Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка синтетических пептидов и вириона вируса ящура в радиоиммуноанализе

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Оценка синтетических пептидов и вириона вируса ящура в радиоиммуноанализе"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И

ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Всероссийский научно-исследовательский Г i 5 О Д институт защиты животных

— О TT"

2 у Г» 1 ¡8ч)!'

НЯ !m;m:t» ПУНППИПИ

УДК 578, 835, 2: 619-078: 615, 371. Петрова Ольга Николаевна

ОЦЕНКА СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ВИРИОНА ВИРУСА ЯЩУРА В РАДИОИММУ НО АНАЛИЗЕ

03.00.06 "Вирусология"

Автореферат

1 t-j) (.чини на сонскиние ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

РЫБАКОВ Сергей Сергеевич, доктор биологических наук, профессор.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Колоптгсв Ллсь-сандр Алексеевич. доктор оиолоппсских наук, старший научный сотрудник (ВНИИВВиМ, г. Покров);

Перевозчикова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, старшин научньш сотрудник (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г. Щелково Московской области

Защита состоится " & 1995г. в 10 часов

на заседании диссертационного совета К 120. 60. 01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан

¿с^ичл. ¡995г,

Ученый секретарь диссертационного совета - Узгомов В.Л.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В системе мероприятий, применяемых для борьбы с ящуром, важное значение имеют меры по специфической профилактике заболевания, экспрессной диагностике и достоверному определению типовой и штаммовой принадлежности возбудителя. В настоящее время используются вакцинные и диагностические препараты, полученные на основе целого вириона. Имеются многочисленные публикации, указывающие на то, что данные препараты не лишены недостатков Одним из перспективных направлений работы по созданию безопасных и эффективных препаратов является получение антигенов путем химического синтеза.

Антигены, созданные на основе синтетических пептидов, имеют ряд преимуществ: они неинфекционны, методы их синтеза позволяют получать препараты воспроизводимого качества, хранение пептидов при плюсовых температурах не приводит к потере специфической активности. Разработка вакцинных и диагностических препаратов на основе синтетических пептидов невозможна без предварительного изучения в тестах in vitro иммунобиологических свойств большого числа фрагментов, содержащих антигенные детерминанты полипептида VPj вируса

'ящура. Использование иммунохимлческих методов анализа позволяет проводить скрининг и выявлять пептады, пригодние для создания на их основе вакцинных препаратов и диагностических наборов.

Одним из таких методов является радиоиммуноанализ (РИА), который характеризуется высокой специфичностью, методической простотой и точностью измерений. Указанные преимущества РИА способствовали выбору его в качестве метода исследования антигенов вируса ящура и антител к ним.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлись оценка качества и определение количественного содержания синтетических пептидов, вириона вируса ящура и антител к ним с использованием радиоиммуноаналнза.

Для достижения поставленной цели необходимо было' решить следующие задачи:

подобрать оптимальные условия получения меченных

Р5т

41 синтетических пептидов, вирионов вируса ящура, антител к ним и белка А;

разработать методику постановки радиоиммуноанализа с использованием поликлональных и моиоклональных антител, 140Э частип п синтетических лсшздой - фрагментов УР^ гяруса яшурл разпых типов;

изучить антигенные свойства синтетических пептидов-фрагментов УР) вируса ящура типов А, О и Азия 1;

выявить связь между антигенными свойствами пептидов, титрами антипептидных, в том числе вирусспецифич-ных антител с одной стороны - титрами вируснейтрализугощих антител и протективнымп свойствами пептидов с другой;

провести сравнительное изучение аффинности антител, полученных на вирион и синтетические пептиды - фрагменты УР [ вируса ящура типа А;

на основе РИА разработать методики: выявления и количественного определения 140Б частиц вируса ящура; определения специфичности антител в сыворотках крови животных с применением синтетических пептидов - фрагментов УР1 вируса ящура типов А, О и Азия I.

Научная новизна. Впервые с применением РИА на

полиэтиленовой пленке изучены иммунобиологические свойства синтетических пептидов - фрагментов \'Р-[ отечественных

производственных штаммов вируса ящура типов А, О и Азия 1 и конструкций, созданных на основе пептидов. Проведена оценка их антнгенности и способности индуцировать антитела, реагирующие с пептидом и вирусом. На основе полученных результатов разработаны критерии отбора синтетических пептидов для проверки их иммуногегшой и протектнвной активности на лабораторных и естественно-восприимчивых к ящуру животных с целью создания пептидных вакцин и

диагностических препаратов. Получены новые данные по выявлению антител в сыворотках крови переболевших ящуром или вакцинированных животных в РИА с применением синтетических пептидов - фрагментов УР{ вируса ящура А22-Ь&550, 01№194 и Азия 1 №48. Выявлена закономерность, показывающая, что аффинность антипептидных антител, полученных от защищенных при контрольном заражении животных выше, чем от незащищенных.

