у новорожденных поросят. Эти результаты-полностью' совпадают с пионерскими исследованиями J.Cuttis and FJ.Boume (1971), которые, используя-поликлональные антисыворотки, предположили, что основным подклассом IgG в секретах молочных желез свиноматок является IgG2.

Классификация субизотипов IgG свиньи, составленная J.Butler (1996) на основе собственных исследований по секвенированию Су генов, оставляет вероятность того, что возможно и другие субизотипы IgG свиньи принимают участие в иммунном ответе, но в настоящее время они не идентифицированы иммунохимически, их физико-химические свойства остаются неизученными и антитела к ним не получены.

Значение slgA и IgM в иммунном ответе к ВТГС

Количественная оценка и определение уровня специфических slgA- и IgM- антител в секретах слизистых и изучение их роли в местном иммунном ответе представляет значительный интерес в клинической иммунологии животных и человека. Считается, что у свиней основным изотипом иммуноглобулинов в секретах молочных желез в первые 48 часов после опороса является IgG, а, начиная с 3-х суток после начала и до конца лактационного периода, антитела IgA- изотипа являются доминирующими в молоке свиноматок.

Результаты наших исследований показали, что двукратная вакцинация ассоциированной вакциной ведет к достоверному повышению как вирус- специфических антител, так и общего уровня slgA и IgM в секретах молочных желез свиноматок. Так, концентрация slgA

возрастает на 63,5% в молозиве и более чем в 2 раза в молоке иммунных животных. Уровень IgM у животных опытной группы превышает таковой у контрольных животных на 15,8% в молозиве и на 100% в молоке. Титры slgA- и IgM-антител к ВТГС увеличиваются на 2-3 log2 в секретах животных опытной группы в сравнении с аналогичными показателями у контрольных свиноматок. ' -

Несмотря на то, что титр вирус- специфических IgA- антител в молоке не превышает уровень IgG2- антител, наши данные вполне объяснимы при сопоставлении с результатами исследований других авторов (E.R.Henning, P.C.Thomas, 1981; P.Matisheck et al., 1982;

GL.Waxler, 1992; T.G.Kimman et al., 1992 и др.), которые показали, что йнактивированные

вирусы, введенные внутримышечно, индуцируют синтез IgM-, IgGl-, IgG2- антител в сыворотке крови и вызывают слабый иммунный ответ IgM-антител в секретах слизистых. Только при заражении свиней per os или интрацистернально вирулентным штаммом ВТГС основным изотипом антител в молозиве и молоке является slgA. Ассоциированная вакцина, используемая в нашем опыте, содержит живой вирус ТГС и то, 4TO.IgG2- антитела доминируют в местном иммунном ответе, объясняется прежде всего способом ее введения (внутримышечно) при котором, очевидно, не весь вирус адсорбируется на поверхности эпителиальных клеток и происходит нарушение его репликации. Как показали многочисленные исследования, именно репликацией ВТГС в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудочно- кишечного тракта и объясняется синтез антител преимущественно IgA- изотипа. Вместе с тем, в наших экспериментах уровень ВТГС-специфических антител в секретах молочных желез животных опытной группы, обусловленный применением ассоциированной вакцины, оказался достаточным для формирования активного иммунитета у свиноматок и лактогенного иммунитета у новорожденных поросят. Это заключение было подтверждено сравнительными результатами сохранности поросят, полученных от свиноматок опытной и контрольной групп, после экспериментального заражения. При 26,6% сохранности поросят контрольной группы, сохранность поросят, полученных от иммунных свиноматок, достигала 78%. Возможно, что несмотря на преобладание вирусспецифических IgG2- антител в секретах, именно IgA- плазматические клетки, быстро появляющиеся в lamina propria желудочно- кишечного тракта и лимфатических узлах брыжейки после экспериментального заражения ВТГС, могут играть главную роль в защите зараженных поросят.

п.

Рис. 5. Результаты титрования сывороток молозива (I) и молока (II) контролыюй (А) и

иммунной (В) свиноматки. Цифрами обозначены: (1)- ^в-антитела, (2)- ^01- антитела; (3)- антитела, содержащие к-цепи; (4)- антитела, содержащие Х- цепи. По оси абсцисс- разведения сывороток, по оси ординат- 00 492. Представленные кривые титрования отражают аффинность данного пула антител и являются характерными для всех животных исследуемых групп.

Распределение /£'х (к) и (X) в иммунном ответе кВТГС Легкие цепи иммуноглобулинов представляют интерес как субъединицы, участвующие в формировании и поддержании структуры антигенсвязывающих центров молекул антител. Известно, что наряду с пятью типами тяжелых цепей, определяющих класс иммуноглобулина, существует два типа легких цепей к- и Х- . Каждая молекула ^ содержит в своем составе пару идентичных легких цепей только одного типа (к или X), но никогда двух вместе. Соотношение молекул иммуноглобулинов содержащих к- или X-легкие цепи, зависит от вида млекопитающих. У человека отношение к: X равно 70:30, у

мышей-1:20, у лошади-1:25, усобак- 1 -.9 по мнению одних арторов, другие же считают, что все легкие цепи Ig's собак являются X . Распределение иммуноглобулинов, содержащих тот или другой тип легких цепей свиньи, до настоящего времени практически не установлено."

Анализ проведенных нами опытов по изучению распределения Ig's (к) и Ig's (X) в иммунном ответе к ВТГС позволяет заключить следующее.

Иммуноглобулины, имеющие в своем составе как к-так и Х- цепи, участвуют в формировании гуморального иммунного ответа к ВТГС, что выражается в достоверном увеличении титра специфических Ig's (к)- и Ig's (X)- антител в секретах молочных желез иммунных свиноматок по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (рис.5). Вместе с тем следует отметить, что пул Ig's (X)- антител в молозиве характеризуется более низким аффинитетом по отношению к ВТГС и, вероятно, играет менее значимую роль в местном иммунитете при данном заболевании. Соотношение к: X цепей при этом

составило 57:43; 55:45 в молозиве и молоке опытных и 60:40; 57:43 в молозиве и молоке

^> ■

контрольных свиноматок.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

СЫВОРОТКИ КРОВИ СОБАК ПРИ ДЕМОДЕКОЗЕ И ДЕРМАТИТАХ

Иммуноглобулины собак являются одними из наименее изученных по сравнению с Ig других видов домашних животных и человека Анализ литературных данных свидетельствует о недостаточной изученности количественной характеристики иммуноглобулинов отдельных классов и их роли при некоторых патологических состояниях и в патогенезе паразитарных болезней у собак. Это относится прежде всего к демодекозу-внутрикожной паразитарной инвазии, вызываемой клещами Demodex canis. Патогенез данной болезни не полностью, ясен, однако. явная предрасположенность некоторых пород к генерализованному демодекозу, условно-патогенный характер D. canis и связь между заболеванием и ослабляющими здоровье факторами, такими как кишечный паразитизм, течка, появление щенков, эндокринные нарушения, ппококортикотерапия и химиотерапия предполагают сочетание наследственной предрасположенности (за счет врожденного дефекта Т-клеток) и подавления иммунитета. Присутствие большого числа клещей способствует дополнительному снижению функции Т-клеток посредством образования сывороточного фактора супрессии, находящегося в (J-глобулиновой фракции сыворотки крови, приводящего к генерализованному иммунодефициту.

