Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства"

004Ь

Ягудии Тимур Анверович

Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства

Специальность 03.01.04 - «Биохимия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010 г

2 5 НОЯ 2010

004613907

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГосНИИГенетика и в лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

C.B. Беневоленский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B.JI. Карпов кандидат биологических наук Е.В. Свирщевская

Ведущая организация: Центр «Биоинжеиерия» РАН

Защита диссертации состоится «2. » декабря 2010 года в «/V » часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат диссертации разослан «23 » О^ТЙ^р^ 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Бешенство и чума являются особо опасными инфекционными заболеваниями. По данным Всемирной организации здравоохранения более 55 тысяч человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из них - дети до 15 лет (Информационный бюллетень ВОЗ, 2008). В случае развития симптомов болезнь становится практически неизлечимой и приводит к быстрой смерти (Hildegund, 2009). После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой, ВОЗ рекомендует пассивную иммунизацию, то есть введение анти-рабического иммуноглобулина (Информационный бюллетень ВОЗ, 2008). Оптимальными являются рекомбинантные человеческие иммуноглобулины, предохраняющие от развития симптомов бешенства, например, гуманизированные моноклональные антитела (мАт) 1С5 против гликопротеида вируса бешенства, способные нейтрализовать вирус (Грибенча и др., 1991а; Грибенча и др., 19916).

В год фиксируется около 2000 случаев заболевания чумой, и Всемирная Организация Здравоохранения недавно признала чуму как вновь циркулирующее заболевание (Cornells, 2000). Особо опасна легочная форма чумы, при которой симптомы болезни нарастают лавинообразно, и в течение 24 часов после заражения может наступить смерть. Для экстренной нейтрализации воздействия чумного микроба на организм человека целесообразно вводить в кровоток иммуноглобулин, специфичный к возбудителю чумы - бактерии Yersinia pestis. Наиболее подходящим кандидатом для этого выглядит гуманизированное мАт F19 против Fl антигена Y. pestis (Ягудин и др., 2010).

Выбор рекомбинантных человеческих или гуманизированных иммуноглобулинов обусловлен тем, что клиническое использование мышиных или иных чужеродных мАт, особенно для повторного применения, может быть ограничено человеческим иммунным ответом на эти белки, способным привести к снижению терапевтической эффективности (Graziano et al., 1995).

Разработаны различные методы для снижения антигенных свойств мышиных антител при сохранении аффинности (Staelens et al., 2006). Простейшим, но мало эффективным способом является химеризация. Развитием этого метода является более эффективный и распространённый метод гуманизации, представляющий собой модификацию чужеродных

каркасных аминокислотных остатков при сохранении последовательностей антигенсвязывающих областей (Rosok et al., 1996).

В свою очередь, существуют различные методы гуманизации, такие как трансплантация (grafting) мышиных антигенсвязывающих областей (CDR) в каркасные области антител человека (Rosok et al., 1996), перекладка (resurfacing) вариабельного домена (Staelens el al., 2006), метод позиционного консенсуса (Couto et al., 1995), метод ближайшего гомолога (Singer et al., 1993), управляемая селекция (Rosok et al., 1996), трансплантация SDR (specificity determining residues) (Nishida et al., 2008), супергуманизация (Tan et al., 2002), метод Mix&Match (Shearman et al., 1991).

Цель работы: разработка комплексного метода гуманизации антител на примере мАт против гликопротеида вируса бешенства (1С5) и F1 антигена Y. pestis (F19) и системы их продукции.

Задачи:

1) Установить нуклеотидные последовательности клонированных генов мАт 1С5 и F19;

2) Сконструировать и синтезировать гены гуманизированных Fab-фрагментов мАт 1С5 и F19;

3) Получить дрожжевые штаммы - продуценты гуманизированных Fab-фрагментов мАт 1С5 и F19;

4) Наработать препараты и определить Kd гуманизированных Fab-фрагментов мАт 1С5 и F19.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Клонированы и секвенированы гены мАт 1С5 против гликопротеида вируса бешенства и F19 против F1 антигена Y. pestis.

Сконструированы гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт F19 с помощью перекладки вариабельного домена, метода позиционного консенсуса, а также метода Mix&Match. Получены дрожжевые штаммы-продуценты функционально активных гуманизированных вариантов Fab-фрагмента мАт F19. На основе анализа Kd полученных Fab-фрэгментов разработан комплексный метод гуманизации антител.

4

С помощью разработанного метода сконструированы гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5. Получен дрожжевой штамм-продуцент функционально активного гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.

С помощью введения гена протеин-дисульфид-изомеразы человека в штамм-продуцент гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 достигнуто увеличение уровня продукции более чем в шесть раз по сравнению с уровнем продукции исходного штамма-продуцента. При высокоплотном

культивировании штамма-продуцента гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 достигнуто увеличение уровня продукции почти на два порядка по сравнению с уровнем продукции в колбах.

Полученные гуманизированные Fab-фрагменты мАт 1С5 и F19 могут быть использованы в терапии бешенства и чумы, соответственно. Разработанные способы оптимизации продукции могут быть использованы для наработки препарата гуманизированных антител для доклинических испытаний в препаративных количествах. Разработанный комплексный метод гуманизации может быть использован для создания человеческих рекомбинантных антител.

Апробация работы. Работа была представлена на международной научной школе-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009) и на межлабораторном семинаре ИНБИ РАН.

Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в рецензируемых российских журналах, 1 статья в международном журнале, 2 тезисов в сборниках материалов конференций и 2 патентные заявки.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на_

странице и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы,

5

результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа

иллюстрирована_рисунками и_таблицами. Список литературы содержит

_источника.

Результаты

Клонирование и секвенирование генов вариабельных доменов антитела против Р1 антигена К ре5й$.

Первым шагом при гуманизации антител является определение аминокислотной последовательности их вариабельных Ун и Уь доменов. Для этого из клеток гибридомы Б19, продуцирующей мАт против Р1 антигена К ре.чИз, выделена суммарная РНК. Затем полученная РНК использована для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы и синтетических олигонуклеотидов А26 и Ь-т-г (Рис. 1 и 2).

