Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Полиморфизм белков зерна и селекция озимых пшениц

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм белков зерна и селекция озимых пшениц"

^ На правах рукописи

\

Копусь Михаил Мефодиевич

ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ ЗЕРНА И СЕЛЕКЦИЯ ОЗИМЫХ ПШЕНИЦ

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Краснодар 1998 г.

Работа выполнена во. Всесоюзном селекционно-генетическом институте в 1973-1983 гг. и Донском селекцентре НПО "Дон" в 1984-1994 гг.

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук,

академик РАСХН A.A. Созинов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Э.Р. Авакян; доктор биологических наук A.C. Казакова;

доктор биологических наук Н.И. Бочкарев.

Ведущая организация: Кубанский государственный

университет.

Защита состоится ". _ 1998 г. в 10 час.

на заседании диссертационного совета Д.020.66.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте риса по адресу: 350101, г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ риса.

Автореферат разослан "_

/¿Г" с¿¿¿?<% 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

'Е.М. Сорочинская

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Меняющиеся условия хозяйствования и возрастающие требования к качеству зерна новых сортов пшениц, вынуждают совершенствовать существующую систему оценок этого признака во всех звеньях селекции. Кроме того, более глубокое изучение связи качества зерна с другими свойствами генотипа необходимо для разработки и обоснования направлений селекции па длительную перспективу.

Основные трудности селекции на высокие хлебопекарные качества муки обусловлены полигенной природой генетических факторов, оказывающих влияние на этот признак, множественным аллелизмом по отдельным локусам и наличием фенотипической изменчивости.

Современный уровень развития биологии открывает путь к разработке принципиально новых методов оценки селекционного материала. В основе этого подхода лежат исследования по биохимической генетике, одной из задач которой является идентификация локусов по контролируемым ими белкам (Г.Харрис,1973; Р.Левонтин,1978; Я.Тосиюки,1979) и установление их роли в определении признаков и свойств генотипа. Это направление исследований в настоящее время интенсивно развивается в биохимической генетике человека, растений, животных, микроорганизмов эволюционной и популяционной генетике я получило название - белковые маркеры или более широко, с выходом на различные фрагменты нуклеиновых кислот-молекулярно-генетические маркеры (Созинов А.А., 1993; Глазко В.И., Со-зинов И.А.Д993).

Общепризнанно, что хлебопекарные качества муки в основном определяются свойствами клейковины. Поэтому использование подходов биохимической генетики при изучении клейковинных белков пшеницы пред-

ставляется весьма перспективным. В этой связи можно предполагать, что различия в свойствах клейковины на сортовом уровне могут определяться генетически обусловленными особенностями составляющих ее белков -глиадина и глютешша.

В связи с использованием методов электрофореза в гелевых носителях, получены важные сведения по биохимической природе и генетическим особенностям белков клейковины. Установлена природа биохимической гетерогенности этих белков, вызываемая генетическими факторами. Сорта пшениц характеризуются специфичностью компонентного состава глиадина и некоторыми отличиями по глютенинам. Оградно отметить, что отечественные исследователи школ академиков Созинова А.А. и Копарева В.Г. внесли решающий вклад в развитие работ этого направления. Однако, важнейшие для селекционной практики вопросы о сопряженности особенностей компонентного состава клейковинных белков с основными показателями качества зерна на всех этапах селекции, изучены еще совершенно недостаточно.

Цель и задачи исследований. Основная цель проведенных исследований - всестороннее изучение клейковинных белков методами биохимической генетики в системе гибридологического анализа отдельных растений, а также при создании чистых и изогенных линий, отдельных сортов и селекционных образцов, мутантных форм и популяций по основным параметрам качества зерна и другим хозяйственно-важным свойствам для разработки системы комплексной оценки генотипов пшеницы в процессе селекции.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать наиболее приспособленные к задачам селекции элек-трофоретические методы фракционирования клейковинных белков на геле-вых носителях;

- разработать более простой способ идентификации компонентов спектра белков по сравнению с моносомным и дисомно-замещенным методами;

- разработать систему генетической классификации компонентов спектра белков у мягких и тургидных (твердых) пшениц;

- изучить влияние особенностей компонентного состава клейковинных белков на качество и другие хозяйственно-ценные свойства у отдельных растений, линий, селекционных образцов;

-изучить влияние эколого-географических факторов на адаптивность биотипов пшеницы с различными аллелями глиадина;

- разработать систему комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству;

- изучить эффективность использования системы комплексной оценки генотипов в селекции пшешщы.

Научная новизна работы. Установлено, что основными источниками генетического разнообразия (полиморфизма) среди сортов пшеницы по клейковкнным белкам являются : полигенный контроль ( 6 основных локу-сов по глиадинам и глютенинам) и множественный аллелизм. Аллель маркируется ( сигнализируется) на электрофореграмме группой сцепленно наследуемых компонентов названных блоком. Впервые генетическое понимание наследствешюй единицы глиадинов-блока компонентов сформулировано в нашей стране летом 1975 года ( Созинов А.А.,Попереля Ф.А.,Копусь М.М.,1975). Была предложена номенклатура блока компонентов и разрабо-

таны основы генетической классификации глиадинов, составлены каталоги и изучены сопряженности различных аллелей с изменчивостью хозяйственно-ценных признаков. Экспериментально доказано, что гибридологический анализ является простым и удобным способом идентификации компонентов спектра как у мягких, так и у тургидных ( твердых) пшениц. Впервые выявлены спонтанные мутанты по глиадиновым белкам затрагивающие один (М-1654) и несколько ( супермутант) глиадинкодирующих локусов целиком, а также описаны примеры очень редких мутаций внутри локуса. Эти мутации проливают свет на причины и следствие огромного естественного полиморфизма клейковинных белков.

Впервые созданы изогенные линии по молекулярно-генетическому признаку - компонентному составу глиадина мягкой пшеницы. Основной набор этих линий ( 24 штуки), переданы в Национальные центры генетических ресурсов растений России ( ВИР) и Украины (УИР). При пересеве зерна экспериментальной популяции, составленной из изо-глиадшговых линий в пяти зонах СНГ впервые получен прямой ответ об адаптивной значимости аллелей глиадина озимой мягкой пшеницы и установлена их естественная генбгеография. Эти линии позволили впервые установить фактическую, а не относительную ценность различных аллелей глиадина в определении генетического уровня качества зерна у озимой мягкой пшеницы и доказать, что аллели глиадина непосредственно и совершенно одинаково влияют на качество муки как на уровне гибридов К-4, так и на уровне изо-глиадиновых линий, причем выращенных на различных предшественниках и в разных зонах.

В результате анализа различного материала (гибриды Е2-4, константные линии, биотипы сортов, мутантные формы, изо-глиадиновые линии) предложена система комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству и

сопряженных с полиморфизмом глиадина продуктивности и морозостойкости. В эту систему включены важнейшие факторы, влияющие на хлебопекарные качества: полиморфизм клейковинных белков, содержание белка и консистенция эндосперма. Приводится также шкала для селекционной оценки генотипов пшеницы с максимальным выражением признаков на ге-нофоне Безостая 1 по качеству муки, морозостойкости, продуктивности и в комплексе. Результаты многолетнего использования предложенной системы при оценке селекционного материала озимой мягкой тпепицы подтвердили ее эффективность. С использованием метода в Донском селекцептре создано 1В сортов озимой мягкой пшеницы. Все они имеют "хороший" глиадин, оптимальное содержание белка и твердозерный эндосперм, что гарантирует им высокое хлебопекарное качество.

Впервые показана возможность идентификации сортов и биотипов озимых тургидных пшениц по спектрам птиалинов. Предложена номенклатура наследственной единицы - блока компонентов, составлен каталог идентифицированных аллелей, изучена их связь с качеством , продуктивностью и морозостойкостью.

Практическая пснность. В результате проведенных исследований, с участием автора, разработаны и адаптированы к задачам селекции высокопроизводительные методы электрофореза глиадиновых белков на крахмальном (КГ) (18) и полиакриламидиом гелях (ПААГ) (9). Разработаны основы генетической классификации глиадинов мягких (1) и тургидных ( твердых) (23) пшениц составлены каталоги идентифицированных аллелей ( 5,9,18,27). Установлена относительная и фактическая ценность аллелей глиадина в определении качества, продуктивности и морозостойкости у озимых мягких и тургидных ( твердых) пшениц ( 5,38,42). Выявлены спонтанные мутанты по глиадиновым аллелям и открыты "нуль" аллели (8,14) у озимых мягких

пшениц. Эти мутанты используются в селекционной работе (Жогин А.Ф., 1996). Для оперативного определения сооношения биотипов в гетерогенных селекционных образцах разработан "Способ оценки селекционного материала пшеницы" (А.С.К1360657) (17).

Предложена система комплексной оценки для отбора наиболее цепных генотипов пшеницы по качеству и сопряженных с полиморфизмом глиадина продуктивности и морозостойкости (38). Система используется в селекции озимой пшеницы Донского селекцснтра, других НИИ. С участием автора создано 7 сортов (Ростовчанка 2, Подарок Дону, Донская Нива, Дар Зернограда- озимая мягкая; Новинка 4, Новипка 5 и Донской янтарь -озимая тургидная).

Созданные автором изогенные по глиадиновым аллелям линии позволили установить исключительно большую роль в повышении жизнестойкости ( морозо-зимостойкость) у озимой мягкой пшеницы аллеля вМ 1Д5 и изучить глиадингеографию по зонам СНГ (37).

На основании проведенных исследований, с учетом мирового опыта и меняющихся условий хозяйствования сделан вывод о необходимости расширения задач селекции по качеству у мягких пшениц до трех-четырех направлений^ ( улучшители ), В ( хлебопекарные сами по себе), С (их улучшают за счет А), Д (кормовые, бисквитные, технические) (28).

Показана практическая необходимость и целесообразность использования белковых маркеров в первичном семеноводстве ,а также потребность периодического контроля за сохранением чистосортности (биотипного состава) у сортов используемых в гибридизации и в качестве стандартов в селекционных посевах (43).

Установлено, что резкое снижение качества муки вызывает признак мягкозерности (5). Для оперативного контроля за ним в селекционном мате-

риале предлагается использовал, специально подобранную коллекцию образцов озимой мягкой пшеницы и откалиброванный инфракрасный анализатор ( например, Инфрапид 61).

Разработан "Способ идентификации сортов тургидной пшеницы" (A.C. N1750554) (27). Установлено, что аллели глиадина Gld 1А1 и Gld 1В2,идентифицированные у мягких пшениц и вызывающие здесь снижение хлебопекарного качества, нет никакого риска для включения в генотипы (сорта) макаронных (тургидных-твердых) пшениц (36).

Апробация работы и публикация результатов исследований.

Разработанные методы оценки селекционного материала и результаты исследований атфобировались и используются в ВСГИ ( г.Одесса), Укр.НИИ орошаемого земледелия (г.Херсоп),Допском селекцентре (г.Зерноград),Северо-Донецкой станции (п.Тарасовка),Самарском НИИСХ (г.Безенчук), Ульяновском СХИ ( г.Ульяновск ), НИИСХ Юго-востока (г.Саратов), Курганском НИИСХ, Мироновском НИИ пшеницы и других НИИ.

Основные положения работы докладывались на V и 1 Съездах ВОГиС (1987,1994), на Координационных советах ВАСХНИЛ и РАСХН по качеству зерна ( 1983,1987,1994), на 6-м Французско-Советском симпозиуме по биохимии белка пшеницы (Монпелье,Франция,1989),

на Всесоюзной конференции по проблемам селекции зерновых культур на устойчивость к болезням и неблагоприятным условиям среды (Саратов,

1990), на Всесоюзной конференции по экологической генетике растений, животных и человека (Кишинев, 1991),на научно-практической конференции по проблемам интенсификации с.х. производства (Ростов/Дон - п. Рассвет,

1991), на международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам и селекции растений (Киев, 1994 ), на научных кон-

ференциях Ростовского общества ВОГиС (Ростов/Дон 1984-1997), а также во время отчетов в ВСГИ (1974-1983) и Донском селекцентре (1984-1996).