Гуморальные факторы иммунитета при этом заболевании во многом остаются неизученными и долгое время считалось, что они не играют какой-либо роли в иммуногенезе.

Целью данного раздела нашей работы была количественная оценка уровня ^М и ^А в сыворотке крови собак при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных.

Исследования были проведены совместно с к.б.н. А.А.Лисициной (МГАВМиБ).

В работе использованы сыворотки крови, полученные от клинически здоровых собак (п=12), от собак с дерматитами неинфекционной и непаразитарной этиологии (п=15), собак с локализованной (п=8) и генерализованной (п=12) формами демодекоза. Диагноз был подтвержден в ветеринарной клинике г.Москвы по обнаружению возбудителя а содержимом демодекозных очагов при микроскопировании и наличия клинических признаков заболевания. При проведении исследований все животные были разделены на четыре группы и две возрастные подгруппы: до 1 года (щенки) и старше 1 года (взрослые).

Перед проведением опытов по количественному определению уровня ^М, ^А, все сыворотки крови были исследованы на содержание общего белка, альбуминов и глобулинов, кроме того был проведен их элекгрофоретический анализ.

Анализ полученных результатов позволил заключить следующие. Генерализованный демодекоз собак сопровождается гиперпротеинемией (80,55 мг/мл- в среднем по группе; 65,02 мг/мл- содержание общего белка в сыворотке крови здоровых собак; 53-73мг/мл- нормы по этому показателю, приведенные в работах зарубежных авторов) и гиперглобулинемией (51,04; 35,14; 19-39 мг/мл соответственно). Гиперглобулинемия объясняется значительным увеличением количества р- и у- глобулинов. Так, содержание у- глобулинов у взрослых здоровых собак равно 8,8 мг/мл, в то время как у аналогичных животных 4 группы этот показатель составляет 16,5 мг/мл, что связано прежде всего со значительным повышением уровня . Статистически достоверное увеличение (З-глобулиновой фракции (13,5 и 20,8 мг/мл соответственно) также свидетельствует о том, что наши исследования подтверждают данные зарубежных авторов о наличии фактора супрессии, локализованного именно в этой фракции.

У собак с локализованной формой демодекоза и с дерматитами неинфекционной и непаразитарной этиологии также наблюдается увеличение содержания общего белка и

глобулинов за счет увеличения количества р- и у- глобулинов и повышения количества 1§0. Общее количество альбуминов в сыворотке крови '!-всех исследуемых живбтных практически не изменялось (29,31; 28,41; 29,75; 28,7 мг/мл'в среднем по группам), что' закономерно вело к снижению коэффициента соотношения альбумин/глобулин (0,8; 0,74; 0,53-у исследуемых; 0,9- у контрольных собак; 0;5'1 >6- литературные данные).

Результаты по количественному определению - уровня иммуноглобулинов в сыворотках крови клинически здоровых собак (1 группа),! животных 'с алиментарными дерматитами (2 группа), локализованной (3 группа) и генерализованной (4 группа) формами демодекоза приведены в таблице 7. , .•••, л ■• .»•>,......... .„:•* >• • .>:•

Таблица 7. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови собак

Группы животных Концентрация иммуноглобулинов (мг/мл)

ДО

1 щенки (п=5) 6.50 ± 1.16 2.94 ±0.25 0.42 ± 0.06

взрослые (п=7) 11.92 ±1.82 2.50 ±0.17 0.77 ±0.10

2 щенки (п=5) 11.95 ± 1.13* 1.74 ±0.15 0.34 ± 0.05

взрослые (п=10) 13.80 ±1.56 2.23 + 0.42 0.45 ±0.07*

3 щенки (п=4) 10.51 ±1.35 2.97 ±0.28 0.39 ± 0.07

взрослые (в-4) 16.96 ±1.23* 2.76 ±0.20 0.54 ±0.08*

4 щенки (п=3) 12.36 ±0.95 2.48 ±0.12 0.37 ± 0.06

взрослые (п=9) 19.59 ±2.10* 2.68 ±0.43 0.51 ±0.06*

Примечание: концентрация иммуноглобулинов приведена как М ± т значений;

*- статистическая достоверность различий по отношению к' ' контрольной группе, Р < 0,05.

Анализ полученных нами данных показал, что содержание ^М и ^А в сыворотке крови клинически здоровых взрослых собак составляет 11.92 ± 1.82, 2.50 ± 0.17 и 0.77 ± 0.10 мг/мл соответственно, при этом, концентрация и ^А в сыворотке крови щенков увеличивается с возрастом животных, в то время как концентрация ГцМ снижается.

Сопоставление наших результатов по возрастным изменениям содержания у здоровых животных с литературными данными показало, что общая тенденция возрастных изменений концентрации иммуноглобулинов у собак согласуется с результатами других авторов (И.М.ЗсЬугапгтап, 1984; Е.1.На11 ег а1., 1992 и др.), а результаты по количественному содержанию иммуноглобулинов в сыворотке крови клинически здоровых собак могут служить критерием для объективной оценки состояния животных-

Хорошо известно, что концентрация иммуноглобулинов отражает реакцию периферических лимфоидных органов на антигенный раздражитель, позволяет судить о функциональном состоянии иммунной системы, раскрыть их роль в гуморальном иммунитете и определить значение в патогенезе инфекционных и инвазионньк бЬлезней.

Проведенный анализ наших результатов и сопоставление их с имеющимися на сегодняшний день литературными данными, показал, что IgA и играют значительную роль в иммуногенезе при паразитарных и атопических болезнях у собак. Установлено, что концентрация 1^3 в сыворотке крови больных собак увеличивается, а уровень 1£А уменьшается в зависимости от степени кожных поражений у животных. При этом, статистически достоверное снижение уровня ^А зарегистрировано в сыворотке крови взрослых собак всех трех исследуемых групп. В сыворотке крови щенков, несмотря на отсутствие статистически достоверных различий, наблюдается выраженная тенденция снижения уровня иммуноглобулинов этого класса в сыворотке крови больных животных по отношению к здоровым. В сравнении с контрольными животными концентрация ^О достоверно увеличивается у больных демодекозом взрослых собак и щенков с дерматитами неинфекционной и непаразитарной этиологии. В сыворотке крови животных всех остальных исследуемых групп также наблюдали выраженную тенденцию повышения уровня ^О в сравнении с контрольными.

Таким образом, полученные нами и другими исследователями (КХ.СатрЬеН й а1., 1991, 1992; М.БсЫшП; е1 а1„ 1994; Р.В.НШ е1 а1., 1995) данные свидетельствуют о том, что при патологии собак, ассоциированной с различными формами демодекоза или дерматитами неинфекционной и непаразитарной этиологии, происходит нарушение иммуно-

регуляторных механизмов организма животных, что приводит к развитию селективной иммуносупрессии, обуславливающей низкий уровень 1§А в сыворотке крови. В то же время, повышение концентрации напрямую связано с гуморальным иммунным ответом организма на воздействие антигенов клеща (при демодекбзе), аллергенов (при дерматитах) и сопутствующей вторичной (прежде всего стафилококковой) микрофлоры.

