Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к инсулину и проинсулину человека, их применение

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к инсулину и проинсулину человека, их применение"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 573.6.086.83:612.017.1; 575.22; 547.466

ИОНОВ

Юрий Викторович

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ИНСУЛИНУ И ПРОИНСУЛИНУ ЧЕЛОВЕКА, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

(03.00.03 — Молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории иммунологии Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов Министерства медицинской промышленности СССР.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук В. Л. Юрин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю. И. Козлов; кандидат химических наук В. А. Несмеянов.

Ведущее учреждение — НПО «Биотехнология» Минмедпрома СССР.

Защита диссертации состоится « «£/ » 1991 г.

в « /V » часов на заседании специализированного Совета дсш.фЛ.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИге-нетика.

Автореферат разослан « ^ » й'У'^ьЫ^Л 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темн. Сахарный диабет - одна из самых распространенных болезней( в мире насчитывается около 30 млн. больных диабетом) в основе которой лежит нарушение регуляции обмена углеводов рядом гормонов, в том числе инсулином, секретируемым ос-тровковыми клетками поджелудочной железы. Некоторе формы диабета связаны со сниженным уровнем инсулина или с'изменением его строения), обусловленным аминокислотными заменами в белковой последовательности. Для контроля за состоянием поджелудочной железы, для дифференциальной диагностики различных форм диабета, решения вопроса о полной или частичной инсулиновой недостаточности, диагностики инсулином, выбора препарата для лечения диабета и установления его оптимальной дозы в процессе лечения необходим простой, надежный и быстрый метод количественного определения инсулина в сыворотке крови человека. Б настоящее время таким требованиям удовлетворяют иммунометрические методы анализа.

До сих пор единственным реальным средством продления жизни больных инсулинозависимой формой диабета является парэнтеральное введение инсулина. Вследствие этого человеческий инсулин является одним из важных объектов генной инженерии, и биотехнологии. Поскольку инсулин образуется из своего предшественника проинсу-лийа путем частичного протеолиза ( Steiner et al, 1974), для биотехнологических исследований важно иметь быстрый и простой метод контроля за процессом превращения проинсулина в инсулин.

Цель рчботч. Данная работа посвящена разработке высокочувствительной и экспрессивной иммуйоферментной тест-системы для определения концентрации инсулина в сыворотке крови человека на основе двух моноклональных антител. Работа посвящена также разработке иммуноферментных методов определения концентрации проинсулина или инсулина, секретируемых штаммами микроорганизмов, ко-торыемогли бы обеспечить слежение за уровнем экспрессии гена проинсулина и за эффективностью его процессинга. Решение данных задач может быть обеспечено только на базе достаточного знания о тонкой специфичности антительных реагентов и их свойствах при взаимодействии с инсулиновыми молекулами.

В связи с этим решались следующие конкретные задачи:

1. Получить панель моноклональных антител, направленных к инсулину и проинсулину человека.

2. Определить эпитопную специфичность полученных антител.

-23. Разработать на основе полученных антител иимуноферментные тест-системы для определения концентраций рекомбинантного инсулина и его полупродуктов, а такав инсулина в крови человека.

Няучияя шишка.

1. Получена широкая панель высокоафоипкых моноклональных антител к инсулину и проинсулину человека.

2. Охарактеризованы физико-химические свойства полученных алти-тел, определена их тонкая эпитопная специфичность.

3. Разработан новый надежный метод определещ^,констант связывания мококлональных антител, сорбированных на ..твердую фазу. Практический яипчиипстт,. 1. Создана высокочувствительная имиуно-Фермекгная, основанная на двух мококлональных антителах тест-система для определения концентрации инсулина в сыворотке крови человека.

2. Создан быстрый имнунодаерментный способ определения концентрации инсулина или проинсулина в ку.гьтуральных жидкостях штаммов-продуцентов.

Аттробяпия ре^ультктоп. Апробация диссертации состоялась на семинаре отдела биотехнологии ВНИИгекетики Ниимедпрома СССР.

Результаты работы представлены на I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи-Дагомыс,1988 ) , на Международной школе-кокференции молодых ученых "Биотехнология: теория и эксперимент" (Какдалак-• па, 1989), на I мегдукароднок симпозиуме по б>юа:-;а.'.'итичгским методам (Прага, 1990).

Объем и структура сг.боты. Диссертация состоит из сведения,, обзора литературы, описания материалов и исходов исследования, 3 глав изложения собственных результатов и их обсуждения, заг.лоче-ния. выводов и списка литературы из 95 наименований советских и иностранных авторов. Объем диссертации составляет 120 страниц основного текста, включая 21 рисухок и .10 таблиц.

Список сокращений. ПАФ, НАФ - соответственно полнай и неполный адыовакты Орейкда, НкАт - ноноклональкыс антитела, РИА - ро-■ диоиммукный анализ, ИФА - иинуновермокткый анализ, БСД - бычий сы вороточный альбумин: Ков - константа связывания.

-3-

НАТЕРИАЛЫ И"МЕТОДЫ Аг.тиген». гивотннх. В качестве антигенов исполь-

зовали инсуликы бика, свиньи (Signa), человека и крысы (НПО "фермент"), С-пептид человека, проинсулины свиньи и быка (Novo).