Далее синтезированная кДНК использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой подбирались праймеры, необходимые для клонирования генов мАт Р19. В качестве прямых праймеров использован набор вырожденных олигонуклеотидов, гомологичных сигнальным последовательностям антител. В качестве обратных праймеров использовались олигонуклеотиды А26 для тяжелой цепи и Ь-ш-г для лёгкой цепи.

Анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле показал, что использование пары праймеров В8 и А26 приводит к образованию ПЦР-фрагмента с ожидаемой для тяжёлой цепи РаЬ-фрагмента длиной «700 п.н. Аналогично, использование праймеров С4 и Ь-ш-г приводит к образованию ПЦР-фрагмента с ожидаемой для лёгкой цепи РаЬ-фрагмента длиной «700 п.н.

Для каждой из цепей в независимых ПЦР получено по два ДНК-фрагмента. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены, фосфорилированы с использованием Т4 полинуклеотидкиназы и клонированы в плазмидном векторе р11С18, расщепленном по сайту рестрикции 8та\. После трансформации полученными векторами клеток Е.соИ отобраны рекомбинантные плазмиды, содержащие вышеупомянутые ДНК-фрагменты.

После секвенирования в двух направлениях определены нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов.

Анализ нуклеотидной последовательности пары независимых клонов тяжёлой цепи показал, что они идентичны (Рис. 1). Анализ нуклеотидной последовательности пары независимых изолятов лёгкой цепи показал, что Ук и .1к соединены в одну рамку считывания (Рис. 2).

1 CTCCTGTCHG ТЙЙСТТСЙСС TGTCTACTCA CAGGTTCAGC TCCAGCAGTC TGGGGCTGAG 61 CTGGCAAGAC CTGGGGCTTC AGTGAGGTTG ТССТ&СййЕТ CTTCTGGCTА СЙССТТТЙСТ 121 AGCTACTGGA TGCAGTGGGT AAAACAGAGG CCTGGACAGG GTCTGGAATG GATTGGGGCT 181 ATTTATCCTG GAGATGGTG» TATTAGGTAC ACTCAGAAGT TCAAGGGCAA GGCCACATTG 241 ACTGCAGATA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAAATCA GCAGCTTGGC ATCTGAGGAC 3 01 TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGTACTTCG GCTACGGTTT ACTGGGGCCA AGGGACTCTG 361 GTCACTGTCT CCGCAGCCïm AACGACACCC CCATCTGTCT ATCCACTGGC CCCTGGATCT 421 GCTGCCCASA CTAACTCCAT GGTGACCCTG GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG 481 CCAGTGACAG TGACCTGGAA CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT 541 GTCCTGCAGT CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG SOI CCCAGCGAGft CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA GGTGGACAAG 6 61 AAAATTGTGC CCAGGGATTG TTAACTCGAG CCTTGC ~~

Рисунок 1. Нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагмента с геном тяжёлой цепи РаЬ-фрагмента мАт И19. Праймеры В8 и А26, использованные для клонирования, подчёркнуты.

1 GTTGT AATGT CCAGAGGACA AATTGTTCTC ACCCAGTCTC СЙССАДТСАТ GTCTGCATCT 61 CCAGGGGAGA AGGTCACCAT AACCTGCAGT GCCАССТСАА GTGTAAGTTA CATGCACTGG 121 TTGCAGCAGA AGCCAGGCAC ТТСТСССААА CTTTGGATTT АТААСАСАТС CASGCTGGCT 181 TCTGGSGTCC CTGCTCGCTT CAGTGGCAGT GGATCTGGGA ССТСТТАСТС ТСТСАСДАТС 241 AGCCGAATGG SGGCTGAAGJk TGCTGCCACT TMTHCTGCC AGCAKRGGAG ТAGTTCCCCG 301 TACACGTTCG GAGGGGGGAC CAAGCTGGAA ATAAAACGGG CTGATGCTGC ACCAACTGTA

3 61 ТССАТСТТСС САССАТССAG TGAGCAGTTA ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC

4 21 TTGAACAACT ТСТАССССАА AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA 481 CAAAATGGCG TCCTGAACAG TTGGACTGAT СAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG 541 AGCAGCRCCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA TACCTGTGAG 6 01 GCCACTCACA AGACATCAAC ТТСАСССАТС GTCAAGAGCT TCAACAGGAA TGAGTGTTAA 661 CTCGAGA ТАТТ

Рисунок 2. Нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагмента с геном лёгкой цепи Fab-фрагмента мАт F19. Праймеры С 4 и L-m-r, использованные для клонирования, подчёркнуты.

Получение дрожжевых штаммов — продуцентов рекомбинантного мышиного РаЬ-фрагмента мАт Р19.

Гены тяжёлой и лёгкой цепей РаЬ-фрагмента мышиного мАт (ммАт) И19 клонированы в вектора рР1С2аА (¡гтй^еп) и рР1С2аА -АРте1 , соответственно. При этом к С-концу тяжёлой цепи добавлен гексагистидин

(№з6Та§). После секвенирования BglU -ВатШ фрагмент вектора с лёгкой цепью клонирован в Bgll^ сайт вектора с тяжёлой цепью. Таким образом, получен вектор рР1С7аА-Р1-ЬН-тоизе, в котором гены обеих цепей РаЬ-фрагмента ммАт Р19 слиты в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью гена МРаУ дрожжей Басскаготусез сеге\тае и находятся под контролем АОХ1 промотора. Схематическое изображение векторов, использовавшихся для экспрессии РаЬ-фрагментов антител, представлено на Рисунке 3.

Рисунок 3. Карта вектора рР1С2аА- Р1-ЬН.

Плазмида pPICZaA-Fl-LH-mouse была линеаризована по РтеI и введена в клетки штамма РкЫа раь1ог'1$ 08115 (1пукго§еп) с помощью электропорации. Трансформанты отобраны на полной среде с глюкозой (УРЭ), содержащей Zeocin в концентрации 100 мкг/мл. Интеграция линеаризованных векторов в геном рекомбинантных клонов Р.рсШото подтверждена с помощью ПЦР с использованием специфичных последовательности мАт Б19 праймеров и геномной ДНК трансформантов в качестве матрицы.