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛЙЗЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА ПЛОТОЯДНЫХ Й АНАЛИЗ СООТНОШЕНИЯ ТИТР ВИРУСАЯИТР СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ СПОНТАННО ИНФИЦИРОВАННЫХ СОБАК

Одно из фундаментальных характеристик гуморального иммунного ответа-способность антител взаимодействовать с чужеродным антигеном, широко используется для развития и совершенствования двух основных направлений современной лабораторной диагностики. Во- первых, специфические антитела могут быть использованы для детекции или идентификации антигена. Во- вторых, выявление специфических антител в сыворотке дает возможность установить было ли животное инфицировано соответствующим антигеном. Это является серьезным аргументом для подтверждения диагноза или определения степени инфицирования популяции.

Заключительный раздел нашей работы посвящен получению, характеристике и использованию поли- и моноклональных антител в качестве иммунодиагностических реагентов для разработки и эффективного применения методов иммуноферментного анализа для детекции основных структурных белков аденовируса собак 1 серотипа (САУ-1) и диагностики инфекционного гепатита плотоядных (ИГП).

Исследования выполнены совместно с к.б.н. Л.В.Верховской (ВНИИСБ), к.в.н. Е.Д.Захаровой и д.в.н. В.И.Уласовым (ВГНКИ).

Основные структурные белки аденовирусного капсида- гексон, пентон и отросток организованы однотипно у всех представителей семейства и содержат набор антигенных детерминант широкой специфичности. Для всех аденовирусов характерны выраженная продукция главного структурного белка вирусного капсида- гексона в процессе инфекции и преобладание синтеза антител к гексону в иммунном ответе. Поэтому основные способы диагностики аденовирусных инфекций направлены на идентификацию гексона соответствующих серотипов аденовирусов или антител к гексону. В лабораторной диагностике

инфекционного гепатита плотоядных применяют гистологические исследования, выделение вируса в культуре клеток, а также серологические реакции, основанные на обнаружении преципитирующих, агглютинирующих, комплементсвязывающих и вирус-нейтрализующих антител. В современных диагностических исследованиях эти методы вытесняются различными вариантами ИФА.

Йаши исследования в этом направлении включали следующие этапы: получение высокоочищенных антигенных препаратов, разработка непрямого варианта ИФА для выявления антител к гексону аденовируса собак 1 серотипа и сравнительная оценка тест- системы в сравнении с существующими серологическими методами; получение и иммунохимическая характеристика моноклональных антител к структурным белкам САУ-1; разработка «сэндвич»- ИФА на основе полученных поли- и моноклональных антител для выявления гексона САУ-1. При этом мы предполагали, что одновременный иммуноанализ на гексон и антитела к гексону может служить не только в качестве, основного средства диагностики инфекционного гепатита плотоядных, но и для определения и анализа соотношения титр вируса/титр специфических антител, т.е. для изучения иммуногенеза при данном заболевании и взаимосвязи в цепи вирус- гуморальный иммунный ответ.

Для детекции поли- и моноклональных антител к САУ-1 был разработан метод непрямого твердофазного ИФА, подобрана оптимальная концентрация высокоочищенного гексойа САУ-1 (2 мкг/мл) и определены1' рабочие разведения антивидовых иммунопёроксидазных конъюгатов (1:8000- 1:15000). Для характеристики предложенной тест-системы, были исследованы сыворотки крови от экспериментально зараженных и спонтанно инфицированных собак. Параллельно исследовали эти же сыворотки в традиционных серологических тестах. При сравнении результатов исследований сывороток от экспериментально зараженных собак отмечено, что специфические антитела выявлялись на 7 день после заражения в непрямом твердофазном ИФА и на 11-14 день в РТГА, РДП и РСК. Динамика и высокие тигры антител подтвердили чувствительность предложенной системы. •

Вторым этапом данного раздела нашей работы было получение и иммунохимическая характеристика моноклональных антител к структурным белкам СА\М. Для этого, мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали препаратом, содержащим гексон и отросток пентона и через 3 дня после последней инъекции антигена проводили гибридизацию лимфоцитов периферических лимфатических узлов с клетками миеломы линии P3x62-Ag8.653. В результате проведенных опытов были получены 6 гибридом-

продуцентов МкА, активность и специфичность полученных моноклональных антител приведены в таблице 8.

Таблица 8. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к . гекссну и отростку пентона аденовируса собак 1 серотипа

Код Изотоп Специфичность МкА в ИБ Тито МкА пои использовании

клона гексон САУ-1 отоосток пентона различных методов

мыши МП ТФ МП ' НФ ИФА* РДП РТГА РН

4В6.С8 - + - 1:10000 + - 1:32

4В6.Е1 \gG2si - + - - 1:10000 - 1:2 1:32

305 ■у -о. 4- - - 1:10000 + 1:8 1:32

4Е1 1ЙИ - - + 1:1000 1:2 1:64 1:256

1В7 1ё(31 - - - + 1:1000 1:2 1:32 1:128

4Р12 ДО! - + + 1:1000 1:4 1:16 1:64

Примечание: * - титр антител в ИФА определяли как их последнее разведение, ^ дающее 00492 > ОД ,<--.-: •,-.„•

>.-.-. МП- мономерный полипептид, ТФ- тримерная форма гексона, НФ- нативная форма отростка пентона. '"'■" ' " ■'■■''■ •

■ : Результаты анализа свидетельствуют о том, что МкА клонов 4В6.С8, 4В6.Е11, 305 специфически взаимодействуют только с конформационными эпитопамн гексона САУ-1, что согласуется с данными других авторов (С.Н.Хилько с соавт., 1989, 1990; В.Р.Исакова, 1990; Л.В.Верховская, 1992; Е.Ас1ат е1 а1., 1987, 1996 и др.), показавших однозначную корреляцию между сохранностью четвертичной структуры гексона и его антигенной активностью. Кроме того, полученные нами данные подтвердили предположение о том, что в отличие от гексона, в состав отростка пентона входят как ¡информационные, так и линейные эпитопы.

Для выявления гексона САУ-1 нами разработан четырехслойный «сэндвич»- ИФА с использованием поли- (ПкА)- и моноклональных антител. Были испытаны различные комбинации МкА и ПкА как в качестве фиксирующих, так и в качестве детектирующих антител. В данной работе мы остановились на следующем варианте: МкА 4В6.С8 использовали для фиксации антигена на твердой фазе, а детектирующим реагентом служили ПкА. Рабочее разведение антител для «сэндвич»- ИФА подбирали

предварительным титрованием с использованием препарата очищенного гексона САУ-1. Микропанели сенсибилизировали МкА 4В6.С8 в концентрации 50 мкг/мл, в качестве детектирующих антител брали ПкА в разведении 1:1000. Для детекции использовали очищенный препарат гексона, вируссодержащую культуральную жидкость и экстракт печени собаки, павшей с клиническими признаками ИГП. По результатам титрования установлено, что минимальная концентрация гексона САУ-1, детектируемая в такой системе, составляет 20-30 нг/мл.

