Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов диагностики болезней и технологического контроля биопрепаратов на основе моноклональных антител при чуме, парвовирусном энтерите и аденовирусном гепатите плотоядных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черняева, Ирина Станиславовна, Покров

Российская Академия Сельскохозяйственных Наук

Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Ветеринарной

Вирусологии и Микробиологии

На правах рукописи

Разработке методов диагностики болезней и технологического контроля биопрепаратов на основе моноклональных антител при чуме, парвовирусном энтерите и аденовирусном гепатите

плотоядных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.06 - Вирусология

Научный руководитель кандидат биологических наук Власов Н. А.

а-а/У

Покров, 1998 г.

1. Оглавление

1. Оглавление................................................................................2

2. Список сокращений..................................................................5

3. Аннотация................................................................................7

4. Введение....................................................................................£

5. Обзор литературы...............................................-...............13

5.1 Чума плотоядных (чума собак)......................................................13

5.1.1 История изучения...............................................................................13

5.1.2 Характеристика этиологического агента.......................................14

5.1.3 Эпизоотология....................................................................................1 б

5.1.4 Клиническая дигностика....................................................................18

5:1.5 Лабораторная диагностика..............................................................19

5.1.5.1 Гематология и исследование цереброспинальной жидкости........19

5.1.5.2 Биохимия.........................................................................................19

5.1.5.3 Серология и вирусовыделение.......................................................19

5.2 Инфекционный (аденовирусный) гепатит плотоядных.............21

5.2.1 История изучения...............................................................................2 У

5.2.2 Характеристика этиологического агента.......................................21

5.2.3 Эпизоотология....................................................................................22

5.2.4 Клиническая диагностика..................................................................24

5.2.5 Серологическая диагностика.............................................................26

5.2.6 Респираторные аденовирозы плотоядных.......................................27

5.3 Парвовирусы плотоядных...............................................................30

5.3.1 История изучения парвовирусов плотоядных..................................30

5.3.2 Характеристика возбудителя............................................................34

5.3.3 Эпизоотология.............................................................,.......................35

5.3.4 Иммунитет.........................................................................................38

5.3.5 Клиническая диагностика..................................................................39

5.3.6 Лабораторная диагностика..............................................................45

5.3.6.1 Гематология..............................-.л....................................................45

5.3.6.2 Биохимия...........................................................................................46

5.3.6.3 Серология и вирусовыделение.......................................................47

5.3. 7 Получение моноклоналъных антител и их использование в

диагностике......................................................................................................4/

5.3.8 Заключение по обзору литературы...................................................51

6. Собственные исследования................................................54

6.1 Материалы и методы.......................................................................54

6.1.1 Материалы..........................................................................................54

6.1.1.1 Вирусы...................................................>.........................................54

6.1.1.2 Животные........................................................................................55

6.1.1.3 Культуры клеток...................................;...........................................55

6.1.1.4 Питательные среды и растворы.....................................................55

6.1.1.5 Сыворотки.......................................................................................56

6.1.1.6 Реактивы..........................................................................................56

6.1.1.7 Оборудование..................................................................................57

6.1.2 Методы...............................................................................................58

6.1.2.1 Электронная микроскопия..............................................................58

6.1.2.2 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ)........................................................................................58

6.1.2.3 Дот-блот анализ и вестерн-блот белков.........................................58

6.1.2.4 Приготовление иммуносорбентов..................................................59

6.1.2.5 Определение белка..........................................................................60

6.1.2.6 Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации.......60

6.1.2.7 Получение гибридом.......................................................................60

6.1.2.8 Метод тестирования антител при выявлении гибридных антителопродуцентов.......................................................................................61

6.1.2.9 Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулинов...........................................................................................62

6.1.2.10 Клонирование гибридных антителопродуцентов......................62

6.1.2.11 Криоконсервация клеток.............................................................62

6.1.2.12 Приготовление асцитических препаратов моноклональных антител. ......................................................................................................62

6.1.2.13 Очистка МАт из асцитических жидкостей................................63

6.1.2.14 Приготовление конъюгатов антител..........................................63

6.1.2.15 Лиофилизация.............................................................................64

6.1.2.16 Метод конкурентного анализа....................................................64

6.1.2.17 Сэндвич-вариант ИФА................................................................65

6.2 Результаты.........................................................................................67

6.2.1■ Отработка и усовершенствование методов культивирования вирусов. 67

6.2.1.1 Динамика накопления вирусов и вирусных антигенов................67

6.2.1.2 Сокультивирование вируса инфекционного гепатита плотоядных, панлейкопении кошек и энтерита норок.........:.............................................;.67

6.2.1.3 Оптимизация режима выращивания вируса ПЛК в культуре клеток ФК.........................................................................................................72

6.2.1.4 Освежение и препаративное накопление на норках возбудителя парвовирусного энтерита, штамм Родники....................................................73

6.2.1.5 Накопление вируса панлейкопении кошек на культуре клеток ФК 75

6.2.1.6 Накопление вируса чумы плотоядных на культуре клеток СУ... .75 6.2.2 Отработка, усовершенствование и использование методов концентрирования и очистки вирусов............................................................76