Исследования проведены в соответствии с научно-техническими программами.

Результаты исследований опубликованы в 50 научных работах. Основные положения диссертации изложены в 48 научных работах. Изданы рекомендации. Результаты исследований отражены в книгах академика A.A. Созинова "Улучшение качества зерна озимой пшеницы и кукурузы", "Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции", "Генетика и урожай". На отдельные публикации получены заявки от исследователей: Австралии, США, Англии, Германии, Италии, Испании, Нидерландов, Португалии.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести экспериментальных глав с обсуждением результатов, выводов и предложений, списка использованной литературы (233 на русском и 144 иностранных языках). Работа изложена на 265 страницах машинописного текста, содержит 55 таблиц, 32 рисунка и 6 приложений. В обзоре литературы дана характеристика факторов, влияющих на качество зерна, а также представлены сведения по биохимической гетерогенности и генетическому полиморфизму белков клейковины.

Основные положения, вынесенные на защиту.

1. Разработка основ генетической классификации и установление наследственной (мендилирующей) единицы глиадинов мягких и тургидных (твердых) пшениц, идентификация серии аллелей глиадинкодирующих генов на КГ и ПААГе, составление каталогов и запись генотипических формул блоков этого белка у сортов, линий, биотипов, мутантных форм.

2. Установление относительной и фактической ценности аллелей генов глиадина в определении наследственно-обусловленного уровня качества муки и сопряженных с ним продуктивности и морозостойкости у различного генетического материала пшеницы, а также выявление адаптивной значимости глиадиновых аллелей и их естественной геногеографии по зонам СНГ.

3. Разработка и использование системы комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству на начальных этапах селекции, а также целесообразность использования белковых маркеров в первичном семеноводстве и контроле за типичностью сортов-стандартов и используемых в гибридизации.

Условия, материал и методики исследований

Полнота генетического анализа изучаемого признака предполагает ряд этапов его исследования. Это необходимо и для определения характера влияния признака на хозяйственно- ценные свойства сортов пшеницы. В работе изучали сорта мягких, твердых и тургидных озимых пшениц, гибриды от их скрещивания (РI -Р4). Подбор пар для гибридизации осуществляли с учетом различий по качеству муки и по компонентному составу глиадина. В работу вовлекались гомогенные линии и биотипы сортов, что давало возможность получать достаточное количество зерна и провести углубленный анализ по качеству и другим свойствам. К анализу привлекались изогенные линии по глиадиновым аллелям, что открывает новые возможности в одном опыте изучить большой объем генетического полиморфизма признака и его влияние на ценные свойства пшеницы. В работе использовали искусственную популяцию, созданную на базе основного набора изо-глиадиновых ли-

ний для изучения естественной геногеографии по глиадиновым аллелям и выявления их адаптивной ценности. Вьшшяемость блоков компонентов глиадина при записи злектрофореграмм гетерогенных образцов проводили на экспериментальных популяциях по специальным схемам. Спонтанные мутанты позволили расширить наше представление о природе глиадиновых белков и их адаптивной и хозяйственной ценности. Анализ образцов из селекционных, контрольных и межстанционных питомников, предварительных и конкурсных испытаний позволил на практике апробировать установленные закономерности влияния различных аллелей на хозяйственно-цепные свойства и внести коррективы в рекомендации по использованию в селекции и семеноводстве.

Полевые опыты проводили на полях отдела генетических основ селекции ВСГИ (г. Одесса) в период с 1973-1983 годы и на полях отдела озимых пшениц Донского селекцентра (г. Зерноград) с 1984-1994 годы. Высевали родительские сорта, проводили гибридизацию и выращивали гибриды Р1-Р4.

Отдельные зерна гибридов и спонтанных мутантов выращивали в поле на площади питания 40x10 см. Каждое растение обмолачивали о тдельно. Зерно размалывали на мельнице "Квадрумат Юниор". С растения получали обычно 5-10 г муки, которой было достаточно для определения показателей седиментации, ПСХ, электрофореза, содержания белка и каротиноидов.

Биотипы сортов, гомогенные линии высевали отдельными рядами, с нормой высева принятой для данной зоны и предшественника. Предшественниками были: черный пар, кукуруза на силос, горох на зерно. Размол зерна производили на мельнице "Квадрумат Сеньср". Муки было достаточно для проведения биохимических и технологических анализов.

Изо-глиадиновые линии в начале выращивали по схеме гибридов, затем при размножении - рядковыми делянками и при испытании- делянками с учетной площадью 5-10 м2. Зерно размалывали на мельнице МЛУ-202.Экспериментальную популяцию из изо-глиадиновых линий два года пересевали в пяти зонах СНГ (делянками 5-10 м2).

Ежегодно анализировали электрофореграммы 2-3 тысяч селекционных образцов. На анализ брали примерно 30 г зерна и размалывали на мельнице МЛ 1-3100.

За растениями вели наблюдения, уход, учеты и защиту от вредителей. Проморозку растений, высеянных в ящиках, проводили в камерах фитотрона по методике и режиму отдела селекции пшениц селекцентра. Условия произрастания растений пшеницы в целом были типичными для зоны. В отдельные годы частично или полностью погибали слабо морозостойкие формы. Условия формирования урожая зерна и его качество в основном были благоприятными. Во влажные годы на парах наблюдалось полегание и поражение растений корневыми гнилями. Угнетения растений засухой не наблюдалось.

Качество муки определяли с помощью биохимических и технологических методов, а полиморфизм белков клейковины изучали молекулярно-генетическими методами.

Степень соответствия фактических данных гибридологического анализа компонентного состава глиадина теоретически ожидаемым определяли по критерию хи-квадрат. Оценку достоверности разности выборочных средних проводили по критерию Стьюдента. Звездочки, стоящие в таблицах возле цифр, означают, что различия достоверны соответственно при Р<0,1-*,Р<0,05-** и Р< 0,01-***. При анализе полученных данных использовали корреляционный и дисперсионный методы. Соискатель благодарит руково -дителя научной школы КСБЦ академика Н.Е. Алешина за внимание к работе.

Результаты исследований 1. Генетический анализ глиадина мягких пшениц.

Генетический анализ прерывистой или качественной наследственной изменчивости стал возможным благодаря открытию Г. Менделем основных закономерностей наследования признаков и введению понятия о дискретных наследственных факторах, отвечающих за развитие признаков. До сих пор гибридологический анализ представляет собой основной и действенный метод генетического анализа и не потерял своего значения в период развития молекулярной генетики и биотехнологии ( Савченко В.К.,1984).

Гибридологический анализ компонентного состава глиадина озимых мягких пшениц в сочетании со знанием генетического контроля этого признака (Shepherd К.,1968,Рыбалка А.И.,1975), был применен нами (1), одними из первых в мире, с целью идентификации отдельных генов ( аллелей) при использовании электрофоретических методов. В основе этого подхода лежит центральный постулат молекулярной генетики : один ген - одна лолипептид-

бщ ш m *

1 1

0L <Г

Рис.1 .Электрофореграммы глиадина сортов Безостая 1 (а) Днепровская 521 (б) и легкоотличимые типы гибридов от их скрещивания.

•7234 пая цепь. Однако в данном случае картина обстоит несколько иначе. Один глиадюпеодирующий ген, вернее локус, контролирует , как правило, не один электрофоретический полипептид, а группу сцепленно паследуемых ком-

понентов. Еще не знал генетического контроля глиадина отечественных сортов Созинов A.A. с сотр. ( 1974), назвали группу сцепленно наследуемых компонетов -блоком. Однако впервые сформулировать генетическое понятие блока компонентов, обозначающее менделирующую и практически не ре-комбияирующую в процессе кроссинговера группу компонентов, удалось только летом 1975 г., при проведении

гибридологического анализа гибридов F2-F4 от скрещивания сортов Безостая 1 и Днепровская 521 (1). В этой работе впервые предложен нами генетический принцип номенклатуры блока и разработаны основы генетической классификации полиморфизма глиадина. Этот принцип был взят за основу не только по глютенинам и белкам - ферментам у пшениц, но и по другим культурам и белкам. Первые три буквы Gld (Gli) латинское название глиадина. Большая буква после глиадина-А,В,Д, название генома. Первая цифра перед буквой - номер хромосомы, а после буквы - номер идентифицированного блока компонентов. При записи генотипической формулы глиадина сорта (биотипа), в начале идут номера типов блоков первой группы хромосом (1АДВ, 1Д), затем - шестой (6А,6В,6Д). Например: Безостая 1-Gld 1А4,1В1,1Д1,6А1,6В1,6Д1 (4.1.1.1.1.1), или Днепровская 521 (Gld 1.2.1.1.1.1)

На рисунке 1 представлены электрофореграммы глиадина родительских сортов Безостая 1,Днепровская 521 и четыре легкоотличимые типы этого белка у гибридов от их скрещивания.Первый тип электрофореграмм гибридов неотличим от электрофореграмм глиадина сорта Безостая 1 (Gld 4.1.1.1.1.1), четвертый - от электрофореграммы глиадина сорта Днепровская 521 (Gld 1.2.1.1.1.1). Второй (Gld 1.1.1.1.1.1) и третий (Gld 4.2.1.1.1.1) типы являются рекомбинантами. IIa этой комбинации впервые был убедительно доказан монофакториальный тип наследования аллельных блоков: Gld 1А4-

1А1, Gid 1B1-1B2 ( табл.1) и объяснена причина появления четырех вариантов гибридов , как следствие дигибридного расщепления -независимо наследуемых пар блоков компонентов.

Рассматриваемое скрещивание не является самым простым. В диссертационной работе приводится моногибридное расщепление (наиболее приемлемое при идентификации новых блоков компонентов) и полигибридпое. Всего на начальном этапе исследований было изучено пять гибридных комбинаций, что и позволило уже в 1976 году составить первый каталог (рис.2), а наиболее полным является каталог, опубликованный десять лет спустя (рис.3), уже после анализа более 3000 коллекционных образцов пшеницы.

Таблица 1.

Расщепление по блокам компонентов глиадина в Р2-Г4 при скрещивании сортов Безостая 1 и Днепровская 521.

Пары Назва- Типы F2 F3 F4

бло- ние спекг К-во р> К-во Р> К-во р>

ков блоков -ров рас- рас- рас-

рис.1 рис.1 тений ( тений тений с

1А4 1,3 20 54 79

1 1А1 1В1 2,4 1Л 59 22 0002 1. 0,90 110 60 0,69 0,25 83 72 1,63 0,10

2 1В2 3,4 57 0,13 0,50 104 0,03 0,75 90 0,03 0,75

Примечание: ^ 2 рассчитан при теоретически ожидаемом соотношении

фенотипических классов гибридов по блокам компонентов вМ 1А4-1А1. ОМ 1В1-1В2 в Р2-1:3; РЗ-3:5;Р4-7:9.

При обилии идентифицированных блоков компонентов, по каждому глиадинкодирующему локусу можно выделить серии блоков, мало чем отличающихся друг от друга. Их начали объединять в семейства.

Дн

I ЛИ»» «1Я

Рис.2 Первый каталог идентифицированных блоков компонентов от скрещивания сортов: Без.1 (1) и Кавказ (П), Без.1 и Восход (111), Без.1 и Дн.521 (IV), Без.1 и Одесская 26 (V), Без.1 и Одесская 3 (VI,61).

В 1978 году канадцы Бушук и Зильман предложили методику электрофореза глиадина, где вместо крахмального геля используется синтетический гель - полиакриламидный. Он обладает большей разрешающей способностью в области гетерогенных быстроподвижных компонентов. Буферная система осталась прежней. Сейчас эта система широко распространена. Международной группой по электрофорезу (Прага, 1982г., председатель Бушук ), принято решение об утверждении в качестве стандартов: методику Bushuk W., Zillman R.(1978) на ПААГе и методику на КГ в редакции Wrigley C.,et.al. (1982). Поскольку эти методики международно признаны, вызывает интерес насколько отличимы и сходны элекгрофореграммы одних и тех же сортов. С этой целью была проведена совместная работа с Мета-ковским Е.В. (ИОГен г.Москва).