Практическая значимость. В процессе выполнения исследований выбраны критерии и разработан метод оценки качества и определения количественного содержания антигенов вируса язцура и антител к ним. Полученные результаты исследований позволили предложить "Методику по применению радиоиммунологического анализа на полиэтиленовой пленке для определения ящурных антигенов и антител" и "Методику оценки специфической активности антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных с применением РИА и синтетических пептидов", которые утверждены директором института. Подготовлен набор для дифференциации типов вируса ящура, отмеченный серебряной медалью ВДНХ СССР. Использованные методические подходы могут быть рекомендованы для проведения аналогичных работ как с вирусом ящура других типов, так и с другими вирусами.

Апробация и публикация результатов. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на конференции "Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии" (Владимир, 1988), одноименной конференции молодых ученых и специалистов ВНИЯИ и ВНИИВВиМ (Владимир, 1987), на II-симпозиуме специалистов стран - членов СЭВ по проблемам "Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин" (София, 1988), на научно-теоретической конференции молодых ученых ВНИЯИ "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" (Суздаль, 1990), на международном симпозиуме "К новой стратегии борьбы с ящуром" (Владимир, 1991), на научной конференции "Вопросы ветеринарной вирусолопш,

микробиология и эпизоотологии" (Покров, 1992), на Всероссийской научло-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995), на заседаниях Ученого Совета ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) 1987-95гт.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий ссылок на источники литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и

иллюстрирована 13 рисунками и 27 таблицами.

Положения, выносимые на защиту.

1. Результаты оценки с применением РИА антигенных и иммуногенных свойств синтетических пептидов - фрагментов \П?1

отечественных производственных штаммов вируса ящура А22№550, 0^194 и Азия 1 №48.

2. Критерии отбора синтетических пептидов для испытания на лабораторных и естественно-восприимчивых к ящуру животных, основанные на связи их антигенных, иммуногенных и протективных свойств.

3. Методика по применению радиоиммунологического анализа на полиэтиленовой пленке для определения ящурных антигенов и антител.

4. Методика оценки специфической активности антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных с применением синтетических пептидов в РИА.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Матери алы

В работе были использованы реагенты: натрий йодистый-I в растворе гидроокиси натрия (РНЦ Прикладная химия, С-Петербург), ^Р-ортофосфорная кислота и ^Б-метионин

(Радиопрепарат, Ташкент), белок А стафилококка, меченный (Amersham, Англия), белок А (НПО ГАПХ, Москва), антикроличьи антитела козы (YEDA, Израиль), N-хлор-п-толуолсульфамид (хлорамин Т), натрия азид (Sigma, США); бычий сывороточный альбумин (Реахим, Россия или Serva, ФРГ), овальбумин (Реахим, Россия), гемоцианин фиссурели, масляные адъюванты Фрейнда (Calbiochem, США); желатин пищевой, сефадекс G-25 (Pharmacia, Швеция), хлороформ (Химфармзавод, Киев), полиэтиленгликоль 6000 (Merck, ФРГ), тритон Х-100 (Ferak, ФРГ), отечественные реагенты для приготовления буферных растворов имели квалификацию не ниже "ч.д.а.".

Вируссодержащие материалы: вирус ящура А22^550, Oi№194, Oi№16l8, О^Кауфбойрен, ^№564, Азия 1 №48, выращенный в суспензии перевиваемой линии клеток ВНК 21/13 с титром не ниже 7,0 lg БОЕ/мл и лапинизированный вирус тех же штаммов с титром инфекционностп не ниже 6,0-7,0 lg БОЕ/мл производства завода "Юрьевецветбиопрепарат" (Владимир); ящурный антиген для РУСК семи типов (завод "Юрьевецветбиопрепарат"); афтозный вирус разных типов, полученный из лаборатории диагностики ВНИИЗЖ.

Пептиды-. фрагменты VPi вируса ящура Аз2№550:

•136-155, 141-160, 142-151, 142-155, 145-155, 145-151, 197-213 и 10-24; 0*№194: 140-160 142-160, 144-160, 146-160,

148-160 и 200-214; Азия 1 №48: 132-153, 136-153, 140-153, 137-157, 143-157, Cys(Acm)-140-I53-Pro3-Cys(Acm), Cys-140-153-Pro2-Cys, Palm-GIy3-140-153-Gly2-Lys(PaIm)-Leu и 193-208, а также конструкции на их основе были синтезированы в лаборатории биохимии ВНИИЗЖ. В лаборатории химии пептидов института биоорганической химии РАН были синтезированы фрагменты VPf вируса ящура А22^550: 90-98, 175-184, 136-151, 136-152 и О^ауфбойрен: 134-160, 136-152, 136-160, 145-159 и 146-151.