Мишам линии Balb/c (питомник "Столбовая" АМН СССР) вводили в подушечки лап по 50 мкг инсулина человека или быка в ПАФ. На 13-й день то ze количество инсулина вводили в НАФ в подупечки лап и че-pes 3 дня мышей забивали, извлекали подколенные лимфоузлы и клетки лимфоузлов использовали для слияния с миеломой X63.Ag8.653

Получение гибридом и НкАт. Гибридизацию, культивирование и клонирование гибридом, а такяе криоконсервацию клеток проводили как описано в (CoEmitti et al. 1987). Наработку НкАт осуществляли методом "генерации асцитов" (Kohler, Hilstein, 1975) о последующей очисткой НкАт солевым фракционированием и ионообменной хроматографией (DEAE целлюлоза).

Коукугенткяй РИА. Лунки гибкого полихлорвинилового планшета покрывали НкАт (20 мкг/мл)к инсулину или проинсулину человека. По окончании инкубации планшет отмывали и в лункн вносили по 50 мкл 10-кратных разведений конкурирующего агента, в качестве .которого использовались различные КкАт, спиной и бычий инсулины, их А- и В-цепи, рекомбинактный проиясулин человека и его сульфокироианние лроиз1?од:и.";, свиньи, быка в боратном буфере, содег-;а-

1 ' 1^5

кем 13 БСД. Одно~рекэнг.о я лу:'::и вносило-"! яечс:'.'«': "* I инсулин или

npoiEKcy.::..: о~-зг.с. 'л~л--. итгзу,r.i:i>. о::инь:?. 30 и-:,« «ученого инсулина

или грс чсло:з ::-а я тг:;-v? буфере . 1

час,, от:.:/;»,*:!, :v:?pe3ci.-H и лроечитизглк з гс-ттчичп .

ueiriv j1:-.:-4 [г.!:' : _:опо'г.::: г.^оьн :>:-•• :: : лдност^л-

Д!«ЙЯ"?» .' _7"цспгрезой ; яотод, осяовеим'.'Л -н:\ npwjis-

:tз::и:<- «уух ясяоклтхм j>stvK ккгнтол.

~ г.^езол^.-.н по методу, p&3pc3j.a:>s:u:i;' л хки Т.П. , "_>:::; Г*.Л., fSO) :i г ^г^Сло опи-

санному "5 .

ГЛ-Г':!/'',""---^.-!":;..' челс.;ока, or::!.;>:<, Сг.т.а, !:рзипсули::з и С-лапг:;дд с i;ciro.ib-io.*;:i'!Hori хворлтт&-Т (Greenwooü

et al, ISSo).

HMl")_VPrV-' -:ТЛ'."1 ПЯР_0Г.ГИ-

ироао.^и.-м .та :тсрио,>;атн'сну погоду ("ilson 4nd Hakane, 1978) с икзциякн.

Электроаорез' и изоалектроаокусироввние белков проводили по стандартным методикам (ЬаеювИ et а1, 1970, Righвttí еЬ а1, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение гибридом, продуцирующих моноклокпльные .игтитвл?: к инсулину чедпвекя. инсулину вика и прпииоулину человека.

Для получения НкАт к инсулину человека было проведено пять слияний иммунных лимфоцитов с клетками миеломы X63.Ag8.653. Пор-ричные культуры тестировали с помощью (РИА), начиная с 10-ого дня после слияния: антитела из культуральных сидкостей, иммобилизованные на твердую «разу с помощью антимышиных антител исследовали на связывание меченого йодом инсулина. Метод тестирования позволял отбирать те гибридомы, которые продуцируют антитела, связывающие инсулин из раствора. Культуры клеток, которые при вторичном скрининге оказались положительными, клонировали методом лимитирующих разведений. Выросшие положительные клоны наращивали для консервации в жидком азоте и для введения Б мышей, с целью наработки асцитов. В результате была получена панель из 15 НкАт, способных с высокой эффективностью связывать инсулин человека (Табл.1).

Моноклональные антитела к инсулину быка получалм так Ее, как и антитела к инсулину человека, за исключением того, что мышей иммунизировали инсулином быка. Первичные культуры, которые секрети-ровали антитела, связывающиеся с инсулином быка, тестировали вторично на связывание антител с инсулином человека. В результате была получена гибридома продуцирующая антитела, связывагяие

инсулин быка и не связывающие инсулин человека (Табл.1).

Для получения моноклональных антител специфичных к проииоули-ну человека мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали рекомбинактных про-инсулином человека. После анализа первичных культур на продукцию антител, связывающихся с рекомбикантным проинсуликом, 67 самых активных культур тестировали вторично на способность антител к взаимодействию о инсулином человека. Те 7 первичных культур, которые Секретировали антитела, связывюдиеея с проинсулинон н® связываю-сиеся с инсулином человека, клонировали методом лимитирующих разведений. В итоге,- было получено 7 стабильных клонов от разных первичных культур, секретирующих НкАт против проинсулика человека, не имеющие перекрестного связывания с инсулином человека (Табл.1).

2.?.. Изучение иммунохимических свойств НкАт'.

Для исследования физико-химических свойств полученных НкАт к иксуликам быка, человека и проинсулину человека данные антитела

выделяли из асцитных жидкостей с помощью солевого фракционирования и ионообменной хроматографии.