G£<L aid. GicL Gid

TP M " " "*1B tA

'.'.»H.SSV." •V.V..V.V

Gld 1С

gue-ia I >1

Cld6b

V.8, V.o Gld6A

Gld 6 J)

I £7

I Z3

zj-lt

л/-

'•SV,

Рис.3. Каталог идентифицированных блоков компонентов глиадина на КГ у озимых мягких пшениц к 1986г. ( Попереля Ф.А., Собко Т А., 1987).

Проведенные исследования показали, что принятые международным сообществом стандартные методики, на сортах донской селекции дают идеальное совпадение по аллелям 1А,1В,1Д хромосом, а наблюдаемые различия по аллелям шестой группы хромосом с одной стороны свидетельствуют о большей разрешающей способности ПААГа, а с другой - могут объясняться как варианты одинаковых семейств блоков (21,31). В то же время нет основания отрицать потребность создания каталога идентифицированных блоков компонентов и на ПААГе.

Для составления каталога аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов на ПААГе ( стандартная методика), нами была выполнена ог-

ромная совместная работа по гибридологическому анализу расщепляющихся потомста от 32 комбинаций скрещиваний (9). Результаты этой работа показаны на рисунке 4.

и 1о /3 1 ь <ч ч а 1 и <1 ю 7 8 н 3

* 9 $ I н <? Г 44 ч <5 /3 5 2 Ч 9 6

2 5 1 3 б 10 11 7 Ц 8 9

В 2 9 6 3 1 1113 11 7 5

1 7 8 1 4 5 в 3 Ю 9

В

=

Рис.4 Каталог блоков компонентов глиадина сортов озимой мягкой пшеницы при электрофорезе на ПААГе (стандартная методика). Как видно из рисунка 4 на ПААГе, как и на КГ (рис.3) по каждому

кластерному локусу можно также выделить семейства блоков компонентов.

Представленные каталоги блоков компонентов глиадина на КГ и

ПААГе со временем претерпят некоторые изменения. Однако они уже сего-

дня описывают огромный полиморфизм по этим белкам и могут служить как для практического использования, так и для дальнейших исследований.

Спонтанные мутанты по птиалинам. Выше рассматривали наследственную единицу глиадинов - блок компонентов как стабильную, практически не рекомбинирукицую, сцепленно наследуемую группу компонентов. В то же время, по каждому из 6 основных г ли дин кодирующих локусов наблюдаются серии аллелей. Можно предполагать, что разнообразие аллелей глиадина обусловлено естественно текущим тысячелетия спонтанным мутагенезом. Он является первопричиной наследственной изменчивости признаков и свойств, аллелей их определяющих, а в нашем случае - блоков компонентов.

Уже в первый год анализа селекционного материала озимой пшеницы, среди линий от скрещивания сортов Прибой х Безостая 2, была обнаружена форма, получившая наименование М-1654, которая имела компонентный состав глиадина, идентичный материнскому сорта Прибой, но в зоне медленно подвижных компонентов у нее отсутствовали 1-3-я и 10-я субъе-дшгацы. Гибридологический анализ зерен и растений Р2 от скрещивания М-1654 с родительскими сортами показал, что явление отсутствия компонентов стойко наследуется и является аллельным блоку 01(1 1Д1.Эгот аллель назван нами "нуль"аллелсм. Так впервые был описан нуль аллель по глиа-динкодирующему локусу 1Д хромосомы (8).

Если нуль-аллель выявлен по локусу 1Д хромосомы, то естественно предполагать, что такие же аллели можно встретить в соответствии с законом гомологических рядов и по другим глиадинкодирующим локусам. И вот при анализе гибридов от скрещивания мутанта несущего вМ 1 ДО с сортом Безостая 2 в 1983 году был обнаружен уникальный экземпляр с полу-

ФШ

т N

- >4» -Я»

пустым гелем ( рис.5). Обнаруженная форма несет сразу несколько ( предположительно вИ 1Д0 и СЗМ 1В0) нуль аллелей и была названа супермутантом (12,14). К сожалению, получить растение и размножить мутант нам не удалось.

Поиски мутангных форм по глиадиновым белкам следует вести на уровне не отдельных растений, а зерен (половинок). .Нет сомнения, что биотипы несущие нуль аллели (и другие мутации) менее жизнеспособны и гибнут при перезимовке.

Создание изо-гдиаднновых линий. Важным этапом в изучении генетической природы полиморфизма признака, роли его аллелей в определении хозяйственно-пенных свойств, в установлении его адаггшвной ценности- играют изогенные линии. Работ по созданию таких линий по молекулярпо-генетическому признаку, каким является компонентный состав глиадина, мы

Рис. 5. Глиадин нормального (1) и спонтанных мутантов (2,3 с СШ 1Д0,4 - с 1В0 и 1Д0).

не встретили.

Начиная свою работу по созданию изо-глиадпновых линий нас интересовала, во-первых, возможность таких манипуляций с белковыми марке-

рами. Не могла не волновать мысль, что при проведении ряда беккроссов может быть разрушена ассоциация генов, маркером которой служит блок, и возникнуть новая .влияние которой на изучаемый признак будет иным. Во-вторых, изучая гибриды Р2-Р4 мы не смогли ответить как влияют блоки компонентов на качество-непосредственно, или опосредовано-являясь маркером гена (генов), тесно сцепленных с ним. Для создания изо-генных линий по молекулярно-генетическому признаку- компонентному составу глиадина был предложен способ: повторное насыщающее скрещивание гибридов с рекуррентным родителем (беккроссирование) и индивидуальные отборы с контролем по элекгрофореграммам. В геном сорта-реципиента Бсзостая 1 от 36 сортов - доноров перенесены основные 20 наиболее часто встречаемые аллели (блоки) глиадина по локусам всех хромосом (1А,1В,1Д,6А,6В,6Д). Полнота замещения ядерного генома сортов-доноров составила 98,44%. Элекгрофоретические наблюдения за поведением аллелей глиадина при проведении беккроссов, отборов и пересевов линий, показали, что блоки компонентов не разрушились и не изменили свой вид (22,23).

Основной набор этих линий (24 штуки), переданы в Национальные центры генетических ресурсов растений России и Украины.

2. Адаптивная ценность и естественнаи геногсо-графия глиадиновых аллелей.

Вопрос о распространении аллелей глиадина по различным агроклиматическим зонам выращивания сортов озимой пшеницы актуален, поскольку позволяет проследить какие аллели чаще встречаются в этих зонах.

Отсюда можно судить об адаптивной ценности тех или иных аллелей или их ассоциаций и вести более целенаправленный селекционный процесс. Повышение адаптивного потенциала растений - путь эффективного использования искусственных и, особенно, естественных энергоресурсов (Жучен-ко А. А., 1980).

В последнее время выполнено много работ по изучению адаптивной ценности и геногеографии глиадиновых аллелей, но их объектами, как правило, являются местные или селекционные сорта. Эти сорта отличаются не только аллелями глиадина и их ассоциациями, но и другими генетическими факторами, что затрудняет оценить адаптивную ценность блоков этого белка. Изо-глиадиновые линии, в этом отношении, представляют бесспорное преимущество. Нами была создана экспериментальная популяция из основных изо-глн-аллелей в равном соотношении и пересеяна 2-а года в пяти зонах СНГ (Краснодар, Зерноград, Тарасовка, Мироновка, Немчгаювка).

В результате пересева зерна популяции впервые получен прямой ответ об адаптивной значимости аллелей глиадина озимой мягкой пшеницы и установлена естественная глиадиногеография. Эколого-географические условия зоны выращивания оказывают влияние на выживаемость линий с разными аллелями глнадипа. Чем жестче условия выживания растений, тем выше селективность отдельных аллелей глиадина.

Исключительно велика роль в повышении морозо-зимоустойкости у озимой мягкой пшепицы аллеля G!d 1Д5. Генотип, его несущий, оказался очень жизнестойким в экстремальных условиях (Немчиновка) в сравнении с другими. В благоприятных же условиях (Краснодар) наблюдается индифферентное поведение разных аллелей,но здесь более селективны аллели, связанные с устойчивостью к болезням (Gld 1ВЗ). Этот опыт дает ответ, почему

в некоторых зонах на протяжении многих лет не отбирают те или иные аллели глиадина в районированных сортах. (35,37,41).

3. Определение соотношения биотипов в гетерогенном селекционном материале по шкале белковых маркеров.

Поступающие на анализ селекционные образцы пшениц отличаются высокой гетерогенностью по глиадиновым белкам. Это своеобразные микропопуляции. Чаще всего они включают 2-6 биотипов. Встречаются моно-морфные образцы. При чтении электрофореграмм глиадина, получаемых из смеси зерен селекционных образцов, следует рассматривать их как предварительные, позволяющие судить о подавляющем биотипе. Для более оперативного определения соотношения биотипов в гетерогенных селекционных образцах разработан "Способ оценки селекционного материала пшеницы". В его основу положена шкала электрофореграмм глиадина, полученная на основе сочетания аллелей в различном соотношении. Ее получают в результате смешивания в известном соотношении муки исходных гомогенных образцов.

Результаты исследований 12-ти искусственных популяций показали, что вы-являемость блоков компонентов зависит от доли присутствия того или иного биотипа. Блоки глиадина, включающие в свой состав мажерные компоненты 1ВЗ,1В2,1А1,1А2,1Д4 выявляются раньше, чем блоки, состоящие из минорных компонентов: СМ 1А5,1А4, 1В4,1Д7 или их отсутствия -вИ 1Д0. На выявляемость блоков компонентов при анализе популяций большое влияние оказывает конкретная ситуация сочетания биотипов. Предложено соотношение аллелей гетерогенного локуса записывать через

4+5

дробь: Ростовчанка СМ 60+40 .1.7. 3.1.2.

Наиболее полную и точную характеристику готового сорта можно будет получить при анализе отдельных зерен, а еще лучше при анализе его линий в первичном семеноводстве при закладке П-1. Эти исследования показывают, что использование биохимического принципа записи элекгрофо-реграмм глиадина при анализе селекционного материала приведет к серьезным заблуждениям, связанным в первую очередь с интерпретацией интенсивности компонентов в спектре. Генетический принцип записи элекгрофо-реграмм глиадина позволяет избежать подобных ошибок.

4. Влияние компонентного состава глиадина на качество и другие признаки.

Проведение генетического анализа глиадиновых белков клейковины с установлением их дискретной наследственной единицы - блока компонентов, полигенного контроля и множественного аллеллизма, открыло возможность изучить сопряженность аллельного состояния отдельных локусов с изменчивостью важнейших хозяйственно-ценных свойств пшеницы: качеством, продуктивностью, морозостойкостью.

Проще всего предполагать наличие связи глиадиновых аллелей с качеством зерна. Ведь глиадин - белок клейковины, которая является важнейшим фактором качества пшеницы. При этом можно полагать о непосредственном влиянии различных аллельных состояний кластеров генов на формирование признака. Не исключено, что блок компонентов может выступать в качестве типичного генетического маркера или "сигнали" участка хромосомы, в котором находятся другие гены, которые и оказывают непосредственное влияние на проявление исследуемого признака. Можно допустить, что правомерны обе эти гипотезы в зависимость от того, какой из признаков рассматривается: качество, или устойчивость к болезням, морозостойкость или опушенность колосовых чешуй и т.д.

Ответить, какая из этих гипотез верна, или они верны обе, можно только изучив многоплановый материал: гибридные популяции, чистые линии, сорта и их биотипы, мутантные формы и, наконец, изогешгые линии, а также оценить практическую значимость полученных наблюдений в оценке селекционного и семеноводческого материала.

Гибриды расщепляющихся потометв. В системе гибридологического анализа имеется возможность расчленить признак "компонентный состав глиадина" на ряд монофакториально наследуемых и изучить влияние каждого аллеля локуса одной хромосомы, а также 2-х,3-х,4-х,5-и и 6-и локусов разных хромосом в целом уже в Р2 (растения). При этом мы исходили из того, что все другие генетические факторы, которые могут оказывать влияние на изучаемые признаки (качество, продуктивность, морозостойкость), распределялись в сравниваемых группах гибридов с равной вероятностью и при больших выборках в группах гибридов, оказывали одинаковое влияние.

Таблица 2.

Влияние аллелльных блоков глиадина 1В хромосомы на качество муки у гибридов от скрещивания сортов Безостая 1 и Кавказ.

Сравниваемые блоки (рис.2) РЗ Р4

К-во растений Седимен-¡а- ция(мл) Белок в муке % К-во расгс- яий Седимен-тация(мл)

1 1В1 74 55,2 14,71 71 49,5

2 1В1+1ВЗ 46 50,1 14,96 17 45,3

3 1ВЗ 65 41,4 14,37 50 40,5

Безостая 1 15 57,3 14,23 10 54,0

Кавказ 15 39,0 14,97 10 41,7

Достоверность различий

1-2 1В1-(1В1+3) +5,1ххх -0,25

2-3 (Ш1+3)-Ш3 +8,7ххх +0,34 1-3 1В1-1ВЗ +13,8ххх -0,59 Без. 1-Кавказ( 1ВI- 1ВЗ) Н8,3ххх -0,79 Бсз.1-1тип(ШЫВ1) +2,1 -0,48 Канказ-Зтип(1ВЗ-1ВЗ) -2,4 +0,6

+ 4,2ххх + 4,8ххх + 9,0ххх +13,3 ххх + 4,5х +1,2

Гетерозиготы и особенно гомозиготы по локусу Gld 1ВЗ в обоих поколениях имеют значительно хуже качество муки (седиментация), чем гомозиготы по локусу Gld 1В1 ( табл.2 .^Недостоверность различий показателя седиментаци между сортом Кавказ и группой гибридов с подобным ему 3-им типом спектра, а также между Безостой 1 и 1-ым типом, позволяет заключить, что отличия между родительскими сортами в основном обусловлены различиями компонентного состава глиадина и определяются они аллелями локуса хромосомы 1В.

Во всех поколениях максимальное качество муки имеют гибриды, идентичные по глиадинам сорту Безостая 1 (1тип), а минимальное - сорту Днепровская 521 (4тип). Растения со вторым и третьим типами, занимают промежуточное положение. Присутствие блоков Gld 1А1 и 1В2 сопровождается достоверным снижением качества муки, особенно при их сочетании в генотипе. Более резко снижает качество блок Gld 1А1. Различия по седиментации у родительских сортов полностью объясняются различиями аллелей глиадина по локусам 1А и 1В хромосом (табл.3).

При сравнении средних значений показателя седиментации различающихся по блокам компонентов глиадина Gld IA4 и 1А1 гибридов от скрещивания сортов Безостая 1 и Одесская 3, этот признак во всех случаях был достоверно выше у групп растений с блоком Gld 1А4 (в F3 на 7,5мл, а в F4 на 12,3мл). Аналогичное сравнение блоков Gld 1В1 и 1В2 показало, что седиментация у гибридов с блоком Gld IB1 выше ( в F3 на 0,9 мл, в F4-6,6мл). Важно отметить, что аналогичные результаты получены при сравнении тех же пар аллелей у гибридов от скрещивания сортов Безостая 1 и Днепровская 521 (табл.3). При сравнепии гибридов с блоками Gld 1Д1 и 1Д4, достоверных различий по седиментации не наблюдалось.

Таблица 3.

Влияние аллельных блоков ОМ 1А4-1А1 и вМ 1В1-1В2 на качество муки у гибридов от скрещивания сортов Безостая 1 и Днепровская 521.

Сравниваемые F3 F4

блоки (рис.1) К-во Седи- Белок К-во Седи- Белок

расте- мента- % рас- мента- %

ний ция тений ция(мл)

(мл)

1. 1А4,1В1 22 56,8 15,51 38 52,7 14,4

2. 1А1,1В1 38 48,3 14,42 34 42,5 13,86

3. 1А4,Ш2 32 49,5 14,11 41 47,7 13,78

4. 1А1,1В2 72 45,8 14,92 49 39,5 14,01

Безостая 1 10 59,8 14,98 10 51,6 14,56

Днепровская 10 44,2 14,93 10 38,4 13,71

521

Достоверность различий

1-2 1В1-фон +8,5ххх : +1,09 +10,2ххх +0,54

1А4-1А1

3-4 IB2 +3,7ххх -0,81 +6,2ххх -0,23

1-3 1А4-фон +7,3ххх +1,4х (5/txxx +0,62

1В1-1В2

2-4 1А1 +2,5 -0,5 +3,0х -0,15

Без.1-Дн.521 +15,бххх ; НО,05 +13,2ххх 10,85

1-4(1А4,1В1-1А1,1В2) +11,0ххх +0,59 + 13,2ххх +0,39

Бсз.1-1тин +3,0 +0,53 -1,1 +0,16

Дн.521-4тип +1,6 +0,01 -1,1 -0,3

У гибридов от скрещивания сортов Безостая 1 и Восход наблюдалась зависимость показателя седиментации как от компонентного состава глиа-дина (Gld 1А1 и здесь был достоверно хуже Gld 1А4), так и от консистенции эндосперма. Гибриды с hard эндоспермом отличались значительно более высоким уровнем седиментации по сравнению с аналогичными по компонентному составу глиадина гибридами, но soft эндоспермом.

Идентифицированные блоки компонентов глиадина у сортов Безостая 1 и Одесская 26 оказывали аналогичное влияние на качество муки.

Проведенные нами исследования на уровне начальных расщепляющихся потомств гибридов, позволили впервые установить, что генетически

обусловленные особенности компонентного состава глиадина, его аллели имеют отношение к наследственному уровню качества муки. Наибольшее влияние на качество муки оказвало присутствие различных блоков 1А и 1В хромосом. Самое сильное снижение качества муки вызывает блок Gld 1ВЗ, затем Gld 1А1 и 1В2. Всего лишь замена их аллельными блоками Gld 1 A4 и Gld 1В1, приведет повышение качества муки до уровня сорта сильпой пшеницы -Безостая 1. Изученные аллели глиадина и консистенция эндосперма по влиянию на качество муки были ранжированы в следующем порядке: Gld 1А4>5>1

Gld 1В1>4>2>3 hard>soii

Gld 1Д4>1 Gld 6A3>1,

Этот подход затем был использован большой группой исследователей школы A.A. Созинова, что в итоге позволило вовлечь в ранжировку все наиболее часто встречаемые в селекционном материале аллели глиадина (Со-зинов А.Л.,1985;Коиусь М.М.,1988).

Gld 1А 7>4>5>3>2>1>6 Gld 6А 3>1

Gld 1B 1 >4>2(7)>5>6>3 Gld 6B 2>1 Gld 1Д 4>5(7)>1 >2,3 Gld 6Д 2>1

Константные линии (биотипы сортов) и мутанты.

Не менее удобны для изучения влияния различных аллелей глиадина на признаки пшеницы липни районированных, передаваемых па испытания и коллекционные сорта. Нами изучены линии трех хорошо известных сортов озимой пшеницы: Донская безостая, Тарасовская 61и Урожайная. Особенностью этих сортов является то, что они относятся к группе "сильных" птпепиц и не содержат аллелей глиадина, явпо снижающих качество муки:

вЫ 1А1(6), 1В2(7), 1ВЗ. Все они состоят го четырех основных биотипов по глиадинам и, следовательно, отличаются по аллелям двух глиадинкоди-ругощих локусов.Выделенные лиши размножались и высевались отдельными делянками. Учитывалась урожайность, выполнялись технологические оценки, и 1громорозки растений.

Исследования показали, что самые высокие показатели качества (сила муки -и1) и морозостойкости были у растений Донской безостой с 1 биотипом (Ос! 6АЗ,6Д2), а самые низкие у 4-го (вЫ 6А1,6Д1), однако продуктивность у них самая высокая. Выигрывая в качестве и морозостойкости, приходится терять в продуктивности. Такая же закономерность наблюдалась и на линиях Тарасовской 61 (СИ 1АЗ,1Д5-повышены качество и морозостойкость,вЫ 1А4,1 Д1- продукгавность).По линиям сорта Урожайная была видна только закономерность положительного влияния на Качество и морозостойкость аплеля С1с16АЗ,

Линии сортов, как и гибриды сгг скрещивания родителей с различающимися аллелями по 2-6 глиадинкодирующим локусам, позволяют выявлять аддитивный эффект взаимодействия не аллельных блоков и выделять трансгрессивные формы.

Спонтанные мутанты, которые были описаны выше, представляют интерес при изучении влияния различных аллелей на признаки пшеницы и как источник новых, еще не известных аллелей. Форма М-1654, являющаяся носителем нуль аллеля вМ 1Д0, обратила внимание своим высоким качеством. Уже у гибридов в ¥2, весьма гетерогенной среде, было установлено преимущество СИ 1 ДО над С1с11Д1 и 1Д2 по качеству ( седиментация была выше в среднем на 10 мл.). Однако до сих пор у нас не создано сортов озимой мягкой пшеницы с <ЗШ 1Д0, но есть такие сорта в Западной Европе.

Причина заключается в том, что растения с Gld 1Д0 менее зимостойки и в наших условиях гибнут.

Изо-глнадиновые линии. Создавая эти линии мы хотели прежде всего установить истинную ( фактическую) ценность различпых аллелей в определении качества муки у озимой пгаепицы, на сколько она отличима от относительной ценности, установленной при изучении гибридного материала.

В результате 3-х летнего изучения линий с посевом их в делянках по чистому пару и кукурузе на силос (беспарье) впервые установлена фактическая, а не относительная ценность различных аллелей глиадина в определении наследственного уровня качества муки у озимой мягкой пшеницы. Доказано, что аллели глиадина непосредствешго и совершенно одинаково влияют на качество муки как на уровне гибридов F2-4, так и на уровне изо-глиадиновых лилий, причем выращенных на разных предшественниках (пар, беспарье) и в равных зонах (Одесса, Зерноград). Наиболее резкое снижете качества муки (седиментация,сила муки, объем и оценка хлеба) вызывали блоки Gld 1ВЗ и Gld 1А1. Линии с аллелями Gld 1В2,1В7, хотя и имели ниже седиментацию и силу муки, по объему хлеба мало чем отличались от стандарта (Gld 1В1-Безостая 1), особенно на более богатом фоне (пар).

По морозостойкости у изо-глиадиновых линий рекордсменом оказался аллель Gld 1Д5. Затем следовали : Gld 1А1, 1В5, 1А2, №13, 1Д6, 6В2, 1В4,1А5,1А7,1В12, 1В8, 1Д4, 1В9, 1ВЗ, 6Д2, 6АЗ, 1АЗ, а по локусам хромосом их можно ранжировать:

Gld 1А 1>2>5>7>3>4 Gld 6А 3>1

Gld IB 5>13>4>2>7>12>8>9>3>1 Gld 6В 2>1 Gld 1Д 5>6>4>1 Gld 6Д 2>1

В результате анализа различного материала (гибриды F2-4, константные линии, биотипы сортов, мутантные формы, изо-глиадиновые линии) предложена система комплексной оценки гепотипов пшеницы по качеству муки и связанных с ним продуктивности и морозостойкости. В эту систему включены важнейшие факторы, влияющие на хлебопекарные качества муки: полиморфизм клейковинных белков (и прежде всего глиадшюв), содержание белка ( от которого зависит содержание клейковины), и консистенция эндосперма (hard-soft) (табл.4,5,6).

По глиадинам "О" баллов взят аллель Gld 1ВЗ, за +10 аллели Gld 1В1,1В4,1А7, остальные в промежутке - от +1 до +8. По высокомолекулярным глютенинам за "0" баллов приняты аллели Glu IAO и 1ДЗ, а за +4 Glu 1BI, остальные в промежутке. За "0" баллов по содержанию белка взят уровень в 14%. Увеличение белка дает прирост баллов, снижение-уменьшение. Тюшчпая мягкозерность (soft) оценена в -18 баллов.

Таблица 4.

Глиадин озимой мягкой пшеницы с максимально выраженными признаками на генофоне сорта Безостая 1.

Признак Аллели глиадинкодирующих локусов хромосом

1А № 1 1Д 6А 1 6В 6Д

Качество мухи 7 1 0 3 2 2

(4,5,3) (4,5) (4,5,7)

Морозостой- 1 5 5 3 2 2

кость (6,2) (13,4,2,7) (7,6,4)

Продуктивность 1 4 1 1 1 1

(6,2,4,3) (7,2,3,1) (2,3)

По всем призна- 4,5,3 1,4 5,7 зд 2,1 2,1

кам

Примечание, аллели в скобках незначительно меняют выражение признака.

Таблица 6.

Шкала для селекционной оценки генотипов пшеницы по пгаадиновым аллелям (качество, морозостойкость).

Оценка гено- Глиадинкодирующие локусы хромосом

типа 1А 1 1В | 1Д | 6А | 6В | 6Д

Отличный 2,3,4,5 1,4 7,5,4 3 1,2 2

Хороший 2,3,4,5 1,4 1,2,3 1,3 1,2 1,2

Среди»» 2,3,4,5 2,7 7,5,4 1,3 1,2 1,2

Удовлетво- 1+4,2,3 2,7 1,2,3 1,3 1,2 1,2

рит. 4,5 3 4,5,7 1,3 1,2 1,2

Плохой 1,6 2,7 1,2,3 1,3 1,2 1,2

4,5,3 3 4,5,7 1 1 1

Таблица 7.

Рейтинг основных генетических факторов, влияющих на качество муки озимой мягкой пшеницы.

Хро Gld-аллели (баллы) Glu Белок Конси-

-мо- аллели стен эн-

сома баллы досперм

0 1 2 3 4 ¡5 6 7 «1 9 1 12 13 0 1 2 3 41 % Ба Тип бал

1 0 лл л

1А г 8 8 8 8 2 10 6 6 6 0 2 -> 12 -10 hard 0

1В 10 4 0 10 8 0 4 5 5 4 4 4 3 13 -5

1Д 6 2 1 1 5 4 1 4 4 2 1 0 14 0 soft -18

6А 2 2 4 15 +5

6В 2 4 16 10

Щ 2 3 17 15

5. Использование глиадиновых маркеров в селекции и семеноводстве.

Предлагаемая система оценки генотипов по качеству муки была многократно апробирована нами и другими исследователями при оценках селекционного и семеноводческого материала. Только автором за годы оценок (1977-1997гг), изучено более 100 тыс. образцов озимой мягкой пшеницы.

В результате анализа большого количества селекционных образцов и сортов из различных селекцеетров страны и иностранной селекции установлено, что хлебопекарными могут быть только твердозерные (hard) пшеницы.

Чтобы сорт пшеницы мог претендовать на "сильную" (улучшитель), его глиадин не должен содержать аллели Gld 1ВЗ(6), 1А1(6), 1В2(7), а сумма баллов аллелей этого белка у сортообразца должна быть не ниже 25. Содержание белка не должно опускаться ниже 14%. Поскольку сорта озимой мягкой пшеницы отечественной ( в том числе и донской) селекции по высокомолекулярным глютенинам мало чем отличаются, этот признак на данном этапе селекции можно не учитывать.

Результаты многолетнего использования полиморфизма белков зерна при оценке селекционного материала не только подтвердили предложенную систему оценки генотипов пшеницы по качеству муки, но и позволили выявить ее эффективность. Так установлено, что до использования глиадино-вых маркеров в селекции донских пшениц в 3-х сортах из 9 созданных, имелись отрицательные для качества аллели Gld 1ВЗ (Зерноградка 2), Gld 1Д7 ( Донская полукарликовая ) и Gld I А1,1В2 ( Приазовская улучшенная), что не позволило им попасть в список улучшителей. С использованием метода создано 18 сортов. Все они имеют "хороший" глиадин ( 25-29 баллов), hard эндосперм, содержание белка не ниже 14%, что и гарантирует им высокое хлебопекарное качество. Следует особо подчеркнуть, что к этому итогу привел коллектив отдела озимой пшеницы известный селекционер академик И.Г. Калиненко, рационально сочетая традиционные (технологические, биохимические) и новые (молекулярно-генетические) методы оценок.

Учитывая мировой опыт, меняющиеся условия хозяйствования в стране, логику хлебопечения, а также биологические особенности формирования урожая и качества зерна, сделан вывод о необходимости расширения задач селекции. Для наиболее полного удовлетворения потребности страны в зерне в количественном и качественном отношении и повышения эффективности его производства, в селекционных программах по озимой мягкой пшенице в зоне производства высококачественного зерна должно бьгть три-

четыре направления: А ( улучшители), В ( хлебопекарные сами по себе), С (их улучшают за счет А), Д ( кормовые, бисквитные, технические).

На конкретных примерах показана необходимость и целесообразность использования глиадиновых маркеров в первичном семеноводстве (Зерно-градка 8), а также потребность периодического контроля за сохранением чистосортности (биотипного состава) сортов (24 штуки), используемых в гибридизации и в качестве стандартов в селекционных посевах.

6. Глиадиновые белки тургидных твердых пшениц.

Для идентификации сортов тургидных (твердых) озимых пшениц (27) разработай способ ( А.С.Ш750554). В его основе лежит гомология геномов мягких, твердых и тургидных (Аа-Аа-А1, Ва-Ва-В') пшениц, отдельных их хромосом или их участков и использование тестерных аллелей (блоков компонентов) глиадина, идентифицированных ранее у мягких пшениц. Эти аллели имеются в геноме твердых, а твердые пшеницы легко скрещиваются с тургидными. Нами было обнаружено, что сорт озимой твердой пшеницы селекции ВСГИ - Черномор имеет четкие тестершлс аллели 01(1 1А1 и вН 1В2 унаследованные от мягких. Он послужил в качестве отцовского компонента, как носитель тестерных аллелей в гибридизации с тургидной пшеницей. Это позволило нам идентифицировать первые блоки компонентов у тургидных (твердых) озимых пшениц, предложить номенклатуру и составить каталог (рис.6). Для расширения каталога идентификацию новых аллелей следует продолжить.

Поскольку аллели СМ 1А1 и ОЫ 1В2 у мягких пшениц вызывают снижение хлебопекарного качества, возник вопрос, как они влияют на макаронные свойства у тургидных ( твердых). Исследования показали, что нет никакого риска при уровне белка около 14% включать эти аллели в макаронные пшеницы. Прочность макарон от их присутствия даже увеличивает-

ся, вероятно они делают упругую клейковину тургидных (твердых) более пластичной.

иыг 9 Ь

сШ^

Рис.6. Каталог идентафидированных блоков компонентов глиадина тургидных - твердых (т) озимых пшениц на КГ.

Основные выводы.

1.Основными факторами генетического полиморфизма клейковинных белков у сортов пшеницы является:полигенный контроль (6 основных и 2 дополнительных локуса по глиадинам, 3 локуса по низкомолекулярпым и 3-по высокомолекулярным глютенинам) и множественный аллелизм по каждому локусу ( от 2-х и выше аллелей). На элекгрофореграмме каждый аллель маркируется, как правило, группой сцешюнно наследуемых компонентов, названных блоком. Блок компонентов - это дискретная наследственная (менделирукмцая) единица клейковинных белков. Разработаны номенклатура блоков и основы генетической классификации этих белков.

2. Гибридологический анализ компонентного состава глиадина удобный путь для идентификации различий между сортами и для изучения характера влияния вариантов блоков (аллелей) на качество муки и другие хо-зяйствсшго-цегшые признаки. Приводятся первый и наиболее полные каталоги идентифицированных блоков у мягких пшениц на КГ и ПААГе. Эта каталоги расширяют представление о природе кластерного локуса и дают возможность выделил, семейства блоков компонентов, включающих те их типы, которые мало различаются по электрофоретичсским характеристикам, по селекционной ценности или же являются рекомбинационнкми производными одного локуса.

3. Выявлены спонтанные мутанты по глиадиновым белкам, затрагивающие один (М-1654) и несколько (супермутант) глиадинкодирующих ло-кусов целиком, а также описаны примеры очень редких мутаций внутри локуса. Мутант М-1654, обнаруженный в 1977 году, после проведения генетического анализа, стал родоначальником нуль аллелей. Эти мутации проливают свет на причины и следствие огромного естественного полиморфизма клейковинкых белков.

4. По молекулярно-генетическому признаку - компонентному составу глиадина созданы впервые изогенные линии. Разработан способ их создания - повторное насыщающее скрещивание гибрида с рекуррентным родителем <{еккроссирование) и индивидуальные отборы с контролем по элек-трофореграммам. В геном сорта-реципиента Безостая 1 от 36 сортов-доноров перенесены основные 20 аллеля (блока) глиадина по всем локусам хромосом. Полнота замещения ядерного генома сортов-доноров составило 98,44%. Основной набор этих линий (24 ппуки) переданы в Национальные центры генетических ресурсов растений Украины (УИР) и России (ВИР).

5. В результате пересева зерна экспериментальной популяции, составленной из зоглиадиновых линий в пяти зонах СНГ впервые получен прямой ответ об адаптивной значимости аллелей глиадина и установлена естествен-

ная гл иади i гагеография. Эколого-географические условия зоны выращива ния оказывают влияние на выживаемость линий с разными аллелями глиа-дина. Чем жестче условия выживания растений, тем выше селективность отдельных аллелей. Исключительно велика роль в повышении морозостойкости у озимой мягкой пшеницы аллеля Gld 1Д5. В благоприятных же условиях (Краснодар) наблюдается индифферентное поведение разных аллелей, по здесь более селективны аллели, связанные с устойчивостью к болезням (GldlB3).

6.В системе гибридологического анализа у гибридов расщепляющихся потомств впервые было установлено, что генетически обусловленные особенности компонентного состава глиадипа, его аллели имеют отношение к наследственному уровню качества муки. Наибольшее влияние на качество муки оказывало присутствие в спектре глиадина блоков компонентов, контролируемых локусами 1АДВ хромосом. Резкое снижение качества муки вызвал блок Gld 1ВЗ, затем Gld 1А1,1В2. Всего лишь замена их аллельными им Gld 1А4ДВ1 приводит к повышению качества муки до уровня сильной пшеницы Безостая 1. Очень резко снижает качество муки признак мягко-зерности (soft). Он не сцеплсн с глиадинкодирующими локусами и его необходимо учитывать самостоятельно. Приводит к улучшению качества муки, но одновременно снижает морозозимостойкость нуль аллель Gld 1 ДО.

7. Константные линии, биотипы сортов позволяют изучать закономерности по влиянию на признаки как по отдельным аллелям глиадина, так и по аллелям во взаимодействии. Здесь можно наблюдать аддитивный эффект взаимодействия не аллельных блоков компонентов и выделять трансгрессивные формы, следить за чистолинейностыо сорта и компановать его биотипный состав в таком соотношении, чтобы он мог расширить свой ареал и наиболее эффективно сочетал аллели по влиянию на качество и урожай.

8. На изо-гля эдиповых линиях впервые установлена фактическая, а не относительная ценность различных аллелей в определении генетического уровня качества муки у озимой мягкой пшеницы. Доказано, что аллели глиадина непосредственно и совершенно одинаково влияют на качество муки как на уровне гибридов F2-4, так и на уровне изо-глиадиновых линий, причем выращенных на разных предшественниках (пар, беспарье) и в разных зонах. И здесь наиболее резкое снижение качества муки (седиментация, сила муки, объем и оценка хлеба) вызывали блоки Gld 1ВЗ и Gld 1А1. Линии с аллелями Gld 1В2,1В7, хотя и имели ниже показатели седиментации и силы муки, по объему хлеба - мало чем отличались от стандарта (Gld IB 1-Безостая 1). По морозостойкости рекордсменом оказался аллель Gld 1Д5.

9. В результате анализа различного материала предложена система комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству и связанных с ним продуктивности и морозостойкости. В эту систему включены: полиморфизм клейковинных белков (и прежде всего глиадшюв), содержание белка ( от которого зависит содержание клейковины) и консистенция эндосперма (hard-soft). Многолетнее использование полиморфизма белков зерна при оценке селекционного материала позволило выявить эффективность подхода. Рациональное сочетание традициошшх (технологических, биохимических) и новых (молекулярно-генетических) методов - наиболее эффективный путь в селекции озимой мягкой пшеницы, подтверждешгый многолетней практикой.

10. Разработан способ идентификации сортов озимых тургидных (твердых) пшениц по глиадиновым белкам в системе обычного гибридоло-гичекого анализа. Составлен каталог идентифицированных аллелей для записи генотипических формул глиадина этих пшениц. Изучено влияние особенностей компопентного состава глиадина на качество, морозостойкость, продуктивность. Идентифицированные у этих пшениц аллели имеют некоторое (не всегда достоверное) преимущество над Gld 1А1,1В2 ( идентифи-

дарованные у мягких) по морозостойкости, содержанию белка и каропшои-дов, но уступают по урожайности, массе 1000 зерен, прочности макарон.

Предложения и рекомендации.

1. Наиболее адаптированными к селекционным нуждам являются электрофоретические методы разделения глиадинов на КГ и ПААГе в кислом буфере (рН 3,1-3,2) с системой каталогов идентифицированных аллелей и сведениями о степени их влияния на качество муки. Определенную информацию о сортовом разнообразии можно получить по высокомолекулярным глютенинам в ПААГе с СДС в щелочном буфере (рН 8,8).

2. Гибрдологический анализ - простой и удобный способ идентификации компонентов спектра глиадинов как у мягких, так и у тургидных (твердых) пшениц, при условии, что один из родителей имеет четкие тестерные аллели (блоки компонентов). Эту работу можно проводить уже на гибридах ¥2 (растения) где ее можно совмещать с изучением влияния новых аллелей на хозяйственно-ценные свойства.

3. Спонтанные мутанты в глиадишеоднрующих локусах целесообразно искать при анализе отдельных зерновок (половинок), учитывая их пониженную жизнеспособность. Эти формы могут представлять интерес для начала селекционной работы по улучшению кормовой и пищевой ценности пшеницы.

4. Велика роль в повышении жизнестойкости (морозозимостойкости) аллеля 0!с1 1Д5. На большей части территории России, где возделываете» озимая мягкая пшеница, необходимо присутствие этого аллеля в сортах. Исключение составляет Краснодарский край (кроме северных районов). Ро-сгвоская область находится на стыке. Здесь нужны сорта с СИ 1Д5 (более пластичные) и с вМ 1Д1 (более интенсивные).

5. Анализируемые по глиадиновым белкам селекционные образцы характеризуются высокой гетерогенностью. Для более оперативного предва-

рителытого определения соотношения биотипов в селекционных образцах предлагается использовать разработанный способ (А.С. N1360657).

6. Для отбора наиболее цепных генотипов пшеницы по качеству и связанных с ним продуктивности и морозостойкости предложена система комплексной оценки. В эту систему включены важнейшие факторы: полиморфизм клейковинных белков, содержание белка, консистенция эндосперма. Для оперативного контроля за мягкозерностью в селекционном материале предлагается использовать специально подобранную коллекцию образцов и откалиброванный инфракрасный анализатор.

7. Для наиболее полного удовлетворения потребности страны в зерне в количественном и качественном отношении и повышении эффективности его производства, рекомендуется расширить в селекционных программах задачи селекции по качеству зерна у озимых мягких пшениц до трех-четырех направлений :А (улучшители), В(хлебопекарные сами по себе), С (их улучшают за счет А) и Д (кормовые, технические, бисквитные).

8. Использование глиадиновых маркеров целесообразно при закладке семенного питомника (П-1), как поли-, так и мономорфного сорта. В первом случае это необходимо для поддержания биотипного состава (их соотношения), во втором - для поддержания чистолинейпости сорта. Во всех случаях необходим контроль за примесями, выявить которые по внешним признакам бывает невозможно.

9. Аллели глиадина СИ 1А1 и С 1(1 1В2, идентифицированные у мягких пшениц, и вызывающие здесь снижение хлебопекарного качества, нет ни какого риска для включения в генотипы ( сорта) макаронных ( тургидных - твердых) пшениц при уровпе белка в зерне около 14%.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Созинов A.A., Попереля Ф.А., Копусь М.М. Генетически обусловленные различия компонентного состава глиадина сортов Безостая 1 и

Днепровская 521 и их роль в определении качества муки.// Докл.ВАСХНЮЫ975.-Ш 1 .-С. 10-14.

2. Копусь М.М. Гибридологический анализ компонентного состава глиадина и качество муки у озимой пшеницы. 1. Сорта Безостая 1 и Кавказ. П. Сорта Безостая 1 и Одесская 26.//Научно-тех. бюлл. ВСГИ. Одесса,-1977.-В.28.-С.35-38.-С.39-43.

3. Копусь М.М. Гибридологический анализ компонентного состава глиадина сортов мягкой пшеницы Безостая 1 и Одесская 3.// Научно-тех. бюлл. ВСГИ. Одесса.-1980.-В.1(35).-С.43-45.

4.. Копусь М.М. Связь генетически обусловленных особенностей компонентного состава глиадина с качеством муки у сортов мягкой пшени-цы.//В Сб.: Биологические аспекты изучения и рационального использования животного и растительного мира.Рига.-1981.-С.50-51.

5. Копусь М.М. Связь генетически обусловленных особенностей компонентного состава глиадина с качеством муки у сортов мягкой пшеницы: Автореф. дис. ...канд. биол. наук, Немчиновка, Московской обл.-1981.-16 с.

6. Ильина Л.Б., Копусь М.М., Сайфуллин Р., Гималов Ф.Р. Исследование спирторастворимого белка эндосперма сортов и гибридов яровой пшеницы методом электрофореза в крахмальном геле.//Цитол.иген.-1981.-Т.15.-N2.-C.40-45.

7.Копусь М.М. Влияние особенностей компонентного состава глиадина и консистенции эндосперма на качество муки у гибридов от скрещивания сортов пшеницы Безостая! и Восход.// Научпо.-тех. бюлл. ВСГИ.-1982,-Вып.1(43).-С.35-39.

8. Созинов A.A., Копусь М.М. Мутация глиадинкодирующего локуса хромосомы 1Д//Цитол.и ген.-1983.-Т.17.-№.-С.19-24.

9. Metakovsky E.V.,Novoselskaya A.Ja.,Kopus M.M.,Sobko T.A., Sozinov A.A.Bloks of gliadin components in Winter Wheat detected by one dimensional polyacrilamide gel eIectrophoresis.//TAG.-1984.-67.-N6.-P.559-568.

10.Копусь М.М., Перерва Т.Н., Игнатьева Н.Г. К методике определения содержания азота в растениях.//!? кн. Селекц. и сем-во с.х.растений в Ростовской обл. Зерноград.-1985.-С.52-56.

11. Копусь М.М., Перерва Т.И., Евич И.В. Компонентный состав глиа-дина сортов озимой мягкой пшеницы Донской селекции.//В сб.: Биохимическая оценка белков зерновых культур в связи с задачами селекции на качество. Краснодар. -1985.-С.12-16.

12. Копусь М.М., Перерва Т.И., Мокрушина Н.И. Спонтанный мутант компонентного состава глиадипа "полупустой гель" В сб.: Селекция и сем-во зерновых к-р, Саратовский СХИ.-1986.-С.59-60.

13. Басова К.И., Перерва Т.И., Шептана A.A., Копусь М.М. Каротинои-ды в зерне кукурузы, озимой твердой и тургидной пшениц и методика их определения.//В кн.: Селекц., сем-во и агротехн. корм, к-р на Дону-Зерноград, 1987.-С.67-73.

14. Копусь М.М. Супермутант компонентного состава глиадипа мягкой пшеницы (эффект "полупустого"геля).//Докл. ВАСХНИЛ.-1987.-Ш.-С.5-6.

15. Копусь М.М. Блоки компонентов глиадипа как белковые маркеры при анализе популяций.//Селекция зерновых и крупяных культур на Дону.-Зерноград.-1987.-С.90-97.

16. Копусь М.М. Глиадиновые маркеры при изучении селекционного материала.//Тр.У съезда ВОГиС им. Вавшгава.-Москва,1987.-Т.1 V.-4.4.-С.18.

17. Копусь М.М. Определение соотношения биотипов в гетерогенном селекционном материале по шкале белковых маркеров.//Доклады ВАСХ-НИЛ.-1988.-С.4-5.

18. Копусь М.М. Исследование полиморфизма глиадина методом электрофореза в крахмальном геле. Методические рекомендации.-Ростов/Доп-1988.-40C.

19. Копусь М.М. Глиадиновые маркеры в селекции пшеницы. - Ростов-на-Дону .-1988.-27с.

20. Копусь М.М., Прищепов С.Н., Ковтун В.И., Шатилов Л.Г. Глиадиновые маркеры и морозостойкость озимой мягкой пшеницы.// В сб.: Проблемы селекции зерновых культур на устойчивость к болезням и неблагоприятным условиям среды. Саратов-Москва.-1990.-С.32-33.

21. Метаковский Е.В., Копусь М.М. Анализ аллелей глиадинкодирую-щих локусов у сортов мягкой пшеницы в крахмальном и полиакриламидном гслях.//Докл. ВАСХНИЛ.-1991.-Ш.-С.5-9.

22. Копусь М.М. Замещенные линии по глиадиновым аллелямновый этап в изучении их генетики, селекционной и экологической ценносги.//В сб.: Экологическая генетика растений, животных,человека.-Кишинев. Шти-инца.-1991.-С.35.

23. Копусь М.М. Генетический контроль .номенклатура и классификация компонентного состава глиадина у тургидных -твердых озимых пше-ниц.//В сб. Экологическая генетика расг., жив., человека.-Кишинев. Штиин-ца. 1991 .-С. 133-134.

24.Копусь М.М. Система оценок качества урожая селекционного материала в Донском селекцешре.//Научн.-теор.конф. "Проблемы интесифик. с.х. произв.".-Ростов/Дон (п. Рассвет). 1991.-С.35-36.

25. Копусь М.М., Семиков ЕЛ. Рейтинг по качеству и хозяйственная ценность сортов озимой мягкой пшсницы.//Научн.-теор. конф. "Проблемы интесифик. с.х. произв."-Ростов/Дон (п.Рассвег).1991.-С.22-23.

26. Копусь М.М., Воронина Л.А., Игнатьева Н.Г. Оценка качества зерна селекционных образцов инфраскохшческими методами.///Научн.-теор. конф. "Проблемы интесифик. с.х. произв."-Ростов/Дон (п. Рассвет). 1991.-С.36-37.

27. Копусь ММ., Самофалова Н.Е., Евич И.В. Идентификация сортовых различий тургидных /твердых пшениц с помощью генетического анализа электрофореграмм глиадина .//Докл. ВАСХНИЛ.-1991 .-N8.-C.6-l 1.

28. Копусь М.М., Прищепов С.Н. Ковтун В.И. Проблемы селекции мягкой озимой пшеницы с позиций полиморфизма проламинов.//В сб.: Селекция и семеноводство зерновых и кормовых к-р на Дону. Зерноград.-1992.-С. 152-170.

29. Копусь М.М., Самофалова Н.Е. Генетика глиадина тургидных (твердых) озимых пшениц.//Сб.тр./Селекц.и сем-во зерн.и корм, к-р на До-ну.-Зерноград.1992.-С. 170-172.

30. Копусь М.М. Создание замещенных линий по глиадиновым аллелям ( блокам компонентов) у озимой мягкой пшеницы.//Сб. тр. /Селекц. и сем-во зерн.и корм, к-р на Дону.-Зерноград. 1992.-С.182-186.

31. Копусь М.М., Метаковский Е.В. К проблеме характеристики и оценки электрофореграмм глиадинов, получаемых на крахмальном и поли-акриламидном гелях.//В сб.:Селекция и сем-во зерновых и кормовых культур на Дону. Зерноград.-1992.-С.187-191.

32. Копусь М.М. Три уровня оценок в системе отборов по качеству урожая.//Тр.У1 съезда ВОГиС им. Вавилова - Минск,1992.-ч.П.-С.74.

33. Копусь М.М., Ковтун В.И., Прищепов С.Н. Создание и использование почти изогенных по глиадиновым аллелям лилий на основе сорта озимой мягкой пшеницы Безостая 1.//В сб.: Изогешше лилии и генетич. коллекции. Новосибирск.-1993.- С.82-84.

34.Копусь М.М. Молекулярно-генетические маркеры в селекции мягких пшениц на качество.//Сб.тр./Мол. ген. маркеры и селекция раст.-Киев,1994.-С .31 -32.

35. Копусь М.М. Смещение в популяциях изо-глиадиновых линий озимой мягкой пшеницы по зонам СНГ.//Сб.тр./Мол. ген. маркеры и селекция Раст.-Киев,1994.-С.33-34.

36. Копусь М.М., Копусь Н.Г. Влияние особенностей компонентного состава глиадина на хозяйственно-ценные свойства у озимых тургидных

(твердых) пшениц.// Сб.тр./ Мол. ген. маркеры и селекция раст.-Киев,1994.-С.34-35.

37. Копусь М.М. О естественной геногеографии глиадиновых аллелей у озимой мягкой пшеницы.//Селекц. и сем-во,1994.-N4 .-С.9-14.

38. Копусь М.М. Об эффективности использования глиадиновых маркеров в селекции мягкой пшеницы.//Селекц. и сем-во,-1994.N3 .-С.29-31.

39. Копусь М.М., Шатилов Л.Г. Генетический полиморфизм глиадина в решении проблем селекции на качество зерна мягких пшениц.// Сб.тр./Селекц., ссм-во и агротехн. зерн. и корм.к-р на Дону. Зерпо-град,1994.-С.141-146.

40. Копусь М.М., Шатилов Л.Г. Рациональное сочетание традиционных и новых методов - наиболее эффективный пуль в селекции на качество озимых мягких пшениц.// Сблр./ Селекц., сем-во и агротехн. зерн. и корм, к-р на Дону- Зерноград, 1994.-С.146-152.

41. Копусь М.М., Грабовец А.И., Жопш А.Ф., Ковтун В Л., Колючий В.Т., Погорелова Л.Г.. Пршцепов СЛ. Влияние эколого-географических факторов на частоту встречаемости глиадиновых аллелей в искусственной популяции озимой мягкой пшеницы.//Сблр./Селекц., сем-во и агротехн. зерн. и корм, к-р на Дону.-Зерноград,1994.-С.153-163.

42. Копусь М.М., Самофалова Н.Е., Копусь Н.Г. Относительная ценность аллелей глиадина по влиянию на хозяйственно-ценные свойства у турщдных (твердых) озимых пшениц.// Сб.тр. /Селекц.,сем-во и агротехн. зерн. и корм, к-р на Дону.-Зерноград,1994.-С.164-170.

43. Копусь М.М., Копусь Н.Г. Полиморфизм глиадина в селекции донских пшениц.// Сб.тр./ Селекц., сем-во и агротсхн.зерн. и корм, к-р на Дону.-ЗерноградД994 .-С. 170-173.

44 .Копусь М.М., Копусь Н.Г. Элеюрофоретические свойства восстановленных глиадинов.// Сб.тр./ Селекц., сем-во и агротехн. зерн. и корм, к-р на Дону,- Зерноград, 1994.-С.173-176.

45.Копусь М.М. Система комплексной оценки генотипов пшеницы по глиадинам.// Сб.тр/Генетика и селекц. раст. на Дону.-Ростов/Дон, 1995,-Вып.2.-С.33-38.

46. Калиненко И.Г., Прищепов С.Н., Копусь М.М., Шатилов Л.Г., Ков-тун В.И. К вопросу о методах оценки качества мягкой пшеницы на начальных этапах селекции.//Сб.тр./Геиетика и селекц. раст. на Дону.-Ростов/Дон,1995.-Вып.2.-С.38-48

47. Копусь М.М., Мокрушина Н.И., Игнатьева Н.Г. Определение содержания белка с помощью прибора Инфраматик 8100.//Сб.тр. /Генетика и селекц. раст. на Дону.-Ростов/Дон,1995.-Вып.2.-С.52-53.

48. Копусь М.М. Использование молекулярно-генетических маркеров в селекции мягких пшениц на Дону.//Генетика.-1994.-т.30,-С.78.

49.Способ консервации крахмального геля//Удостовереиие па рац. предложение №1 от 23.04.1990.Донской селекцентр ДЗНИИСХ НПО «Дон»

50.Приспособление к экстршпу жира в установке ЭЖ-101.1//Удостоверение на рац. предложение №2 от 17.04.1990.Донской селекцентр ДЗНИИСХ НПО «Дон».

51.Водяная баня для гидролиза крахмала//Удостоверение на рац. предложение №3 от 17.04.1990.Донской селекцентр ДЗНИИСХ НПО «Дон».

52.Усовершенствование измельчителя проб растений ИПР-2// Удостоверение на рац. предложение №4 от 17.04.1990.Донской селекцентр ДЗНИИСХ НПО «Дон».

53.Способ оценки селекционного материала пшеницы. А.С.№1360657 от 22.08.1987.

54.Способ идентификации сортов тургидной пшеницы. А.С.№4839456 от 01.04.1992.

55.Сорт озимой тургидной пшеницы Новинка 4.А.С.№6142 от 12.01.1994.

56.Свидетельство ВИР от 27.12.1994 о включении в каталог под номерами К 62370-62393 (24 образца) почти изогенных линий сорта озимой мягкой пшеницы Безостая 1, различающихся по аллелям генов глиадина.

57.Свидетельство №4 от 26.01.1995 о передаче образцов (24) генофонда в Национальный центр генетических ресурсов растений Украины (г.Харьков, И-т растениеводства им. В.Я.Юрьева) и регистрации под номерами интродукции Украины:4088-4111.

58.Сорт ярового ячменя Задонский 8.А.С.№28414 от 08.04.1997.

59.Сорт ярового ячменя Дончак 2.3аявка №9200436,приоритет 14.10.1991.

60.Сорт озимой пшеницы Донская Нива. Заявка №9400362,приоритет

20.10.1993.

61 .Сорт озимой пшеницы Ростовчанка 2.3аявка №8900620,приоритет 20.09.1998.

62.Сорт озимой пшеницы Новинка 5.3аявка №9500251, приоритет

10.10.1994.

63.Сорт озимой пшеницы Дар Зсрнограда. Заявка №9607242,приоритет 27.11.1996.

64.Сорт озимой пшеницы Донской янтарь. Заявка №29764,приоритет

27.11.1996.

65.Сорт озимой пшеницы Зерноградка Ю.Заявка №30637,приоритет

17.11.1997.

66 .Сорт люцерны Ростовская 90.3аявка №9601082,приоритет

27.11.1995.

67.Сорт эспарцета Зерноградский 3. Заявка №9601112, приоритет 27.11.1995.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Копусь, Михаил Мефодьевич, Зерноград

ДОНСКОЙ СЕЛЕЕШЭТГР

Научно-производственное объединение "Дон"

На правах рукописи

КОПУСЬ МИХАИЛ МЕФОДИЕВИЧ

Полиморфизм белков зерна и селекция озимых пшениц 06. 01.05- селекция и семеноводство

Диссерадия

на соискание ученой степени доктора биологических

наук

Научный консультант; доктор сельскохозяйственных наук, академик А, А. Созинов

Зерноград - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ФАКТОРЫ ВЛИЯЮЩИЕ НА КАЧЕСТВО ЗЕРНА 14

ГЛАВА 2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ 18

2.1. Содержание белка и клейковины. 18

2.2. Белки клейковинного комплекса 24

2.3. Гетерогенность белков клейковины. 29

2.4. Генетический полиморфизм белков клейковины 37

2.5. Полиморфизм белков клейковины и качество муки пшениц.. 49

2.6. Консистенция эндосперма 57

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 62

3.1. Краткая характеристика объектов исследований 62

3.2. Методика проведения полевых опытов 63

3.3. Биохимические методы оценок 66

1. Определение содержания белка в муке и шроте 66

2. Определние содержания каротиноидов. 68

3.4. Технологические методы оценок 69

1. Определение показателя седиментации 69

2. Определение твердости зерна на приборе ПСХ-4 и ИК-анализаторе Инфрагшд-61 70

3. Определение содержания и качества сырой клейковины. 71

4. Определение физических свойств теста на альвеографе Шопена 71

5. Лабораторная выпечка хлеба 72

3.5. Молекулярно-генетические методы 73

1. Электрофорез глиадина в крахмальном геде (КГ) 73

2. Электрофорез глиадина в полиакриламидном геле

(ПААГе). 75

3. Электрофорез глютенина в СДС-ПААГе. 77

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЛИАДИНА МЯГКИХ

ПШЕНИЦ. 79 4.1. Гибридологический анализ компонентного состава

глиадина. 79 1. Особенности расщепления при анализе зерен ¥2 и

растений ¥2. 81

2. Моногибридное расщепление 85

3. Дигибридное расщепление. 89

4. Полигибридное расщепление. 94

5. Каталоги идентифицированных блоков компонентов глиадина на КГ. 101

4.2. Анализ аллелей глиадинкодирующих локусов в КГ и ПААГе. 108

1. Сходство и различия 109

2. Каталог идентифицированных блоков компонентов иадина на ПААГе 113

4.3. Выявляемость спонтанных мутантов поглиадинам 118

1. Мутация глиадинкодирующего локуса хромосомы 1Д-«нуль аллель». 118

2. Супермутант компонентного состава глиадина озимой мягкой пшеницы (эффект «полупустого»геля) 125

4.4. Создание изо-глиадиновых линий 129

ГЛАВА 5. ГЛИАДИНОГЕОГРАФИЯ В ЕСТЕСТВЕННОЙ И

ИСКУССТВЕННОЙ ПОПУЛЯЦИЯХ 141

ГЛАВА 6. БЛОКИ КОМПОНЕНТОВ ГЛИАДИНА,КАК

БЕЛКОВЫЕ МАРКЕРЫ ПРИ АНАЛИЗЕ ПОПУЛЯЦИЙ

150

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ГЛИАДИНА НА КАЧЕСТВО И ДРУГИЕ ПРИЗНАКИ 160

7.1. Гибриды расщепляющихся потомств 161

7.2. Констнтные линии (биотипы сортов) 176

7.3. Мутанты 180

7.4. Изо-глиадиновые линии 182

7.5. Система комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству и связанных с ним продуктивности и морозостойкости. 195

ГЛАВА 8. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

ГЛИАДИНОВЫХ МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ 207

8.1. Оценка селекционного материала 207

8.2. Эффективность использования глиадиновых маркеров в селекции пшеницы на качество. 214

8.3. Хозяйственно-биологическая классификация мягких пшениц по качеству и задачи селекции 219

8.4. Оценка семеноводческого материала 224 ГЛАВА 9. ГЛИАДИНОВЫЕ БЕЛКИ ТУРГИДНЫХ ТВЕРДЫХ

ПШЕНИЦ. 233

9.1. Способ идентификации,наследование и номенклатура 233

9.2. Влияние особенностей компонентного состава глиадина на хозяйственно-ценные свойства 244

ГЛАВА Ю.ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ. 251

10.1. Основные выводы 251

10.2. Предложения и рекомендации 261

ЛИТЕРАТУРА ПРИЛОЖЕНИЯ

264 300

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Меняющиеся условия хозяйствования и возрастающие требования к качеству зерна новых сортов пшениц,вынуждают совершенствовать существующую систему оценок этого признака во в всех звеньях селекции. Кроме того, более глубокое изучение связи качества зерна с другими свойствами генотипа необходимо для разработки и обоснования направлений селекции на длительную перспективу.

Основные трудности селекции на высокие хлебопекарные качества муки обусловлены полигенной природой генетических факторов, оказывающих влияние на этот признак, множественным аллелизмом по отдельным локусам и наличием фенотипической изменчивости.

Современный уровень развития биологии открывает путь к разработке принципиально новых методов оценки селекционного материала. В основе этого подхода лежат исследования по биохимической генетике , одной из задач которой является идентификация локусов по контролируемым ими белкам ( Г.Харрис, 1973; Р.Левонтин,1978;Я.ТосиюкиД979) и установление их роли в определении признаков и свойства генотипа. Это направление исследований в настоящее время интенсивно развивается в биохимической генетике человека, растений, животных, микроорганизмов эволюционной и популяционной генетике и получило название -белковые маркеры или более широко, с выходом на различные фрагменты нуклеиновых кислот-молекулярно-генетические маркеры (Созидав A.A., 1993; Глазко В.И.,Созинов И.А.,1993).

Общепризнано, что хлебопекарные качества муки в основном определяются свойствами клейковины. Поэтому использование подходов биохимической генетики при изучении клейковинных белков пшеницы представляется весьма перспективным. В этой связи можно предполагать,

что различия в свойствах клейковины на сортовом уровне могут определяться генетически обусловленными особенностями составляющих ее белков - глиадина и глютенина.

В связи с использованием методов электрофореза в гелевых носителях, получены важные сведения по биохимической природе и генетическим особенностям белков клейковины. Установлена природа биохимической гетерогенности этих белков, вызываемая генетическими факторами. Сорта пшениц характеризуются специфичностью компонентного состава глиадина и некоторыми отличиями по глютенинам. Отрадно отметить, что отечественные исследователи школ академиков Созинова A.A. и Конарева В.Г. внесли решающий вклад в развитие работ этого направления. Однако, важнейшие для селекционной практики вопросы о сопряженности особенностей компонентного состава клейковинных белков с основными показателями качества зерна на всех этапах селекции, изучены еще совершенно недостаточно.

Полигенный контроль и множественный аллелизм глиадиновых и глютениновых белков - факторы генетического полиморфизма сортов пшениц, отличающихся между собой по целому ряду хозяйственно ценных признаков и в том числе по качеству зерна. Генетический полиморфизм или дискретная индивидуальная изменчивость и наследственность признаков лежат в основе генетики и селекции.

Еще до недавнего времени практически все закономерности наследственности и изменчивости изучались при помощи генетического анализа морфологических (внешних) признаков. Морфологические признаки были главным критерием в систематике, в фундаментальных работах Менделя, Моргана, Вавилова , Серебровского и др. Однако морфологические признаки крайне ограничены , изменяются не всегда дискретно (прерывно) . На их проявление существенное влияние оказывают внешние условия.

Недостаточность изучения только морфологических особенностей организмов все более осознается генетиками и селекционерами особенно у с.х. культур, где главное внимание уделяется количественным ( непрерывным) полигенным признакам: продуктивность, качество, устойчивость к стрессфакторам и болезням. Уровень проявления этих признаков сильно варьирует в меняющихся внешних условиях жизни. Селекционер, чтобы отобрать лучшие формы, вынужден проводить многократную оценку. Особенно сложно сделать такую оценку на начальных этапах селекции и избавиться от ненужного материала. Поэтому систематика, генетика и селекционная практика нуждается в принципиально новых методах получения достоверной информации о свойствах генотипа. Изучение полиморфных белковых систем, в том числе белков клейковины пшениц методами биохимической генетики , важный и доступный путь получения объективной информации о свойствах генотипа.

Цель и задачи исследований. Основная цель проведенных исследований - всестороннее изучение клейковинных белков методами биохимической генетики в системе гибридологического анализа отдельных растений , на этапе создания чистых и изогенных линий,отдельных сортов и селекционных образцов, мутантных форм и популяций по основным параметрам качествам зерна и другим хозяйственно- важным свойствам для разработки системы комплексной оценки генотипов пшеницы в процессе селекции.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

•разработать наиболее приспособленные к селекционным нуждам электрофоретические методы фракционирования клейковинных белков на гелевых носителях;

•разработать более простой способ идентификации компонентов спектра бежов по сравнению с моносомным и дисомно-замещенным методами;

•разработать систему генетической классификации компонентов спектра белков у мягких и тургидных (твердых) пшениц;

•изучить влияние особенностей компонентного состава клейковинных белков на качество и другие хозяйственно-ценные

и и у"""

свойства у отдельных растении, линии, селекционных образцов;

•изучить влияние эколого-географических факторов на

адаптивность биотипов пшеницы с различными аллелями глиадина;

•разработать систему комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству;

•изучить эффективность использования системы комплексной оценки генотипов в селекции пшеницы.

Научная новизна работы. Установлено, что основными источниками генетического разнообразия (полиморфизма) среди сортов пшеницы по клейковынным белкам являются : полигенный контроль ( 6 основных локусов по глиадинам и глютенинам ) и множественный аллелизм. Аллель маркируется ( сигнализируется ) на электрофореграмме группой сцепленно наследуемых компонентов названных блоком. Впервые генетическое понимание наследственной единицы глиадина- блока компонентов сформулировано в нашей стране летом 1975 года (Созинов А.А.Допереля Ф.А.Допусь М.М.,1975). Была предложена номенклатура блока компонентов и разработаны основы генетической классификации глиадинов, составлены каталоги и изучены сопряженности различных аллелей с изменчивостью хозяйственно-ценных признаков. Экспериментально доказано , что гибридологический анализ является простым и удобным способом идентификации компонентов спектра как у мягких , так и у тургидных (твердых ) пшениц. Впервые выявлены

спонтанные мутанты по глиаднновым белкам, затрагивающие один (М-1654) и несколько ( супермутатнт) глиадинкодирующих локусов целиком , а также описаны примеры очень редких мутаций внутри локуса. Эти мутации проливают свет на причины и следствие огромного естественного полиморфизма клейковинных белков.

Впервые созданы изогенные линии по молекулярно-генетическому признаку- компонентному составу глиадина мягкой пшеницы. Основной набор этих линий ( 24 штуки), переданы в Национальные центры генетических ресурсов растений РОссии (ВИР) и Украины (УИР).При пересеве зерна экспериментальной популяции , составленной из изо-глиадиновых линий в пяти зонах СНГ впервые получен прямой ответ об адаптивной значимости аллелей глиадина озимой мягкой пшеницы и установлена естественная глиадиногеография. эти линии позволили впервые установить фактическую , а не относительную ценность различных аллелей глиадина в определении генетического уровня качества зерна у озимой мягкой пшеницы и доказать , что аллели глиадина непосредственно и совершенно одинаково влияют на качество муки как на уровне гибридов Р2-4;гак и на уровне изо-глиадиновых линий, причем выращенных на различных предшественниках и в разных зонах.

В результате анализа различного материала ( гибриды Б 2-4,константные линии, биотипы сортов , мутантные формы, изо-глиадиновые линии) предложена система комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству и связанных с ним продуктивности и морозостойкости. В эту систему включены важнейшие факторы, влияющие на хлебопекарные качества : полиморфизм клейковинных белков, содержание белка и консинстенция эндосперма. Приводится также шкала для селекционной оценки генотипов пшеницы с максимальным выражением признаков на генофоне сорта Безостая 1 по

качеству муки, морозостойкости , продуктивности и в комплексе. Результаты многолетнего использования предложенной системы при оценке селекционного материала озимой мягкой пшеницы позволили выявить ее эффективность.С использованием метода в Донском селекцентре создано 18 сортов озимой мягкой пшеницы. Все они имеют «хороший» глиадин, оптимальное содержание белка и твердозерный эндосперм,что гарантирует им высокое хлебопекарное качество.

Впервые показана возможность идентификации сортов и биотипов озимых тургидных пшениц по спектрам глиадинов. Предложена номенклатура наследственной единицы - блока компонентов, составлен каталог идентифицированных аллелей , изучена их связь с качеством, продуктивностью и морозостойкостью.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований,с участием автора , разработаны и адаптированы к нуждам селекции высокопроизводительные методы электрофореза глиадиновых белков на крахмальном (КГ) и полиакриламидном гелях (ПААГ) . Разработаны основы генетической классификации глиадинов мягких и тургидных (твердых) пшениц, составлены каталоги идентифицированных аллелей. Установлена относительная и фактическая ценность аллелей глиадина в определении качества, продуктивности и морозостойкости у озимых мягких и тургидных ( твердых ) пшениц. Выявлены спонтантные мутанты по глиадиновым аллелям и открыты «нуль» аллели у озимых мягких пшениц. Эти мутанты используются в селекционной работе (Жогин А.Ф.,1996 ). Для оперативного определения соотношения биотипов в гетерогенных селекционных образцах разработан «Способ оценки селекционного материала пшеницы (А.С.К 1360657 ).

Предложена система комплексной оценки для отбора наиболее ценных генотипов пшеницы по качеству и связанных с ним продуктивности и морозостойкости . Система используется в селекции

озимойпшеницы Донского селекцентра , других НИИ. С участием автора создано 7 сортов (Ростовчанка 2, Подарок Дону , Донская Нива,Дар Зернограда- озимая мягкая; Новинка 4, Новинка 5 и Донской янтарь - озимая тургидная ).

Созданные автором изогенные по глиадиновым аллелям линии позволили установить исключительно большую роль в повышении жизнестойкости ( морозо- зимостойкость) у озимой мягкой пшеницы аллеля СИ 1Д5 и изучить глиадиногеографию по зонам СНГ.

На основании проведенных исследований с учетом мирового опыта и меняющихся условий хозяйствования , сделан вывод о необходимости расширения задач селекции по качеству у мягких пшениц до трех четырех направлений: А (улучшители ) , В ( хлебопекарные сами по себе ) ,С( их улучшают за счет А ), Д (кормовые, бисквитные, технические).

Показана практическая необходимость и целесообразность использования белковых маркеров в первичном семеноводстве, а также потребность периодического контроля за сохранением чистосортности (биотипного состава ) у сортов используемых в гибридизации и в качестве стандартов в селекционных посевах.

Установлено, что резкое снижение качества муки вызывает признак мягкозерности.Для оперативного контроля за ним в селекционном материале предлагается использовать специально подобранную коллекцию образцов озимой мягкой пшеницы и откалиброванный инфракрасный анализатор (например,Инфрапид61).

Основные положения, вынесенные на защиту.

1.Разработка основ генетической классификации и установление наследственной ( менделирующей) единицы глиадинов мягких и тургидных (твердых) пшениц , идентификация серии аллелей глиадинко дарующих генов на КГ и ПААГе , составление каталогов и запись

генотипических формул этого белка у сортов, линий, биотипов, мутантных форм.

2.Установление относительной и фактической ценности аллелей генов глиадина в определении наследственно-обусловленного уровня качества муки и связанных с ним продуктивности и морозостойкости у различного материала пшеницы, а также выявление адаптивной значимости глиадиновых аллелей и их естественной геногеографии по зонам СНГ.

3.Разработка и использование системы комплексной оценки генотипов пшеницы по качеству на начальных этапах селекции, а также целесообразность использования белковых маркеров в первичном семеноводстве и контроле за типичностью сортов-стандартов и используемых в гибридизации.

Основные исследования по диссертационной работе проводились во Всесоюзном селекционно-генетическом институте (г.Одесса) с 1973 по 1983 гг. и в Донском селекцентре с 1984 по 1996 гг. Эта тема являлась составной частью тематики института и селекцентра по разработке и совершенствованию методов идентификации и оценок с