Культура клеток: перевиваемая линия клеток ВНК-21/13; первичная культура клеток СП.

Животные: морские свинки беспородные массой 400-500г; кролики породы шиншилла массой 1,5-2,0 кг; крупный рогатый скот черцопестрои или костромской породы массой 200-400 кг; подсвинки массой 15-20 кг.

Методы

Очистка препаратов вируса япгупя. Очистку я отделение 1405 частиц культурального вируса ящура зыполплди по методике, предложенной Bachrach H.Z. е. а. (1964), лапннизированного вируса - Сатиной Т.А. с соавт. (1982).

Радиоактивное мечение антигенов к антител. Меченне

qo ос

вируса ° Р или S in vivo проводили путем биологического синтеза в культуре клеток (Minor Р.Н., 1980). Мечение вируса и пептидов 125Г in vitro выполняли хлораминовым методом в модификации Schilow W. (1982). Мечение антител и белка А проводили как описано в разработанной нами "Методике по применению радиоиммуиол отеческого анализа на полиэтиленовой пленке для определения ящурных антигенов и антител" (1989).

Синтез пептидов. Пептиды синтезировали жидкофазным способом с помощью метода активированных эфиров и смешанных аигидридов аминокислот или твердофазным методом. Полученные пептиды были исследованы в свободном виде, в виде конъюгатов с белками-носителями или сконструированных на основе пептидов иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ) и полимеров,

Иммунизация и заражение животных. Кроликов, морских свинок, свиней и крупный рогатый скот иммунизировали синтетическими пептидами подкожно или внутримышечно, используя масляные адъюванты. Повторную иммунизацию проводили через 42 дня. Иммунитет к ящуру у вакцинированного крупного рогатого скота и свиней проверяли путем заражения животных гомологичным вирусом в дозе 10!ИД5о интрадермо-

лингвально. Морских свинок заражали интраплантарно в дозе 500-1000 ИД50. Учет результатов заражения проводили через 7

суток и оценивали по генерализации ящурного процесса.

Получение гни ер иммунных сывороток. Гипериммунные сыворотки на различные варианты вируса ящура типов А, О, С и Азия 1 получали путем двукратной иммунизации кроликов 140 S частицами вируса в дозе 80-100 мкг.

Серологические исследования. Титры вируснейтрализую-щих антител определяли в реакции нейтрализации вируса в культуре клеток свиной почки, используя двукратные разведения сывороток и постоянную дозу вируса 100 ТЦД5о/0,1 мл.

Методы радноиммунологнческого анализа. Вариант радиоиммуноаналнза двойной сандвич проводили по методике, разработанной во ВНИИЗЖ (Рыбаков С.С. и соавт., 1989). При выполнении непрямого варианта проводили адсорбцию исследуемого антигена на поверхности полиэтиленовой пленки, регистрацию иммунного комплекса выполняли с помощью 12"*1-белка А. Для прямого варианта нспользовалп меченые

антигены или вирусспецифические антитела. Реакцию

125

конкуренции проводили, ингибируя связывание меченного I антигена с адсорбированными антителами добавлением в реакционную среду гомологичного немеченого препарата.

Аффинность антител. Кажущуюся константу диссоциации комплекса антиген-антитело определяли иммунохимдческими методами по методике, изложенной в работе Мерннговой Л.Ф. и соавт. (1989), с нашими модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение меченых антигенов и антител Удельная активность препаратов, меченных Р или S в

процессе биологического синтеза, составляла в среднем 0,005125

0,014 мкКи/мкг вирусного белка. Мечение I вирусного белка in vitro хлораминовым методом обеспечивало получение препаратов с удельной активностью 0,1-0,9 мкКн/мкг вирусного белка, но титр ннфекцнонностн при этом снижался на 1,0-1,5 lg БОЕ/мл. Проведенные исследования не выявили различий в

антигенной активности меченых неинактивированного и ннактивированного вирусов. Специфичность полученных меченых препаратов проверяли в прямом варианте твердофазного радиоиммуноаналяза (ТФ РИА).

Удельная радиоактивность меченых хлораминовым методом антител составляла в среднем 0,2-1,5 мкКи/'мкг для вирусспецифическнх и козьих антикролнчьих антител, 1,2-2,0 мкКи/мкг для белка А стафилококка. Увеличение удельной активности усиливало ясспсцяфяческое связывание. Добавление к меченому препарату бычьего сывороточного альбумина (BSA) до концентрации 0,1% позволяло сохранить его специфичность при длительном хранении. Удельная активность антител, полученных иодохлоридным методом (McFarlane А., 1958) или по методу Болтона-Хантера (1973), колебалась в пределах 0,04-0,20 мкКи/мкг белка. Специфическую активность препаратов проверяли в ТФ РИА.