Для того, чтобы убедиться, ^то МкАт являются продуктами независимых клонов, сульфатные фракции анализировали с помощью изоэ-лектрофокусирования в тонком слое полиакриламидного геля. Определение изотипов полученных НкАт проводили с помощью ИФА с использованием изотипспецифических антисывороток, коньюгированных с перок-сидазой хрена (Са1Ь1осЬеп). Данные представлены в табл.1

Перекрестную специфичность МкАт определяли о помощью РИА с 125т

использованием меченых I инсулинов человека, свиньи, рыка, а также проинсулина и С-пептида человека. МкАт сорбировали на поверхности лунок гибкого 96-луночного планшета и в лунки вносили вышеуказанные антигены. В ходе проведенной серии экспериментов было показано, что все МкАт полученные к инсулину человека имеют перекрестную специфичность к инсулинам быка, свиньи и к проинсулину, но не к С-пептиду человека.'Анализ специфичности МкАт ЬР1, полученных в результате иммунизации животных бычьим инсулином, показал, что эти антитела способны перекрестно взаимодействовать лишь с инсулином свиньи, но не о инсулином, проиноулином и С-пептидом человека.

Исследование специфичности НкАт, полученных к проинсулину человека, подтвердило отсутствие перекрестной реактивности к инсулину человека, что соответствовало характеру отбора гибридомных клонов в ходе их получения. Вместе с тем, данные НкАт оказались не способны взаимодействовать с С-пептидом человека,.а также с инсу-линами всех использованных видов (Табл.1).

Важнейшей характеристикой антител является их аффинность взаимодействия с антигеном,.количественно определяемая константой связывания. Для определения констант связывания МкАт мы использовали разработанный нами метод, подробно описанный в диссертации. Особенность метода заключается в применении лангмюровской формы записи уравнения реакции антиген-антитело:

1/АГ - = К * АТ/АГ - К * АТ ^/АГ

своб св связ св своб связ

где АТ - концентрация антигенсвязываюдих центров антител, АГсвоб и

АГ _ - соответственно концентрации свободного и связанного анти-свяэ

телами антигена при равновесии реакции, ~ концентрация не-

занятых антигенсвязываюдих центров при равновесии реакции, Ксв -

-константа связывания антител. Отношение АТ/АГ определяется из

... связ

Таблица!. Физико-химические свойства полученных антител.

МкАт Имму-ноген

Назв.

Изо-тия

Ксв

р1 специфичность ■

инс икс икс прочел быч cr.nu кнс

1 инс, .чел. ЕБЕ5 18Й1 7,5х109 6, 7 + + • + +

2 инс, .чел. 04В8 1801 1,4x10® 6, 6 + +

3 инс. .чел. 03Е7 . 16<Н 6,3x10® 6, 4 + + + +

4 инс. .чел. 06С4 1661 8,1x10® 6, 5 + + + +

5 инс. .чел. 01С9 1801 С, 3 + + -г-

6 инс, .чел. Г2в1 6, 4 + + +

7 икс, .чел. В12Е7 1бН + + +

8 инс, . чел. А1С1 1,8x10® 6, 5 + + + +

9 инс, .чел. А8С6 1601 7,2x10® 6, 4 + V + +

10 инс, .чел. СЗРЮ 1й01 6, 8 + + + +

11 инс. .чел. Е5ВЗ 1802а 7, 0 + + г

12 инс .чел. А2С10 1801 6, 8 + * + +

13 инс. .чел. Н10А2 1е01 5,2x10® 7, 2 + + + +

14 инс, .чел. Р1В11 16« + + . - + +

15 инс. .чел. вЮРЗ 5,7x10® 6, 4 + ч + +

16 инс. .быч. ЬП 12й1 2, 2x10® 6, 8 + + -

17 проинс. ЗА10 1е01 3,1х107 - - . - - " +

18 проинс. Ю4 1861 2,6х107 - - - +

19 проинс. АЗ '. 1801 1.7х107 - - - . " +

20 проинс. 5010 1801 - - - - ' +

21 проино. ЗА1 1в<Я 1,1x10® - - - ■т

22 проинс. 408. • 1361 - -

23 проинс. СЮ - 1ев1 - - -

зависимости связывания меченого антигена с антителами иммобилизованными на поверхности лунок планшета для микрвтитровакия.- Концентрация несвязавшегося с антителами (свободного) меченого антигена определяется по связыванию его с антителами во втором лланне-те с помощью калибровочной кривой. Откладывая по одной оси ведичи-

ны АТ/АГ , а по другой соответствующие обратные величины кон-свчз

цеятрацийсвободяого антигена, согласно уравнению получим прямую, тангенс наклона которой равен константе связывания. Константы связывания получены* антител представлены в табл.1

?.. Определен«» этгитоттной специфичности ^<кАт и локялизачия

Для выяснения тонкой эпитопной специфичности НкАт к инсулину человека использовался конкурентный вариант РИА , в котором за 125

связывание с меченым I инсулином конкурировали пары НкАт, одно из которых сорбировано на поверхности лунок гибкого 96 ячеечного планпета, а другое, в избыточной концентрации (500 мкг/мл) находится в жидкой Фазе вместе с меченным инсулином. В экспериментах