6.2.2.1 Очистка и концентрирование вируса чумы плотоядных..............76

6.2.2.2 Очистка и концентрирование вирусов энтерита и гепатита плотоядных.......................................................................................................83

6.2.2.3 Отработка методов иммунизации мышей BALB/c с антигенами

вирусов панлейкопении кошек, чумы и гепатита плотоядных.....................87

6.2.3 Получение, скрининг и первичная характеристика гибридных продуцентов моноклоналъных антител к вирусным антигенам..................88

6.2.4 Разработка методов выявления и количественного определения вирусных антигенов и специфичных к ним политональных антител..........93

6.2.4.1 Сравнительная оценка активности и специфичности вариантов серологических реакций на основе моноклоналъных антител для диагностики парвовирусного энтерита, чумы и гепатита плотоядных........93

6.2.4.2 Определение активности и специфичности моноклональных антител 1В6, 5С12 и 1D8 методом иммунофлюоресценции.........................95

6.2.4.3 Отработка сэндвич - варианта ИФА на основе моноклональных антител для выявления вирусных антигенов................................................100

6.2.4.4 Разработка тест-систем на основе моноклональных атител для выявления антител, специфичных к вирусным антигенам.........................102

I. Обсуждение...........................................................................112

8. Выводы..................................................................................122

9. Практические предложения............................................... 124

10. Список использованной литературы.............................. 126

II. Приложения...........................................................................149

2. Список сокращений

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность;

AJIT - аланинтрансферраза;

ACT - аспартаттрансферраза;

АВТС -диаммониевая соль 2.2"-азинобис (З-этилбензтиазолин-6-

сульфоновая кислота;

ВЧП - вирус чумы плотоядных;

ВГС - вирус гепатита собак;

ВПЛК - вирус панлейкопении кошек;

ГГФРТ - гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансферраза;

ГАТ - среда селективная, включающая смесь гипоксантина,

аминоптерина и тимидина;

ГТ - среда селективная, включающая смесь гипоксантина и тимидина;

ГАЕ - гемагглютинирующая единица;

Г11 - гепатит плотоядных;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; СЭНДВИЧ- - двойной антительный сандвич - вариант ИФА;

ИФА

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДСН-ПААГ - полиакриламидный гель, включающий додецилсульфат

натрия в буферном растворе (электрофорез по Лэммли);

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИЭОФ - иммуноэлектроосмофорез;

КДа - тысяча Дальтон - единица измерения молекулярной массы

КЩ комплемент-зависимый цитолиз;

КРС - крупный рогатый скот;

ЛДГ - лактатдешдрогеназа;

МФА - метод флуоресцирующих антител;

м.м. - молекулярная масса;

МАт - моноклональные антитела;

НИ ФА - непрямой иммуноферментный анализ;

НЦЛ - нитроцеллюлозный лист;

ПЭГ - полиэтиленгликоль (6000);

I IЛ К - пашхейкопения кошек;

ПТП - перевиваемая культура клеток тестикул поросенка;

РДП - реакция диффузионной преципитации (Оухтерлони);

РСК - реакция связывания комплемента;

РДСК - реакция длительного связывания комплемента;

РИД - реакция иммунодиффузии (Манчини);

РН - реакция нейтрализации;

РТГА - реакция торможения гемагглютинации;

РТПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинации;

РГА - реакция гемагглютинации;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

РОЭ - реакция оседания эритроцитов;

ФК - перевиваемая культура клеток почки котенка;

CELYSA - вариант твердофазного иммуноферментного анализа, когда

вместо твердой фазы используются живые или убитые клетки; 1-1 - собачий парвовирус тип 1;

СПВ-2 - собачий парвовирус тип 2;

- собачий аденоассоциированный вирус;

- животные свободные от патогенной микрофлоры;

СУ1 - перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки;

ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ; ТФБР - фосфатный буферный раствор, содержащий Твин;

ТК ФБР - фосфатный буферный раствор содержащий Твин и казеин; ЦПД - цитопатогенное действие;

ЧП - чума плотоядных;

- чума крупного рогатого скота;

- центральная нервная система; ЭС - эмбриональная сыворотка (КРС); ЭП - энтерит плотоядных;

Аннотация____7

3. Аннотация

Работа посвящена созданию средств серологической диагностики на основе моноклональных антител для трех наиболее важных вирусных болезней плотоядных - чумы, парвовирусного энтерита и инфекционного (аденовирусного) гепатита.

Работа проводилась в лаборатории Гибридомной биотехнологии ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ВНИИВВиМ) в ходе исследований по тематикам НИР института.