Отобранные трансформанты выращены на полной среде с глицерином (ВМОУ) и перенесены на полную среду с метанолом (ВММУ) для индукции экспрессии генов РаЬ-фрагмента. Содержание в культуральной среде РаЬ-фрагментов мАт Р19 контролировали твердофазным ИФА на Р1 белке и методом иммуноблоттинга.

Характеризация рекомбинантного РаЬ-фрагмента ммАт Р19

Рекомбинантные РаЬ-фрагменты ммАт Б19, имеющие в своем составе His6Tag, выделяли из культуральной жидкости клеток Р.раз(опз, трансформированных плазмидой рР1С2аА-Р 1 -ЬН-тоиБе металло-хелатной хроматографией на колонке с N1. Измеренная константа диссоциации (К^) свидетельствует о том, что аффинность полученного рекомбинантного РаЬ-фрагмента превышает не только аффинность полученного протеолизом РаЬ-фрагмента, но и аффинность исходного полноразмерного ммАт П9 (Табл. 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что гены антитела против Р1 антигена У. рм/;.? клонированы успешно.

Таблица 1. Kd полноразмерного ммАт F19 и его Fab- фрагментов.

Полноразмерное ммАт F19 Fab-фрагмент, полученный энзиматическим расщеплением Рекомбинантный Fab-фрагмент

4,5x10"9М 1,4х10"8М 4,6x10-'°

Гуманизация мАт Р19.

Идентифицированные аминокислотные последовательности Ун и Уь доменов мАт Р19 использованы для конструирования гуманизированных вариантов мАт П9 с использованием трёх методов гуманизации, описанных ниже.

Метод перекладки вариабельного домена заключается в замене экспонированных аминокислот каркасных областей на аминокислоты, находящиеся на соответствующих позициях в последовательностях антител человека. Для каждого вариабельного домена с помощью программы В1аэ1Р (А^сЬи! е! а1, 1997) из всех баз данных невырожденных белковых последовательностей отобрано по 50 последовательностей антител мыши и человека с наибольшей гомологией с Б19. Несколько систематических различий найдено при сравнении мышиной выборки с человеческой выборкой, и такие аминокислоты выбраны кандидатами на замену. После этого, с помощью пространственной модели вариабельного домена ммАт Г19

определены аминокислоты, экспонированные на поверхности (доступность больше 30 %). Экспонированные на поверхности кандидаты на замену были заменены на человеческие консенсусные аминокислоты. В результате была получена последовательность Fv-фрагмента гуманизированного мАт F19, обозначенная 'sur' (Рис. 4).

Метод позиционного консенсуса представляет собой трансплантацию антигенсвязывающих областей в каркасную область, составленную из консенсусных последовательностей ближайших гомологов. Для каждого из фрагментов каркасных областей с помощью BlastP в базах данных невырожденных белковых последовательностей найдено 100 ближайших гомологов мАт F19 из которых составлены консенсусные последовательности. Если в человеческой консенсусной последовательности в определённой позиции не было предпочтительной аминокислоты, то оставляли аминокислоту, которая находится в данной позиции в ммАт F19. Составленная из человеческих консенсусных каркасных областей и мышиных антигенсвязывающих областей последовательность обозначена 'соп' (Рис. 4).

Метод Mix&Match заключается в трансплантации антигенсвязывающих областей целиком в сборную каркасную область, составленную из наиболее гомологичных фрагментов каркасных областей вариабельных доменов антител человека. Для этого в базе данных IMGT (Giudicelli et al., 2005) с помощью программы BlastP для фрагментов каркасной области 1,2 и 3 лёгкой и тяжёлой цепей найдены наиболее гомологичные последовательности из гаметной ДНК человека. Затем из мышиных антигенсвязывающих областей, гомологичных фрагментов каркасных областей и J сегментов антител человека составлена последовательность вариабельных доменов гуманизированного варианта мАт F19.

Предварительные конструкции были изучены и некоторые аминокислоты идентифицированы как возможные ключевые остатки в определении связывания с антигеном. А именно, определены аминокислотные остатки, которые являются частью канонических структур конформаций антигенсвязывающих областей, и остатки, которые потенциально участвуют в укладке VL-VH (Chothia et al., 1989).

Была также отмечена низкая частота некоторых аминокислот в специфических позициях. Кроме того, из аминокислотной последовательности

предварительного варианта гуманизированнного Fab-фрагмента были удалены потенциальные сайты N-гликозилирования.

А

C'vù tí; 011 \VsX.?XZ<$'¿ й Xlï'tS Î ГУг Х.ЧУ'^-Х85í£%ATlT&ZK2

..........V.t.....X................................................................................................

Б

.........т.......*......................«-■»...............................-i...............................

Рисунок 4. Аминокислотные последовательности VH (А) и VL (Б) доменов мышиного (ms) и гуманизированных вариантов 'sur', 'con' и 'hom' Fab-фрагмента мАт F19. Аминокислотные остатки гипервариабельных областей подчёркнуты.

С учётом этой информации и с использованием пространственной модели вариабельного домена ммАт F19 принималось решение о целесообразности обратной замены конкретного аминокислотного остатка в выбранных каркасных областях антител человека на аминокислотный остаток, который присутствует в данной позиции в вариабельном домене ммАт F19. В результате получена последовательность Fv-фрагмента гуманизированного мАт F19, обозначенная 'hom' (Рис. 4).

Получение дрожжевых штаммов - продуцентов гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19

Для того чтобы оценить эффективность проведённой гуманизации, гены мышиного и гуманизированных VH и VL доменов мАт F19 синтезированы с помощью ГГЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов и клонированы в экспрессионные кассеты с генами константных доменов антител человека IgGl каппа-типа Сщ и Ск, соответственно.

Таким образом были получены гены тяжёлой и лёгкой цепей гибридного (обозначенного 'hyb') и гуманизированных Fab-фрагментов 'sur', 'con' и 'hom', расположенные на экспрессионных векторах pPICZaA и pPICZaA-APmel, соответственно.

После секвенирования BglII -ВатШ фрагменты векторов с лёгкой цепью клонированы в Bglll сайт векторов с соответствующей тяжёлой цепью. В результате получены плазмиды pPICZaA-Fl-LH-hyb, pPICZaA-Fl-LH-sur, pPICZaA-F1 -LH-con и pPICZaA-Fl-LH-hom.

