Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

На правах рукописи

ЕЗДАКОВА Ирина Юрьевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНУ КЛАССА М РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ю. Н. Федоров

Официальные оппоненты:

Засл. деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Л. П. Дьяконов (ВИЭВ).

Доктор биологических наук, профессор И. И. Бенедиктов

(ВИГИС).

Ведущее учреждение: Московская ветеринарная академия им. К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится » 1994 г.

часов на заседании Специализированного Совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, г. Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан «1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

общая характеристика работы

Актуальность темы. Интенсивное развитие иммунохимии белков подтвердило важную роль иммуноглобулинов в защите организма от инфекционных и кеинфекционных болезней животных и человека. Иммуноглобулины класса M - первый и основной иммуноглобулин, синтезируемый в раннем первичном иммунном ответо. Идентификация и количественное его определение в отологических жидкостях организма животных является вакным тестом для диагностики острых инфекций и оценки .иммунного статуса (Z.Trainin, H.Ungar-Waron, 1931; J.P.Siegel, J.S.Remington, 1983; В.Ы.Чекишев, 1983; Ю.Н.Федоров, 1984; A.Tisoher, Е.Reriks, 19S6; J.D.Gail et al., 1986; P.Kuller, 1986; P.Westenbrink, T.G.Kinraan, 1987; G.Florent, A.Wiseman, 1990). Однако, выявление lgK-антител не нашло пока широкого практического применения, вследствие отсутствия' доступных высокоспецифических стандартных препаратов для их идентификации. Получение

моноспецифических антисывороток к IgM связано с определенны™ трудностями, так как выделение иммунохимически чистого Igfi в нужной для иммунизации животных концентрации - процесс весьма трудоемкий. Антискворотки к иммуноглобулинам класса M, получаемые на лабораторных животных, обладают существенными недостатками, такими как, низкая активность, гетерогошюсть, перекрестная реактивность с другими иммуноглобулинами.

Разработанная Недаром и Мильштейном (1975) технология получения гибридом, продуцирующих., моноклональные - антитела .заданной специфичности, открыла новые пути в методах иммунологических исследований. Клеточные гибрида на основе клеток миеломы и антителопродуцируюцих . лимфоцитов мышей balb/o используются для получения моноклоналышх антител к различным антигенам, включая антигены вирусов, бактерий, паразитов, клеток крови, а также к иммуноглобулинам (M.Pinder et al.,1980; S.Srikumaran et al.,1983; P.S.Paul et al., 1935; K.J.Beh, 1988; R.A. Goldsby et al.,1987; D.tf.Estes et al.,1990; D.J.L.Williams et al.,1990; О.А.ВерховскиЙ, 1991). . .

Гибридомы являются стабильным продуцентом антител строго определенной специфичности, одного изотопа, направленные к одному эпитопу антигена. Моноклональные антитела можно получать а неограниченном количестве с минимальными затратами. Проблема'

получения гибридом - постоянного продуцента моноклональных антител заданной специфичности является актуальной, что определило выбор теш и направление , исследований.

Целью настоящей работы было получение гибридом, продуцирующих моноклоналыше антитела к иммуноглобулину класса М рогатого скота, и их иммунохкмическая характеристика, а также разработка тест-системы для количественного определения уровня 1£М в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец.

В работе были поставлены задачи:

1. Оптимизировать условия выделения и очистки иммуноглобулинов класса М из сыворотки крови крупного рогатого скота и овец.

2. Отработать технологию получения гибридом и получить штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональныэ антитела к крупного рогатого скота и овец.

3. Отработать условия выделения и очистки моноклональных антител из культуральных и асцитических жидкостей.

4. Дать ишужшшичесную характеристику полученным моноклоналышм антителам к

5. Получить препараты моноклоналышх антител к ВДИ рогатого скота и на их основе создать диагностические тест-системы для индикации и количественного определения иммуноглобулинов этого нзотипа е биологических жидкостях.

Научная новизна. Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных ыиз .Мивси1ив - продуцент моноклональных антител и иммуноглобулинам класса М рогатого скота ( авторское свидетельство Л 1&60549 от 3.01.90 г.). Штамм депонирован в Российской коллекции клеточных культур Института цитологи! РАН, г. Санкт-Петербург.

Оптимизированы условия выделения и получения иммунохимичесю чистого крупного рогатого скота и овец, отработана технологи! получения гибридом и моноклональных антител к ( схем;

иммунизации, обеспечивающая высокую эффективность полученш антителопродуцирувдих клонов гибридом, гибридизация иммуннш лимфоцитов селезенки' с клетками шеломы, тестирование продукцш гибридомами специфических антител в культуральных .и асцитически; жидкостях методом РИД и ИФА).

Получены моноклональные антитела специфически взаимодействую®!! с иммуноглобулином класса М крупного рогатого скота, овец, коз : оленей.

: Определены ишунохимические . характеристики моноклональных антител к IgM рогатого скота, продуцируемые клонами: Bg.Cg.C^.Cy.Cjj.Gg.Eg, показана их активность и специфичность в РИД,

, ЙФА И ИКМуНОбЛОТТИНГе.