такого типа взаимодействие ^•'х инсулина с антителом, сорбированным на твердую фазу, свидетельствует о возможности одновременного связывания с инсулином исследуемой пары антител, и таким образом о пространственной разделеиности детерминант антигена, выявляемых КкАт. Наоборот, отсутствие связывания меченого инсулина с твердофазным антителом свидетельствует о перёкрываемости эпитопов для данной пары антител. По данным конкурентного связывания все 15 НкАт можно разделить на пять, отличаювихся по эпитопной специфичности групп. Антитела Е6Е5 и СЗЕ10 , которые способны одновременно связываться с антителом 04В8 и йонкурируют за связывание со всеми остальными антителами к инсулину,образуют первую группу антител. Ко второй группе относится антитело Э4В8, которое конкурирует со всеми антителами, кроме Е6Е5 и СЗК10. Представителем треп и. группы является антитело 03Е7, которое может связываться с инг/лином одновременно с антителами 06С4, А8С6, А2С10, и конкурирует со всеми остальными антителами. Соответственно МкАт 06С4, А8С6 и А2С10 образуют четвертую группу антител, которые конкурируют со всеми остальными антителами, кроме антитела 03Е7. Наконец к пятой группе относится 8 антител, конкурируюиих со всеми антителами. Схематически, конкурентные взаимоотнояеиия пяти групп антител представлены на рис.1. Эпнтопы изображаются в виде кругов, перекрывание пло-иадей которых отображает их перекрывание. Отсутствие перекрывания указывает на пространственную разобщенность эпитопов, достаточную для неконкурентного, одновременного взаимодействия двух НкАт, от-личаюаихся по специфичности.

Для определения расположения антигенных детерминант полученных антител на молекуле инсулина мы применили комбинированный под-

Рис.1 Диаграмма конкурентного взаимоотношения S-ти групп НкАт к инсулину человека. 1 -Б6Е5, C3F10; 2 - D4B8; 3 - D3E7; 4 -D6C4, А8С6, А2С10; и 5 - D1C9, F2G1, В12Б7, A1G1, G10F3, Б5ВЗ, Н10А2, F1B11.

ход, заключающийся в использовании схемы взаимного расположения антигенных детерминант, изображенной на рис. 1, пространственной модели молекулы инсулина, анализа конкурентного взаимодействия антител с антителом, антигенная детерминанта которого определена достаточно точно, а также в использовании анализа конкуренции различных инсулинов, отличающихся точечными аминокислотными заменами, за связывание с антителами. При этом мы исходим из предположения, что точечные аминокислотные замены в молекуле инсулина не изменяют конформации лолипептидных цепей С что подтверждается данными реит-геноструктурного анализа.'для бычьего и свиного инсулина, отличающихся двумя заменами) и поэтому отмена связывания, иди ослабление его благодаря аминокислотным заменам, означает вхождение соответствующих аминокислот в антигенные детерминанты. В таблице 2 изображены позиции в которых отличаются между собой инсулины мыши, свиньи, человека и быка.

Инсулин человека, который мы использовали для иммунизации мышей, отличается от .инсулина мыви в позициях ВЗ, ВЗО и А4. Поэтому можно было ожидать, что аминокислоты в этих позициях входят в антигенные детерминанты для НкАт к инсулину человека. Однако известно, что при иммунизации родственным белком Могут возникать аутоиммунные антитела, которые связывают собственный■белок, являющийся аналогом имнукогеиа (Wilkin & Nicholson, 1984). Чтобы выяс- -

-9-Таблица 2

Аминокислотные замены между инсулинами мыши, человека, быка и свиньи.

происхождение позиция

инсулина -----------------------------------

A4 А8 А10 ВЗ B3Û

Мыяь/крыса Asp Thr Ile Lys Ser

Человек Glu Thr Ile Asp Thr

Бкк Glu Ala Val Asp Ala

Свинья Glu Thr Ile Asp Ala

нить, какие из полученных антител к инсулину являются аутоиммунными, а какие взаимодействуют с антигенными детерминантами включающими вминокислоты в позициях ВЗО, ВЗ и A4 проводили конкурентный анализ, в котором меченый инсулин человека конкурировал за связывание с антителами с немечеными инсулинами человека и крысы (инсу-лины мыши и крыса идентичны). Данные представляли в виде величины отноиения концентрации мшзиного инсулина, вызываюпей 50Х ингибицию связывания антителами меченого инсулина человека к концентрации человеческого инсулина, вызывающей 50 Z ингибицию связывания меченого инсулина- человека (01jg)- Отношение большее 1 означает ослабление связывания антитела с мьшикым инсулином по сравнению с человеческим, из чего следует, что в формировании антигенной детерминанты для данного антитела принимают участие аминокислоты, по который мысиний инсулин отличается от человеческого. В таблице 3 приведены -данные экспериментов по конкуренции мышиного и человеческого инсуиотов для 15-ти антител к инсулину человека.

Как видно из таблицы, только два антитела - Е6Е5 из первой группы и A1G1 ira пятой группы - практически не связывают мышиный инсудин. Это говорит о том, что в антигенные детерминанты для этих антител входят позицга или ВЗ, или ВЗО, или A4, по которям инсулин человека отличается от инсулина мыши. Антитела D4B8 второй группы, D3E7 третьей группы, D1C9, G10F3 и F2G1 пятой группы связывают крысиный и человеческий инсулины с равной пффипиостыэ, из. чего можно заключить, что данные позиции скорее всего не входят в антигенные детерминанты. Остальные антитела связыэают мызиный инсулин с мень-пей аффинностью, чем человеческий; это значит, что вышеуказанные позиции должны входить в антигенные детерминанты антител.

Таблица 3. Отношение концентраций инсулина кыши и человека, вызывающих 50Х ингибицию связывания 01^^ антителами меченого инсулина человека.