Полученными плазмидами стандартным способом трансформированы клетки штамма P.pastoris GS115. Штаммы-продуценты гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19 отобраны аналогично тому, как были отобраны штаммы-продуценты мышиных Fab-фрагментов мАт F19. После анализа культуральных жидкостей трансформантов с помощью ИФА получены штаммы GS115/Fl-hyb, GS115/Fl-sur, GS115/Fl-con и GS115/Fl-hom, секретирующие варианты 'hyb', 'sur', 'con' и 'hom' Fab-фрагмента мАт F19, соответственно.

Очистка и анализ гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19.

В ДСН-ПААГ геле в отсутствие восстановителей аффинноочищенные Fab-фрагменты дают одиночную полосу с мобильностью, соответствующей предполагаемой молекулярной массе 50 кДа. Электрофорез в восстанавливающих условиях даёт полосы, соответствующие предполагаемой массе свободных тяжёлых и лёгких цепей. Следовательно, тяжёлые и легкие цепи Fab-фрагментов собраны правильно.

То, что гуманизированные Fab-фрагменты связываются с F1 антигеном в ИФА уже говорит о том, что при гуманизации не произошло потери связывания с антигеном. Для сравнения эффективности методик гуманизации необходимо определить константы диссоциации Fab-фрагментов. Аффинноочищенные из супернатанта Fab-фрагменты сравнивали с мышиным Fab-фрагментом по связыванию F1 антигена (Табл. 2). Сравнение проводили с использованием ИФА.

Сравнение связывания мышиного и гибридного Fab-фрагментов говорит о том, что замена мышиных константных доменов на человеческие приводит к ухудшению связывания. Однако гуманизация не только не приводит к

ухудшению связывания с антигеном (вариант 'sur'), но и компенсирует вышеупомянутое падение связывания (варианты 'hom' и 'con').

Сравнение эффективности методик гуманизации, несмотря на разницу в подходах, говорит о том, что поиск человеческой реципиентной последовательности отдельно для каждого фрагмента каркасной области (варианты 'hom' и 'con') более эффективен, чем поиск для всей каркасной области целиком (вариант 'sur').

Таблица 2. Характеристики гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19.

Метод Количество Штамм- Продукция, Kd

аминокислотных продуцент мг/л

замен

Р19 мышь 0 - - l,4x 10'SM

(контроль)

Гибрид 0 GS115/Fl-hyb 0,2 3,2 x 10_'M

Перекладка VH-3 VL-5 GS115/Fl-sur 0,4 3,5 x 10"'M

Позиционный VH-7 GS115/Fl-con 5 8 xl0"8M

консенсус VL-2

Ближайший VH-9 GS115/Fl-hom 1,4 4,5 xlO"8M

гомолог VL -14

Поскольку у варианта 'hom' эффективность связывания выше, чем у варианта 'con', то последовательности гаметной ДНК человека предпочтительнее в качестве реципиентных, по сравнению с последовательностями из базы данных невырожденных последовательностей антител человека. Вероятно, это так, потому что в них нет соматических мутаций, возникших в результате созревания аффинности к антигену, отличному от F1, которые могут повлиять на кон формацию антигенсвязывающих областей, то есть их структура более общая и позволяет различные варианты конформаций.

Таким образом, из экспериментальных данных следует, что для гуманизации предпочтительны реципиентные человеческие

последовательности, состоящие из консенсусных последовательностей

ближайших гомологов для каждого фрагмента каркасной области. При этом поиск гомологов следует вести в базе данных гаметной ДНК человека.

Алгоритм, разработанный по результатам гуманизации антитела против F1 антигена У. pestis, проверен на примере гуманизации антитела против вируса бешенства.

Дизайн и гуманизация мышиного антитела против вируса бешенства.

Гены антитела против гликопротеида вируса бешенства клонированы из гибридомы 1С5 и секвенированы аналогично тому, как это было сделано для мАт F19. Идентифицированная аминокислотная последовательность Ун и Vl мАт 1С5 использована при гуманизации (Рис. 5).

Для этого сначала были определены границы каркасных областей согласно (Kabat et al., 1987). Для каждого фрагмента каркасной области найдено 50 ближайших гомологов в базах данных последовательностей антител из гаметной ДНК мыши и человека. Несколько систематических различий найдено при сравнении мышиной и человеческих выборок. Аминокислоты в таких позициях рассматривались в качестве кандидатов на гуманизацию.

После этого идентифицированы возможные ключевые аминокислотные остатки в определении связывания с антигеном. А именно, определены аминокислотные остатки, которые являются частью канонических структур формирующих петли антигенсвязывающих областей, предложенных (Chothia et al., 1989), остатки, которые потенциально участвуют в укладке Vl-Vh> как описано (Chothia et al., 1989), а также найдены аминокислоты, редко встречающиеся в последовательностях антител мыши. При анализе пространственной модели Fv-фрагмента ммАт 1С5 определены аминокислотные остатки, которые находятся в радиусе 5 ангстрем от CDR и наиболее вероятно связываются с антигеном.

Все вышеперечисленные позиции исключены из числа кандидатов на гуманизацию. В итоге получена консенсусная последовательность гуманизированного мАт 1С5, состоящая из аминокислот, наиболее часто встречающихся в человеческих гомологах ммАт 1С5, а также аминокислот ммАт 1С5, определяющих связывание с антигеном (Рис. 5).

Из полученных последовательностей удалены любые потенциальные сайты N- гликозилирования. Кроме этого, сделаны обратные замены на

14

мышиные аминокислоты из-за опасности нарушить конформацию Fv-фрагмента (2 для тяжёлой цепи и 1 для лёгкой). Таким образом, получена последовательность гуманизированного Fv фрагмента мАт 1С5 (Рис. 5).

А

Kitean ____V.i. .. V........V.................Я. A..........................1.........Г.....t. .

Б

Сьм ..............V.b........................K3l............................Т......J?............................

Ruain ..............V.D.........................1............................1..................................