В, разработанной нами тест- системе были исследованы образцы вируссодержащих культуральных жидкостей пяти штаммов аденовирусов собак {три-серотипа САу-1 и два-серотипа САУ-2), распространенных в России и имеющихся в коллекции ВГНКИ.

Анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод о возможности выявления в «сэндвич))- ИФА гексона аденовирусов собак 1 и 2 серотипов, но с определенными ограничениями для САУ-2. В образцах вируссодержащей культуральной жидкости штаммов Ада и Корнелл (серотип САУ-2) антиген детектируется в разведениях до 1:800 с более низким 01)492, в то время как антиген, содержащийся в образцах культуральных жидкостей штаммов серотипа СА\М, выявляется в разведении 1:6400. Эти результаты полностью отражают данные по определению титра антител в гаперйммунных к САУ-1 и к САУ-2 кроличьих сыворотках в непрямом ИФА с использованием высокоочшценного гексона САУ-1 в качестве антигена.

Для проведения первого этапа исследований по определению возможности выявления гексона САУ-1 в предложенной тест- системе, было проведено экспериментальное заражение собак одним из штаммов САУ-1. Для этого вирус с активностью! О4,3 ТЦД$о /мл ввели внутрибрюшинно 4 щенкам в возрасте 2-4 месяцев в дозе 4 мл. На 4-5 сутки у зараженных собак развилось заболевание с клиническими признаками, характерными для ИГП. На 7, 10, 14 и 21 сутки после заражения у собак были взяты мазки из глотки, выделения из глаз и кал. Серологические тесты (РДП, РГА), направленные на выявление антигена в исследуемых образцах, не дали положительных результатов. Проведенные нами исследования с использованием «сэндвич»-ИФА показали, что вирус выявляется в мазках из глотки на 7 и 10 дни после заражения в разведениях 1:8-1:128. В выделениях из глаз и в кале вирус вьмвлялся во всех пробах, взятых на 7, 10, 14,21 сутки после заражения в разведениях 1:8- 1:64 и 1:64-1:128 соответственно. Причем 00492 был максимально высоким при исследовании всех образцов кала.

Заключительным этапом исследований было определение титров САУ-1 и антител к гексону САУ- в сыворотках спонтанно инфицированных собак. По нашему мнению, одновременное выявление вируса и антител к нему позволяет наиболее полно охарактеризовать гуморальные факторы иммуногенеза и установить форму течения болезни. В опыт были взяты пробы сыворотки крови от 40 собак спонтанно инфицированных САУ-1, 5 сывороток крови от клинически здоровых взрослых собак, вакцинированных в соответствующие сроки коммерческими вакцинами против ИГП и 5 сывороток крови щенков не подвергавшихся вакцинации. Все материалы были получены из ветеринарной клиники от собак с установленным предварительным диагнозом по результатам клинического наблюдения и осмотра. Все пробы сывороток крови были исследованы на наличие антигена и специфических антител в «сэндвич»- и непрямом ИФА, а также в традиционных серологических тестах. Диагностическая эффективность всех методов приведена в таблице 9.

Таблица 9. Сравнительные результаты исследований сывороток крови спонтанно инфицированных собак

Идентификация вируса ИФА РДП РГА Детекция специфических антител ИФА РДП РТГА

Всего исследованных проб 40 40 40 40 40 40

Из них положительных 33 4 4 37 23 26

% положительных 82,5 10 10 92,5 57,2. 64,3

Из данных таблицы видно, что «сэндвич»- и непрямой ИФА обладают более высокой чувствительностью чем традиционные серологические тесты. Во всех случаях результаты ИФА совпадали с результатами двух других реакций, как и результаты РДП и РГА при выявлении вируса. Результаты РТГА и РДП в ряде случаев несовпадали, что связано со сроками появления и циркуляции в крови агглютинирующих и преципитирующих антител. Не менее важной характеристикой иммуноферментных методов является их специфичность, подтвержденная отсутствием реакции в отрицательных контролях

(сыворотки клинически здоровых животных, гетерологичные антигены или сыворотки) и отсутствием неспецифического связывания между всеми компонентами систем. В 95% случаев наблюдалась выраженная корреляция в результатах, полученных с помощью всех методов иммуноанализа. <

Анализ полученных результатов и сопоставление их с анамнестическими данными 1 позволил распределить всех исследованных собак на пять групп (рис.6).

Рис. 6. Соотношение титра СА\М с

титром антител к нему в сыворотках крови исследуемых собак. Приведены средние геометрические значения величин.

В первую группу (А) отнесены клинически здоровые собаки, в сыворотках крови которых не выявлен аденовирус. При этом, титр специфических антител составил 1:6400 в среднем по группе (от - до 1:400 у щенков не подвергавшихся иммунизации и 6400- 12800 у взрослых собак).

Вторая группа (В) состояла из 11 животных, которые согласно анамнезу болели 2- 5 дней. Инфекционный процесс у этих собак (подгруппы В1, ВЗ) характеризовался высокой концентрацией САУ-1 в сыворотке крови (1:400- 1:1600), сопоставимой с титрами специфических антител (1:1600- 1:6400). У 4-х собак (подгруппа В2) титр СА\М (1:16001:12800) превышал титр антител к нему (1:200- 1:800), что может быть связано с тем, что специфические антитела активно расходовались на нейтрализацию вируса. Помимо этого, низкий уровень 1§0 может быть связан с преимущественным синтезом ^М, если предположить, что для животных этой группы характерны острая или подострая формы заболевания.

В исследованиях, проведенных Л.Ф.Меринговой и др. (1997) по оценке системного гуморального иммунного ответа при первичной и вторичной экспериментальной гриппозной инфекции, было отмечено трехкратное снижение содержания циркулирующих вирусспецифических ДО-антител к 4-му дню и восстановление их количества к 7-му дню реинфёкции до их уровня в отдаленные сроки первичного инфекционного процесса, Это в значительной степени согласуется с нашими результатами, приведенными по группе С.

Животные этой группы (п=10) характеризуются значительным приростом специфических антител, циркулирующих в крови (1:12800- >■ 1:25600), на фоне постепенного снижения концентрации вируса (1:800- 1:200). Это процесс неразрывно связан, с усиленной антителопродукцией клонами вирусспецифических антитело- секретируюшмх клеток и является продуктивной фазой логарифмического прироста антител.

Сыворотка крови собак группы Б (п=12) характеризуется низким содержанием вируса (титр 1:10-1:100) и максимально высоким, по сравнению с группами А, В, С, титром вирусспецифических антител (> 1:25600). :..-.-.

И наконец, к последней группе (Е) относятся, видимо, недавно, переболевшие животные (п=7) в сыворотке крови которых вирус идентифицирован не был, но уровень антител был аналогичный таковому у собак группы О (т.е. выше на 4 1о£2 по сравнению с клинически здорЬвыми животными). Таким образом, титры сывороточных антител к САУ-1 у собак в группах О и Е отражают фазу стабилизации (период максимума) иммунного ответа.

Продемонстрированный нами комплексны^,, подход к диагностике ИГП, направленный на одновременную детекцию вируса и ,антител, к нему, позволяет выявлять инфицированных животных на ранней стадии болезни, прогнозировать ее течение, определить стратегию терапии и целесообразность применения специфических глобулинов или сывороток для лечения индивидуального животного.