1 1 |НкАт| 1 I Е6Е5 C3F10 D6C4 А8С6 А2С10 D3E7 1 04В8 |

1 1 lOI50l >1000 4.0 1.8 2.2 2.2 1.0 1.0 • |

1 1 |НкАт| D1C9 G10F3 F1B11 F2G1 Н10А2 В12Е7 A1G1 |

1 1 lOI50l 1 1 1.0 1.0 6.3 1.0 4.5 2.8 >1000 | . 1

Антитело LF1, лолученное к инсулину быка, имеет перекрестную специфичность к инсулину свиньи и ке имеет перекрестной специфичности к инсулину человека. Око также не связывает мышиный инсулин. Из этого можно заключить, что антигенная детерминанта этого антитела включает С-концевую 30 аминокислоту B-цепи, так как инсулин свиньи отличается от инсулина человека заменой аланина на треоннн в положении В30 (Roeenwasser et al,197ö) Из компьютерной пространственной модели инсулина свиньи, построенной на основе данных рентгеноструктуркого .анализа кристаллов инсулина, к представляющей каждый атом как жесткую .сферу с характеристическим Ван-дер-Вааль-совым радиусом (Shroer et al,1983) , видно, что аминокислоты в позициях A4 и ВЗО пространственно сближены. Для -выяснения расположения антигенных детерминант антиинсулиновых НкАт относительно детерминанты для антитела LF1, включающей позицию ВЗО, и позиций A4 и ВЗ проводили конкурентный радиоинмунный анализ, в котором за . связывание меченого свиного инсулина конкурировали МхАт к инсулину человека; иммобилизованные на твердой фазе и возраставшие концет-рации антитела LF1. Ингибиция связывания меченого свиного инсулина наблюдалась для антител второй и четвертой групп. Связывание с инсулином антител.пятой группы ингибировалось антителом LF1 в разной степени. Связывание антител D1C9, F1B11, F2G1 и G10F3 полностью икгибировалось антителом LF1, а антител Е5ВЗ, A1G1 и Н10А2 не ингибировалось антителом LF1. Связывание антитела В12Е7 ингибировалось большим избытком антитела LF1 на 60%. Для антител первой и третьей групп ингибиции не наблюдалось. На рис.2 изображены кривые ингибиции для антител D4B8 и D6C4 из второй и четвертой группы, для антител D3E7 и Е6Е5 из первой и третьей групп и для антител Н10А2, D1C9 и В12Е7 из пятой группы. Из данных по ингибиции связы-

а о

100-6

0-|—I 111 nrq—I 11 niiq—гтпт Ю"1 10-* 10"' 1

I I llll!l|—i I 11 llllj-1 | llllltf

10 10* 10* гонцейтрация ингибитора мкг/ил

Рис.2 Связывание меченого инсулина антителом LF1 в присутствии возраставших концентраций антител, принадлеяавих к 5-ти группам специфичности. (-Q-). - D4B8, (-а-) - DSC4, (-СО - D3E7, (—Qi - Е6Е5, - Н10А2, (-9-) - D1C9, - В12Е7

вания меченого инсулина антителом LF1 можно сделать вывод, что антигенные детерминанты для антител второй и четвертой групп расположены вблизи Н-концевой аминокислоты В-цепи, причем детерминанты для четвертой группы антител, чтличающих мышиный инсулин от человеческого, должны включать в себя анинокислоту в позиции А4, так как она, согласно пространственной модели находится поблизости от аминокислоты в позиции B30. Антигенные детерминанты для антител Е6Е5 и C3F10, принадлежащих к первой группе антител должны включать позицию ВЗ, отдаленную от позиции ВЗО, распознаваемой антителом LF1, так как эти антитела отличают инсулин мыши от инсулина человека и не конкурирует с антителом LF1. Что касается антител пятой группы, которые конкурируют за связывание о инсулином со всеми антителами других групп и друг с другом, то они оказались неоднородными по своей тонкой специфичности. Среди них имеются антитела, как конкурирующие с антителом LF1, так и не конкурирующие, как отличающие мыаихый инсулин от человеческого, так и не отличаю-

щие. Перекрывание эпитодов, распознаваемых антителами пятой групп« с эпитопами, распознаваемыми антителами остальных групп может иметь место не только.из-за строго определенной локализации »питс— пов для антител пятой группы, но и из-за больной площади поверхности взаимодействия антител и инсулина. Согласно последним представлениям о природе антигенной детерминанты (Laver et al, 1990), . поверхность, накрываемая антигенсвязываювим центром антитела монет иметь площадь 650 - 900 квадратных ангстрем. Сама же молекула инсулина, согласно пространственной модели, построенной на основа данных рентгеноструктурного анализа (Shroer et al, 1983) представляет собой компактную глобулу размером 35 х 30 х 20 X. Если считать, что конкуренция между антителами за связывание с антигеном обусловливается перекрыванием их эпитопов, то мы, используя диаграмму конкурентных взаимоотношений МкАт Ъ-ти групп специфичности, изображенную на рис.1, а также данные по конкуренции антител с антителам LF1 и инсулинов друг с другом зв связывание с антителами, можем с хорошей точностью локализовать некоторые эпитопы, распознаваемые антителами пятой группы и антителом D3E7 третьей группы.