Рисунок 5. Сравнение мышиной, консенсусной и гуманизированной аминокислотных последовательностей Vh (А) и Vl (Б) доменов мАт 1С5.

Получение дрожжевых штаммов — продуцентов рекомбинантного гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5

Гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 были синтезированы из набора перекрывающихся олигонуклеотидов и клонированы в экспрессионный вектор pPICZaA-AR-human-opt-LH аналогично тому, как это было сделано для мАт F19.

Штаммы P.pastoris, полученные в результате трансформации плазмидой pPICZaA-AR-human-opt-LH отбирали и выращивали стандартным образом (см. выше). Культуральные жидкости трансформантов проанализированы с помощью ИФА.

По результатам анализа отобран штамм 7-22-1 (GS115/ pPICZaA-AR-human-opt-LH) с максимальной продукцией Fab-фрэгментов гуманизированного мАт 1С5, составившей 1.8 мг/л.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки P.pastoris секретируют в культуральную жидкость Fab-фрагменты, способные связываться с гликопротеидом вируса бешенства. Это позволяет сделать предварительный вывод о том, что при гуманизации мАт 1С5 сохранена его способность связываться с антигеном. Для подробной характеризации полученного Fab-фрагмента необходимо выделить его в чистом виде. Для этого

предприняты меры к повышению продукции данного Fab-фрагмента в клетках P.pastoris.

Оптимизация процесса продукции гуманизированного Fab-фрагмента мАт F19

Было сделано предположение, что уровень продукции Fab-фрагментов можно повысить путём более эффективного образования дисульфидных связей, так как этот процесс является одним из ключевых при сборке Fab-фрзгментов. Для этого в геном отобранного штамма 7-22-1 введён ген протеин-дисульфид-изомеразы человека hPDI. Вероятно, протеин-дисульфид-изомераза человека имеет большее сродство к гуманизированным Fab-фрагментам, чем протеин-дисульфид-изомераза дрожжей.

Ген hPDI, слитый с геном сигнального пептида а-фактора дрожжей 5. cerevisiae на плазмиде pPH92-GAP-hPDI (Рис. 6) находится под контролем конститутивного промотора гена GAP (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы). Вектор рРН92, являющийся производной плазмиды рР1С9 (Invitrogen), любезно предоставлен А.М.Чулкиным (ИНБИ РАН).

Плазмидой pPH92-GAP-hPDI, предварительно линеаризованной по SalI, штамм 7-22-1 трансформирован путём электропорации. Трансформанты отобраны на минимальной среде (MD).

termAOX!

H1S4 ' 1

Süll U7!»l

Рисунок 6. Структура плазмиды рРН92-0АР-ЬР01.

Уровни продукции отобранных клонов трансформантов определены аналогично тому, как это сделано для штамма реципиента 7-22-1. По

результатам ИФА отобран штамм Т117 с максимальной продукцией Fab-фрагментов гуманизированного мАт 1С5, составившей 12 мг/л.

Следовательно, в результате введения гена hPDI в геном штамма-продуцента гуманизированных Fab-фрагментов мАт 1С5 уровень продукции Fab-фрагмента увеличился более чем в шесть раз. Это позволяет с большой долей уверенности утверждать, что повышение эффективности образования дисульфидных связей приводит к увеличению уровня продукции фрагментов антител.

Высокоплотная ферментация штамма P. pastoris 7-22-1

Другим способом повышения продукции Fab-фрагментов является масштабирование процессов культивирования. Для проверки действенности данного метода осуществляли высокоплотное культивирование штамма Р. pastoris 7-22-1 в ферментерах фирмы Sartorius с сосудами, имеющими рабочий объем 2,0 литра. Использованные ферментёры оборудованы системами поддержания температуры, рН, концентрации растворенного кислорода. Результаты высокоплотной ферментации штамма P.pastoris 7-22-1 приведены на Рисунке 7.

Время ферментации,

Рисунок 7. Высокоплотная ферментация штамма P.pastoris 7-22-1 при температуре 26°С и значении рН 7,0. (■) - оптическая плотность культуральной жидкости, (•) - концентрация гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.

В результате оптимизации процесса культивирования штамма P.pastoris 7-22-1 уровень накопления Fab-фрагментов в культуральной жидкости увеличился на два порядка и составил 170 мкг/мл.

Полученный уровень продукции позволяет выделить препарат Fab-фрагмента гуманизированного мАт 1С5 в достаточных количествах для его последующей характеризации.

Анализ и очистка гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5

Культуральную жидкость, полученную в результате высокоплотной ферментации штамма P. pasloris 7-22-1, исследовали методом электрофореза в 10% ДСН-ПААГ геле (Рис. 8А).

А Б

кДа 1 г 3 кДа 1 2 3 4 5 б

Рисунок 8. Свойства гуманизированного РаЬ-фрагмента мАт 1С5. А. Электрофорез в 10% ДСН-ПААГ. Дорожка 1, стандарты (кДа); дорожка 2, ЭФ в невосстанавливающих условиях; дорожка 3, ЭФ в восстанавливающих условиях. Б. Вестерн-блот в невосстанавливающих (дорожки 1-3) или в восстанавливающих (дорожки 4-6) условиях. Инкубацию проводили либо с антителами против каппа цепей иммуноглобулинов человека (дорожки 1 и 4), либо с антителами против Н1з6Та§ (дорожки 2 и 5), либо с антителами против каппа цепей иммуноглобулинов мыши (дорожки 3 и 6).

Fab-фрагменты при окрашивании Кумасси дают одиночную полосу с подвижностью, соответствующей предполагаемой молекулярной массе Fab-фрагмента 50 кДа. Электрофорез в восстанавливающих условиях даёт полосы, соответствующие предполагаемым массам свободных тяжёлых и лёгких цепей. Отсюда следует, что гуманизированные Fab-фрагменты обладают нативной структурой, а именно состоят из двух цепей, соединённых межцепочечной дисульфидной связью.

Степень гуманизации полученных Fab-фрагментов определяли анализом Вестерн блот. Результаты этого анализа представлены на Рисунке 9. На высокую степень гуманизации мАт 1С5 указывает тот факт, что поликлональные антитела, специфичные к каппа-цепям иммуноглобулинов человека, узнают гуманизированный Fab-фрагмент (Рис. 8Б, дорожки 1 и 4), тогда как антитела против каппа-цепей иммуноглобулинов мыши гуманизированный Fab-фрагмент практически не связывают (Рис. 8Б, дорожки 3 и 6).