Установлено, что для использования в тест-системах моноклональных антител клонов С2,С4 и g9, необходимо сочетание вариабельных и константных областей в молекуле IgM, так как полученные !ЖА являются конформациошю-завясимымн.

Полученные клоны гибридом, продуцирующие моноклсналыше антитела к IgM рогатого скота, являются основой для создания высокоэффективных диагностических тест-систем по выявлению ранних форм инфекций и внутриутробного инфицирования плодов крупного рогатого скота и овец, оценки качества фатальных сывороток для биотехнологии.

Практическая ценность работы. Получена коллекция гибридом, секрэтагоуюишс монсклоналышэ антитела к иммуноглобулину класса' М рогатого скота, открывающая перспективу разработки диагностических препаратов на основе различных тест-систем.

На основе полученных ША к IgM рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов класса М в биологических жидкостях организма гшвотных методом РИД и ЙЭА, а также выявления ранних l^f-антктел в сыворотке крови.

Материалы диссертации вошли в "Лабораторный регламент по изготовлению н контролю набора препаратов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма жвотных катодом радиальной кммунодаффузии и в реакции лзтвкс-агглатанации"(I99I-I992 гг.)•

Разработана методика и получены кадете а лиофилизированвые препсрагн кюноклоналлшх антител из асцжпгшскшс жидкостей и конъЕгатн их с торокспдазоЗ хрена для использования в диагностических тост-систэмах на основа РИД, РДП, ША, PIA для качественной и • количественной индикации иммуноглобулинов и Igti-антигал. .

Апробация работы Оснопгаэ результаты работы дологэш на:

- конфэронцяи молодах ученых ВИЭВ (Ш г.);

- Всосоиэной научно-технической конференции:

"Пргменвяиэ биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и

ветеринарной медицине", Ленинград (1988 г.);

- Всесоюзной научной конференции:

"Теоретические и практические вопроси ветеринарии", Тарту (1988 г.);

- Всесоюзной научной конференции:

"Интенсификация производства в отраслях АПК на основе использования методов биотехнологии", Минск (1989 г.); ~ Научной конференции ВНИИВВИМ, Покров (1992 г.);

- меклабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано девять научных работ"!

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследований по выделению, очистке иммуноглобулинов класса И крупного рогатого скота и овец.

2. Технология получения гибридных клеточных культур (гибридом), секретирующих моноклоналъные антитела к 1§м рогатого скота....

3. Иммунохимическая характеристика моноклоналышх антител к рогатого скота, определение . их активности, специфичности и пригодности для выявления Х^м в биологических жидкостях организма животных.

4. Получение реагентов и разработка диагностических тест-систем на основе РИД и ИФА.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы.

Материалы диссертации иллюстрированы 9 рисунками и 6 таблицам. Список литературы включает 217 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ •■• • .. ;•

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и" биотехнологии ВИЭВ в период 1986-1993 гг..

Исходным материалом для выделения иммуноглобулинов класса М служила нормальная сыворотка крови КРС и овец.

Метод выделения 1§м из сыворотки кроЕи состоял из осаждения сульфатом аммония 50% насыщения при 4°С глобулинов овцы и КРС и гель-фильтрации их на колонке с сефарозой 6В.

Для идентификации и определения иммунохимической чистоты 1§м

использовал! ишуноэлэктрофорэз и элшстрофорез в ПЛАГ-ДСН.

йммуноэлектрофорез, РДП проводили по методикам, отработанным в лаборатории иммунолотГй биотехнологии виэв.

Электрофорез в ПААГ-ДСН в стеклянных трубках проводили по методу H.H.Usurer (1971)1

Получение антисывороток. Иммунизации кроликов проводили по методу, разработанному М.А.МискикозоЯ и А.Ю.Самострэльским (1976).

Иммунизация мыией линии вахв/о проводилась по разработанной нами схеме на.основе методики P.S;?aul et ai.(1385).

Специфические моноклональные антитела выявляли в непрямом твердофазном ифа и ршп

Клонирование гибридом проводили методом лимитирующих разведений по стандартным методикам (R.Kennst et ai., 1931).

Асцитше препараты получали по методу, описанному G.Gairre, c.MilatsIn (1982).

Диск-элэктрофорэз белков в ПААГ-ДСН проводила в буферной системе и.й.ЬаепетИ (Г970).

Изофокусирозку белков осуществляли в приборе "Phast System" фирмы "Fharmaoia"-(Швеция) по методике» предложенной фирмой.

Элэктроттерэкос белков после электрофореза в .ПААГ-ДСН осуществляли в буферной системе H.Towbin et al. (1979).