Оптимизация условий проведения радиоиммуноаналнза

На чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов, получаемых в РИА, оказывают существенное влияние, условия проведения анализа. В связи с этим нами были проведены исследования по подбору подложек, буферных систем с оптимальной ношюй силой, блокирующих растворов, времени адсорбции компонентов реакции и температурного режима, а также испытаны разнообразные варианты постановки РИА.

При подборе, оптимальных условий для исследования вируса и синтетических пептидов в ТФ РИА лучшие результаты были получены при использовании 0,07М фосфатно-натриевого буферного раствора, проведении всех стадий анализа при температуре 18-20лС, применении 0,5% раствора желатина в качестве блокирующего, инкубировании антител с антигенами в течение 2-х и более часов и адсорбции одного из компонентов нммунохимнческой реакции на поверхности полиэтиленовой пленки не менее 18 часов.

Установлено, что проведение реакции на полиэтиленовой пленке с последующей регистрацией результатов радиометрическим и авторадиографическим способами дало возможность сократить объем анализируемого образца (20 мкл) и увеличить количество одновременно анализируемых проб.

Выявлено, что минимальная концентрация вируса, определяемая в непрямом варианте, составляла 10-30 нг/мл, в варианте двойной сандвич - 10-60 нг/мл, в варианте сандвич -60-80 нг/мл. Показано, что с учетом специфики антигенов вирус целесообразно исследовать в варианте двойной сандвич, а синтетические пептиды - фрагменты вируса ящура - в

непрямом варианте ТФ РИА.

Выявление и определение количественного содержания вируса ящура типов А, О, С н Азия 1

Анализ вирусного антигена в материалах различного происхождения проводили в варианте двойной сандвич. Количество антигена в исследуемых образцах определяли в ТФ РИА по предельному разведению стандартного образца вируса с известной концентрацией или по калибровочному графику, полученному для стандартных образцов вируса. Для результатов десяти измерений активности каждого стандартного раствора вируса ящура О ДО 194, взятого с исходной концентрацией 200 мкг/мл, определяли средние значения, доверительный интервал ошибок и коэффициенты вариации. Профиль коэффициента вариации свидетельствовал о том, что диапазон достоверно определяемых концентраций, при которых ошибка в анализе не превышала 10-15%, составлял 0,03-0,20 мкг/мл стандартного антигена при концентрации иммуноглобулина в системе 3-5 мкг/мл. Исследование образцов с меньшей концентрацией (0,010,03 мкг/мл) вируса ящура сопровождалось большей ошибкой (коэффициент вариации составлял 15-20%).

Пример дифференциации типов вируса ящура, выполненной в режиме авторадиографии на рентгеновской пленке, приведен на рисунке 1. На авторадиограмме

О о

1

«а ©

1 2 3 4 5 8 7 8 9 10 11 12131415161718

—■—1—I_I_I_I..............

А-б-В г-

Д

еж-3-

®оооооооео<мюооооо

«ОООООООФОФФОООООО ОФООООФФООООООООвФ

о©оооо©фоооооооо©ф 00©00©000000©00©00 оофооооооооо©ооооо

ооооооооо0ооо0оооо

оооооооооесооФоооо

Рис. 1 Дифференциация типов вируса ящура с использованием авторадиографпи.

А п Б - иммуноглобулины к вирусу ящура А22^550; В и Г - иммуноглобулины к вирусу ящура О (№194; Д и Е - иммуноглобулины к вирусу яшура С {№56-1; Ж п 3 - иммуноглобулины к вирусу ящура Азпя 1 >&48. Стандартные антигены: 1 -А22^550:

2 - 0^194;

3 - С!№564;

4 - Азия 1 № 48;

5 - контрольный антиген (вирус ВБС); Исследуемые образцы: 6-18 - афтозные материалы в разведении 1:10.

представлены стандартные образцы вируса ящура 4-х типов (№1-4), контрольный антиген (№5) н исследуемые афтозные материалы (№6-18). Анализ проводили в варианте двойной сандвич с использованием в качестве улавливающих антител иммуноглобулинов сывороток крови крупного рогатого скота, в качестве проявляющих - вирусспецифичные иммуноглобулины кроликов, а также козьи антикроличьи антитела, меченные I.

При сравнении результатов РИА и реакции связывания комплемента (РСК), выявлены следующие закономерности: результаты РИА коррелировали с результатами РСК, чувствительность последней была ниже при анализе как образцов кулыурального или лапинизированного вируса различной степени очистки, так и афтозных материалов, независимо от условий и срока хранения. Все исследованные образцы афтозных материалов были активны в РИА без предварительного пассирования их в культуре клеток и концентрирования, доля активных в РСК материалов не превышала 65%.

Таким образом, подобранные нами условия постановки РИА позволили использовать его для выявления, дифференциации типов и определения количества вируса ящура в материалах различного происхождения.

Изучение возможности использования МАт для дифференциации типов и штаммов вируса ящура в ТФ РИА

Актуальность исследований по изучению возможности использования моноклональвых антител (МАт) для дифференциации типов и штаммов "вируса ящура обусловлена тем, что разные животные вырабатывают к одному и тому же антигену индивидуальные варианты специфических антител. Получить стандартный препарат поликлональньтх антител практически невозможно. Наработка МАт решает проблему стандартизации препаратов антител, в связи с этим нами была изучена возможность замены в используемой тест-системе поликлональных антител монокловальными.

Скрининг образцов в непрямом варианте ТФ РИА с вирусом гомологичного типа показал, что активность МАт колебалась от 3,0 lg до 8,0 Ig, активность с вирусами гетерологачных типов не превышала 3,0 lg. При использовании МАт в качестве улавливающих в тест-системе для дифференциации типов вируса ящура антиген выявляли в образцах с концентрацией 8-50 нг/мл. Результаты дифференциации типов вируса ящура с использованием моно- и ппяттлональ^нг ахшиед совпадали. Однако дифференцировать титасгы вируса з пределах субтипа с имеющимся набором МАт не удалось.

Антигенные свойства синтетических пептидов - фрагментов VPj вируса ящура типов А, О и Азия i

Изучение иммунобиологических свойств синтетических пептидов включало оценку их активности в реакциях со специфическими сыворотками против 140S частиц вируса и определение титров антнпептидных антител. Выявление связи между этими параметрами являлось одной из задач данного этапа исследований.

Пептиды из области основной антигенной детерминанты VP[ (130-160 а.о.) вируса ящура обладали активностью в реакции с иммуноглобулинами против вируса гомологичного типа (табл. 1), при этом перекрестная активность пептидов в реакциях с антителами против вируса ящура гетерологачных типов не превышала 5%. Активность пептида 193-208, фрагмента С-концевой антигенной детерминанты VPj вируса ящура Азия 1

№48, оказалась низкой, а антигена ость фрагментов С-концевых детерминт VPj вируса ящура А22 и Ot или пептидов 10-24, 90-98 и 175-184 не была выявлена.

Для усиления иммуногенных • свойств пептиды конъюгпровали с белками-носителями, создавали ИСКОМ, включающие в свой состав пептиды, и проводили полимеризацию пептидов. Оценку антигенных свойств полученных препаратов проводили в непрямом ТФ РИА (табл. 2). Было выяснено, что антигенность конъюгированных с белками пептидов из области

Активность пептидов - фрагментов УР^ вируса ящура типов А, О и Азия 1 в реакциях с антителами _к гомологичным вирусам_

Антигенность* пептидов специфичности:

А 22 1* А 22 О! Азия 1

142-155 4.4 136-151 4.1 140-160 .3.8 140-153 3.8

141-160 4.0 136-152 3.2 142-160 3.6 132-153 3.2

142-151 3.0 10-24 <2.0 144-160 3.7 136-153 3.4

145-151 3.8 90-98 <2.0 146-160 3.7 143-157 2.7

145-155 3.6 175-184 <2.0 148-160 3.6 137-157 3.5

136-155 3.9 197-213 <2.0 200-214 <2.0 193-208 2.4

1405 4.2 140Б 4.1 140Б 4.5

* - антигенность выражена в логарифмах величины обратного разведения раствора пептида, имеющего исходную концентрацию 1 мг/мл, при постоянном разведении иммуноглобулина кролика на 140Б частицы 1;5000.

130-160 а.о. УР1 вируса ящура А22№550 и С>1№194 была выше по сравнению с активностью соответствующих свободных пептидов. Однако конъюгация пептидов, неактивных в свободном виде, не обеспечила повышения их антигенностн. Антигенная активность смеси некоторых свободных пептидов или их коньюгатов была выше активности отдельных компонентов смеси. Антигенность ИСКОМ не превышала антигенностн исходного пептида.

Полимеризация пептидов приводила к увеличению их антигенной активности: активность мономера пептида 142-155 -была равна 4,4 активность полимера (142-155)п - 5,3 ¡3. Следует отметить, что антигенность полимернзованпых пептидов возрастала при увеличении длины мономерного звена. Так, полимер пептида 142-155 был активнее полимеров пептидов 145-151 и 142-151 (табл. 2). Кроме того, антигенные свойства полимеров пептидов изменялись при замене отдельных аминокислот. Антигенность полимера-предшественника (142-155)п, у которого вместо остатков аргинина в положениях 143, 144 и 153

Ангигенностъ различных конструкций, созданных на основе пептидов*

№ Состав антигена Активность в реакции с антителами против вируса

Специфичности А22'- типа А (lg) типа О (lg)

1 145-155-BSA 4,1-5,3 <2,0

2 145-155-KLH 4.2-4.6 2.1

\s UM60-BSA 4.G-5.3

4 141-160-KLH 4,7-5,3 2,0

5 145-151-BSA 5,0-5,1 2,0

6 197-213-BSA <2,0 <2,0

7 197-213-KLH <2,0 <2,0

8 10-24-BSA <2,0 <2,0

9 10-24-KLH <2,0 <2,0

10 (i42-i5i)nOm** 3,8-4,5 <2,0

И (142-151)п 3,8-4,8 <2,0

12 (142-155)QOrn** 3,8-4,2 <2,0

13 (142-155)п 5,1-5,5 <2,0

14 (145-151)ц 2,0 <2,0

15 (141-158)МАР 2,8-3,2 <2,0

Специфичности Азия 1 №48: типа Азия 1 (lg) типа А (lg)

16 (140-153)МАР 3,0-3,4 <2,0

17 Cys-I40-153-Pro2-Cys 3.4-3.8 <2,0

18 Palm- GlyrHO-153-GIy2-Lys(Palm)-Leu 2.8-3.0 <2,0

* - антигеиность выражена в логарифмах величины обратного разведения раствора пептида или конструкций, созданных яа его основе, с исходной концентрацией пептида 1 мг/мл при постоянном разведении иммуноглобулина кролика на 140Б частицы 1:5000.

** - полимеризованные пептиды, содержащие остатки орпитина вместо аргинаиа.

присутствовали остатки орнитина, была ниже антнгенности целевого полимеризованного пептида.

Разветвленные полимеры (МАР-конструкцпи), содержащие фрагменты VPj 142-158 (A22-N?550) или 140-153

(Азия 1 .№48), обладали меньшей антигенносгью, но более высокой иммуногенной активностью по сравнению с мономерами, вероятно, вследствие особых термодинамических и стерических факторов взаимодействия с гидрофобной пленкой при оценке их в ТФ РИА.

Оценка специфической активности антител в сыворотках крови животных, иммунизированных синтетическими пептидами

Исследование в РИА сывороток крови лабораторных животных, иммунизированных пептидами, позволило оценить влияние состава синтетичеких антигенов на их иммуногенную активность. Так, было показано, что титр антипептидных антител (АГ1А), индуцируемый синтетическими пептидами в свободной форме или в составе конъюгатов, был, как правило, выше титра вирусспецифичных (антивирусных - ABA) антител (табл. 3).

Конъюгаты пептидов 141-160-BSA и 141-160-KLH, показавшие наибольшую антигенность, индуцировали выработку большого количества АПА, ABA и вируснейтрализующих антител (ВНА) у кроликов и обеспечивали защиту морских свинок при контрольном заражении гомологичным вирусом (табл. 3).

Конъюгаты пептида 10-24, не проявившие антигенных свойств в РИА, вызывали наработку АПА и ABA в титрах 3,0-3,4 lg, которые не нейтрализовали вирус in vitro ( титр ВНА <1,0 log2) и не обеспечивали защиты животных.

Полимеры пептидов 142-155 и 142-158 обеспечивали 100% защиту морских свинок. Двукратная иммунизация крупного рогатого скота полимером (142-155)п в дозах 1-3 мг защищала от заболевания более 70% животных, титры АПА, ABA и ВНА были равны у защищенных животных соответственно 4,3 Ig, 3,1 Ig и 8,0 Iog2, у незащищенных - 3,6 lg, 2,2 Ig а 4,5 Iog2- Двукратное

Иммуногенность пептидных фрагментов VPj вируса ящура А22№550

Иммупоген Антиген яость в РИА, 18 Титры антител* * * защищено / заражено

РИА, АПА, lg РИА, ABA, lg ВНА, 1°82 НД50/0.1мл

1 10-24 <2.0 <2.0 <2.0 <1.0 0/5

2 10-/4-В ЧА < > U 3.4 3 00 ^1.0 0/ 5

3 10-24-KL1I <2.0 з.ю з.оо <1.0 0/5

4 Í4M60 4.0 4.10 3.20 <1.0 5/5

5 141-160-BSA 4.9 6.00 4.10 3.50-5.00 5/5

б 141-160-KLH 5.0 7.00 4.70 3.00-6.00 5/5

7 142-155 4.8 2.60 2.60 <1.0 1/5

8 142- 155-BSA 4.8 5.20 3.60 <1.0 0/5

* - титры антител исследовали в сыворотках, отобран-пых на 20-е сутки после второй иммунизации кроликов с интервалом 42 дня, доза пептида 200-400 мкг;

** - морских свинок иммунизировали двукратно, доза пептида 200 мкг.

введение крупному рогатому скоту препарата (142-158)МАР в дозе 1,5 мг индуцировало образование АПА, ABA и ВНА (4,2 Ig, 4,0 Ig, 10,6 log2) в количествах, обеспечивающих защиту животных при заражении гомологичным вирулентным вирусом. Анализ результатов испытания иммунобиологических свойств показал, что высокая протективная активность пептидов сочеталась с их высокой антигенностыо и высокой активностью индуцируемых ими антител в реакциях in vitro с пептидом и вирусом.

На основании результатов исследования в РИА антипептидных сывороток морских свинок, иммунизированных свободными пептидами - фрагментами VPj вируса ящура Азия 1

№48, сделан вывод о существовании в составе фрагмента 140-153 В- и Т-эпитопов, специфичных для морских свинок. Была выявлена высокая антигенная (3,8 lg) и иммуногенная (АПА -

5,3 lg, ABA - 3,9 Ig, BHA - 3,5 log2) активность пептида 140-153-Cys(Acm) по сравнению с более длинными фрагментами: 136-153, 132-153, 143-157 и 137-157. В опытах по оценке протективной активности было показано, что данный пептид защищал 50% морских свинок при контрольном заражении гомологичным вирусом ящура. Оказалось, что сыворотки против всех названных пептидов практически одинаково реагировали с пептидами 140-153 и 137-157, что позволило предположить наличие в участке 140-153 В-эпнтопа, взаимодействующего с антителами. Высокая активность антипептидных сывороток, полученных на пептиды 140-153 и 136-153, в реакции с гомологичным вирусом указывала на наличие Т-эпитопа в составе фрагмента 140-153 VPi вируса ящура Азия 1 №48, обеспечивающего активацию Т-клеточного иммунного ответа на пептид.

Результаты проведенных исследований показали, что для испытания нммуногенной активности в опытах на лабораторных или естественно-восприимчивых к ящуру животных следует отбирать синтетические пептиды и содержащие их конструкции, антпгенность которых в РИА превышала 3,0 lg. Оценка в тестах in vitro специфической активности антител, содержащихся в сыворотках крови животных, иммунизированных синтетическими пептидами, а также оценка протективного эффекта на лабораторных животных позволяли рекомендовать отдельные пептиды и созданные на их основе конструкции для проверки иммуногенных свойств на естественно-восприимчивых к ящуру животных •

Для сравнительного изучения аффинности антител, полученных на нммуногенные полимеры фрагментов VPi вируса ящура Агг (142-155)п н (142-158)МАР, определяли кажущуюся константу диссоциации комплекса (Кдк) антиген-антитело. Кдк является количественной характеристикой сродства антител к антигену, для ее расчета строили график зависимости концентрации комплекса Аг-Ат, регистрируемого в непрямом варианте РИА, от концентрации антигена. Кдк определяли как тангенс угла наклона полученной прямой к оси абсцисс.

Аффинность антипеп-гндных антител, полученных при иммунизации свиней пептидом (142-155)0*

№ № Доза Ти тр Кдк комплекс» ВНА Защита

Ме Си воротец живот- пепти- АПА, 1Й АВА, 18 Ат-вирус*** Лт-( 142- 1°82

ного да, мхг 15:5)п

1 Полимер 1 5 4.11 3.50 0.267 0 601 5.33 +

2 пептида 2 5 3.83 3.20 0.249 0 445 3.00 +

3 142-155 3 5 3.83 3.20 0.305 0 649 4.50 +

4 4 2.5 3-50 3.20 0.230 0 863 1.00 +

5 с J 2.5 3.83 3.50 0.509 <) 424 3.17 +

б 6 2.5 4.11 3.50 0.324 1 0350 4.28 +

7 7 1.25 3.20 3.20 0.141 0 624 1.25 +

8 8 1.25 2.90 2.30 0.087 О 140 0.83 -

9 9 1.25 3.89 3.20 0.267 () 509 3.76 +

10 А-)')№550рен. 2.30 3.50 0.306 0 158 1.00 +

11 Ат)№550цак. 3.20 3.83 0.325 0 324 н.о +

12 неяммун(Ы) <2.0 <2.0 0.034 0.087 <1.0 -

оо

- подсвинков массой 15-20 кг иммунизировали однократно, зарахсгнне проводили через 28 дней адаптированным вирусом ящура а22^550 в дозе 104ИД5о;

** - " + " животное ие заболело, "-" животное заболело;

"** - 1405 частицы вируса ящура А22^550.

Было установлено, что иммунизированные пептидом (142-158)МАР животные 1-й группы крупного рогатого скота (2 головы) были защищены при контрольном заражении гомологичным вирулентным вирусом А22-К!°550. Степень родства антител против МАР-конструкции к вирусу была равна 0.315 и 0.373, к пептиду (142-158)МАР - 0.425 и 0.601. Животные 2-й группы (2 головы), иммунизированные пептидом 141-160, после заражения вирусом ящура заболели. Аффинность антител в сыворотках крови животных 2-й группы была заметно ниже, чем 1-й группы: соответственно с вирусом - 0.087 и 0.141, с пептидом - 0.287 и 0.315. При этом титр АПА, ABA и ВНА у защищенных животных был заметно выше (4,1-4,4 Ig, 3,9-4,1 lg, 10,0-11,0 Iog2 соответственно), чем у незащищенных (соответственно 3,5 lg, 2,9-3,2 lg, 6,2-6,3 log2).