Следовательно, полученный Fab-фрагмент обладает нативной структурой и высокой степенью гуманизации. Для определения способности полученного Fab-фрагмента связываться с антигеном был получен препарат Fab-фрагмента с высокой степенью очистки.

Очистку гуманизированных Fab-фрагментов из культуральной жидкости осуществляли методом одностадийной аффинной металло-хелатной хроматографии, так как целевой продукт имеет His6Tag на С-конце тяжелой цепи (Рис. 8Б, дорожки 2 и 5).

Определение константы диссоциации гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.

Аффинночищенный из супернатанта Fab-фрэгмент сравнивали по связыванию гликопротеида вируса бешенства с мышиным Fab-фрагментом и полноразмерным ммАт. При определении Kd для полноразмерного ммАт 1С5 и его мышиного Fab-фрагмента использовали антимышиный иммунопероксидазный конъюгат (к-специфичность). Для гуманизированного Fab-фрагмента 22-1 использовали античеловеческий иммунопероксидазный конъюгат (к-специфичность).

Результаты, представленные в таблице 3, указывают на то, что гуманизированный Fab-фрэгмент, обладают аффинностью не меньшей, чем у исходного полноразмерного ммАт 1С5.

Таблица 3. Kd полноразмерного ммАт 1С5, мышиного Fab-фрагмента и гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.

Полноразмерное ммАт 1С5 Мышиный Fab-фрагмент Рекомбинантный гуманизированный Fab-фрагмент

1,92 х10'9М 2,7 х10'9М 1,15 х10'9М

Таким образом, штамм P. pastoris 7-22-1 секретирует гуманизированный Fab-фрэгмент мАт 1С5, который обладает нативной структурой, высокой степенью гуманизации и не меньшей аффинностью, чем у исходного полноразмерного антитела. Это позволяет сделать вывод, что гуманизация ммАт 1С5 проведена успешно. Следовательно, разработанный метод гуманизации эффективен.

Выводы

1. Впервые определена структура Fv-фрагментов моноклональных антител F19 против Fl антигена Y. pestis и 1С5 против гликопротеида вируса бешенства.

2. Разработан метод гуманизации, позволяющий быстро и эффективно получать гуманизированные Fab-фрагменты. Эффективность метода проверена на мАт Fl9 и 1С5.

3. Показано, что дрожжи Р.pastor is способны секретировать функционально активные мышиные и гуманизированные Fab-фрагменты мАт F19 и 1С5.

4. Установлено, что продукция Fab-фрагмента мАт 1С5 в P.pastoris лимитирована на стадии образования дисульфидных связей.

5. При высокоплотной ферментации дрожжей показано, что уровень продукции Fab-фрагмента пропорционален концентрации продуцирующих клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

1. Ягудин Т.А., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский C.B., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б., Городецкая С.Б., Борзилов А.И., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф., Вейко В.П., Свешников П.Г. Получение рекомбинантного фрагмента нейтрализующего антитела против капсульного белка Y. pestis в свете разработки нового терапевтического средства для профилактики и лечения чумы. Молекулярная медицина, 2010, 4,41-47.

2. Свешников П.Г., Ягудин Т.А., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский C.B., Шемчукова О.Б., Позднякова Л.П., Солопова О.Н. Получение гуманизированного Fab фрагмента нейтрализующего антитела против вируса бешенства. Вестник Московского университета, 2010, Серия 2: Химия. 51(3), 185-190.

3. Kozlov D.G., Yagudin Т.A. Antibody fragments may be incorrectly processed in the yeast Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2008, 30(9):1661-1663.

Тезисы конференций

1. Ягудин Т.А.. Марченко А.Н., Зацепин С.С., Городецкая С.Б., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б., Свешников П.Г., Беневоленский C.B. "Рекомбинантное гуманизованное антитело против F1 антигена Yersinia pestis". Тезисы международной научной школы-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября - 1 октября 2009, Москва-Пущино, т. 1, с. 433-434.

2. Ягудин Т.А.. Клячко Е.В., Морозкина Е.В., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Позднякова Л.П., Свешников П.Г. "Разработка комплексного метода белкового дизайна антител для создания нового поколения иммуноглобулинов против бешенства". Тезисы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». 25 -27 ноября 2009, Москва, с.212

Патентные заявки

1. Городецкая С. Б., Свешников П. Г., Солопова О. Н., Шемчукова О. Б., Беневоленский С. В., Зацепин С. С., Марченко А. Н., Клячко Е. В., Морозкина Е. В., Ягудин Т. А. "Мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном F1 из Yersenia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции Yersenia pestis". Заявка на патент РФ № 2009124225 от 25.06.2009.

2. Городецкая С. Б., Свешников П. Г., Солопова О. Н., Шемчукова О. Б., Беневоленский С. В., Зацепин С. С., Марченко А. Н., Клячко Е. В., Морозкина Е. В., Ягудин Т. А. "Гуманизованные антитела и Fab, связывающиеся с антигеном F1 из Yersenia pestis и способ их получения с использованием дрожжей". Заявка на патент РФ № 2009124226 от 25.06.2009.

Подписано в печать:

21.10.2010

Заказ № 4419 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ягудин, Тимур Анверович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Антитела

1.1.1. Гуморальный и клеточный иммунитет.