ВЫВОДЫ

1. Унифицированы методы выделения и очистки различных изотопов иммуноглобулинов животных и их структурных субъединиц. Получены и охарактеризованы иммунохимически чистые препараты , ^02, ^М и э^А свиней и собак, у1- цепи свиньи, Р(аЬ)г- и Рс- фрагменты мыши.

2. Получено 22 гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к иммуноглобулинам и легким цепям ^ свиньи. Разноплановыми иммунохимическими

методами определена аффинность, специфичность и перекрестная реактивность полученных МкА. Установлено, что охарактеризованная панель моноклональных антител позволяет распознавать изотип- специфические эпитопы, локализованные на молекулах всех субизотипов, субизотипические эпитопы у1-цепей эпитопы специфичные для ^М, з1§А, к- и Х- легких цепей ^ свиньи.

3. Проведен анализ специфичности и перекрестной реактивности моноклональных антител 1^(3, ^М и Й^А крупного рогатого скота и к ^М человека. С помощью панели охарактеризованных МкА изучены общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и Человека Показана принципиальная возможность использования МкА к межвидовым эпитопам для разработки разноплановых иммунохкмических методов для выявления специфических антител и/или количественного определения уровня 1% в биологических жидкостях нескольких видов животных и человека.

4. С помощью иммуноблотпшга установлена локализация и структура эпитопов нативных молекул иммуноглобулинов и их субъединиц (тяжелых и легких цепей), с которыми специфически взаимодействуют МкА. На основе моноклональных антител синтезированы иммунопероксидазные конъюгаты, высокоаффинные МкА использованы для разработки разноплановых тест-систем.

5. Получены и охарактеризованы моноспецифическяе ангисыворотки к ДО свиньи и собак и моноспецифическая антисыворотка к IgA собак. Предложены тест-системы на основе РИД для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов данных изотипов в биологических жидкостях организма животных.

6. Получено шесть гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к основным структурным белкам аденовируса собак 1 серогапа. С использованием иммуноблотпшга, ИФА, РДП, РТГА и РН определена специфичность и активность полученных МкА. С помощью моноклональных антител идентифицированы и охарактеризованы конформационные эпитопы гексона и конформационные и линейный эпитопы отростка пептона САУ-1.

7. На основе моноклональных антител для анализа гуморального иммунного ответа разработаны следующие тест- системы:

• РИД для количественного определения уровня ^М в биологических жидкостях организма свиней и собак (на основе МкА 1Р4);

• РИД для количественного определения уровня в секретах свиней (на основе МкА 9Е7);

• «Сэндвич»- ИФА для количественного определения уровня ДО и ДО1 в биологических жидкостях организма свиней (на основе МкА 6С5,2Р1,4Н12);

• Непрямой ИФА по выявлению изотип/субизотип- специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в секретах молочных желез свиноматок (на основе МкА 6С5,4Н12, 1Р4, 9Е7,4ЕЗ, 7В9, меченых пероксидазой);

• Конкурентный.ИФА для эпитопного картирования у1- цепей !д свиньи (на основе И МкА меченых пероксидазой);

• «Сэндвич»- ИФА для детекции гексона аденовируса собак 1 серотипа и диагностики инфекционного гепатита плотоядный (на основе МкА 4В6-С8).

8. Проведены исследования по изучению антигенной структуры у1- цепи свиньи и индивидуальных свойств формирующих ее эпитопов. Определена эпитопная карта антигенного участка у1- цепи, в состав которого входят 7, различных по своим свойствам, эпитопов. По результатам эпитопного картирования отобраны МкА к топографически удаленным эпитопам у1- цепи и на их основе разработан «сэндвич»- ИФА для выявления и количественного определения уровня ^в! в биологических жидкостях организма свиньи.

9. Проведен анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в секретах молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации ассоциированной'вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибакгериоза, а также изучена их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных поросят. Установлено, что двукратная вакцинация ассоциированной вакциной ведет к достоверному повышению в , секретах молочных желез свиноматок как вирус-специфических антител, так и общего уровня sIgA и IgM. Показано, что основным суб-изотипом ^С} в молоке и молозиве свиноматок является ]ДО2. < •

10. Впервые изучена роль антител, содержащих различные типы легких цепей, в формировании, иммунитета слизистых при трансмиссивном гастроэнтерите свиией. Установлено, что ведущая роль в гуморальном иммунном ответе к ВТГС принадлежит вькокоаффннным антителам.: имеющим в своем составе к - цепи. При этом, соотношение с: X цепей в молозиве и мйлоке ''вакцинированных животных составило 57:43, 55:45, а в молозиве и молоке контрольных свиноматок 60:40, 57:43 соответственно. - !

11. Определено Содержание ДО, ^М и ^А в сыворотке крови клинически здоровых :обак, которое у взрослых животных составляет 11.92 ± 1.82, 2.50 ±0.17 й 0:77 ±0.10 мг/мл

соответственно. При этом установлено, что с возрастом животных происходит увеличение количества и ^А и снижение концентрации ^М. В сыворотке крови щенков уровень иммуноглобулинов данных изотипов соответственно составляет 6.50 ± 1.16, 0.42 ± 0.06 и 2.94 ± 0.25 мг/мл.

12. Проведена количественная оценка уровня ¡¿О, ^М и в сыворотке крови собак при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных. Установлено, что при демодекозе и дерматитах у собак наблюдается снижение уровня сывороточного ^Х и увеличение концентрации При этом у больных демодекозом животных содержание указанных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови зависит от возраста и степени демодекозной инвазии.

13. Предложены методы иммуноанализа («сэндвич»- и непрямой- ИФА), позволяющие осуществлять диагностику инфекционного гепатита плотоядных на основе выявления гексона и антител к нему, а также оценку гуморальных факторов иммуногенеза в постйнфекционный и поствакцинальный периоды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ю.Н. Федоров, С.О.Кадыров, И.Ю.Ездахова, О.А.Верховский и др.- Технологи« ■ получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам животных.- Трудь:

ВИЭВ, т.бб, 1988, с.41-46. ,

2. О.А.Верховский.- Моноклональиые антитела в ветеринарии.- Труды ВИЭВ, т.67 1989, с.11-21.

3. О.А.Верховский.- Иммуноферментный метод тестирования гибридом, продуди рукяцих моноклональиые антитела к ^М свиньи.-Бюлл,ВИЭВ, Вьш.69,1989,с.3-6.

4. Ю.Й.Федоров, О.А.Верховский, Т.А.Феоктистова.- Моноклональнь» антитела - новый путь в иммунодиагностике и иммунопрофилактике инфекционные болезней животных.- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1990,2, с.22-38.

5. Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова, О.А.Верховский.- Моноклональны антитела в ветеринарной иммуннологии,- Тезисы научн. конф., Кишинев, 1990, с.5.

6. О.А.Верховский,- Технология получения и характеристика моноклональны антител к иммуноглобулинам классоввиМсвиньи.- Дисс....канд. биол.наук, М., 1991,160с

7. О.А.Верховский.- Получение моноклональных антител к иммуноглобулинам < и М свиньи.- Тезисы докл. I Съезда Иммунологов России, Новосибирск, 1992, с.77-78.

8. Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова, О.А.Верховский, В.И.Кис,- Иммунна биотехнология в ветеринарии.- Там же, с.494.

9. В.И.Кис, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова, О.А.Верховский,- Латекс-тест дл экспресс индикации иммуноглобулинов.- Мат. научн. конф. ВНИИВиМ, Покров, 1992, с.324

10. Ю.Н.Федоров, ТА.Феокгистова, ОА.Верховский, В.И.Кис.- Монокяональнь антитела как иммунологические реагенты.- Там же, с.340-341.

11. Yu.N.Fedorov, T.A.Feoktistova, O.A.Verkhovsky, V.I.Kis, I.Y.Ezdakova.- Monoclonal antibodies as immunological reagents.- Abstr. of 3 Int.Vet.Immunol. Symposium. In: Vet. Immunol. Immunopathol., 1993, suppl. to vol.35, p.216-217.

12. Ю.Н.Федоров, В.И.Кис, Т.А.Феокгистова, О.А.Верховский.- Экспресс-оценка иммунного статуса новорожденных животных в реакции латекс-агглютинации,- Мат. научно- практ. конф. ВИЭВ, Москва, 1993.

13. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, Т.А.Феоктистова, А.В.Белоусова, И.П.Федорова,-Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgG и slgA крупного рогатого скота.- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1993,6, с.111-116.

•14. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова и др.- Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом "вестерн-блотгинга".- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1993,6, с.135-141.

15. Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова,. О.А.Верховский и др.- Получение и применение моноклональных антител к иммуноглобулинам животных.- Мат. международного, симпозиума "Мол. генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных" С.-Петербург-Пушкин, 1994, с.94-95.

16. О.А.Верховский, ЛВ.Верховская, Е.Д.Захарова и др.- Разработка "сэндвич"-ИФА на основе моноклональных антител для диагностики инфекционного гепатита плотоядных - Там же, с.95-96.

17. О.АДЗерховский, Ю.Н.Федоров, И.П.Федорова.- Выделение и очистка''slgA из бронхо-альвеолярных смьшов свиньи,- Мат. республ. научно- практ. конф, " по животноводству и ветеринарной медицине, Витебск, 1994, с.54.

18.0.А.Верховский, Л.В.Верховская, Е.Д.Захарова и др.-Иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к гексону аденовируса'собак' I серотипа (CAV-1).- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1994,4, с.135-139. *'

19. G.K.Yurov, G.L.Neugodova, O.A.Verkhovsky and B.S.Naroditsky.- Thiophilic adsorption: rapid purification of F(ab) and Fc fragments of IgGl antibodies from murine ascitic fluid.- J. of Immunological Methods, 1994,177, p.29-33. ,, '

20. О.А.Верховский, Л.В.Верховская, Е.Д.Захарова,', и J' др.-"'Диагностика инфекционного , гепатита плотоядных методом иммуноферментного анализа.- Тез. докл.Всеросс., научно- практ. конф. "Вирусные болезни с.-х. животных'*, Владимир, 1995, с.6.

21. O.AlVerkhovsky, L.V.Veri&ovskaya, E.D.Zakharoya et al.-.Sandwich* enzyme-linked immunosorbent assay for detection' of canine adenovirus serotype' CAV-1'^hexon using monoclonal antibodies.- Abstr. of 4 Intern,. Vet Immunol. Symposium, Davis, USA, .19^5,'p.183.

2£^Yii!N.F<$otbY,..^Jeoidsiova, O.A.Verkhovsky et al.-Quantitative determination of bovine and porcine immunoglobulins using monoclonal antibodies.- Там же, p.299."

23.;P^yerkhpysky, ( Yu.NrFedorov, V.K.Sologub et al.- Detection' of antigenic determinants (epitopes) common to animal and human immunoglobulins using monoclonal antibodies.- Abstr.. of 9 , Intern. Congress of Immunology, San Francisco, California, USA, 1995, 4027 A. 1 ' ^ - ■ -

24. ,О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, В.К.Сологуб и др.- Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных.-Ж. Сельскохозяйст?енная биология, 1995,4, с.94-100. '/'"' "

25. Е.Д.Захарона, О.А.Верховский, В.И.Уласов.- Антигенные свойства штаммов аденовирусов собак,- Сборник научи, трудов ВГНКИ, 1995, т.57, с.28-36.

26. О.А.Верховский, ЛВ.Верховская, Ю.Н.Федоров, ЕД.Захарова, В.И.Уласов,- Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к структурным белкам аденовируса собак серотипа 1 (CAV-1) и их использование для

диагностики инфекционного гепатита плотоядных,- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1996,2, с.87-94.

27. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский.- Иммунодефицита домашних животных.- М., 1996,95с. :гк "

28. O.A.Verkhovsky, G.KL.Yurov, I.V.Slugin and Yu.N.Fedorov.- Detection of antibody against canine parvovirus by ELISA.- Abstr. Vlllth Intern. Symposium of Vet.'Càb. Diagnosticians, Jerusalem, Israel, 1996, p.52. •

29. L.V.Verkhovskaya and O.A.Verkhovsky.- Preparation' of i'mmunoperoxidase conjugates for ELISAs using unificational technology.-Там же, p^59.: '

30. О.А.Верховский, А.А.Лиснцина, Ю.Н.Федоров.- Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки крови собак в' норме и при патологии,- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1996,4, с. 103-109.

31. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский,- Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота.-Ж. Ветеринария, 1996,10, с.17-19.

32. О.А.Верховский, Г.К.Юров, Ю.Н.Федоров.- . Выделение, идентификация, использование Н-цепей иммуноглобулинов животных.- Мат.1 Международн. научно-практ. конф. "Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства", Витебск, 1996, с.89.

33. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский,- Иммунодефициты животных: происхождение, характеристика, диагностика, коррекция,-Там же, с. 12.

34. O.A.Verkhovsky, Yu.N.Fedorov, , T.A.Feoktistova and I.Ezdakova.- Quantitative précipitation assay for animal immunoglobulins with monoclonal antibodies.- Abstr. of First Congress of the Federation of Immunological ' Societies of Asia-Oceania (FIMSA), Adelaide, Australia, 1996,71. / 1

! '"J1.35. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, И.П.Федорова - Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L., используемый дня получения моноклональных антител к L-цепям иммуноглобулинов свиньи.- Патент РФ № 2093572. Зарегистрирован в Государственном ' реестре изобретений 20 октября 1997 г. Бюл. Ка29.

36/' О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова - 'Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L., используемый для получения моноклональных антител'1 к "Î|M свиньи,- Патент РФ № 2093573. Зарегистрирован в Государственном реестре изобрет«1ий 20 октября 1997 г. Бюл.№29. "м

37. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Т,А.Феоктистова - Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.muscûlii^" L., используемый для' получения моноклональных антител к IgG свиньи.- Патент РФ № 2093574. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 октября 1997 г. Бюл.№29.

' 38. О.А.Верховский, Л.В.Верховская, Ю.Н.Федоров, Е.Д.Захарова, В.И.Уласов .Штамм гибридных клеток Mus.miisculus L., продуцирующий "моноклональные антитела к гексоку аденовируса собаки первого серотипа (CAV-1).- Патент РФ N»2095411. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 йоября 1997 г. Бюл. №31.