В результате работы созданы 6 диагностических наборов на основе иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител для выявления антигенов указанных вирусов и специфичных к этим антигенам сывороточных антител. Все наборы могут быть применены для исследований патологического материала и сывороток крови животных (подозреваемых в заболевании, больных, вакцинированных, пассивно иммунизированных) вне зависимости от их видовой принадлежности. Разработанные наборы для выявления вирусных антигенов можно применять для лабораторной диагностики указанных болезней, для определения содержания вирусных антигенов в вакцинах (в том числе лиофилизированных и инактивированных), для выявления контаминации клеточных культур и биологического сырья этими вирусами, для технологического контроля накопления вирусных антигенов в процессе изготовления вакцинных и диагностических вируссодержащих препаратов. Разработанные наборы для выявления противовирусных антител можно применять для лабораторной диагностики указанных болезней, для определения содержания противовирусных антител в лечебных и диагностических антительных препаратах (лечебные и диагностические сыворотки и глобулины), для выявления контаминации сывороток, используемых при производстве клеточных культур, антителами к этим вирусам, для технологического контроля противовирусных антител в процессе изготовления лечебных и диагностических антительных препаратов, определения напряженности иммунитета (поствакцинального, колострального, постинфекционного и пассивного).

Научно-техническая документация на наборы утверждена директором ВНИИВВиМ на основании результатов двух комиссионных испытаний, проведенных во ВНИИВВиМ и ВГНКИ. В настоящее время с разрешения департамента Ветеринарии Минсельхозпрода Российской Федерации проводится их апробация в ветеринарной практике в некоторых областях России.

В ходе исследований и по их результатам разработаны 18 нормативно-технических документа, получено 3 новые линии гибридных клеток, опубликовано 8 научных работ, получены новые данные о динамике накопления вирусных антигенов в ряде культур клеток, разработаны модифицированные методы очистки вирусов.

Введение______8

4. Введет®

4.1 Актуальность темы

Среди множества инфекционных болезней плотоядных животных - диких и разводимых в неволе хищных пушных зверей, домашних собак и кошек - наиболее значимы такие вирусные болезни, как чума, парвовирозы, адено-вирозы [2, 320]. В настоящее время создан и применяется целый спектр живых и инактивированных вакцин против этих болезней, средств их лечения и дезинфекции, хорошо разработаны санитарио-карантинные мероприятия. Несмотря на это все перечисленные болезни продолжают оставаться серьезной проблемой, как для пушного звероводства, так и для домашних животных. Одной из основных причин такого положения, наряду с формированием очагов стационарного неблагополучия в дикой природе, а также среди бродячих собак и кошек, является неадекватность средств диагностики той ситуации, в которой они применяются.

Средства диагностики этих болезней разрабатывались в течение длительного времени. Для- диагностических целей применяется ряд клинических, •патологоанатомических, серологических методов, вирусовыделение и другие. Практически все методы клинической прижизненной и посмертной патолого-анатомической диагностики легко позволяют выявлять типичные формы течения болезни, но их реализация сильно затруднена в случаях возникновения атипичных форм течения болезней, которые получают все более широкое распространение в настоящее время. Разработанные серологические методы при возникновении вспышки болезни на неиммунном поголовье дают, как правило, отличные результаты в сочетании с выделением вируса, вызвавшего ее, но при возникновении болезни у животных на иммунном фоне или в стаде, в котором имеется иммунный фон, практически невозможно серологическими методами отличить антительный ответ на вирулентный и вакцинный вирус. При проведении ретроспективных исследований возникают все те же проблемы, и, часто, проблема с некачественным отбором проб для исследований. Кроме того, подавляющее большинство серологических методов, основанных на использовании поликлональных антител, имеют некий пороговый уровень выявления антител и антигенов, связанный с практически неизбежным фоно-

Введение 9

вым сигналом и неспецифическими реакциями, которые затрудняют получение надежных результатов.

Успехи, достигнутые современной биотехнологией в настоящее время позволили развиться двум направлениям, лишенным указанных выше недостатков, - методам молекулярной гибридизации и серологическим методам на основе использования моноклональных антител [12, 13, 22, 36, 155, 299]. Разработке средств диагностики чумы, парво- и аденовирозов плотоядных на основе моноклональных антител посвящена настоящаяя работа.

4.2. Цель и задачи исследований

Целью работы было разработать средства и методы диагностики чумы, парвовирусного энтерита и инфекционного гепатита плотоядных на основе моноклональных антител.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

1.Получить и охарактеризовать по ростовым свойствам, стабильности антителопродукции при серийных пассажах, пригодности для культивирования в виде асцитических опухолей у линейных мышей линии гибридом, продуцирующие моноклональиые антитела к антигенам вирусов чумы, парвовирусного энтерита и инфекционного (аденовирусного) гепатита плотоядных.

2.На основании изучения свойств в серологических реакциях с различными вирусными штаммами и изолятами отобрать из числа полученных гибридом наиболее перспективные для создания диагностических тест-систем.

3. Провести. сравнительную оценку эффективности применения различ-

о

ных вариантов постановки иммуноферментного анализа. На основе полученных данных отобрать те из них, которые позволяют эффективно выявлять вирусные антигены и противовирусные антитела в пробах патологического материала и биологических препаратов.

4. Разработать^ лабораторную технологию производства тест-систем для диагностики болезни и контроля биопрепаратов, соответствующую нормативно-техническую документацию.

Введение 10

4.3. Научная новизна работы

Научная новизна работы заключена в получении новых данных по параметрам репродукции штаммов использованных в работе вирусов, в частности - по динамике накопления антигена штамма ВНИИВВиМ-88 вируса чумы плотоядных в культуре клеток С