Антитела как часть гуморального иммунитета

1.1.2. Строение антител. Вариабельные и константные домены

1.1.3. Константные домены. Тяжёлая цепь и классы иммуноглобулинов. Функции различных классов

1.1.4. Вариабельные домены. Гипервариабельные области. Каркасные области. Предпосылки графтинга

1.1.5. Образование генов функциональных антител. Сигнальные пептиды. Секвенирование

1.1.6. Рекомбинантные фрагменты антител

1.1.6.1. Антителоподобные конструкции

1.1.6.2. Комплексные и биспецифические антитела

1.1.6.3. Антителоподобные структуры

1.2.Применение терапевтических антител в терапии особо опасных инфекционных заболеваний

1.2.1. Механизмы и модели вирус-нейтрализации

1.2.2. Коктейли антител

1.2.3. Терапевтические антитела против чумного микроба

1.3.Бешенство

1.3.1. Эпидемиология бешенства

1.3.2. Роль гликопротеида О в патогенезе бешенства

1.3.3. Профилактика бешенства и антирабические вакцины

1.3.4. Антирабический иммуноглобулин для пассивной иммунизации и антителотерапия бешенства

1.4. Чума

1.4.1. Эпидемиология чумы

1.4.2. Роль антигена в патогенезе чумы

1.4.3. Вакцины против чумы

1.4.4. Пассивная иммунизация и терапевтические антитела против чумы

1.5.Гуманизация антител

1.5.1. Анализ последовательности

1.5.1.1. Антигенсвязывающие области (СБЫ)

1.5.1.2. Канонические аминокислотные остатки

1.5.1.3. Аминокислотные остатки, стабилизирующие антигенсвязывающий сайт

1.5.1.4. Редкие аминокислотные остатки каркасных областей

1.5.1.5. Потенциальные сайты 1Ч-гликозилирования

1.5.2. Трёхмерное компьютерное моделирование структуры антитела

1.5.3. Выбор последовательности человеческой каркасной области

1.5.3.1. Невырожденные белковые последовательности

1.5.3.2. Консенсусные последовательности

1.5.3.3. Последовательности гаметной ДНК

1.5.4. Обратные замены

1.5.5. Перекладка/Маскировка

1.5.6. Перенос областей определяющих специфичность

1.5.7. Применение фаговых библиотек для гуманизации

1.6. Системы продукции антител

1.6.1. Высшие эукариоты

1.6.2. Прокариоты

1.6.3. Грибы и дрожжи

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства"

Антитела являются наиболее охарактеризованным классом белков. Антитела связываются с целевыми молекулами с высокой аффиностью и специфичностью. Терапевтические антитела, на сегодняшний день, являются важнейшим инструментом врачей для борьбы с опухолями, воспалением и инфекциями. В настоящее время сотни антител и их производных проходят клинические испытания для терапии соответствующих заболеваний. Общий рынок терапевтических моноклональных антител составляет десятки миллиардов долларов США.

Хотя в природе антитела продуцируются иммунной системой, потребности в больших количествах антител с уникальной специфичностью стимулировали создание новых технологий для производства препаратов антител в биофармацевтических масштабах.

Гибридомные технологии стали первым методом для создания антител против любого необходимого антигена. Гибридомы получают путём слияния клеток селезенки иммунизованного животного с клетками миеломы. Большинство моноклональных антител произведённых с помощью гибридомной технологии являются мышиными, поэтому они иммуногены при использовании их в качестве терапевтических агентов для людей. Иммунный ответ организма человека против мышиных антител быстро снижает эффективность терапии путём очистки кровотока от мышиных антител [1]. Кроме того простого связывания антител с целью часто недостаточно для терапии иммунных заболеваний и рака. Для этого необходимы эффекторыные функции антител, такие как активация комплемента или клеточный ответ опосредованный связыванием с Бс рецептором, и мышиные моноклональные антитела не могут их полностью обеспечить [2].

Разработка человеческой гибридомной технологии, для продукции человеческих антител сталкивается с трудностями как технического (низкая эффективность иммортализации), так и этического характера (недопустимость иммунизации людей) [1].

Существуют различные методы для снижения антигенных свойств мышиных антител при сохранении аффинности. Первой стратегией для снижения иммуногенности было создание химерного антитела соединением вариабельных доменов мышиного антитела с константными доменами человеческого антитела [3, 4]. Было показано, что чужеродные framework области могут вызывать иммунный ответ [5], поэтому для дальнейшего снижения потенциальной иммуногенности было разработано несколько методов гуманизации антител.

Гуманизация включает в себя модификацию чужеродных каркасных аминокислотных остатков при сохранении последовательностей антигенсвязывающих областей. Первым описанным методом гуманизации была трансплантация (grafting) мышиных антигенсвязывающих областей (CDR) в человеческие каркасные области [6, 7]. Этот метод обычно приводит к значительному снижению или полной потере аффинности, так как некоторые каркасные аминокислотные остатки важны для поддержания конформации антигенсвязывающих областей [8, 9] или даже непосредственно участвуют в связывании антигена [10]. Кристаллографические данные помогают идентифицировать подобные аминокислотные остатки в гуманизованных антителах, их сохранение часто обеспечивает аффинность, сравнимую с нативным антителом [11,12].

Детальная структурная информация недоступна для многих антител, поэтому были разработаны методы конструирования вариабельных доменов, позволяющие сохранять аффинность. Эти методы включают в себя конструирование с помощью компьютера [13], перекладка (resurfacing) вариабельного домена [14], метод позиционного консенсуса [15], метод ближайшего гомолога [16], управляемая селекция [17], трансплантация SDR (specificity determining residues) [18], супергуманизация [19], метод Mix&Match [20].

Антитела, генетически 100% идентичные иммуноглобулингам человека, получают из набора генов антител человека с последующей селекцией с помощью фагового дисплея, либо производят в трансгенных мышах, несущих локусы иммуноглобулинов человека. Многие из антител, полученных таким образом, находятся в стадии клинических испытаний. Тем не менее, в настоящее время метод гуманизации является доминирующим для создания терапевтических антител вследствие его доступности. Поэтому разработка более совершенных методов гуманизации актуальна по сей день. В данной работе гуманизированы нейтрализующие антитела против возбудителей чумы и бешенства.

Чума - инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Yersinia pestis. Имея неограниченный природный резервуар в грызунах, чума до сих пор остается непобежденным заболеванием, вспышки которого регулярно регистрируются в разных точках Земного шара. Лечение антибиотиками бывает неэффективно при заражении резистентными штаммами возбудителя чумы Y. pestis или в случае быстротекущей легочной чумы. Для экстренной нейтрализации воздействия чумного микроба на организм человека целесообразно вводить в кровоток иммуноглобулин, специфичный к Y. pestis. Высокоаффинное мышиное антитело F19 против капсульного антигена F1 Y. pestis показало способность предотвращать гибель мышей, которых заражали летальными дозами вирулентного штамма Y. pestis 231(F1+). Такое антитело является наиболее подходящим кандидатом на роль прообраза терапевтического антитела.