С целью уточнения расположения антигенных детерминант распознаваемых полученными антителами сравнивали характер икгмбиции связывания этими антителами меченого инсулина человека »озрастаюиимн концентрациями инсулина человека, свиньи и быка. На рисунке 3 иэо-

125

Сражены кривые ингибиции связывания меченого I человеческого инсулина ихсулинами человека и быка о антителами из всех пяти-групп (на рисунке предотавлехо по одному антителу от каждой группы). Инсулин свиньи ихгибировал связывание меченного инсулина человека так же как иксулик быка (кривые ингибиции ха графиках не представлены). Из одинакового хода кривых ингибиции иоахо сделать вывод, что антитела воех пяти групп не видят различий между ихсулинами свиньи, человека и быка. Из этого можно заключить, что аминокислоты в позициях ВЗО, А8 и А10, в которых имеются отличия между этими инсулинами, не входят ь антигенные детерминанта антител, полученных к инсулину человека. Нормальный рост асцитоз у мышей, которым вводили гибридомы, говорит о том, что образующие область связывания с рецептором инсулина инвариантные остатки Val В12, Туг В16, Phe В24, Phe В25 и Туг В28 (Brange et ni, 1988), которые, предположительно, находятся в области рецепторног.о связывания, не входят в антигенные детерминанты полученных антител.

Таким образом, совокупность вышеприведенных экспериментальных данных позволяет нам расположить выявляемые НкАт эпитопы на проек-

Н10А.2

Ю J 10 t0 1 10

жесуяжя ьпх/жп

D4B8

нищ lililí iiniiq IIIII:i| 10 10 10 *' 1 10 ЖДЦ-JJUm жхг/ыл

ТОО •

«

я

3 75-q

S 504

о

23-

0-

Е6Е5

\\

Л

Ч.

V—4

liniq iiiiq 141>ц lliiiq !04I0'j10j Г 10

100 7550

25 -1

1"||ЧЦ |1!Щ I шиу I ППЦ

10"* 10 ■* Ю 1 '10 т/жя

D6C4

i i |Н,ц i !нц i niq 10 -1 10-* 10" 1 10 r/iai

Рис.3 Ихтибиция связывания меченого инсулина человека с £~г ИкАт, при-валлехавими к разжим группам специфичности, возраставшими концентра-циями немеченых иисулннов человека (-a-a-) и быка (-0~<У).

7)!С9

2ЧВ8

А1&1

ь.6£Ь

Рис.4 Респояожекие гипотетических эпигонов, распознаваемых НкАт, на проекции молекула инсулина, построенной на основе манных рентг еноструктур-ного анализа.

ции молекулы инсулина, построенной на основании данных рентгеност-руктурного анализа. На рис.4 показано расположение выявляемых антителами к инсулину человека эпитопов с указанием некотррых позиций полипептидных цепей на проекции молекулы инсулина.

3 - Локализация антигенных дртерминант НкАт. получпикых к проинсулину человека. •

Для выяснения тонкой эпитопной специфичности НкАт, полученных к проинсулику человека и не имеющих"перекрестной специфичности к инсулину человека, конкурентный радиоиммунный анализ проводили так же, как и в случае анализа НкАт к инсулину. Оказалось, что все антитела взаимно ингибируют друг друга, было установлено также что,

125

что ни одно из антител не связывает меченого I С-пептида человека. Из этого можно сделать вывод, что антигенные детерминанты для всех 7 НкАт к проинсулину человека расположены' в месте соединения С-пептида о А- или В- цепью инсулина. Проинсулины свиньи и быка не ингибиро&али связывания меченного проинсулина человека со всеми НкАт к проинсулину человека. Так как в позиции ВЗО, где на-

ходится место соединения С-пвптйда и В-цепи, проинсулины свиньи и быка отличаются от проинсулина человека, можно утверждать, что антигенные детерминанты для КкАт к проинсулину человека расположены в месте соединения В-цепи и С-пептида. Из 7-и НкАт к проинсулину человека при сорбции на твердую фазу лучше всех связывают проинсу-лин из раствора НкАт ЗА1 и 1(14. Для МкАт ЗА1 и Ю4 проводили инги-бицию связывания меченного проинсулина возрастающими концентрациями антител (по одному из каждой группы антител), получен.чых к инсулину человека. Было установлено, что антитело ЗА1 конкурирует за связывание с проинсулином с антителами 04В8 и 06С4 и не конкурирует со всеми остальными антителами к инсулиновой части молекулы проинсулина, а антитело 1(т4 конкурирует за связывание с проинсули-ном только с антителом 04В8. На рис.5 показано ингибирование связывания меченого проинсулина антителами 04В8 и 06С4. Ны ложем сделать вывод, что антигенная детнрминанта для антитела ЗА1 сдвинута больше в сторону инсулиновой части молекулы, чем детерминанта для антитела 104,а так же о том, что детерминанта для МкАт 04ВЗ расположена блите к С-концу В-цепи, чем детерминанта для НкАт С6С4.

Для НкАс ЗА1 и 1в4 проводили конкуренцию связывания мечен-125т

иого I яативного ттооинсулина возраставшими концентрациями проинсулина с воостанс^кенхыми и сульфонированными Б-Э связями. Установили, что антитело ЗА1 не взаикодествует с денагурирс-эанкь'.м про-инс/лином, а антитело Ю4 взаимодействует но с меньшей аффинностт, чем с нативным провисулиион. (рмс. 6) . Эти данные подтверждают :1ап вывод о том, что детерминанта для ЙкАт ЗА1 смешена к инсулиновой части молекулы проинсулина, так как она зависима от конформации проинсулина.