39. O.A.Verkhovsky and Yu.N.Fedorov- Characterization and applications of monoclonal antibodies against porcine immunoglobulins.- Abstr. of 13th Eur. Immunol. Meeting, In: Immunol. Letters, 1997, vol.56 (1-3), p.404.

40. A.A.Lisi'tsina, O.A.Verkhovsky and Yu.N.Fedorov - Immunological investigations in dogs with demodicosis and dermatitis.-Там же, p.433.

41. O.A.Verkhovsky, M.Anoyatbekov, Yu.N.Fedorov et ' al.- Humoral immune response to and maternal immunity from associated vaccine against' transmissible gastroenteritis virus, rotavirus and enterotoxigenic E.coli infection of swine.- Abstr. of 4th Intern. Congress of Vet. Virology, Edinburgh, Scotland, 1997,p,203. "'""'

42. O.A.Verkhovsky, Yu.N.Fedorov, V.K.Sologub et al.- Determination of cross- reactive (common) epitopes of animal and human immunoglobulins using monoclonal antibodies.- Russian J. of Immunology, 1997,2(1), p.23-28.

43. O.A.Verkhovsky, Yu.N.Fedorov, N.N.Korotkova, T.A.Feoktistova.- Epitope specificity of monoclonal antibodies to porcine immunoglobulin G and light chains.- Russian J. of Immunology, 1997, 2(2), p.103-110.

44. В.И.Уласоа, О.А.Верховский, Л.В.Верховская, И.В.Уласов.- Физико- химические свойства штаммов аденовирусов собак,- Труды Межд. конф. посвящ. 100-летию открытия вируса ящура, Владимир, 1997, с. 187.

45. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, М.Аноятбеков, Б.Г.Орлянкин, Н.А.Соколова, Э.А.Шегидевич- Лактогенный иммунитет у поросят против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза свиней- Ж.Ветеринария, 1997, 12, с.20-23.

46. Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский- Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии-Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с.114-124.

47. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Н.Н.Короткова- Эпитопное картирование yl-цепей IgGl свиньи с помощью моноклональных антител.- Труды ВИЭВ, 1998, в печати.

48. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, Б.Г.Орлянкин, Л.В.Верховская, М.Аноятбеков-Оценка изотипического распределения антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в секретах молочных желез иммунных свиноматок,- Ж. Сельскохозяйственная биология, 1998,2, с.59-72.

49. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, А.АЛисицина, Т.Ю.Клюева- Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови собак при демодекозе и дерматитах,- Ж. Ветеринария, 1998,6, с.33-38.

Размножено в Типографии "РОТЭКС" /00 Заказ № 59 Цена договорная.

экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Верховский, Олег Анатольевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я.Р.Коваленко

Верховский Олег Анатольевич

ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В АНАЛИЗЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА, СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ животных

03. 00.04 - биохимия 03-00.23 - биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени а биологических наук

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Федоров

Москва -1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................2

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................13

2.1. Иммунная система: основные понятия.......................................................................13

2.2. Иммуноглобулины и гуморальный иммунный ответ:

теоретические основы...................................................................................................43

2.3. Развитие и совершенствование методов иммуноанализа на основе

поли- и моноклональных антител................................................................................65

2.4. Использование антител в клинической практике:

стратегия антительной терапии...................................................................................71

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................75

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................................................................91

4.1. Выделение, очистка, идентификация иммуноглобулинов

и их фрагментов......................................................................................................................91

4.1.1. Выделение и очистка ^ хроматографическими методами....................................93

4.1.2. Идентификация иммуноглобулинов свиньи и собак..............................................96

4.1.3. Выделение и идентификация тяжелых цепей

иммуноглобулинов...................................................................................................100

4.1.4. Выделение и идентификация Р(аЬ)2- и Рс- фрагментов иммуноглобулинов...................................................................................................102

4.2. Получение поли- и моноспецифических антисывороток..............................................104

4.3. Получение моноклональных антител заданной специфичности...............................105

4.3.1. Иммунизация мышей и слияние клеток с помощью

полиэтиленгликоля..................................................................................................107

4.3.2. Скрининг гибридом на продукцию МкА..............................................................110

4.3.3. Клонирование гибридом..........................................................................................114

4.3.4. Перевод гибридом в массовую культуру и

получение асцитов....................................................................................................116

4.4. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител...............................119

4.4.1. Определение изотипа моноклональных антител...............................................119

4.4.2. Определение активности и специфичности

моноклональных антител.........................................................................................120

4.4.3. Определение эпитопной специфичности моноклональных

антител методом иммуноблоттинга......................................................................127

4.4.4. Анализ перекрестной специфичности

моноклональных антител........................................................................................135

4.4.5. Очистка моноклональных антител из мышиных асцитов

и синтез иммунопероксидазных конъюгатов......................................................142

4.5. Использование моноклональных антител в качестве иммунодиагностических реагентов...................................................................................146

4.6. Эпитопное картирование у1-цепей свиньи

с помощью моноклональных антител.............................................................................149

4.7. Оценка гуморального иммунного ответа и изотипического распределения антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах молочных желез

иммунных свиноматок.........................................................................................................159

4.7.1. Количественное определение уровня иммуноглобулинов и специфических антител в секретах свиноматок..................................................161

4.7.2. Анализ изотипического распределения антител к ВТГС

в секретах молочных желез иммунных свиноматок............................................163

4.7.2.1. Роль и его субизотипов в иммунном ответе к ВТГС......................168

4.7.2.2. Значение э^А и ^М в иммунном ответе к ВТГС................................173

4.7.2.3. Распределение (к) и (А,) в иммунном ответе к ВТГС...............176

4.8. Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки

крови собак при демодекозе и дерматитах.......................................................................178

4.9. Разработка и использование методов иммуноанализа

для диагностики инфекционного гепатита плотоядных и анализ

соотношения титр вируса/титр специфических антител в сыворотках

крови спонтанно инфицированных собак.......................................................................187

4.9.1. Разработка непрямого твердофазного ИФА для выявления антител

к гексону САУ-1......................................................................................................189

4.9.2. Получение и иммунохимическая характеристика МкА к

структурным белкам САУ-1....................................................................................192

4.9.3. Разработка «сэндвич»-ИФА на основе полученных поли-

и моноклональных антител для детекции гексона САУ-1...............................196

4.9.4. Определение и анализ соотношения титр вируса/титр специфических антител в сыворотках крови спонтанно инфицированных САУ-1 собак..........200

5. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................205

6. ВЫВОДЫ...................................................................................................................................229

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................232

8. ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................................................................258

1. ВВЕДЕНИЕ

Бурное развитие научных и научно- прикладных направлений иммунологии и молекулярной биологии коренным образом изменило методологические подходы в разработке диагностикумов и вакцин нового поколения. К середине 1980-х годов новые идеи в иммунодиагностике и иммунопрофилактике были подготовлены прогрессом в изучении элементарных единиц иммунологической активности, что привело к материализации антигенной детерминанты, или эпитопа, как простейшей структуры, определяющей иммунологические свойства белка. Такой прогресс был обусловлен существенным расширением возможностей молекулярной иммунологии, базирующейся ныне целиком на использовании моноклональных антител и синтетических пептидов [9, 13, 38]. Развитие новых терапевтических подходов к предупреждению инфекционных заболеваний, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, в основе которых лежат современные представления об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает отношение в системе антиген-антитело [1, 53].