По данным Всемирной организации здравоохранения, более 55 тысяч человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из них- дети до 15 лет [21]. Основным способом борьбы с бешенством на сегодняшний день является иммунизация человека и домашних животных. После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой, ВОЗ рекомендует пассивную иммунизацию, то есть введение анти-рабического иммуноглобулина [21]. Моноклональное 9 антитело (мАт) 1С5 полностью защищало мышей при введении через 3 часа после инфицирования и оказывало более выраженный терапевтический эффект, чем лошадиный антирабический иммуноглобулин [22, 23]. Такое антитело является приемлемым для создания терапевтического антитела против вируса бешенства.

Для решения многих практических задач не требуются полноразмерные антитела. Методы молекулярной биологии позволяют создавать различные рекомбинантные фрагменты антител. Например, Fab-фрагмент, образующийся при обработке молекул IgG папаином, структурно и функционально моновалентен, он обладает способностью связываться с антигеном, но не вызывает их преципитации или агглютинации. Поэтому оценку свойств связывания гуманизированных антитела удобнее проводить на примере его Fab-фрагмента. Дрожжи Pichia pastoris успешно используются для продукции Fab-фрагментов [24-26].

Таким образом, целью данной работы является разработка комплексного метода гуманизации антител на примере мАт против гликопротеида вируса бешенства (1С5) и F1 антигена Y.pestis (F19) и системы их продукции в дрожжах P. pastoris.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антитела

Антитела — одни из самых востребованных молекул на сегодняшний день. Трудно перечислить все области их применения. Не претендуя на всеобщность обзора, следует упомянуть некоторые из них. Так, антитела применяются для изучения клеточных процессов, для изучения взаимосвязи структуры белков и их функций. С помощью антител осуществляется типирование как молекул, так и клеток. Антигенная диагностика инфекций давно вошла в медицинскую практику, как и анализ компонентов крови с помощью антител. Методы аффинной очистки с помощью антител также широко распространены. Возможности терапевтического применения антител поистине безграничны: иммуносупрессия, визуализация и избирательное поражение опухолевых клеток и прочее. Прежде чем перейти к практическому применению антител, необходимо осветить общие вопросы, касающиеся антител.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ягудин, Тимур Анверович

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые определена структура Fv-фрагментов моноклональных антител F19 против F1 антигена Y. pestis и 1С5 против гликопротеида вируса бешенства.

2. Разработан метод гуманизации, позволяющий быстро и эффективно получать гуманизированные Fab-фрагменты. Эффективность метода проверена на мАт F19 и 1С5.

3. Показано, что дрожжи P. pastoris способны секретировать функционально активные мышиные и гуманизированные Fab-фрагменты мАт F19 и 1С5.

4. Установлено, что продукция Fab-фрагмента мАт 1С5 в P. pastoris лимитирована на стадии образования дисульфидных связей.

5. При высокоплотной ферментации дрожжей показано, что уровень продукции Fab-фрагмента пропорционален концентрации продуцирующих клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ягудин, Тимур Анверович, Москва

1. Sa Adu, A., Zumla, A., Human monoclonal antibodies: production, use, problems, in Monoclonal Antibodies-Production, Engineering and Clinical Application, Ritter, M., Ladyman, H., Editors. 1995, Cambridge University Press: Cambridge.

2. Diibel, S., Therapeutic Antibodies — From Past to Future, in Handbook of Therapeutic Antibodies, Dubel, S., Editor. 2007, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co: KGaA, Weinheim. p. 3-16.

3. Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A., Oi, V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigenbinding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:6851-6855.

4. Boulianne, G.L., Hozumi, N., Shulman, MJ. Production of functional chimaeric mouse/human antibody. Nature 1984, 312:643-646.

5. Bruggemann, M., Winter, G., Waldmann", H., Neuberger, M.S. The immunogenicity of chimeric antibodies. J. Exp. Med. 1989,170:2153-2157.

6. Jones, P.T., Dear, P.H., Foote, J., Neuberger, M.S., Winter, G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 1986, 321:522-525.

7. Verhoeyen, M., Milstein, C., Winter, G. Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity. Science 1988, 239:1534—1536.

8. Foote, J., Winter, G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J. Mol. Biol. 1992, 224:487^199.

9. Mian, I.S., Bradwell, A.R., Olson, A J. Structure, function and properties of antibody binding sites. J. Mol. Biol. 1991, 217:1-33-151.

10. Co, M.S., Deschamps, M., Whitley, R.J., Queen, C. Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88:2869-2873.

11. Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 1988, 332:323—327.

12. Queen, C., Schneider, W.P., Selick, H.E., Payne, P.W., Landolfi, N.F., Duncan, J.F., Avdalovic, N.M., Levitt, M., Junghans, R.P., Waldmann, T.A. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:10029-10033.

13. Couto, J.R., Blank, E.W., Peterson, J.A., Ceriani, R.L. Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3: humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitro characterization. Cancer Res. 1995, 55(8): 1717-22.

14. Tan, W., Lam, P.H. Expression and purification of a secreted functional mouse/human chimaeric antibody against bacterial endotoxin in baculovirus-infected insect cells. Biotechnol Appl Biochem 1999, 30:59-64.

15. Shearman, C.W., Pollock, D., White, G., Hehir, K., Moore, G.P., Kanzy, E.J., Kurrle, R. Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor. J Immunol 1991,147:4366-4373.

16. Всемирная Организация Здравоохранения, информационный бюллетень. 2008.

17. Lange, S., Schmitt, J., Schmid, R.D. High-yield expression of the recombinant, atrazine-specific Fab fragment K411B by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J Immunol Methods 2001, 255:103-114.

18. Takahashi, K., Toshifumi, Y., Takai, Т., Ra, C., Okumura, K., Yokota, Т., Okumura, Y. Production of humanized Fab fragment against human high affinity IgE receptor in Pichia pastoris. Biosci Biotechnol Biochem 2000, 64:2138-2144.26.