3. Соплание н^цнянтов иимукоаврмектного анализа для опре-

Приведекные вызе данные позволили подробно опясать свойства полученных антител и явились базою для создания инмунометрических методов определения концентраций инсулина и прсинсулнна. На основа имевшейся информации были выбраны пары антител для разработки дву-сайтовых иммунофернектных методов определения концентраций инсулина и проинсулина, продуцируемых штаммами микроорганизмов, а также для создания иммуноферментного диагностикума для определения уровня инсулина в крови человека. Так на основе антиинсулиновых МкАт 03Е7 и 06С4, ииеюзих перекрестную специфичность с проинсулином человека был создан двусайтовый иммуноферментный способ определения

. ЗА1 1С4

Рис.5 Связывание антителами ЗА1 и ю^ кэчаного проинсулина в присутствии возрастающих концентраций антител 04В8 (-о-в-) и 06С4 (-"-*-).

ЗА1

Рис.6 Связывание мачаного проинсулина антителами ЗА1 н 1й4 в присутствии возрастании* концентраций немеченых нативного (-4нз-> -и сульфоннрованного проинсулинов.

проиксулина или инсулина в культуралышх жидкостях штаммов-поду-центов, ртличающийся простотой в проведения анализа, быстротой и необходимой чувствительностью. Время от внесения образцов до получения результатов не превышает 2-х часов.

На основе антипроинсулинового антитела ЗА1 и антииксулинового антитела Е6Е5 был создан метод определения концентрации проинсули-на в культуральных жидкостях штаммов продуцентов, не распознаюций инсулин человека. Этот биотехнологический метод анализа обладает теми же достоинствами, чтои вышеприведенный метод.

На основе высоковффинного антитела Е6Е5 и не конкурирующего с ним антитела 04В8, меченого пероксидазой хрена, был создан двуеай-товый инмуноформентный способ определения концентрации инсулина в сыворотке крови человека.

При разработке клинического варианта ИФА, который дальше мы будем называть теот-сиотемой была поставлена задача обеспечить следующие основные требования: 1> максимальная простота процедуры анализа (одна иммукохимическая стадия), 2) быстрота проведения аяалиэв (не бодее двух часов), 3) возможность достоверного определения инсулин л в цирокон диапазоне концентраций (2-200 мк.МЕ/мл) на основе линейной или близкой к линейной калибровочной кривой (согласно международному стандарту ВОЗ, 1' нг инсулина равен 25 мкНЕ), 4) высокие параметры аналитической надежности ( чувствительность не менее 5 мкМЕ/мл, воспроизводимость в пределах 153!, линейности разведения еыворот":,, 5) минимальный объем анализируемых образцов (не более 20 мкл) 8) кореляция результатов измерений данным методом с результатами измерений коммерческим диагносгикуиом, применяемым в клинической практике. Основные характеристики тёст-систены и основные результаты проведенных испытаний приведены ниже.

вочная кривая для определения инсулина в объеме образцов 20 мкл. Как видно из рисунка калибровочная кривая близка к линейкой на всем диапазоне физиологических концентраций инсулина.

Линейность разделения сывороток. Несколько образцов сывороток с высоким содержанием инсулина разводили 0,2Н боратнын буферным раствором, содержлаем ЗХ БСА в 2, 4, и 8 раз. Зависимость определяемых методом ИФА значений концентраций инсулина в разводимых сыворотках ( в мкЕД/мл) от степени.разведения сывороток близка к линейной: (рис 8).

Чут*стг»мтрзтъностъ тест-системы. Нижнй предел чувствительности определяли как минимальную концентрацию инсулина при которой зна-

1.50 -н

150

I I I I | I I I 1 | I I ) I | I I I I | I I I I

.0 50 100 150 200 250

концентрация инсулина ихЫЕ/Ъсп

100-

ё 50-

I ! 1 I I I | I 1 I I I I I 1 I | I 1 I

0.0 0.5 1.0

разведения сывороток

Рис. 7.Калибровочная кривая для определения концентрации инсулина нетомом ИФА в сыворотке крови человека в объеме образцов 20 мкл.

Рис.8 Зависимость определяемых методом ИФА значений концентраций инсулина в разводимых сыворотках от степени разведения сивороток.

чекие оптической плотности соответствующее этой концентрации превышало значение оптической плотности, соответствующей нулевому контролю с на 2 средне-квадратичных отклонения. Нихлий предел чувствительности, определенной таким образок, составляет 3-5 нкМЕ/ мл при проведении анализа в в объеме 20 мкл. Таким образом, чувствительность нашей тест-системы позволяет определять концентрацию инсулина в малых объемах сыворотки, что дает возможность использовать для анализов капиллярную кровь кз кончиков пальцев.

Воепронзпппинпстъ. Воспроизводимость определяли следуюаи* образок. Вычисляли Б - среднее стандартное отклонение и КВ - коэффи-

Таблипа 4. Воспроизводимость измерений концентрации инсулина тест-системой.

Средняя концентрация инсулина (икМЗ/мл) ¡Число иэ-!мерений. S (мкМН/мл) кв(Х) :

148,2 : 10 3 5,4 ;

57,6 ! 10 5 8,7 :

12,3 : ю 1,5 12,2 ;

Табл.5 Процент открытия добавленного в образцы с.иво-рстки крови инсулина. Концентрация инсулина дана р мкМЕ/мл.

Концентрация Концентрация!Измеренная Вычисленная Процент

инсулина в иясулииа з концентрация концентрация открытия

исходной сы- .'.г.ъаэленном инсулина. инсулина.

воротке. ооъиме обра- - ■

зца.

47 -- - — — --

о 50 43,5 103

100 72 .73,5 99

' 200 116 123,5 94

12 . — — ...

50 33 31 1U6

100 57 56 101

200 102 1С6 96

62

25 300 200

45 77 119

43,5 31 131

104 95 91

циент вариации в 10 повторных измерениях концентрации инсулина в сыворотках с высоким, средним, и низким содержанием гормона. Как видно из таблицы 3 коэффициент вариации не превышает 15 Х.

Тест ня " открытие" С я ппитивипстт, V К сывороткам добавляли равные объемы образцов с известными концентрациями инсулина. Определяли концентрации инсулина в исходной сыворотке и в получившихся смесях. Процент открытия определяли по формуле: % открытия = полученное значение/вычисленное значение хЮОХ. Как следует из представленных данных (табл.4) X открытия лехит в пределах 100+. 10%, что соответствует требованиям, предъявляемым подобным способам определения концентраций.

Рио.9 Определение концентрации инсулина в 30 образцах сывороток методами ИФА и РИА.

Корреляция результатов определения концентраций иягу.и-ча хон-мерчсским РИА диагмоотикунон и радраЯотятгой нпми тест-сисч емой,

Измеряли концентрацию инсулина в 30 образцах сывороток инму-нофермектиой тест-системой и коммерческой РИА тест-системсй (Опытное производство Института биоорганической химии АН БССР). По оси абсцисс откладывали значения концентраций инсулина, полученные РИА тест-системой, по оси ординат - ИФА тест-системсй. На рис.9 изображены экспериментальные точки и прямая, наилучпин образен проходящая через них. Прямая описывается формулой у = -1,4+0, Й2:<. Коэффициент корреляции г равен 0,91. Отличие тангенса угла наклона полученной прямой от 1 может объясняться тем, что моноклональхые антитела, применяемые в ИФА тест-системе, имеют более узкую направленность, чем поликлональные антитела, применяемые в РИА тест-системе, которые могут распознавать не только инсулин и про-иисулих, но тзк*е и присутсвуюцие в сыворотке инс.уличпподобные факторы роста.

Таким образом., в результате проведенной работы была получена иммуноферментная тест-система, позволяющая определять концектрацис* инсулина в сыворотке крови человека по принципу одностадийного двусантового (сандвич) иммунометрического анализа о использованием двух НкАт различной специфичности. Раз'рвботанная тчет система полностью удовлетворяет всем вышеуказанным требованиям.

внаоды

1. Получены панели моноклональных антител к. инсулину и проинсулину человека. Охарактеризованы фиэико-химическиг свойства антител и оценена их специфичность к инсулинам и проинсулинам разной видовой принадлезности.

2. С пемогоыо комбинированного подхода-, основанного на анализе прямых и конкурентных взаимодействий различных антител с мзгсулинами разных видов, а также пространственной модели инсулина, описана локализация антигенных детерминант, выявляемых полученными НкАт.

3. Совокупность данных показывает, что даже такие консервативные молекулы кик инсулин могут при иммунизации индуцировать антительнкй ответ, отличающийся широким разнообразием эпитопной специфичности.

4. Разработан новый метод определения констант связывания мо-ноклональных антител, сорбированных на твердую фазу, преимуществами которого являются: а) концентрация свободного антигена измеря-

ется непосредственно с помощью калибровочной кривой, в) па определение концентрации свободного антигена ко влияют процедуры, приводящие к сдвигу равновесия реакции антиген-антитело, в) значения, откладываемые по оси х и по оси у при построении графика, кото'-

рого находят величину К. , определяются независимо. Нетод пригоден

св

для определения констант связывания антител, находящихся в г.ульту-ралькой жидкости.

5. Разработан высокочувствительный и быстрый, основанный на моноклональных антителах двуоайтовый иммуноферментный метод определения концентрации инсулина в сыворотке крови человека. Разработаны также быстрые, основанные на моноклональных антителах дсусай-товые иммуноферментные методы определения концентраций проиксулика и инсулина, продуцируемых штаммами микроорганизмов.

Список работ, опубликованных по тем р. писсертации.

X. Ионов Ю:В., Юрин В.Л. Способ определекня кскитант связывания моноклональных антител, сорбированных на тг-ердую Фазу. Биотехнология,. 1, стр. 36-38, 1890.

2. Xonov Y.V., Yurin V.L., Епгуве iccunoascay tests for human insulin and proinsulin quantification based or. monoclonal antibodies. Abstract, in Situpoaiuu c¡: fcioi :¡c.ly tinel aie I hods, Prague 1SS0.

3. Ионов Ю.В. Ноаий i\ » v.ep оль' ; ■•■"ыос :.o::c:'.~o-налх.кьх ангитол. Тезисы докладов ->orc est <..'...'.troro :;'::'у::0,лз-гического еьезда. 15-17 нояЗря 198Пг., Сйч',:.

4. Егамк гибридных куль «¡¿li^y к.'.огс;: Мао ■ Dusculus - продуцент моношокалышх сштитг.-' ьзгс; .t:¡;:y j.-озг::-.. Иоков Ю.В. , Врик В.Л.- и 4310182/13; Заяз,7. 3.G4.C0; Паг.оькг. решение от .-30.1.0.90.

5. Сг&им гибридных культивируемых 1:лотс". ¿.¡i-íci i::;:; ¡;us aesculus - продуцент коз:ог.локалькь::с пг.т.;т:.г, ;; .-оегг^, Ионов 13.В., «Срин В.Л.- U 4810181/13; Залгл. 3.0Í.00: По.-ст.;:т. решение от 20.10.90.