Для приготовления иммунопероксидазкых конъюгатов использовали метод~р.К.Иакапе, A.Kawaoi (1Э7ТП

Количественное определение уровня иммуноглобулинов класса М в ' биологических жидкостях организмгГкивотных осуществляли методом РИД ПО методу O.Manohini et al.(1965) И КФА (Е.Er.gval 1,Р.Perirr.ann,1971).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИИ Впделонив к очистка иммуноглобулина класса М . . из сыворотки крови КРС и овец ~~

. На первом этапе работы необходимо было получить иммунохимически чистый антиген igM. Его получали двумя методами. Первый состоял из выделения IgM из глоб'улииовой фракции сыворотки крови овец и КРС с последующей обработкой 0,1 М раствором сернокислого цинка' для освобождения от о^-макроглосулинов. После диализа в фосфатном буфере, глобулины наносили на колонку с сефадексом G-200. Фракции восходящей части первого белкового пика, содержащие IgM, собирали.

концентрировали и дополнительно очищали методом препаративного электрофореза в блоке-певикона. Иммунохимическую чистоту препарата контролировали методом иммуноэлектрофореза, содержание белка определяли по методу Лоури (1951).

Второй метод включал в себя следующие этапы: диализ сыворотки крови против фосфатного буфера низкой ионной силы с кислым pH, осаждение сульфатом аммония 50% насыщения, диализ против физиологического раствора с последующей гель-фильтрацией препарата на колонке с сефарозой 6В.

Было установлено, что при гель-фильтрации глобулинов на . сефарозе GB, иммуноглобулины выходят в 3 основных пиках. Первый пик содержит высокомолекулярные белки с небольшой примесью IgM.. Второй пик обогащен IgM, а в третьем в основном содержится IgG.

Сравнивая два метода выделения IgM из сыворотки крови, мы пришли к выводу, что второй способ более прост и экономичен. При данном способе обработки сыворотки крови сокращаются потери иммуноглобулина, исключается этап обработки сернокислым цинком,, так как на сефарозе 6В с^-какроглобулин достаточно хорошо отделяется от IgM в большинстве фракций.

Из 5 мл глобулинов овцы, нанесенных на колонку с сефарозой 6В, получали 2-3 мл igu с содержанием белка от 6 до 9 мг/мл.

Таким образом, применяя гель-фильтрацию на сефарозе 6В в сочетании с осаждением сульфатом аммония, мы накопили достаточное количество IgM для использования в иммунохимических тестах,, а такке для получения моноклональных антител. . V

Идентификация и определение иммунохимической чистоты IgM.

Оценку : юяиунохимичэской чистоты и идентификацию иммуноглобулинов осуществляли с помощью иммуноэлектрофореза.

При проведении ИЭФ полученных в процессе хроматографии фракций с использовашем антисывороток к белкам сыворотки крови ;КРС отмечено, что одиночные линии, характерные для IgM, наблюдались во Фракциях второго пика, а линии, характерные для Ige, во фракциях третьего пика. Результаты, полученные в иммуноэлектрофорезе, сопоставляли с . результатами реакции , двойной диффузионной преципитации. Фракции, содержащие IgM, образовывали четкую, одиночную линию преципитации. При полном соответствии результатов: в РДП и

4 8 . -

иммуноэлектрофорезе, в полученных . препаратах определяли белок, добавляла 50% глицерина и хранили при температуре -20°С.

Для исследования иммунохимической чистоты полученного препарата использовали метод аналитического разделения молекул в полиакриламидном гелэ, который бал впервые описан Орнстейном и Дэвисоы (1964). Образцы готовили в двух вариантах. В первом варианте образец использовали в нативном виде, а во втором, образец прогревали при 100°С в присутствии 2-меркаптоэтанола, восстанавливающего дксульфидаые связи и расщепляющего молекулу иммуноглобулина на легкие и тяжелые полипэптидныэ цепи. В первом варианте образец 1ёМ.в столбике геля оставался на границе двух гелей, поскольку нативная, неразрушенная молекула имеет большую молекулярную массу (900000 Д) и проходит только крупные поры фокусирующего геля, не входя в мэлкопористный разделяющий гель. В отличие от пмуноглобулины классов о и А' имеют меньшую

молекулярную массу (150000-350000 Д) и проходят мелкие поры разделяющего . геля. Это отлитое слуют основным критерием качественного определения иммуноглобулина класса М. Во втором варианте, в окрашенных столбиках геля были видны 2 полосы, соответствующие легким ( 22000 Д) и тяжелым ( 65000. Д) цепям иммуноглобулина класса М.

Получение гибридом, продуцирущих МКА к

Схема иммунизации гилей при получении ША включала 3-х кратное внутркбрюштаное введение i ¿i (крупного рогатого скота - 200 мкг и . овэц - 100 ют) с последующей внутривенной инъекцией бустерной дозы антигена (250 мкг igíl овец). Мышей с наиболее высоким титром - специфеческих, антител в 1Ш. (1:6400-1:12800) использовали для получения ишшоцитов. Клетки шеломы • X63-Ag8.653 и

антнтелопродуцпруицив лимфоциты- смешивала а соотношении 1:10, учитывая, что сплоноцагн менее устойчивы in vitro и часть их мокет быстро погибнуть. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор ПЗГ(м.м.ГООО).