Природа антисывороток ограничивает их использование в иммунологических тестах. Поликлональные антитела образуются в результате функционирования многочисленных клеточных клонов и, следовательно, гетерогенны на самых разных уровнях: по изотипу антител, их специфичности, активности и аффинности. Из одной и той же антисыворотки можно приготовить препарат, содержащий антитела к множеству отдельных антигенов (полиспецифичность), антитела к небольшому числу антигенов (олигоспецифичность) или антитела к одному единственному антигену (моноспецифичность). Но даже в последнем случае антитела не являются гомогенными, поскольку иммуноген представляет собой полидетерминантную структуру, стимулирующую образование поликлональных, направленных к различным детерминантам антител, причем нередко относящихся к разным изотипам [94]. Кроме того, в процессе формирования гуморального иммунного

ответа, на индивидуальный эпитоп антитела продуцируются многочисленными клонами клеток, и таким образом за один и тот же эпитоп могут конкурировать антитела с разной аффинностью. Поэтому, в каждом отдельном случае необходимо оценивать пригодность антисыворотки для того или иного иммунологического теста. Низкое содержание специфических антител в неочищенной антисыворотке (20- 30% от общего количества Ig) снижает ее эффективность в одних тестах и может приводить к повышению фоновых значений в других. В связи с поликлональной полиспецифической природой обычных антисывороток их очистка до той степени специфичности, которая необходима для выявления отдельных структур и антигенных различий между молекулами на уровне индивидуального эпитопа, представляется практически невозможной задачей [2].

Разработанный Келлером и Милыптейном (1975) метод получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела заданной специфичности, открыл новую эру в биологической науке. С тех пор моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии. Гибридомная биотехнология является примером не только очень быстрого внедрения науки в практику, но и продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне.

Секретируемые гибридомными клетками антитела гомогенны по специфичности, аффинности и изотипу. Образуемые in vitro МкА преобладают (или оказываются единственным белком) в культуральной среде. Являясь реагентами направленного действия, моноклональные антитела позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур [188, 189, 192, 193].

Область применения МкА быстро расширяется, поскольку все больше ученых, работающих в разных лабораториях, убеждается в их преимуществах и овладевает методами их получения. Ряд фирм уже предлагают коммерческие препараты МкА для приобретения, что очень важно прежде всего для специалистов, работающих в области иммунологии, вирусологии и микробиологии, где преимущества МкА воплощены в разработанных тест-системах широкого спектра [30,121,191,199].

Особая ценность МкА предопределяет их использование для проведения исследований различных антигенов, где их чувствительность и специфичность способствуют решению множества проблем, которые не могут быть решены с помощью поликлональных реагентов. Моноклональные антитела способны значительно упростить многие тесты и значительно расширить число тестируемых молекул.

Вместе с тем, потребность в полиспецифических преципитирующих антисыворотках, равно как и значение самих методов, связанных с иммунопреципитацией, в связи с разработкой технологии получения и расширением областей применения моноклональных антител, не снижается.

В настоящее время современные методы иммунохимического анализа, основанные на применении как поли- так и моноклональных антител, широко используются в диагностике инфекционных и паразитарных болезней, онкологической, сердечно-сосудистой и другой патологии. Как в медицине, так и в ветеринарии, особая роль при этом отводится углубленной характеристике иммунного статуса здоровых и больных людей и животных. В связи с этим, возникает необходимость разработки разноплановых диагностических тест-систем на основе МкА для оценки распределения изотипов/субизотипов иммуноглобулинов в иммунном ответе и ¿для эпитопного картирования субъединиц ^'э, что представляет значительный интерес не только в прикладных аспектах, но и для фундаментальной науки в целом [3, И, 12, 34,77, 84,107,131,141,167,170,173].

Анализ гуморальных факторов иммунного ответа играет важную роль в диагностике и анализе иммунологической недостаточности и напрямую связан с определением количественных соотношений иммуноглобулинов и распределением изотип/субизотип-специфических антител в биологических жидкостях организма. Несмотря на то, что за последние годы сделаны значительные успехи в изучении иммуноглобулинов, остаются недостаточно рассмотренными вопросы, связанные с изучением эпитопной структуры ^ и их субъединиц, иммунохимической природы специфических антител и их функциональных свойств у многих видов животных.

Получению поли- и моноклональных антител к различным изотипам/субизотипам и их структурным субъединицам, разработке иммунохимических методов на их основе и применению этих методов для оценки иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза, характеристики гуморального иммунного ответа и изучения роли иммунных реакций в патогенезе инфекционных и инвазионных заболеваний животных и при контроле традиционных и разрабатываемых вакцин и посвящена данная работа.

Цель работы.

Анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-/субизотип-специфического распределения антител и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней и собак на примере ряда болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также при определении антигенных и иммуногенных свойств вакцинных препаратов. Изучение и характеристика эпитопов иммуноглобулинов свиньи и некоторых других видов животных и человека.

Основные задачи исследований.

4. Изучить общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и человека, провести исследования по эпитопному картированию у1- цепи 1^01 свиньи и детально охарактеризовать специфичность формирующих ее эпитопов.

5. Провести анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза, а также изучить их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных.

6. Провести количественную оценку уровня ^М и ^А в сыворотке крови собак при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных.

7. Используя поли- и моноклональные антитела к основным структурным белкам аденовируса собак 1 серотипа (САУ-1), сконструировать диагностические

иммуноферментные тест- системы, предназначенные для одновременной детекции гексона САУ-1 и антител к нему и с их помощью изучить взаимосвязь в цепи вирус- гуморальный иммунный ответ.

Научная новизна работы.

Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к ^О, ^01, ^М, в^А, к- и Х- легким цепям ^ свиньи, а также охарактеризованы МкА, направленные к различным изотипам ^ крупного рогатого скота и человека. На гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к ^М и Ь- цепям ^ свиньи получены Патенты РФ: № 2093572 «Штамм гибридных культивируемых клеток Мш.тшоЛш Ь., используемый для получения моноклональных антител к Ь-цепям иммуноглобулинов свиньи», № 2093573 «Штамм гибридных культивируемых клеток Мт.тизсиЫз Ь., используемый для получения моноклональных антител к ^М свиньи» и № 2093574 «Штамм гибридных культивируемых клеток Миз.ппшсЫш Ь., используемый для получения моноклональных антител к 1^0 свиньи» от 20 октября 1997 г.

С использованием полученных и охарактеризованных поли- и моноклональных антител к различным изотипам/субизотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак разработано девять диагностических тест- систем на основе различных вариантов ИФА и РИД.

Впервые проведено эпитопное картирование у1- цепи ^01 свиньи и детально охарактеризована специфичность семи ее эпитопов.

Впервые изучена роль антител, содержащих различ�

Информация о работе

Верховский, Олег Анатольевич
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.04

Диссертация

Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы