Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перспективы разработки живой вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса Лангат ТР-21

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Перспективы разработки живой вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса Лангат ТР-21"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА РАМН

РГ6 ол

1 3 ПНО Ш7

На правах рукописи

Соколова Екатерина Дмитриевна

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ОСНОВЕ ВИРУСА ЛАНГАТ ТР-21

(экспериментальные и клинико-зпидемиологические исследования)

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург, 1997

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Научные консультанты: -член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Пашкевич В.А.

-доктор медицинских наук, профессор Коновалов Г. В.

Официальные оппоненты:

-заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Гольдин Р.Б.

-доктор медицинских наук, профессор Аксенов O.A.

-заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Отеллин В.А.

Ведущая организация: Военно-медицинская академия МО РФ

Защита состоится

1997г.

на

заседании

диссертационного совета Д.001.46. при^НИИ гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института .

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Покровская Е.Е.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Клещевой энцефалит (КЭ) - тяжелая и, в настоящее время, наиболее эпидемиологически значимая для РФ природноочаговая вирусная инфекция. Вакцинация населения природных очагов и контингентов, профессионально связанных с риском заражения, играет основную роль в снижении ущерба, наносимого здоровью людей вирусом КЭ. Поэтому исследования по разработке и совершенствованию вакцин против КЭ не прерываются у нас в стране уже 60 лет. За это время работы по инаетивированной вакцине против КЭ (ИВКЭ) ознаменовались рядом крупных этапных достижений (мозговая вакцина, тканевая вакцина, концентрированная очищенная вакцина), последовательно усовершенствовавших препарат в отношении реактогекности и антигенности (A.A. Смородинцев и соавт., 1941, E.H. Левкович к соавт., 1S30, Л.Б.Эльберт и соавт., 1980). Однако, недостатки ИВКЭ как средства профилактики КЭ (ограниченная эпидемиологическая эффективность, двух-трехкратность инъекций при вакцинации и неоходимость ежегодной ревакцинации) не удалось преодолеть даже созданием высокоантигенной концентрированной очищенной вакцины, весьма дорогостоящего препарата. В условиях постоянно возрастающей заболеваемости КЭ, обусловленной повышением контактов населения с природными и антропургическими очагами циркуляции вируса и отменой их обработок акзрицидами, нужда в более эффективной и менее дорогой вакцине очевидна.

Переболевание КЭ и, по-видимому, перенесение инфекции в наиболее часто встречающейся бессимптомной форме оставляют пожизненный иммунитет. Уже в шестидесятые годы решение проблемы профилактики КЭ связывали с разработкой живой вакцины (ЖВКЭ), но попытки аттенуации вируса КЭ не были успешными. Поэтому, в качестве более перспективного источника штаммов для ЖВКЭ стали рассматривать открытый в 1956 г. (C.E.G. Smith) вирус Лангат ТР-21 -

сочлен антигенного комплекса вируса КЭ со сниженной патогенностью для лабораторных животных, в районах циркуляции которого не регистрировались лихорадочные заболевания с неврологической симптоматикой (C.E.G. Smith, 1961, В.И. Ильенко и соавт., 1962-1968, W.H. Price et al., 1963-1970, V. Е.Н. Левкович и соавт., 1964-1973, Mayer et а!., 1963 -1976). В опытах на лабораторных животных иммунизация этим вирусом обеспечивала эффективную защиту против всех вирусов комплекса КЭ. Однако реализовать эту идею в шестидесятых-семидесятых годах не удалось. Исследования остановились, когда среди привитых одним из штаммов - кандидатов для ЖВКЭ (Еланцев 15-20/3) были зарегистрированы случаи поствакцинального энцефалита (1:20000), а у золотистых хомячков, выживших после интрацеребрального заражения вирусом Лангат ТР-21 и усыпленных через 3-12 месяцев, выявлена спонгиозная дегенерация нервной ткани, что позволяло предполагать у них хроническую нейроинфекцию (LZIotnik et al., 1973). Возникли сомнения в возможности получения достаточно безопасной ЖВКЗ на основе вируса Лангат и опасения, что его аттенуированные варианты могут оказаться причиной не только острых поствакцинальных эццефалитов, но и обусловленных хронической нейроинфекцией отдаленных во времени неврологических осложнений. Исследования биологических свойств ослабленных вариантов вируса Лангат в последующие годы имело весьма ограниченный характер, и указанные вопросы остаются актуальными по настоящее время.

Решение первого из этих вопросов зависит от совершенства лабораторных методов сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности ослабленных клонов флавивирусов. За истекшее время по усовершенствованию первичного отбора штаммов-кандидатов для ЖВКЭ были сделаны ряд предложений (Е.Н. Левкович и соавт., 1973, С.Г. Дзагуров: и соавт., 1977, С П. Чунихин и соавт., 1980, М.С. Воробьева и соавт., 1982). Однако, общепризнано, что наиболее адекватным способом сравнения потенциальной нейровирулентности

для человека вирусов с нейротропныгии свойствами являются количественные нейроморфологические исследования на обезьянах. Разработанная же для этих целей нейроморфологическая методика сравнительной оценки нейровирулентности флавивирусов по данным ее авторов ([\1.№*Ьап5оп е! а1., 1966-1968) и по результатам ее использования в весьма близкой модификации другими исследователями (А.Е. Чигиринский, 1984) не обладает несводимой разрешающей способностью. Таким образом, изучение возможности получения более безопасных в качестве кандидатов для ЖВКЭ, чем штамм Еланцев 15-20/3, вариантов вируса Лангат оказалось связанным с необходимостью усовершенствования контроля их потенциальной нейровирулентности на обезьянах.

Решении второго вопроса может быть достигнуто при адекватных экспериментальных подходах и использовании пока еще существующей уникальной возможности клинико-зпидемиологических исследований отдаленных результатов иммунизации людей экспериментальными ЖВКЭ. Тяжелые дегенеративные изменения нервной ткани, сочетающиеся в ряде случаев с параличами мышц шеи и конечностей, были выявлены у золотистых хомячков, перенесших после внутримозгового заражения вирусом Лангат ТР-21 острый энцефалит, причем летальность достигала 40% (I. ЯоМк е! а)., 1973). Вирус был предварительно пассирован на хомячках-сосунках и значительно повысил свою патогенность для взрослых животных. Следует учитывать также, что реакция животных разных видов на заражение одним и тем же вирусом может быть весьма различной. Более адекватным экспериментальным подходом для изучения вопроса о возможности отдаленных неврологических последствий ЖВКЭ являются, безусловно, опыты с ослабленными вариантами вируса Лангат на низших приматах, наиболее близкой по биологии человеку лабораторной модели. Изучение же состояния здоровья людей на протяжении двух-трех десятилетий после иммунизации вариантами вируса Лангат, рассматривавшимися ранее как кандидаты в вакцинные,

обеспечивает возможность оценки реальной опасности отдаленных неврологических последствий, то есть длительно скрытой хронической нейроинфекции у человека.

Цель исследования. Определение перспектив разработки ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21: изучение возможностей аттенуации вируса, исследование потенциальной опасности отдаленных неврологических последствий вакцинации, получение нового клона -кандидата в вакцинные.

Задачи исследования:

1. Изучить возможность получения стабильных и иммуногенных вариантов вируса Лангат ТР-21 с меньшей, чем у штамма Еланцев 15-20/3, остаточной нейровирулентностыо для обезьян:

- изучить клинические и нейроморфологические особенности экспериментальных флавивирусных энцефалитов обезьян;

- усовершенствовать методику сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности флавивирусов в опытах на обезьянах по данным количественных нейроморфологических исследований;

- получить несколько клонов штамма ТР-21; дифференцировать эти клоны по биологическим свойствам in vitro и на мышах между собой и со штаммами группы Еланцев;

провести сравнительные испытания потенциальной нейровирулентности полученных клонов вируса Лангат ТР-21 и штаммов группы Еланцев в опытах на обезьянах.

2. Исследовать безопасность аттенуированных вариантов вируса Лангат в хронических опытах на обезьянах:

- провести длительное, до одного года, клиническое наблюдение, включающее регулярные неврологические осмотры обезьян, зараженных в головной мозг несколькими ослабленными вариантами вируса Лангат;

- провести вирусологическое и морфологическое исследование ЦНС обезьян через 6 и 12 месяцев после заражения несколькими ослабленными вариантами вируса Лангат.

3. Изучить влияние иммунизации людей ослабленными вариантами вируса Лангат на их здоровье в последующие годы, оценить реальность опасений хронической нейроинфекции и неврологических осложнений в отдаленные сроки:

- сбор и анализ данных о состоянии здоровья и причинах смерти людей,

привитых штаммом Еланцев 15-20/3 в конце шестидесятых-начале семидесятых годов;

- сбор и анализ данных о состоянии здоровья и причинах смерти пациентов психиатрических клиник г. Санкт-Петербурга, привитых вариантами ТР-21-А и ТК 9/2 в начале шестидесятых годов.

4. Подготовить новый апгамм-кандидат для ЖВКЭ. Обосновать лабораторные критерии его отбора и безопасности.

Положения, выносимые на защиту

1. Нейроморфологические особенности флавивирусных энцефалитов обезьян определяются различиями в тропизме вирусов к отдельным структурам ЦНС, общей выраженностью реакции нервной ткани на заражение, превалированием дистрофически-некробиотических или воспалительно-пролиферативных процессов в целом или в определенных образованиях серого вещества головного или спинного мозга.

2. Разрешающая способность количественных нейроморфологических исследований для сравнения нейровирулентности на обезьянах апатогенных по клиническим данным флавивирусов значительно повышается при использовании показателей, рассчитанных на основе дифференцированных определений поражения нейронов, глиоза и воспалительной реакции.

3. Ослабленные клоны вируса Лангат ТР-21 гетерогенны по биологическим свойствам. Методом предельных разведений на

мышах из популяции штамма ТР-21 выделены потенциально более безопасные в качестве вакцинных клоны, чем штамм Еланцев 1520/3.

4. Ослабленные варианты вируса Лангат не являются индукторами особых форм хронических нейроинфекций у обезьян и человека. Через 6 и 12 месяцев после заражения в ЦНС обезьян не обнаружен вирус и не было морфологических проявлений воспалительно-дегенеративного процесса или иных проявлений поражения нервной ткани. Клинико-зпидемиологические исследования не выявили отдаленных неврологических или иных осложнений у привитых экспериментальными ЖВКЭ.

5. Селекционирован новый иламм-кандидат для ЖВКЗ. Клон Л1 вируса Лангат ТР-21 по остаточной нейровирулантности близок вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа, иммуногенен, стабилен, высокорепродуктивен в культурах клеток.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Выявлены особенности морфологических изменений в ЦНС обезьян при заражении флавивирусами с разной по клиническим данным степенью нейровирулентности. Показано, что хотя, в среднем, при экспериментальных флавивирусных энцефалитах в выраженности некробиотических изменений нейронов, глиоза и воспалительной реакции существует прямая взаимосвязь, при инфицировании обезьян некоторыми вирусами или при использовании определенных доз вирусов возможна диссоциация этих процессов. На основании этих данных усовершенствовано использование морфологических показателей для сравнительной лабораторной оценки потенциальной нейровирулентности флавивирусов.

Впервые проведено комплексное сравнительное изучение биологических свойств in vitro и in vivo, включая нейровирулентность для обезьян, нескольких вариантов вируса Лангат ТР-21. Установлено,

что ослабленные варианты этого вируса гетерогенны по остаточной кейровирулентности для обезьян. Доказано, что из штамма ТР-21 могут быть выделены иммуногенные стабильные клоны с меньшим уровнем потенциальной нейровирулентности,. чем у штамма Еланцев 15-20/3, близкие по показателям морфологического контроля вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа. Показано, что популяция аттенуированных клонов вируса Лангат ТР-21 гетерогенна и по другим биологическим свойствам: репродукции в культурах клеток при 37 и 40°С, патогенности для мышей при эктраневральном заражении, иммуногенности на мышах. Однако эти свойства не имеют определенной связи с нейровирулентностьго для обезьян и не могут быть существенно полезны при отборе штаммов-кандидатов для ЖВКЭ.

Показано, что чувствительность обезьян к ослабленным клокам вируса Лангат ТР-21 зависит от их физиологического состояния: неадаптированные к лабораторному содержанию животные, перенесшие транспортировку и резкую смену условий содержания непосредственно перед опытом, гораздо тяжелее переносили заражение, чем адаптированные. На таких животных различия в нейровирулентности ослабленных клонов проявлялись значительно сильнее, чем на содержавшихся в лаборатории до опыта не менее 1,5 месяцев.

Получены новые данные, опровергающие опасения отдаленных неврологических последствий при использовании ослабленных клонов вируса Лангат ТР-21 в качестве ЖВКЭ. Вирусологически и морфологически доказано, что ослабленные клоны вируса Лангат ТР-21 не вызывают у обезьян (наиболее близкой человеку биологической модели) персистентной инфекции ЦНС. Установлено, что и в столь отдаленные временные интервалы, как 16-19 лет, среди привитых штаммом Еланцев 15-20/3 не было случаев хронических нейроинфекций и не выявлялись какие-либо иные вредные последствия этих прививок. Впервые исследованы данные о состоянии

здоровья в последующие годы ( от 1 до 29 лет), пациентов психиатрических клиник, привитых штаммами ТР-21-А и ТК-9/2 у которых осложнения после прививок могли быть спровоцированы патологией ЦНС, свойственной основному заболеванию. Среди зтих лиц впоследствии тоже не были зарегистрированы случаи хронических нейроинфекций.

Доказана перспективность продолжения исследований по разработке ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21. Селекционирован ослабленный клон (Л1) не вызывающий у обезьян заболевания при введении в головной мозг в дозах до 8,5 lg ЛД50, стабильный по патогенное™ при пассировании в культуре клеток КФ (селекционирующей патогенные клоны), иммуногенный на мышах и обезьянах, близкий вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа по уровню остаточной нейровирулентности в тесте интрацеребрального заражения обезьян ( положительное решение на выдачу патента на штамм-кандидат для ЖВКЭ).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях НИИЭМ ИМ.Пастера, Санкт-Петербург, 1983,1984, 1986, . 1987, 1990,1993,1995, 1996 гг., на конференции "Биология вируса КЭ", НИИБХ СО АМН СССР, Новосибирск, 1987, на конференции "Клещевой энцефалит" Медицинского Управления СО АН СССР, Новосибирск, 1989, на заседании Проблемной комиссии "Природноочаговые заболевания" (37.05) Научного совета по медицинским проблемам Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера АМН СССР, Иркутск, 1989, на Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита", г. Иркутск, 1990 г., на International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and Aids, Leningrad, 1991, на юбилейных научных конференциях Омского НИИПИ (Омск, 1991) и Томского-НИИВС (Томск.1991), на заседании Президиума СО АН СССР, Новосибирск, 1990, на специальном совместном заседании Проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" и

Ученого Совета МП и ВЭ РАМН, Москва, 1993, на Международном симпозиуме "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, Санкт-Петербург, 1995 г.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 25$страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который включает 167 отечественных и зарубежных источников. Текст иллюстрирован 42 таблицами и 22 рисунками.

Материалы и методы исследования

Вирусы. Лангат ТР-21, клещевого энцефалита (КЭ), штаммы Софьин и Абсеттаров, желтой лихорадки (ЖЛ), штамм Дакар БАТ 249, денге 2, штамм New Gv/inea В, омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), штамм И-40, и полиовирус 3 типа, вакцинный штамм А. Sabin, были получены из музея вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Вирус Лангат ТР-21 пассировали на мышах (вариант ТР-21-М). Методом предельных разведений на мышах было получено 11 его клонов (Л1-Л11). Пассированием исходного штамма в культуре клеток куриных фибробластов при 40°С был получен вариант ТР-21-К. Штамм Еланцев 15-20/3 и его дополнительно аттенуированные варианты Е-30 и Е-37 были любезно предоставлены для исследований профессором А. В. Дубовым.

Культуры клеток. В работе использовали перевиваемые клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и почки обезьяны (Vero) и первично-трипсинизированные фибробласты куриного эмбриона (КФ). В культуре клеток Vero пассировали и титровали вакцинный полиовирус. В культурах клеток СПЭВ и КФ изучали способность исследуемых вариантов вируса Лангат к репродукции при 37°С, 40°С и 42°С (ret 37,40

и 42), определяя титр культуральной жидкости на мышах массой 8-10 г. при заражении в мозг в lg ЛДго/мл.

Животные. Мыши - белые нелинейные (сосунки и массой 8-10 г.) и линии BALB/c (массой 14-16 г.). Сосунков использовали для выделения вируса из ЦНС обезьян. На нелинейных белых мышах массой 8-10 г. и мышах линии BALB/c изучали патогенность исследуемых вариантов вируса Лангат при заражении в мозг и под кожу, определяли их инвазивность - индекс инвазивности (II) в lg ЛДго. На мышах линии BALB/c исследовали и иммукогенность вариантов вируса Лангат ТР-21, оценивая выживаемость иммунизированных животных при заражении вирусом КЭ и, в некоторых случаях, другими вирусам комплекса КЭ (ОГЛ и ШЗО) по сравнению с контрольными - индекс резистентности (IR) в lg ЛД50. В отдельных опытах исследовали гуморальный (РТГА) и клеточный (адоптивный перекос) иммунитет иммунизированных мышей к вирусу КЗ. Обезьян - макак трех видов (М. mulatta, М. fascicularis, М. nemestrina), павианов гамадрилов (P.hamadryas) и зеленых мартышек (С. aethiops) с массой тела 1,5-4,5 кг использовали для изучения нейровирулентности вариантов вируса Лангат клиническими и морфологическими методами. У зараженных обезьян изучали также вирусемию (биопробой на мышах в трех пассажах) и гуморальный иммунитет (РТГА) к вирусу КЭ.

Опыты на обезьянах. Заражение - интраталамическое или интраспинальное, по методике A.Sabin (1959), под наркозом (эфир, гексенал или калипсол). Клинические наблюдения продолжались в течение 1-1,5 или 6-12 месяцев, если животные не погибали раньше, в зависимости от целей опытов. У зараженных животных измеряли температуру тела, исследовали силу и объем движений конечностей, оценивая ее в баллах (от "0° до "5") по шкале D. Bodian (1948), выявляли симптомы раздражения мозговых оболочек и спинномозговых корешков (ригидность затылочных мышц, симптомы Кернига, Б руда*! некого и Лесажа) и поражения экстрапирамидной системы

- п -

(нарушение координации движений, тонуса мышц, гиперкинезы, тремор и др.). Тяжесть клинического течения заболевания оценивали по шкале N.Nathanson et al. (1966-1968) в баллах (от "О" до "4+"). Неврологическое обследование обезьян проводил доцент кафедры нервных болезней ВМА МО РФ доктор медицинских наук В.И.Головкин. Гистологические препараты ЦНС обезьян готовили по методике N.Nathanson et al. (1966-1968). Структуры ЦНС идентифицировали на срезах по стереотаксическим атласам мозга обезьян (R.S. Spinder and С. Lee, 1951, T.R. Shantha et al., 1968). Степень морфологических изменений в структурах ЦНС оценивали на зашифрованных препаратах. Использовали интегральную четырехбалльную шкапу N.Nathanson et al. ? (1966-1968) и дифференцированное определение поражения нейронов и сосудисто-воспалительной реакции по соответствующим четырехбалльным шкалам Дремова Д.П. (1977). Интенсивность глиоза определяли по собственной, также четырехбалльной, шкале: "1" балл - при выявлении 1-2 маленьких глиальных узелков на площади всего среза через исследуемую структуру ЦНС, "2" балла - при наличии 1-2 крупных фокусов глиоза или диффузного глиоза с относительно невысокой плотностью пролиферации, "3" балла - несколько отчетливых и обширных фокусах глиоза, "4" балла - сочетание фокусного и диффузного глиоза с высокой плотностью пролиферации глии.

Стабильность вариантов вируса Лангат ТР-21> определяли по их инвазивности (II на мышах линии BALB/c) и, в некоторых случаях, нейровирулентности для обезьян (N М ¡/с) после пассирования в культурах клеток СПЭВ и КФ, обладающих свойством селекционировать патогенные клоны.

Клинико-эпибемиологическиэ исследования. Сведения о состоянии здоровья привитых экспериментальными ЖВКЗ на основе вируса Лангат получали путем изучения медицинской документации и результатов осмотров невропатологов. Данные о здоровье пациентов

- 12 -

психиатрических клиник г. Санкт-Петербурга, привитых в шестидесятых годах сериями вакцины ТР-21-А и ТК-9/2 ( В.И. Ильенко и соавт., 1962), были получены из историй боллезни, хранящихся в архивах психиатрической больницы № 3 им. Скворцова-Степанова и детской городской психиатрической больницы. Данные о состоянии здоровья привитых штаммом Еланцев 15-20/3 (А.В. Дубов и соавт., 1969) собраны во время экспедиций 1936, 1987 и 1989 гг. из амбулаторных карт, журналов диспансеризации и путем опроса медработников в 90 населенных пунктах трех районов Пермской (Пермский, Осинский и Октябрьский) и пяти районов Екатеринбургской (Талицкий, Байкаповский, Пышминский, Тугулымский, Шалинский) областей и при неврологических осмотрах, проведенных местными невропатологами и профессором А.Н.Шаловалом. Обобщение данных медицинской документации и неврологических осмотров проведено под руководством и с участием профессора А.Н. Шаповала.

Результаты и обсуждение

1. Совершенствование нейроморфологической методики сравнительной оценки нейровирулентности флавивирусов в опытах на обезьянах.

23 обезьяны (M.mulatta и M.fascicuiaris) были заражены в таламус высокими дозами флавивирусов для сравнительного клинического и морфологического исследования вызываемого ими заболевания: 5 обезьян - вирусом ЖЛ (в дозе 7,1 lg ЛД50), 5 - вирусом КЗ (8,0-9,0 lg ЛД50), 5 - вирусом денге 2 ( 6,8 lg ЛД50), и по 4 - двумя вариантами вируса Лангат - ТР-21-К и ТР-21-М (7,0 lg ЛД50 в обоих случаях).

У обезьян, зараженных вирусами денге 2 и Лангат ТР-21 -М, в течение месяца (срок наблюдения) симптомов нарушения функции ЦНС или каких-либо иных признаков нездоровья не было. В остальных случаях у обезьян наблюдали острый энцефалит, но с определенными

клиническими особенностями для каждого вируса. По клиническим данным вирусы ЖЛ, КЭ и Лангат ТР-21 могли быть дифференцированы по степени нейровирулентности: быстроте, тяжести и исходе поражения ЦНС (табл.1). Наиболее высокой нейровирулентностью обладал вирус ЖЛ. Инкубационный период составлял, в среднем, 5,4±0,2 дня, болезнь прогрессировала молниеносно, острый энцефалит развивался, преимущественно, в полиомиелитической форме, агония наступала з течение 1,2+0,4 дня после появления первых симптомов нарушения функции ЦНС. При экспериментальном КЭ обезьян, при близком к вызываемому вирусом ЖЛ заболеванию инкубационном периоде (4,6+0,6 дня), поражение ЦНС развивалось несколько медленнее, неврологические симптомы были разнообразнее и появлялись последовательно, доминировала энцефалополиомиелитическая форма течения инфекции и, хотя клиническое состояние животных было тяжелым в день усыпления (с 3 по 8 день после заражения), они все же еще не находились в состоянии агонии. Из четырех обезьян, зараженных вирусом Лангат ТР-21-К, заболели 3, и у всех трех заболевание протекало в разных клинических формах. Две обезьяны выздоровели к концу месячного наблюдения, у одной заболевание протекало настолько тяжело, что она могла погибнуть, и, поэтому, на двеннадцатый день ее пришлось усыпить. Одна из обезьян, зараженных вирусом Лангат ТР-21-К, в течение месяца так и осталась клинически здоровой.

Анализ средних показателей морфологических изменений (СПМИ) в особо чувствительных к флавивирусам структурах ЦНС ("индикаторных центрах") подопытных обезьян, полученных по шкале и методу Ы.ЫаШап$оп е1 а1. (1966-1968), выявил их определенную связь с клиническими проявлениями болезни (табл. 2). У обезьян, зараженных вирусом ЖЛ, наиболее яркими симптомами нарушения функции ЦНС были вялые парезы и параличи конечностей и именно для этих животных были получены наиболее высокие СПМИ в передних рогах

Клинические показатели экспериментальных флавивирусных энцефалитов у зараженных в таламус обезьян

№№ Инку- Конец Состояние обезьян в день окончания опыта

Вирус обезьян бация опыта темпера- сила рук и общее клиническая форма

(п/п) (дни) (День) тура (°С) ног (баллы) (баллы) инфекции

1 5 5 н.и. н.и. погибла не исследовали

2 5 6 33,8 1111 4+ полиомиелитическая

ЖЛ 3 5 6 34,0 1111 4+ полиомиелитическая

4 6 8 34,2 0000 4+ полиомиелитическая

5 6 8 34,5 2222 4+ энцефалополиомиелитическая

1 6 9 36,1 2222 3+ энцефалополиомиелитическая

2 4 10 35,1 2222 3+ энцефалополиомиелитическая

КЭ 3 3 11 37,0 2222 3+ энцефалополиомиелитическая

4 6 9 37,5 2211 3+ полиомиелитическая

5 4 8 36,1 2200 4+ менингоэнцефалополио-

миелитическая

1 8 12 36,0 2222 4+ энцефалополиомиелитическая

Лангат 2 13 30 38,7 5555 2+ полиомиелитическая

ТР-21-К 3 6 30 38,9 5555 1 + менингополиомиелитическая

4 - 30 38,0 5555 0 бессимптомная

Примечание: силу рук и ног определяли по шкале Б.ВосНап (1948) в порядке: правая рука, левая рука, правая нога, левая нога; общее состояние определяли по шкале Ы^аШапзоп е1 а1.(1966-1968).

Таблица 2

Оценка морфологических изменений в ЦНС обезьян, зараженных в таламус исследуемыми флавивирусами, по интегральной четырехбаллькой шкале М-Ма^апвоп е1 а1. (1966-1968)

Вирус Средние (х±а) показатели морфологических изменений (в баллах) в "индикаторных центрах" (особо чувствительных структурах) ЦНС

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ЖЛ 2,0±0,0 2,0±0,0 2,0±0,0 2,6+0,3 2,0+0,0 4,0±0,0 2,0+0,0 4,0+0,0 2,0±0,0

КЭ 2,0±0,0 2,0±0,0 2,0+0,0 4,0+0,0 2,0+0,0 3,0±0,0 2,0+0,0 3,0±0,0 2,0+0,0

Лангат ТР-21-К 1,0±0,6 1,2+0,6 0,3+0,4 1,8+1,1 1,2±0,6 2,8±0,6 1,7+0,3 2,5+0,3 1,7±0,3

Денге 2 1,6±0,4 1,2+0,4 1,2+0,4 2,2+0,6 1.2+0,4 1,0+0,4 1,4+0,4 0,8+0,4 0,8±0,4

Лангат ТР-21-М 0,7±0,6 0,5+0,6 0,5+0,3 1,7+0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Примечание: 1-таламус, 2-полосатое тело, 3-черное вещество, 4-кора мозжечка, 5-ретикулярная формация, 6 и 8 - вентральные рога шейного и поясничного отделов спинного мозга, соответственно, 7 и 9 - вентральные и боковые столбы белого вещества шейного и поясничного отделов спинного мозга, соответственно.

- к -

шейного и поясничного отделов спинного мозга. У обезьян, зараженных вирусом КЭ, конечности были парализованы в меньшей степени, а неврологическая симптоматика, более разнообразная в целом, включала ярко выраженное нарушение координации движений. Соответственно, СПМИ в передних рогах шейного и поясничного отделов спинного мозга этих животных были менее высокими, а в коре мозжечка - более высокими, чем у обезьян, зараженных вирусом ЖЛ. СПМИ в "индикаторных центрах" ЦНС обезьян, перенесших заражение вирусами денге 2 и Лангат ТР-21-М бессимптомно, были ниже, чем у обезьян с клинически выраженным энцефалитом. Тем не менее, для сравнительнаой оценки нейровирулентности исследуемых флавивирусов СПМИ, полученные по шкале и методике М.Ыа^апвоп е{ а1. (1966-1968), не были достаточно информативны. Во-первых, различия в СПМИ для отдельных "индикаторных центров" ЦНС были невелики и, как правило, недостоверны. Это объяснялось грубостью четырехбалльной шкапы оценок, которая не могла, однако, быть преодолена путем увеличения градации степени морфологических изменений без потери воспроизводимости результатов исследования. Во-вторых, флавивирусы, при несомненно присущем им свойстве вызывать наиболее тяжелое поражение нервной ткани в определенных Ы.Ыа^апзоп е* а). (1966-1968) "индикаторных центрах" ЦНС, отличались в тропизме к некоторым из них и, поэтому, получение однозначного результата было исключено.

Исследуя препараты головного и спинного мозга обезьян, мы пришли к выводу, что возможны два дополняющие друг друга подхода к повышению эффективности использования нейроморфологических показателей для сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности флавивирусов. Первый из них заключается в получении суммарных СПМИ (ССПМИ) в отделах ЦНС и ЦНС в целом. Этот прием позволяет выявить наиболее значимые для сравнения отделы ЦНС, увеличить разницу в сравниваемых показателях за счет суммирования в основном однонаправленных, но слабовыраженных по

- 17 -

отдельным "индикаторным центрам" различий, нивелировать влияние особенностей тропизма вирусов на результат сразнения. При применении этого приема к данным, полученным по шкале N.Nathanson et al. (1966-1968)^ удалось установить, что клинические показатели нейровирулентности флавивирусов наиболее соответствуют поражению спинного мозга, но для дифференциации апатогенных по клиническим данным вирусов целесообразно ориентироваться на ССПМИ в ЦНС в целом, поскольку иначе представление об их потенциальной нейровирулентности может оказаться заниженным (табл.3). Второй прием заключается в дифференцированном определении на одних и тех же препаратах поражения нейронов, глиоза и сосудисто-воспалительной реакции по специальным четырехбалльным шкалам с последующим получением интегральных ССПМИ путем их сложения. В большинстве случаев наблюдалась вполне определенная корреляция в выраженности поражения нейронов, глиоза и воспалительной реакции, доля дифференцированных показателей этих морфологических изменений в интегральных ССПМИ в отделах ЦНС или в ЦНС в целом составляла: 20-25%, около '30% и 45-50%, соответственно (табл.4). Однако, наблюдались и весьма значительные отклонения от этого соотношения. Так, доля ССПМИ нейронов в интегральном ССПМИ в спинном мозге обезьян, зараженных вирусом ЖЛ, была максимально высокой (42%), при том, что глиоз и воспаление проявлялись относительно слабо и составляли только 21% и 37% интегрального ССПМИ, соответственно. Напротив, при заражении обезьян вирусами денге 2 и Лангат ТР-21-М наблюдалось превалирование воспалительной реакции, вклад которой в интегральный ССПМИ достигал 62-69% в первом случае и 100% - во втором. Наиболее тесно с клинической оценкой нейровирулентности патогенных флавивирусов для обезьян коррелировали ССПМИ нейронов спинного мозга. Глиоз и воспалительная реакция могли искажать это соответствие. Дифференцированное определение показателей глиоза и воспалительной реакции было весьма полезным и

Средние суммарные показатели морфологических изменений (ССПМИ) в ЦНС обезьян, зараженных исследуемыми флавивирусами, полученные на основе интегральных показателей Ы^а^апвоп е! а1. (1966-1968) для отдельных "индикаторных центров"

Заражение ССПМИ (х±ст) в баллах в:

обезьян ЦНС головном мозге СПИННОМ

вирусом в целом полушариях стволе мозге

ЖЛ 22,6±0,2 6,0+0,0 4,5±0,2 12,0+0,0

кэ 22,0+0,0 6,0+0,0 6,0±0,0 10,0+0,0

Лангат ТР-21-К 14,5±3,9 2,7±1,4 3,0±1,7 8,7+1,4

Денге 2 11,5+4,1 4,0+1,2 3,4+1,0 4,0+1,7

Лангат ТР-21-М 4,3+1,3 2,1 ±1,1 2,2±0,3 0,0

- - ■ - Таблица 4 Дифференцированные средние суммарные показатели морфологических изменений в ЦНС обезьян, зараженных исследуемыми флавивирусами, и интегральные показатели, рассчитанные на их основе_

Заражение обезьян вирусом Отделы ЦНС обезьян, в которых оценивали морфологические изменения Дифференцированные ССПМИ в абсолютных (х±о, баллы) и относительных (проценты ) величинах: Интегральные ССПМИ (1+2 + 3) (баллы)

поражение ней ронов (1) глиоз (2) воспаление (3)

абс. % абс. % абс. %

ЖЛ Все три отдела 9,0+0,0 25 10,8+1,7 30 ' 16,0+0,4 45 35,8+1,8

Спинной мозг 8,0±0,0 42 4.0±0.0 21 6,6±0,4 37 18,6±0,4

Ствол гол. мозга 1,0±0,0 11 3,6+0,4 41 4,2+0,4 48 8,8±0,8

Полушария гол. мозга 0,0 0 3,2±1,1 38 5,2±0,4 62 8,4±1,5

КЭ Все три отдела 14,6±0,3 23 19,4+1,5 30 30,0±1,2 47 64,0±1,8

Спинной мозг б,0±0,0 24 7,0+0,4 28 12,4+0,4 48 25,4±0,9

Ствол гол. мозга 4,2+0,2 25 5,8+0,2 34 6,8+0,2 41 17,8±0,2

Полушария гол. мозга 3,4±0,2 16 6,8±0,7 33 10,6±0,2 51 20,8±0,8

Лангат ТР-21-К Все три отдела 5,0±2,2 18 7,7+2,5 28 14,9+5,6 54 27,7+10,3

Спинной мозг 4,2±1,1 20 5,8+1,4 27 11,0+3,8 52 21,0±6,2

Ствол гол. мозга 0,7±0,6 16 2,0+1,2 45 1,7+1,4 39 4,7+3,3

Полушария гол. мозга 0,0 0 0,0 0 2,2±1,4 100 2,2±1,4

Денге 2 Все три отдела 1,0±0,4 5 7,0+3,0 33 13,6+4,9 62 21,6+7,5

Спинной мозг 1,0+0,4 10 2,4±1,3 26 5,2±1,7 64 8,6±3,0

Ствол гол. мозга 0,0 0 1,4±0,6 31 3,0±1,3 69 4,4+1,7

Полушария гол. мозга 0,0 0 3,2±1,3 36 5,6±1,9 64 8,8+3,1

Лангат ТР-21-М Все три отдела 0,0 0 0,0 0 2,7±0,8 100 2,7+0,8

Спинной мозг 0,0 0 0.0 0 0,0 0 0,0

Ствол гол. мозга 0,0 0 0,0 0 1,0±0,0 100 1,0+0,0

Полушария гол. мозга 0,0 0 0,0 0 1,7±0,6 100 1,7+0,6

при сравнительной оценке нейровирулентности апатогенных по клиническим наблюдениям флавивирусов. Получение интегральных ССПМИ на основе дифференцированных компенсировало грубость оценок по четырехбалльной шкале и повышало разрешающую способность метода. Так, различия в интегральных ССПМИ в ЦНС обезьян, зараженных вирусами денге 2 и ТР-21-М, при определении по методу N.Nathanson et al. (1966-1968) были трехкратными (табл.3), при определении по нашему методу - семикратными (табл.4).

2. Клонирование штамма ТР-21 и сравнительное изучение биологических свойств вариантов вируса Лангат in vitro и in vivo. Отбор штамма-кандидата для ЖВКЭ.

Клоны штамма ТР-21 вируса Лангат (Л1-Л11) были получены методом предельных разведений на интрацеребрально зараженных белых мышах, который по данным литературы представлялся нам оптимальным для селекции вариантов со сниженной нейровирулентностью.

Все исследованные варианты вируса Лангат ТР-21 по репродукции в культурах клеток при 37°С разделились на две группы: высокорепродуктивные (ret 37t), титр которых в культуральной жидкости на 3-4 день после заражения достигал 6,5 (6,0-7,0) lg ЛД5о/мл, и низкорепродуктивные (ret 374) - титр 4,5 (4,2-5,2) lg ЛДбо/мл. Способностью к репродукции при 42°С обладал только вариант ТР-21 -К, в этом он был сходен с вирусом КЭ. Способность или неспособность ослабленных вариантов вируса Лангат к репродукции при 40°С часто, но не обязательно, совпадала с высокой или низкой репродукцией при 37°С. По патогенности для мышей при интрацеребральном заражении (Pm i/c ) исследуемые варианты вируса Лангат практически не различались-. Патогенность же для мышей при подкожном заражении (Pm s/c), являлась дифференцирующим признаком, по которому они

разделялись на три группы: Pm i/c min - титр на нелинейных мышах 0 (01,9), на мышах линии BALB/c-0, Pm i/c mid - титр на нелинейных мышах 2,5 (0-3,8), на мышах линии BALB/c -0 (0-3,3) и Pm i/c max - титр на нелинейных и линейных мышах - 4,6 (4,0-5,3) lg ЛД5о/мл. Патогенность всех вариантов вируса Лангат, кроме ТР-21-М и ТР-21-К, не изменялась при пассировании на мышах и в культурах клеток, то есть они были высокоочищенкы и стабильны. Вариант ТР-21-М повышал патогенность после пассажей в клетках КФ, вариант ТР-21-К снижал патогенность при пассировании на мышах, что объясняется их гетерогенностью.

По иммуногенности на мышах исследуемые варианты тоже разделились на три группы: IR min - 4,6 (3,6-5,0), IR mid -5,6 (5,3-5,9) и !R max - 8,0 (7,0-8,6) !g ЛДю. К последней группе относились все штаммы Еланцез 15-20/3, Е-30 и Е-37. Наименьшей иммуногенностью на мышах обладали два из полученных нами клонов ( Л6 и Л7). Вариант ТР-21-К, оказавшийся высокопатогенным для мышей при подкожном заражении, в сублетальных дозах иммуногенностью не обладал (также, как и вирус КЭ).

По нейровирулентности для обезьян при интрацеребральном заражении исследуемые варианты вируса ЛангатТР-21 тоже разделились на три группы: NM i/c min, NM i/c mid и NM i/c max. Ha параметрах такой дифференциации необходимо остановиться особо.

В целом, в этих опытах использовано 74 обезьяны (24 М. mulatta, 26 М. fascicularis, 4 М. nemestrina и 20 P. hamadryas). При значительных колебаниях индивидуальной чувствительности животных к заражению видовых различий мы не выявили. Результат заражения определялся, главным образом, тремя факторами: собственно свойствами исследуемого варианта вируса, его дозой и физиологическим состоянием животных, (табл. 5). Наибольшей нейровирулентностью для .^обезьян (NM i/c max) обладал вариант ТР-21-К, который будучи применен в равной (или даже несколько меньшей) с другими

Таблица 5.

Сравнительная оценка нейровирулентности вариантов вируса Лангат для обезьян при заражении в мозг.

Варианты вируса Лангат Дозы 09 ЛД50) Количество обезьян ССПМИ в ЦНС обезьян в абсолютных (баллах, х±<~) и относительных (% от интегральных ССППИ) величинах:

всего больных нейроны глия воспаление интегральные

абс. % абс. % абс. % абс. %

ТР-21.Л1, Л2, ЛЗ, Л4, Л-5, Е-30 6,57,5 39 0 0,0 0 0,2±0,07 5 2,7±0,3 95 2,9+0,4 100

ТР-21, Л1, Е-37 8,08,5 11 0 1,1+0,5 10 3,1±0,7 29 6,4±1,3 61 10,7+2,1 100

Е-15-20/3 7,3 4 0 2,7+1,1 18 4,0+1,4 27 8,2±1,9 55 14,9±3,4 100

ЛК 7,0 4 3 5,0±2,2 18 7,7+2,5 28 15,5±5,6 54 27,7110,3 100

Л1* 6,4 8 0 3,5±2,1 14 8,2+3,9 33 13,0±3,5 53 24,6±9,6 100

Е-15-20/3* 6,8 9 9 10,8+1,1 24 11,4+1,0 26 21,8+2,8 50 44,0+5,7 100

Примечание: '-опыты на неадаптированных к лабораторному содержанию обезьянах.

вариантами дозе 7,0 lg ЛД50 для заражения адаптированных к лабораторному содержанию животных, вызвал острый энцефалит. Средним уровнем ней ро ви рулентн ости для обезьян (NM i/c mid) обладал штамм Еланцев 15-20/3. При использовании б близких с другими ослабленными вариантами вируса Лангат ТР-21 дозах для заражения адаптированных к лабораторному содержанию обезьян, он вызывал более выраженные морфологические изменения в ЦНС. При заражении неадаптированных к лабораторным условиям животных, использованных в опытах сразу после привоза из питомника, штамм Еланцев 15-20/3, даже в меньшей дозе, вызвал острый летальный энцефалит. Для животных, находившихся в неблагополучном физиологическом состоянии, вызванным резким изменением условий жизни, по морфологическим данным более патогенным охазался и клон Л1, однако, клинических проявлений энцефалита у них не было. Вез остальные, полученные нами клоны вируса Лангат, так же как и исходный штамм ТР-21, пассируемый на мышах, и дополнительно аттенуированные варианты штамма Еланцев 15-20/3 (Е-30 и Е-37) по нейрозирулентности для обезьян при интрацеребральном заражении относились к одной наиболее аттенуированной группе (NM ¡/с лил ). Небольшие различия в ССПМИ в ЦНС зараженных этими вариантами обезьян коррелировали с небольшими различиями в их дозах. Клоны Л1-Л5 не удалось дифференцировать по нейровирулентности даже в опыте интраслинального заражения, к которому обезьяны более чувствительны, чем к интрацеребральному (25 обезьян).

По совокупности всех данных среди полученных нами 11 клонов вируса Лангат ТР-21 можно идентифицировать 4 биологических варианта, обозначенных нами по наименованию одного из клонов каждой группы: Л1, ЛЗ, Л4 и Л6, которые при использовании метода предельных разведений на мышах выделялись из штамма ТР-21 в соотношении 4:1:4:1. Всего в наших опытах мы идентифицировали-8 биологических вариантов вируса Лангат ТР-21 (табл.6).

Биологическим свойства вариантов вируса Лангат in vitro и in vivo

Вари- Биологические маркеры

анты in vivo in vitro

вируса NMi/c Pm s/c IRm ret 42 ret 40 rct37 St

ТР-21-М min min mid - + t -

Л1 min min mid - + T +

лз rain min mid - - t +

' Л4 min min mid - - +

Лб н.и. min min - - i -Í-

Е-30 min mid max - -i- л-i

Е-37 min mid max - - ? +

Е-15-20/3 mid mid max - - i +

ТР-21-К max max - + + t -

В качестве штамма-кандидата для ЖВКЭ мы выбрали клон Л1 вируса Лангат ТР-21. От штамма Еланцев он отличался более низкой патогенностью для обезьян при интрацеребральнсм заражении. Нейровирулентность клона Л1 вируса Лангат ТР-21 для обезьян оказалась близкой нейровирулентности вакцинного вируса полиомиелита 3 типа, который использовали для сравнения. Три обезьяны М. fasciculaг¡s были зараженны в таламус вакцинным вирусом полиомиелита 3 типа в дозе 7,9 1д ТИД50. Клинических проявлений энцефалита у них не было. Морфологические изменения в ЦНС варьировали в выраженности: у двух - редкие периваскулярные инфильтраты, у одной - диффузная воспалительная реакция, выраженный глиоз и обширные участки выпадения мотонейронов в передних рогах шейного и поясничного отделов спинного мозга. Такие же выраженные различия в реакции мы наблюдали при заражении обезьян штаммами ТР-21 и Е-37 и клоном Л1 вируса Лангат в максимальных дозах 8,0-8,5 !д ЛД50. ССПМИ в ЦНС обезьян, зараженных вакцинным вирусом полиомиелита 3 типа составляли для нейронов 2,0±2,5, для глии - 2,0±2,5, для воспалительной реакции -6,7±7,1, интегральные - 10,7±11,7, то есть совпадали с величинами ССПМИ в ЦНС обезьян, зараженных максимальными дозами наиболее ослабленных вариантов вируса Лангат (значительная величина стандартного отклонения объясняется малым количеством обезьян в опыте). Высокая степень гомогенности клона Л1 подтверждалась результатами его пассирования в культуре клеток КФ: патогенность вируса для мышей и обезьян не повышалась. (Слон Л1 обладал высокой репродуктивносгью в культурах клеток при 37°С, что обеспечивало возможность разработки технологии получения культуральной вакцины. Кпон Л1 индуцировал иммунитет к заражению вирусом КЭ, о чем можно было судить по результатам опытов по протективности на мышах и по антителообразованию у обезьян. Клон Л1 в опытах на мышах сохранял свойственную ему протективность против вируса КЭ при использовании его для иммунизации в снижающихся десятикратно дозах вплоть до 10

Юбо. Протекгивность клона Л1 мы сравнивали с протективностью ИВКЭ в отношении нескольких штаммов вируса КЭ ( Софьин, Абсеттаров и "205") и других патогенных вирусов комплекса КЗ (ОГЛ и ШЭО). Оба препарата оказались высокоэффективны для защиты мышей против штаммов вируса КЭ: 1!ч>6 1д Ю50. Против вируса ОГЛ клона Л1 превысил 7 1д Ю50, но ИВКЭ оказалась менее эффективной (1Я 4,7 1д 1_О50). Против вируса ШЭО клон Л1 тоже защищал мышей (ИЧ 4,01д Юбо), а ИВКЭ была не эффективна. Эти данные указывают на принципиальные различия в механизмах иммунитета, обусловливаемого живыми ослабленными вирусами и ИВКЭ. По результатам наших опытов на мышах защитный эффект клона Л1 был связан, преимущественно, с клеточными механизмами иммунитета, ИВКЭ - с гуморальными. Защитный эффект иммунизации мышей клоном Л1 обязательно ассоциировался со способностью клеток селезенки обеспечивать адоптивный иммунитет реципиентов, но мог развиваться при отсутствии определяемых титров антигемагглютининов и отсутствии анамнестической гуморальной реакции на заражение. Протективный эффект ИВКЭ обязательно ассоциировался с анамнестической гуморальной реакцией на заражение, но мог развиваться при отсутствии у клеток селезенки способности к обеспечению адоптивного иммунитета.

3. Изучение возможности отдаленных неврологических последствий при использовании ослабленных клонов вируса Лангат ТР-21 в качестве ЖВКЭ.

Проблема ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21 связана с проблемой хронических нейроинфекций в двух аспектах. КЭ, вызываемый родственным и весьма близким по биологическим свойствам вирусом, в 1-3% случаев развивается в хронической форме, причем иногда симптомы поражения ЦНС проявляются лишь в отдаленные сроки после инфицирования, чаще - в течение 1 года, изредка - через несколько лет (А.Н. Шаповал, 1976,1930). Эксперименты на обезьянах

(В.И. Ильенко и соавт., 1974) и обследование больных хроническим КЭ людей ( М.П.Чумаков и соавт., 1944, H.H. Краминская и соавт., 1972) показали, что хронические формы КЭ связаны с длительной персистенцией вируса КЭ в организме. В.В. Погодина и соавт.(1986), изучавшие патогенез КЭ на сирийских хомячках, пришли к заключению, что способность к персистенции в одинаковой степени свойственна всем штаммам вируса КЭ вне зависимости от их патогенности, в том числе и весьма слабопатогенным. Отсюда родилось опасение, что способностью вызывать хронический энцефалит может обладать и слабопатогенный сочлен антигенного комплекса КЭ - вирус Лангат.

Второй аспект проблемы связан с предположениями о том, что вирусы комплекса КЭ могут персистировать в ЦНС в необычной форме. На основании опытов на хомячках i.Ziotnik et al. (1973, 1976) выдвинули гипотезу, что вирус Лангат ТР-21 может персистировать в ЦНС в дефектной форме (как вирус кори при подостром склерозирующем панэнцефалите) и вызывать медленно развивающийся процесс дегенерации нервной ткани. В.В.Погодина и соавт. (1986), также на основании опытов на сирийских хомячках, пришли к выводу, что ослабленные штаммы вируса КЭ могут персистировать в ЦНС при обратимой утрате способности к синтезу гемагглютинина (возможно и других белков) и инфекционности, но под воздействием зкзо- или эндогенных факторов иммуносупрессивного характера, могут восстанавливать ингибированные функции и вызывать манифестную нейроинфекцию. Те и другие авторы рассматривали полученные результаты как указание на опасность использования аттенуированных вакцин на основе вирусов комплекса КЭ в связи с возможностью отдаленных неврологических осложнений.

Наши исследования не выявили фактов, подтверждающих правомерность таких опасений в отношении к аттенуированным вариантам вируса Лангат.

ЦНС 18 обезьян исследовали в отдаленные сроки (6 и 12 месяцев) после интрацеребрального заражения штаммом ТР-21, клонами Л1-Л5 и

штаммами Еланцев 15-20/3, Е-30 и Е-37. Все животные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения. При периодических осмотрах специалиста невропатолога тоже не было выявлено симптомов нарушения функции ЦНС. После усыпления из нервной ткани не удалось выделить вирус, а при нейроморфологическом исследовании обнаружили только единичные мелкие инфильтраты гематогенных клеток в околососудистом пространстве и в мягкой мозговой оболочке. В количественных показателях их было достоверно меньше, чем через 1-1,5 месяца после заражения. Свежих очагов воспалительно-дегенеративного процесса не наблюдалось. Не было выявлено и спонгиознсй дегенерации нервной ткани по типу медленных вирусных инфекций. Эти данные согласуются с результатами исследований А.Е.Чигиринского (1977), Н.В.Шубина (1973) и Д.П.Дремова (1977), в которых у обезьян, зараженных штаммами Е-30 и Томский (всего 13 животных) тоже не находили признакоз хронической нейроинфекции при наблюдениях в течение 8,5 -11 месяцев.

Исследование состояния здоровья привитых экспериментальными ЖВКЭ является наиболее объективным способом для оценки реальной опасности отдаленных неврологических последствий при использовании ослабленных штаммов вируса Лангат для иммунизации людей (табл.7). В нашей стране первыми иммунизацию людей ослабленными вариантами малайского вируса проводили В.И. Ильенко и соавт. в 19611968 гг. Испытание безопасности клонов, рассматривавшихся как кандидаты в вакцинные, происходило в постепенно расширяющихся опытах. В итоге, иммунизировано было около 3 тыс. человек (В.И. Ильенко и соавт., 1989). Около 200 человек авторы наблюдали до трех лет и регистрировали у них сохранение антител к вирусу КЭ, но не выявили побочных реакций. 710 человек из привитых этими авторами, были соматически здоровыми пациентами психиатрических клиник г. Санкт-Петербурга и, следовательно, находились под постоянным медицинским контролем. Это позволило нам получить сведения о

Объем материала, собранного о состоянии здоровья привитых экспериментальными ЖВКЭ в конце

шестидесятых-начале семидесятых годов

Место прививок, контингент привитых Штамм вируса Лангат Сведения о привитых:

возраст (в годах) количество медицинское наблюдение осмотр невропатолога

Саша-Петербург, пациенты психиатрических клиник ТР-21-А Т1С-9/2 <16 >16 >16 32 90 21 1-5 лег 1-29 лет 1-20 лет Регулярно в период лечения

Пермь и Пермская область Елаицев 15-20/3 >16 2788 16-17 лет 6 чел., перенесших поствакцинальный энцефалит (1986 г.)

Екатеринбург и Екатеринбургская область Елаицев 15-20/3 >16 5164 17-19 лет 5 чел., перенесших поствакцинальный энцефалит и 688 лиц, не имевших поствакцинальных осложнений

здоровье привитых вариантами ТР-21-А и ТК 9/2 за значительно более длительные периоды времени после иммунизации. Нам удалось изучить истории болезней 143 больных психоневрологических стационаров, среди которых было 32 ребенка и 111 взрослых лиц. Бее дети были привиты вариантом ТР-21-А, 21 человек из числа взрослых пациентов - культуральным вариантом ТК-9/2. Среди последних наблюдали три случая поствакцинальных осложнений: у двух человек - лихорадка, у одного - менингоэнцефалит. Большинство привитых в течение многих лет до и после прививок страдали тяжелыми психоневрологическими заболеваниями, ассоциирующими с патологией ЦНС. (табл. 8). Но ни в одном случае мы не обнаружили б историях болезней в последующие годы ( от 1 до 29 лет) регистрации неврологических симптомов, указывающих на хроническую нейроинфекцию. В историях болезней зафиксированы 6 случаев смерти среди этих людей. Они не были связаны с хроническими нейроинфекциями (4-острая сердечная недостаточность, 1- легочное кровотечение, 1-киста мозга).

В конце шестидесятых-начале семидесятых гг. прививки штаммом Еланцев 15-20/3 в порядке широкомасштабной вакцинации против КЭ проводили в нашей стране повсеместно. В общей сложности было привито 650 тыс. человек, в Пермской и Екатеринбургской областях - 90 тыс. человек. Прививочная кампания была остановлена в связи со случаями поствакцинального энцефалита ( всего -35, 19 - в Пермской и Екатеринбургской областях). Первыми изучением отдаленных последствий иммунизации людей штаммом Еланцев 15-20/3 занимались профессор А.Н.Шаповал и сотрудники возглавляемой им кафедры нервных болезней Пермского медицинского института (А.А.Смородинцев и соавт., 1986). В течение 1-9 лет были собраны сведения о 6508 привитых, не имевших острых поствакцинальных осложнений. Случаев хронического энцефалита среди этих людей не выявили. Мы продолжили эти исследования через 16-19 лет после прививок. Среди привитых, о состоянии здоровья и причинах смерти

Таблица 8

Причины смерти привитых штаммом Еланцев 15-20/3 по данным на

1986-1989 годы

Причины смерти Число умерших

абс. %%

Онкологические заболевания 182 21,5

Заболевания сердечно-сосудистой системы 225 26,6

Инсульт 104 12,3

Легочно-сердечная недостаточность 48 5,6

Острая почечная недостаточность 7 0,8

Желудочно-кишечные заболевания 12 1,4

Сахарный диабет 15 1,7

Раневая гангрена 2 0,24

Туберкулез легких 11 1,3

Ревмокардит 1 0,12

Сепсис 1 0,12

ГЛПС 1 0,12

Роды л 1 0,12

Криминальный аборт 1 0,12

Эпилепсия 2 0,24

Несчастные случаи 232 27,4

Всего 845 100

(табл.9) которых нам удалось собрать сведения, многие страдали различными сердечно-сосудистыми, легочными и другими соматическими заболеваниями. 35 человек лечились в стационаре по поводу туберкулеза, 11 из них умерло от этой инфекции. 182 человека умерли от онкологических заболеваний, что неизбежно было связано с подавлением функции иммунной системы. Тем не менее случаев хронических нейроинфекций среди 7952 привитых штаммом Епанцев 15-20/3, о которых нам удалось получить сведения, не было. Анализ соматической и инфекционной заболеваемости среди привитых вакциной из штамма Еланцев 15-20/3 и соответствующей по полу, возрасту, и профессиям контрольной группы не выявил и какого-либо иного вредного влияния этого вируса на здоровье людей, которое можно было бы счесть проявлением скрытой хронической инфекции (табл.10). Профессорами А.Н.Шаповапом и С.С.Магазанник не было выявлено хронической нейроинфекции и у 11 обследованных в 1986 -1989 гг. лиц, перенесших после прививки штаммом Еланцев 15-20/3 поствакцинальный энцефалит.

8 целом, профессором А.Н.Шаповалом и сотр. и нами обследован пятнадцатитысячный контингент иммунизированных штаммом Еланцев 15-20/3 лиц, что составляет 16% от общего числа привитых этой вакциной в Пермской и Екатеринбургской областях и позволяет сделать достоверный вывод об отсутствии у этого штамма склонности к индукции у человека нейроинфекции в хронической форме. Клинические данные указывают на то, что хронический КЭ наиболее часто развивается после острой инфекции с очаговыми поражениями ЦНС (А.Н.Шаповал, 1976, 1980). От больных с хроническим КЭ были выделены только патогенные для обезьян при интрацеребральном заражении штаммы (В.В.Погодина и соавт., 1986). Хронические формы энцефалита, в том числе и при отсутствии манифестного острого периода болезни, вызывали у обезьян, по данным В.И. Ильенко и соавт.(1974) только некоторые, но из патогенных для них штаммов. Результаты наших специальных исследований не выявили у

Структура психических заболеваний у пациентов психиатрических клиник, привитых экспериментальными ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21.

Заболевание Дети Взрослые

Олигофрения 17 4

Шизофрения 1 64

Эпилепсия 1 11

Травматическая энцефалопатия 2 9

Психопатия 2 2

Психозы (различной природы) 3 8

Органическое заболевание головного мозга с психическим расстройством 1 4

Невропатия 1 -

Неврастения 1 -

Невротический синдром после токсико-инфекционного заболевания 1

Семейно-бытовая запущенность 2 -

Сосудистое заболевание головного мозга с изменением личности 1

Прогрессивный паралич - 1

Аффективная неустойчивость - 1

Органическое заболевание головного мозга после перенесенного энцефалита 6

Всего 32 100

Структура и частота заболеваемости у привитых штаммом Еланцев 15-20/3

Заболевания органов и систем Пермская область Екатеринбургская область

контроль (1211 чел.) привитые (1186 чел.) привитые (3710 чел.)

абс. %% абс %% абс. %%

Болезни сердечно-сосудистой системы 536 44,3 615 51,8 1619 43,6

Неспецифические легочные заболевания 314 25,9 370 31,2 1163 31,3

Ревматизм 10 0,8 18 1,5 19 0,5

Болезни печени и желчных путей 174 14,4 212 17,9 414 11,2

Болезни почек и мочевыводящих путей 61 5,0 104 8,8 317 8,5

Болезни желудка и двенадцатиперстной кишки 17б"~ 14,4 187 15,8 538 14,5

Заболевания суставов, связок, сухожилий 86 7,1 107 9,2 335 9,0

Заболевания нервной системы 274 22,6 276 23,3 817 22,0

Остеохондроз _246 20,3 261 22,0 445 12,0

Грипп, ОРЗ 1095 90,4 1134 95,6 2715 73,2

Ангины 169 14,0 233 19,6 661 17,8

Туберкулез легких 7 0,6 5 0,4 29 0,8

ослабленных клонов вируса Лангат склонности к индукции хронического энцефалита у обезьян или человека. Таким образом, опасения возможности отдаленных неврологических последствий применения аттенуированных вакцин против КЭ, имевшие умозрительный характер, нашими данными не подтверждаются.

Разработка ЖВКЭ имела бы важное практическое значение для здравоохранения РФ, большая часть территории которой эндемична для вируса КЭ. Наиболее перспективным источником аттенуированных вариантов для ЖВКЭ представлялся ранее и остается по настоящее время малайский вирус Лангат ТР-21. Успешно начатые в шестидесятых годах исследования могут быть продолжены а наше время. Тормозом являлось отсутствие надежных лабораторных методов дифференциации ослабленных вариантов вируса Лангат по биологическим свойствам и потенциальной нейровирулентности. Рядом авторов предложены биологические маркеры аттенуированных вариантов для первичного отбора, а наше исследование позволило усовершенствовать и методику сравнительной лабораторной оценки остаточной нейровирулентности ослабленных клонов. Специальные опыты на обезьянах и изучение состояния здоровья ранее привитых экспериментальными ЖВКЭ людей снимают и опасения отдаленных неврологических осложнений.

Некоторые исследователи полагали, что при высокой степени аттенуации вирус Лангат может утратить и иммуногенность. Мы убедились, что из популяции штамма ТР-21 могут быть выделены высокоиммуногенные клоны с меньшей, чем у штамма Еланцев 15-20/3 потенциальной нейровирулентностью. Близость селекционированного нами клона Л1 по потенциальной нейровирулентности вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа - высокобезопасного в качестве вакцинного варианта нейротропного вируса обнадеживает в продолжении исследований по разработке ЖВКЭ на основе малайского вируса.

Выводы.

1. При заражении обезьян в таламус вирусами ЖЛ, КЭ, Лангат ТР-21 (пассируемые на мышах и в культурах клеток варианты) и денге 2 развивается энцефалит разной степени тяжести. Вирусы ЖЛ, КЭ и Лангат ТР-21-К вызывают острый энцефалит, вирусы денге 2 и Лангат ТР-21-М - бессимптомную инфекцию.

2. При изученных флавивирусных энцефалитах обезьян степень поражения нейронов, глиоз и воспалительная реакция, в целом, жестко взаимосвязаны. В среднем, вне зависимости от общей тяжести патологического процесса в ЦНС, доли показателей поражения нейронов, глиоза и воспалительной реакции составляют в интегральном показателе морфологических изменений в ЦНС 10-20%, 30-35% и 5560%, соостветственно.

3. Типичное для флавивирусных энцефалитов соотношение количественных показателей некробиотических изменений нейронов, глиоза и воспалительной реакции нарушается при особо выраженном нейротропизме вируса (относительное повышение показателя некробиоза нейронов) и при заражении обезьян наиболее ослабленными штаммами (относительное повышение показателя воспалительной реакции).

4. Прямой взаимосвязи тяжести течения инфекции с интегральными показателями морфологических изменений в ЦНС нет. В сравнительной нейроморфологической оценке нейровирулентности патогенных флавивирусов следует использовать дифференцированные показатели поражения нейронов передних рогов спинного мозга,'.

5. Использование интегральных показателей морфологических изменений, полученных на основе дифференцированных определений степени изменения нейронов, глиозз и воспаления, увеличивает разрешающую способность сравнительной нейроморфологической

оценки аттенуации слабопатогенных или апатогенных по клиническим данным штаммоа флавивирусов.

6. Методом предельных разведений на мышах из штамма ТР-21 получена гетерогенная по биологическим свойствам группа клонов, дифференцируемая по репродукции при 37 и 40°С на 4 фенотипа.

7. Результат заражения обезьян ослабленными вариантами вируса Лангат зависит от их физиологического состояния. Неадаптированные к лабораторному содержанию животные значительно тяжелее реагируют на заражение, чем адаптированные.

8. По нейровирулентности для обезьян исследованные нами варианты вируса Лангат разделились на три группы. Наименьшая нейровирулентносгь свойственна штамму ТР-21 на уровне 39-40 пассажа на мышах, клокам Л1-Л5 и штаммам Е-30 и Е-37. Штамм Еланцев 15-20/3 обладает средним уровнем нейровирулентности. Самым патогенным для обезьян при интрацеребральном заражении оказался культуральный вариант вируса - ТР-21-К.

9. Эксперименты на обезьянах пока остаются единственным методом сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности ослабленных клонов вирусов комплекса КЭ. Такие биологические свойства ослабленных клонов вируса Лангат, как ret 37{Ш), ret 40(+/-), Pm s/c (min/mid), IRm (mid/max) или их сочетания не могут служить маркерами степени аттенуации.

10. Резистентность мышей к заражению вирусом КЭ может быть индуцирована минимальными дозами аттенуированных клонов вируса Лангат ТР-21 (10 ЛД50). В отличие от ИВКЭ, они стимулируют клеточные механизмы иммунитета.

11. Ослабленные клоны вируса Лангат ТР-21 не вызывают у обезьян хронического энцефалита. У животных, находившихся под наблюдением в течение 6 и 12 месяцев после заражения, не наблюдали симптомов нарушения функции ЦНС, не выделили вирус из нервной ткани, не обнаружили очагов воспалительно-дегенеративного

процесса в особо чувтвительных к флавивирусам структурахх головного и спинного мозга.

12. Среди 8 тыс. привитых в конце шестидесятых-начале семидесятых годов экспериментальными ЖВКЭ на основе вируса Лангат не выявлено случаев хронических нейроинфекций.

13. Получен стабильный и иымуногенный клон штамма ТР-21 (Л1) с остаточной нейровируленткостью в тесте на обезьянах близкой высокобезопасному вакцинному штамму нейротропного вируса полиомиелита 3 типа, не вызывающий у приматов хронической ней'роинфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Крашенюк А.И., Подоплекина Л.Е., Бекетова З.П., Носков Ф.С. Пути совершенствования инактивированной вакцины против клещевого энцефалита. // Природноочаговые инфекции и инвазии.- Омск, 1984,- С. 15-34.

2. Головкин В.И., Камалов И.И., Соколова Е.Д. Тималин в комплексе с вакциной при защите от клещевого энцефалита. //Химиотерапия и химмопрофилактика вирусных инфекций. Особо опасные и медленные инфекции, - Минск, 1985.-С.113.

3. Подоплекина Л.Е., Федоров Ю.В., Тымчишин П.Н.,Кириленко В.А., Хасаншин P.P., Просалова Г.П., Крашенюк А.И., Соколова Е.Д., Носков Ф.С. К вопросу совершенствования вакцины против клещевого энцефалита. // Актуальные проблемы медицинской вирусологии. -Москва, 1985,- С.65-66.

4. Подоплекина Л.Е., Федоров Ю.В., Чавандилина Л.И., Тымчишин П.Н., Унгер Г.Н., Просалова Г.П., Бекетова З.П., Васильева Т.В., Явья А.Р., Мирютова Т.Л., Кириленко В.А., Носков Ф.С., Крашенюк А.И., Соколова Е.Д., Рейфман Л.С., Калинина Н.К., Гамолицкий В.Н. Совершенствование технологии изготовления вакцины против клещевого энцефалита. // Медико-биологические препараты и иммунологическая реактивность организма, - Томск, 1985.-С.4-5.

5. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Крашенюк А.И., Рожкова Л.В., Никонова А.Н., Носков Ф.С. // Изучение антигенных свойств и иммуногенности фракций инактивированной вакцины клещевого энцефалита, полученных методами микрофильтрации и хроматографии. // Медико-биологические препараты и иммунологическая реактивность организма. -Томск, 1985.-С.6-8.

6. Подоплекина Л.Е., Федоров Ю.В., Киселева H.H., Камалов И.И., Соколова Е.Д., Кириленко В.А., Федорова Л.А., Ляшенко С.К., Тымчишин П.Н., Прасолова Г.П., Хасаншин P.P. Пути совершенствования

коммерческой вакцины клещевого энцефалита производства Томского НИИВС. // Актуальные вопросы производства медицинских иммунобиологических препаратов. - Томск, 1986,- С.15-18.

7. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Киселева H.H., Кириленко В.А., Хаеаншин P.P., Сокольникова Г.А. Изучение возможности использования некоторых режимов очистки и концентрации при производстве вакцины клещевого энцефалита. II Актуальные вопросы биотехнологии. - Москва, 1987,- С.93-94.

8. Соколова Е.Д., Киселева H.H., Рожкова Л.В., Осипова Е.Г., Ляпустин

B.Н., Лашкевич 8.А. Изучение иммуногенности и антигенного состава фракций культуральной вакцины против клещевого энцефалита, полученных методами ультрафильтрации, гель-хроматографии и ультрацентрифугирования. // Клещавой энцефалит. - Ленинград, 1989.-

C.141-150.

9. Шаповал А.Н., Денисова Е.Ю., Камалов И.И., Соколова Е.Д., Лузин П.М.,Шамарина А.Г., Гусманова А.Г., Пинаева Н.И. Изучение отдаленных последствий иммунизации людей живой вакциной против клещевого энцефалита. II Клещевой энцефалит. - Ленинград, 1989.-С. 133-135.

10. Соколова Е.Д. О лабораторных методах контроля иммуногенности вакцин против клещевого энцефалита. И Клещевой энцефалит. -Ленинград, 1989.-С.90-98.

11. Никонова А.Н., Рожкоза Л.В., Соколова Е.Д. Значение гуморального иммунитета в поствакцинапьной резистентности мышей к клещевому энцефалиту. // Клещевой энцефалит.- Ленинград, 1989.-С.84-90.

12. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Денисова Е.Ю. Перспективы разработки живой вакцины против клещевого энцефалита. //Клещевой энцефалит. - Ленинград, 1989.-С.98-120.

13. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Кириленко В.А., Киселева H.H., Хаеаншин P.P., Рожкова Л.В., Никонова А.Н., Денисова Е.Ю. К

вопросу об усовершенствовании инактивированной культуральной вакцины клещевого энцефалита посредством концентрирования вирусного антигена. // Вирусные и бактерийные препараты. - Томск, 1989,- С.32-39.

14. Камалов И,И., Соколова Е.Д., Рожкова Л.В., Денисова Е.Ю., Никонова А.Н. Изучение закономерностей усиления поствакцинального иммунитета мышей к клещевому энцефалиту с помощью иммуностимуляторов. // Вирусные и бактерийные препараты. - Томск, 1989,- С.40-47.

15. Хасаншин P.P., Дьяконова Е.В., Киселева H.H., Осипова Е.Г., Сокольникова Г.А., Бекетова З.П., Соколова Е.Д., Никонова А.Н., Капустянский С.П. Вопросы качества коммерческой вакцины клещевого энцефалита. // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии. - Томсх, 1990.-С.45-51.

16. Шаповал А.Н., Камалов И.И., Соколова Е.Д., Денисова Е.Ю., Никонова А.Н., Лузин ГШ., Гусманова А.Г., Пинаева Н.И., Пономарев Д.Н., Поздняков П.Н., Скоромец Р.З., Буслаев А.П., Циома A.A., Намятов В.Я., Ширяев В.В., Комаров В.В. О состоянии здоровья привитых живой вакциной против клещевого энцефалита. // Совр.проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита. Тез. докл. Всес. симпозиума, г. Иркутск, 1821 сентября 1990. - Иркутск, 1990.-С.88-89.

17. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Рожкова Л.В., Денисова Е.Ю., Никонова А.Н., Шмидт O.A. Сравнительное изучение биологических свойств вирусов Еланцев и Лангат. // Совр.проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита. Всес. симпозиум, 18-21 сентября 1990. - Иркутск, 1990.- Тез. докл. С.69.

18. Kamalov I.I., Sokolova E.D., li'enko V.l., Konovalov G.V. Problems associated with the laboratory evaluation of the specific safety of a live vaccine against Russian Spring-Summer Encephalitis. // International Conference or» Medical Biotechnology, Immunization and Aids, leningad, June 12-18,1991 ,-Тез.докл. S5-3.

19. Камалов И.И., Рожкова Л.В., Соколова Е.Д., Лаврентьева И.Н. Характеристика биологических свойств вируса Лангат ТР-21. // Актуальные вопросы медицинской биологии.- Ч.1.- Томск, 1991.-С,79-81.

20. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Ильенко В.И., Коновалов Г.В., Головкин В.И. Об отборе вариантов вируса лангат ТР-21 для живой вакцины против _ клещевого энцефалита. // Природноочаговые болезни человека,- Омск, 1991 .-С.56-65.

21. Рожкова Л.В., Соколова Е.Д., Вейгман Н.З., Белявская H.A., Камалов И.И., Кветкова Э.А. Сравнительное лабораторное исследование вариантов вируса Лангат ТР-21 и Еланцез. // Природноочаговые болезни человека.- Омск, 1991.-C.S6-73.

22. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Ильенко В.И., Рожкова Л.В. Живая вакцина против клещевого энцефалита - принципы отбора вакцинных штаммов. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1993.-№3.-С.70-76.

23. Шаповал А.Н., Камалов И.И., Денисова Е.Ю., Соколова Е.Д. Оценка состояния . здоровья людей в отдаленные сроки после иммунизации экспериментальными живыми вакцинами против клещевого энцефалита. //Актуальные проблемы инфекционной патологии.-Ч.2.-Санет-Петербург, 1993.-С.69.

24. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Вейгман Н.З., Киселева H.H., Осипова Е.Г. Иммуногенность и нейровирулентность ослабленного клона вируса Лангат ТР-21 в опытах на лабораторных животных. //Актуальные проблемы инфекционной патологии.-Ч.З.-Санкт-Петербург, 1S93.-C.130. 25. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В. Патоморфологическое исследование ЦНС обезьян, зараженных в мозг ослабленными вариантами вируса Лангат ТР-21. //Актуальные проблемы инфекционной патологии.-Ч.З.-Санкт-Петербург, 1993.-С.131.

26. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В., Вейгман Н.З. Нейровирулентность вариантов вируса Лангат ТР-21 в опытах на обезьянах разных видов. // Вопр.вирусол,-1994.-№ 3.-С.116-118. 27. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В. Характеристика нейровирулентности, стабильности и иммуногенности ослабленных вариантов вируса Лангат ТР-21. II Вопр.вирусол.-1994.-№ 5.-С.220-223.

28. Соколова Е.Д., Камалов И.И. О лабораторных критериях оценки безопасности штаммов-кандидатов для живой вакцины против клещевого энцефалита. // Вопр.вирусол.-1994. - № 6.-С.247-251.

29. Соколова Е.Д., Камалоз И.И. Анализ аргументов "за" и "против" возможной роли аттенуированкых вирусов комплекса клещевого энцефалита в индукции хронической инфекции. // Идеи Пастера з борьбе с инфекциями. Междунар. симпозиум.-Санкт-Петербург, 6-10 июня 1995.-Тез. докл.-С.139.

30. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В. Усовершенствование методики оценки нейровирулентности аттенуированных вариантов вирусов комплекса клещевого энцефалита на обезьянах. // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Междунар. симпозиум.-Санкт-Петербург, 6-10 июня 1995,-Тез. докл-С.140.

31. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Шацкая А.И., Пучнова С.М., Гдалевский Г.Я. Адъювант для инакгивированной вакцины против клещевого энцефалита. //Авторское свидетельство № 1202100, 1.09.85

32. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Головкин В.И., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Способ иммунизации против клещевого энцефалита. //Авторское свидетельство № 1235029,1.02.86.

33. Школьник Р.Я., Киселева H.H., Осипова Е.Г., Воробьева М.С., Соколова Е.Д., Медведева Г.И., Васильева В.И., Эльберт Л.Б., Расщепкина М.Н. Способ иммунизации для профилактики клещевого энцефалита.//Авторское свидетельство № 1722503, 01.12.1991.

34. Камалов И.И., Соколова Е.Д., Ильенко В.И., Коновалов Г.В., Кветкова Э.А., Кисилева H.H., Рожкова Л.В., Вейгман Н.З., Денисова Е.Ю., Осипова Е.Г. Штамм вируса Лангат ТР-21 Л1/89 для получения живой вакцины против клещевого энцефалита. Решение о выдаче патента на изобретение.