В точение) 20 дпэй проводили культивирование в присутствии селективной среда, содержащей ГАТ, вызывавшей гибель неслившихся маелокных клеток. Затем постепенно уменьшали количество ГАТ в среде. В результате гибридизации через 7-9 дней появлялись небольшие

кластеры клеток. Используя 96-луночныэ микропанели, через каждые 2-3 дая заменяли половину.среда на равный объем свежей среда. Когда кластеры гибрвдсм достигали 2-3 мм в диаметре, культуральную жидкость тестировали на наличие антител.

Тестирование и клонирование

Предварительно были подобраны оптимальные концентрации антигена и коныогата для выявления ыококлональных антител в ИФА. С этой целью вносили 2-кратные разведения антигена (Igii) в микропанели, добавляли мышиную сыворотку к igM КРС, а затем вносили кояьюгат в нескольких разведениях (1:200,1:400,1:800). За оптимальную концентрацию антигена и коныогата принимали концентрацию, при которой наблюдалась прямая пропорциональная зависимость оптической плотности от концентрации антигена. 8 качество контроля антигена использовали igO и igA. В результате подобрали оптимальное' разведение коныогата(1:400) для определения концентрации igM в диапазоне от 10 до 87 мкг/мл в КФА.

Культуральную кидкость гибридом исследовали на продукция специфических антител в реакции простой радиальной ишуиодкффузии и в твердофазном илмунсферментном анализе в непрямом варианте с использованием приготовленных наш препаратов IgJi, Igo, IgA и антимышиного конъюгата.

Для проведения простой радиальной иммунодайузии использовали 0,8% агарозу с 5% ПЭГ-6000. Процентное содержание сыворотки крови крупного рогатого скота и овец (от 0,Ь% до IOS) в агарозе подбирали предварительно с аптисыворотками к иммуноглобулинам классов с.Ы.А. Наиболее выракенную преципитацию антител отмечали при добавлении 1% нормальной сыворотки овцы в агарозу. В РИД было выявлено .17 первичных культур, продуцирующих преципитирупцие антитела из 145 выросших клонов гибридных клеток. По результатам ИФА было отобрано 7 гибридом - С2,С4,С7,С1:[,Вз,Е5,09, секретиругацих моноклональные антитела к igbí' из 17 культур гибридных клеток, продуцирующих преципитирующие моноклональные антитела.

Специфические антитела, продуцируемые этими гибридомами, обладали преципитирувдими свойствами и реагировали только с IgH крупного рогатого скота и овец.

Пэригошэ положительные культуры ■' размножали в среде ДМЭМ с добавлением 10% фетальной сыворотки в атмосфере с 5% С02 и эаморавивали для хранения в ¡гадком азоте.

Посла тестирования проводили клонирование первичных культур клеток для получения чистых культур гибридом - ■ продуцентов моноклоналышх антител. Нами было проведено клонирование с использованием метода лимитирующих разведений в жидкой среде в 96-лувочных микропанелях. Клонирование проводили дважды. Выросшие -клоны тестировали на продукцию • ими специфических антител после кандого клонирования. Положительные клоны Cg.C^.C^.CjpBg.Eg.Gg .размножали в 96-луяочных микропанэлях, .а затем в матрасах. Культуральную жидкость положительных клонов, содержащую стацифнчзасЕв антитела, концентрировала и использовали для анализа.

Существенное влияние на рост гибридом оказывают фздерные клетки, в качестве которых мы использовали перитопэашше макрофаги. Получали их путем ввэдения 5-10 мл среды ДМВД в брюшную полость ноккмуназяроваяной кыша. Извлеченные . макрофаги разводили в питательной среде и вносили в ЗЗ-лунбчиыв микропанели из расчета 2хГ05 клеток в т. Их действие заюшчвэтся в синтезе моноюшов, которые активируют функции лтфмдатоз. Перитоневяыше макрофаги способны поглощать погибшие и разрушенные клетки, контаминлруищге ростовую среду гибридом.

Для первичного имм5тно2яшг1осксго анализа использовали реакцию двойной -'диффузионной преципитации, В центральную лунку вносили нормальвув сыворотку КРС или овцы, а по периферии двукратные разведения шнокяоналкшхг антител разных клонов, осааденных •сульфатом , аммония а . -'диефжльао внсушешшх. Результаты этих псслэдований представлена в таблица I. Из таблицы следует, что при гаршчнои ооадешшс^фатом-илюши 50% .насыщения титры ШСА в рзанцяэ двойкой даффузтонной преципитации составляла 1:2-1:8, тогда как при вторичном осааданки тнтри увеличились до 1:16-1:32. Также установлено, что после'лиоф£лизациа титри МКЛ та изменялись. В препаратах ШСЛ определяли концентрацию белка по методу Лоури, которая составляла 2,1-4,7 мг/мл.

Таблица I. Титр моноклональных антител, осажденных из культуральной жидкости сульфатом аммония

Клоны Кол-во Осаждение Титр антител в РДП Кол-во

гибрид. мл белка

кид-ти I 2 I 2 после мг/мл

мл лиофилиз.

С2 300 40 20 1:2 1:32 1:32 2,5

с4 300 20 10 1:2 1:32 1:32 . 4,4 .;■ -

СП 50 10 5 1:2 1:16 1:16 4,7

°9 700 40 20 1:8 1:32 1:32 2,1;

Для получения моноклональных антител, кроме культивирования гибридом in vitro, использовали культивирование гибридных клеток в организме мыши. Рост гибридом in vivo обеспечивает продукцию антител в количестве 1-25 мг/мл. Инъецировали внутрибршинно мышам ВАХВ/о пристан, а через неделю гибридные клетки 4 клонов - с2'с4,с11'°9' поскольку они продуцировали специфические антитела в высоких титрах, выявляемые в РДП и ИФА, и отличались /стабильными ростовыми свойствами. При введении гибридных клеток мышам в количестве ЮхЮ^/мшпь, они вызывали образование асцитов. Асцитическую жидкость, осаждали сульфатом аммония 50% насыщения, центрифугировали с последующа! диализом осадка против pbs. . ..

Сравнительная характеристика продукции антител .; гибридными клетками In vitro и.in vivo представлена в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что продукция антител гибридными, клетками в культуральной жидкости составляет от 0,1 до 0,3 мг/мл, тогда как в асцитической жидкости - от 1,0 до 5,0 мг/мл. Титр МКА, выделенных из культуральной жидкости, составлял в РДП 1:16-1:64, а титр в ИФА -1:160 - 1:640. Титр специфических антител, выделенных из

асцитической жидкости, составлял в РДП 1:320 - 1:2560. соответственно в ИФА - 1:Ш06 - 1:2x10®.

Таблица 2. Сравнительная характеристика продукции МКА гибридными клонами

Продукция гибридомами Активность

Клоны МКА в мг/мл (титр антител)

Культур. Асцит. Культур. Асцит.

жидкости жидкости .

РДП ИФА' РДП ИФА

С2 0,2-0,3 2,0-5,0 1:16 1:640 1:1280 1:2х106

С4 0,1-0,2 2,0-3,0 1:64 1:320 1:320 1:1x1О5

СП 0,1-0,2 1,0-2,0 1:32 1:160 1:320 1:1хЮ6

% 0»2-0,3 2,0-5,0 1:32 Н640 1:2560 1:2хЮ6

Выделение и очистка моноклональных антител к I§Н рогатого скота

Очистка моноклональных антител из асцитической жидкости

включала следующие эташ: центрифугирование, осаждение супарнатанта сульфатом аммония БОЖ насыщения, снова центрифугирование и диализ.. Клэточную суспензию использовали для получения новых асцитов. Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости, хранили в замороженном или . лиофилизированном виде. При хранении препаратов МКА в лиофилизированном виде (4°С) их активность сохраняется семь лет (срок наблюдения).

Для определения иммунохимической чистоты полученных препаратор МКА использовали метод иммуноэлектрофэреза. Препараты МКА клоноа В3,С2,С4>Стт и од образовывали одиночные линии преципитации,

характерные ддя иммуноглобулинов, что свидэтельствует об иммунохклЕческой чистоте этих препаратов. Представленные икадунозлектрофэреграмш позволяла определить класс мсшооояалъЕШ. антител к lg!i рогатого скота: антитела клона В3 принадлежат к igH-кла- -¡у, а антитела клопов С2,С4,Сд и Gg - к IgO-iuiaccy. Об этом свидетельствуют, характерные для этих классов шздноглобулшюв линии преципитации с автиснворожой мши. '

Для определения гомогенности препаратов MRA использовали диск-электрофорез в ПААГ-ДСК в сшшшшх трубках и на пластинах в приборе "inast sysiem". Образца МКА готовили в двух вариантах. В первом варианте цельной молекуле : иммуноглобулина на ап,01;тргх{ореграюгэ соответствовала одна колоса. Во второй варианте, легким и тяжелым,цепям тмунох'лобудша соответствовали дке полосы на эя0ктра$оро:грашэ, ссютпегстиушцж» стандартным балкам с молэкуляркой массой 25000 й и" 67000 Д. Легкие цени у всех МКА находились на одтааковом расстоянии от старта, тогда как тякелыз цэт.МКА ¡угонов Bg и Е5 находились на меньшем расстоянии от старта, чем тязэлиа. цша МХА остальных клонов.

Препарата MI CA годввргыи лиофихазавди," при атсн титри антател в рда ко изменялись (табЛ). в дальнейшем зга прзяараиг были использованы для изучсшш ея^юхешчосши свойств МХА, а та'«® для количественного оЁредодэнкя igai в простей; радиальной Ею^однЩгаий по Манчиии и для 'приготовления, коньагатоа. :. . : '

Имг^унохнмачэская характеристика «ттусяалыш ваштеа '

Определение видовой спадажпстя ьшодташшшх ештйтол ' •

Видовую спедаФачкость К& еишш :£з> рэакцва ■. двойесй ли^фузконяой ироцкшггашши с испсльзовшшэм саворочта кровн овца,-крупного рогатого скота, козы, олекя, оши, :.зшада, шроаой свинки, кролика, красы, кур и толоваш.

Было установлено, что шкокжш&ланш" антитела, прадуцируеизэ , вс&«,„. 7 кланами взазшдойствуог о -сявордасаш кроид овца, коэн, оленя и■ крупного рогатого скота. МКА тюков и Е^ рэагаруит тара с сыворотками лоаада, »юрской сшжж и крошш, в ККй клока Сд -еще и с шворотко® .крова человека.

Результаты проведанных иссладомшзй .шк&з&ш наянов отсутствию

сэре крестных реакций ШД Есех кланов с снзороткаш крови свиньи, крысы и кур.

Изотипироваяие мояоклоналышх антител

Для определения изопша МКА проводи/и реакции двойной диффузионной преципитации, для чего использовали 1,255 агар на fbs. В центральную лунку вносили МНА одного из 7 клонов, а по периферии антисыЕоротки к различным изотипам мшинш. иммуноглобулинов фирмы "Sigma"(США).

Линии преципитации с аптисывороткой указывали на принадлежность моноклональшх антител к данному изотипу. Результата приведены в таблице 3, из которой видно, что МКА гибридах клонов Cg.C^.CY.Cjj.Og принадлогат к изотипу igQj, a'í.{KAvклонов В3 и Е5 - к изотипу Iglí.

Таблица 3. Изотоп и нзоэлэктричвская точка моноклональных антител к igji рогатого скота ■

■ Изьэлектрическая

Клона йзотип точка (pi)

ЯКА МКА

С2 ' 6,85

V IgGj • 7,35

V IgOj 7,35

СИ ' ' ' IgSj 7,35

о9 IgOj 7,35

В3 IgM 8,45-8,5

% ie» ■ 7,35

Определение изоэлвктрической точки моноклональных антител

Определение изоэлектрической точки необходимо для работы с моноклоналышми антителами. Во всех методах исследования, связанных с зарядом белка и его изменения, надо учитывать изоточку данного белка. По результатам изофокусировки МКА были представлены на электрофореграше одной полосой, соответствующей изоточке белка. Результаты исследований приведены в таблице 3. Из таблицы следует, что изоэлектрическая точка моноклональных антител клонов C4,c7,0jI,g9 составляла 7,35. Антитела клонов С2 и Вд имеют изоточку в области pH соответственно 6,85 к 8,45-8,5. ••

Определение специфичности моноклональных антител

Тип антигенной детерминанты на молекуле Igti, к которой направлены МКА, определяли методом иммуноблоттинга и РДП в сочетании с глектрофорезом в ПААГ-ДСН. Иммуноблоттинг сочетает в себе несколько методов:

- электрофорез в ПААГ-ДСН;

- перенос белка'из геля на мэмбрану;

- иммуноформэнтшй метод на нитроцеллвлозной «змбрано.

Ишуноблоттинг взимает, в себя преимущества высокой разреаащэй способности электрофореза с иошдательной чувстватэльдастьа ■ и специфичностью методов ША. ' •

ПААГ-ДСН алйктрофэрзз антигенов (igo.lgM.lgA) проводили в буф ерной системе Laeismli. Образцы готовила в двух вариантах: натнвнои и обработанном 2-мэркштоэтанолоы. На элэктрофорограша иммуноглобулины были представлена в шрзом варианте одной полосой, : соответствущ^й цельной нолэкулэ lg, а во йтором вараантэ - двуш цолосами, соотвэтствувдма легким и тяеэдым цепям Ig.

После окончания алэкярофореза гель -шесте • с ВД-ыомбраной ("сэндвич") помещали в камеру для переноса (200 иА в точение 45 мин), затем проводили 1№А.

По данным литератур! известно нажчиэ двух гнвов антигенных Детерминант на молекула иммуноглобулина: конфориацЕонные и линейные (J.S.Haaijman, J.Coolen et al, 1988). Конфораациошкэ Детерминанты нахог?тся на цельной, неразрушенно® молекуле, а ланэйные - на

полипептиднсй цепи.

По результатам проведения иммуноблоттинга, на Щ-мемОране МНА клоков С2,С4,сэ ■ представлены одной полосой, соответствующей пологе кию цельной молекулы Iна электрофореграммэ. Полученные данные позволяют сделать заключение, что МКА клонов с2,С4,о9 специфически взаимодействуют только с нэтиеной молекулой , распознавая том самым эпитоп копформацяонного тала.

Эти дашшо получили подтверждение при использовании сочетания метода электрофореза в ПААГ-ДСН в- стеклянных трубках и РДП для установления типа эпитопов, к которым направлена полученные моноклональные антитела. В центральную лунку помещали диск геля, соответствующий легким или тяжелым цепям иммуноглобулина, а в периферические лунки вносили культуральную жидкость . от 7 клонов гибридом. МКА, продуцируемые клонами В3 п С^, образовывали четкую линию преципитации с тяжелой цепью 1&1, распознавая эпитоп линейного типа. Антитела остальных клонов не образовывали преципитаты в данной реакции, так как онп взаимодействуют только с цельной молекулой I¿и. Результаты этих исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4. Определение типа антигенных детерминант

Класс ig igü Tim эпитопа

Клоны о А и пента- цепи

мэр Ц- L-

конформационный конформационный конформационный линейный линейный

Из таблицы следует, что антитела клонов С2,С4,Сц.о9 и Р взакмодействуют только с Iga крупного рогатого скота и овец, не-реагируя с Ige и IgA; моноклональные антитела клонов и °Э

взаимодействуют только с наташсй молекулой что свидетельствует о кшформэционном характера антигенных дзтермтант на молекуле распознаваемыми этаж антителами; антитела клонов С11 и В3 взаимодействуют не только с.нативной молекулой 1еК, но и с тяжелой полишп' мной цепью что свидетельствует о линейном характере эпитопов на молекула

Использование моноклональных антител в ишунохимичэских - тест-системах '

На основе ыонсшганалышх анхител была р&зрвбогша тест-система по выявлению ¿¿м в биологических жидкостях в реакции простой радеалыюй даадаоди$$у8ш ко методу Манчиш, для чего были использованы моноклоналыше антитела, продуцируемые клонами с2,с4»сэ.

Для проведения РИД брали 5 мл 2,5% агара Дифко . на веронзд-мэданаяовок буфере и смоштали при Б6°С с МКА трех клонов в разных концентрациях - 5%,ЗХ,1%. По плотности и размеру кольца преципитата подбирали оптимальную концентрацию МНА в агаре да использования при ..количественном определении х®» в РИД;

Б результате- проведенных исследований подобрана оптимальная концентрация канокйональшх антител в агаре щи использовании в реакции простой радиальной ккмупсдиффузш'.. Оно составляет для ОКА клона С2 и С4 - 32 { татр в РД11 1:8), а дпя'МКА клона Сд - 1% (татр в РД11 1:32).

Для сравнения проводила копичестншое определение в ИФА с использованием моноклоналышх стжтел, полученных аз асцигачеекой жидкости. Образцы сывороток титровала на .нагфоилатах'* методом ¿-кратного разведения. Было установлено, что да исследования сывороток кр-ви взрослых животных штодом УФА с цэльв определения

необходимо разводить образца многократно - с 1:500 до 1:16000. Это усложняет анализ, .поэтому для количественного определения Х^М в сыес,уОткэх крови взрослых животных лучшэ.использовать РЙД по методу Манчюш,. ' .

Пероксидавные конъюгата да № на основе . моноклоналыаых антител являются. шсокоотецафкчесстма рзагангащ, которые используются дла шя&иеаияшндаальннх количэств . антител в

биологических жидкостях.

На основе ИФА с использованием конъюгатов из МКА к можно

создать тест-системы по выявлению первых ^-антител, появляющихся в крови и тем самым диагностировать острые инфекции у крупного рогатого скота и овец.

Для приготовления коныегатов использовали МКА клонов с2 и с-9, выделенных из асцитических жидкостей, так как в них концентрация МКА адекватна количеству 1®, требуемого для коотвгировэния с ферментом. Рабочее разведение конъюгата определяли методом ИФА при титровании со специфическим (1&Ч) и неспоцифическими (ГеС,г&д.,БСА} антигенам! по его последнему рззводешш, дающему оптачэскув плотность равную 0,9-1,0. Полученные коньягатн на основе !,ЖЛ клонов С2 и а9 реагировали только с тогда как оптическая плотность в лунках с 1§а,1&А. и БСА была практически одинакова и находилась на уровне фона.

Для конъюгата на основе ША клона С2 рабочий титр составил 1:1600, а .для конъюгата на основе МКА клона о9 - 1:6400. Полученные конъюгаты были лиофалыю высулены для длительного хранения.

Коггьюгэта на основе полученных МНА в- дальнейшем были использованы в тест-системе ИФА для выявления специфических антитэл 1йИ-класса.

В результате проведенных исследований были получены гпбридома -продуцента моноклональных антител к иммуноглобулинам 1сласса и рогатого скота; изучена иммунохпмическая характеристика выделенных МКА; показана возможность использования препаратов на основе МКА в диагностических тест-системах для определения уровня в

биологических жидкостях.

вывода

1. Оптимизированы условия получения иммуноглобулинов класса М из сыворотки крови крупного рогатого скота и овец с использованием комплекса физико-химических и кммунохимических методов, включающих седиментацию, гель-фильтрацию, электрофорез в ПААГ-ДСН и иммуноэлектрофорез.

2. Разработана тест-система на основе реакции простс.: радиальной иммунодаффузии и иммуноферментного анализа для выявления гибридом, продуцирующих моноклональнно антитела заданной

специфичности.

3. Получены стабильные гибридош, являющиеся продуцентами юноклональшх антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота.

4. Определены класс и видовая специфичность полученных мснокло; зльных антител методами непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, ишуноблоттаята, ишуноэлектрофореза и в реакции двойной диффузионной преципитации. Установлено, что моноклональныэ антитела, продуцируемые клонами с2, С4, Су и с9 взаимодействует с 1£М крупного рогатого скота, овец, коз и оленей. МКД, продуцируешь клонаш В3.С11 и Е^ дают перекрестные реакции с

лошади, морской свинки, кролика и человека.

5. Определен изоткп конокленальных антител к рогатого скота. Полученные клоны гибридных клеток С2,С4,С7,С11,09, секретирукя шно;июнальние антитела, принадлежащие к изотщу Гса^, а ТАЛОНЫ Во КЕг - к изотипу I¿и.

О о • ■ •

6. Методом .. нымуноблот-тинга установлено, что моноклоналыше антитела клонов С^.С^.йд взаимодействуют только о натшжой молекулой 101, что свидетельствует о конформацпоином тааю зпитопав в молекуле иммуноглобулина класса и, распознаваемыми этаж антителами.

Антитела, 'продуцируемые клонам с^ и В3 взааюдайотвувт • не только с натиЕьоЗ - молекулой на и с ее тяхзлш&1 цопяш, что свидетельствует "о дшэйном тело впптопое, распоЕНэввезаи этими монохлоналышш антителами. • '

7. Определена газоэлектрическая точка моноклок&яъных антител, 'находящаяся в области рИ от 7,35 до 8,45. •

8. Ка основе монокяок8ЛЬ"£с алтитэл клонов С2 в Од приготовлена и^лунопароксидазниэ. коньюгбты для выявления в савароткэ крова крупного рог""ого скота к озац иммуноферивнтша! катодом..

9. "Машииталькш кишела ' использованы . для создания тест-системы по выявжвтт а количостаэвнаау определений иммуноглобу* лка класса и на основе решало? простоя радиальной иммунодиффузяа и иммунсфркевтвого анализа.

ПРАКТИЧЕСКИ: ПРЩСШШ

Материалы диссертации по выделению и очистке шаауноглобулшов класса м из сыворотки крона крупного рогатого скота I! овец, получению и применению модаклональша антитал указанной

специфгшоСтя вошли в:

1. "Лабораторный реглайент по изготовлению и контролю набора препаратов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных методом радиальной иммунодиффузии", утвержденный Директором ВИЭВ, академиком P.AGXH Г.Ф.Коромисловым, 1991 г.

2. "Технологический регламент изготовления и контроля набора препаратов для экспресс-индикации иммуноглобулинов и оценки иммунного статуса крупного рогатого скота и овец в реакции латекс-агглютинации", утвержденный Директором ВИЭВ, академиком РАСХН Г.Ф.Коромысловым, 1992 г.

3."Методические рекомендации по использованию иммуиоферменткого • анализа для выявления антител lgM-класса к вирусу диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота". Одобрены ■ Отделением ветеринарной медицины РАСХН 27 ноября 1Э91 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Федоров D.H., Кадыров С.О., Ездакова И.Ю. и др. Технология получения моноспецифических антискворогок к иммуноглобулина^ хиеотных // Труды ин-та / Всесоюз. н.-и. иц-т эксперимент, вет. им. Я.Р.Коваленко. Том 66. Ветеринарная иммунология и биотехнология, - М, 1988,С.41-46.

2. Федоров D.H., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.В, и др. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам класса М рогатого скота // Труды ин-та / Всесоюз, н.-и. ин-т эксперимент. вет..им. Я.Р.Коваленко. Том 66. Ветеринарная иммунология и биотехнология. - М, 1988,С.13-16. .

3. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А^, Ездакова И.ю. Получение, и применение моноклональных антител к igM рогатого скота, // Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине". Ленинград, 1988,С.72-73.

4. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю.

и др. Количественное определение иммуноглобулинов класса М в . сыворотках плодов рогатого скота // Тезисы докладов научно-» конференции "Теоретические и практические Еопросы ветеринарии". Тарту, 1988,С.95-97.

5. Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.О. Количественный метод определения igK рогатого скота в биологических жидкостях с использованием моноклональных антител // Бюл. ин-та / Всерос. н.-и. ин-т эксперимент, вет им. Я.Р.Коваленко. Вып.68. Теоретические разра0о_.от. - М, 1988,0.3-4.

6. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к igM рогатого скота // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Интенсификация производства в отраслях АПК на основе использования методов биотехнологии". Минск, 1989,0.52-54.

7. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. Штамм гибридных культиыфуемых клеток животных Muß.musouius, используемый для получения моноклональных антител к igSi рогатого скота // Азторскоо свидетельство & 1560549 от 3.01.90 г.

0. Федороз Ю.Н., Феоктистова Т.Д., Кис В.И., Верховский O.A., Ездакова И.О. , и др. Моноклональные антитела как иммунодиагностические реагенты // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВЗИМ. Покров, 1992,0.340-341.

9. Верховский O.A., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом "вестврн-Олоттиага"// Сельскохозяйственная биология. 1993, 6,0.135-141. ' '

Подписано в печать ЦЦ, Qi, W^f г. Формат 60X84/16 Сум. офс. Печать офс.

Тяраж /Ой ЗшзЛЧА/ > ; .

МП «ПЕТИТ»

107564, Москва, Богатырский мост. 17, коре. S