Аналогично исследовали сыворотки крови свиней, иммунизированных VPx-(l42-155)n - пептидом вируса ящура А22-№550, результаты представлены в таблице 4. Было установлено, что существовали индивидуальные отличия в иммунном ответе животных на полимеризованный пептид, но в целом очевидна корреляция между аффинностью антипептидных антител, протективным эффектом и титрами антипептидных, в том числе вирусспецифнчных и вируснейтрализующих антител.

Таким образом, показатель Кдк комплекса антиген-антитело необходимо использовать наряду с другими характеристиками для оценки иммунобиологических свойств синтетических пептидов.

Изучение возможности использования синтетических пептидов для обнаружения антител к вирусу ящура в

сыворотках крови животных Нами была предпринята попытка использования . синтетических пептидов в' диагностических исследованиях. С этой целью были отобраны фрагменты VP[ вируса ящура,

обнаружившие наибольшую антигенную активность: 141-160 (A22-N&550), 140-160 (oj.№194) и 140-153 (Азия 1 №48).

12 3 4 5 Е 7 8 Э 10 11 1213 1.4 1516 171.8 19 20 21 22 2324

_)_1_1_1—1—1_1—1—1—1—1_1—-1—I—1—1—1—■—1—I—1—1—1_1_

Л Б В

г-

Д-

юосхюооосо ООв®ООООООООООвФООООООв® ОС'ООФ0ОО®ФОО0©ОООООО®ФОО ФФООООООООФФООООФООООООО ОООФОООООООООООООООООООО

сооо@®оо®«оо©®ооооооееоо

\ ---. Л Л л

Е

Рис. 2 Обнаружение антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных с применением РИА и синтетических пептидов

1,2 -иммуноглобулины к А 22^550 в разведении 1:250, 3,4 - иммуноглобулины к 0{М194 в разведении 1:250, 5,6- иммуноглобулины к Азия 1 .№48 в разведении 1:250, 7,8 -иммуноглобулины нормальные - N в разведении 1:250,

9-24 - исследуемые сыворотки в разведении 1:250. Антигены: А - VР ]14 1 -160)-нептид вируса ящура А22-№550, Б- УР |-С ! 10-1 60)-пептид вируса ящура 0^\9194, В - УР)-( 140-153)-пептпд вируса ящура Азия 1 №48, Г - 1405-частицы вируса ящура А 22^550, Д - 1403-частпцы вируса ящура 01№194, Е - 1403-частицы вируса ящура Азия 1 № 48, Контроль: Ж - УР 10-24.)-пептид вируса ящура А 22^550.

На рисунке 2 показано, что специфическая активность антивирусных антител в сыворотках крови животных выявлялась в непрямом варианте ТФ РИА как с использованием синтетических пептидов, так и вируса. Специфическое

взаимодействие с контрольным антигеном полностью отсутствовало.

Таким образом, полученные в наших исследованиях результаты свидетельствуют о том, что оценка антигенной активности пептидов - фрагментов УР} вируса ящура разных

типов, качественная н количественная характеристика антипептидных антител в радиоиммуноанализе позволяют выбрать пептиды, наиболее перспективные для создания на их основе вакцинных препаратов и диагностических наборов.

ВЫВОДЫ

1. Изучены иммунобиологические свойства 60 синтетических пептидов - фрагментов V?! вируса ящура типов А,

О и Азия 1 и конструкций, созданных на их основе.

2. Для испытания на лабораторных животных целесообразно отбирать пептиды, показавшие в РИА антигенную активность не ниже 3,0 на естественно-восприимчивых к ящуру животных - пептиды, индуцирующие у лабораторных животных образование АПА с титром не ниже 4,0 1% и АВА - не ниже 3,5

3. Аффинность антител в сыворотках крови иммунизированных пептидами животных, не заболевших в результате контрольного заражения, была выше, чем у заболевших животных. В связи с этим данный показатель необходимо использовать для оценки иммуногенной активности пептидов наряду с определением титра антипептидных, антивирусных и в'нруснейтрализующих антител.

4. Отобраны МАт к 140Б частицам вируса ящура А22№550, 01№194, 01№1б18, С1№564 и Азия 1 №48, пригодные для дифференциации типов вируса ящура в ТФ РИА.

5. Подобраны оптимальные условия постановки радио-иммуноанализа для выявления и определения количественного содержания вируса ящура типов А, О, С н Азия 1, позволяющие обнаруживать вирус, в концентрации 0,1-1,0 мкг/мл;

6. Пептиды - фрагменты УР^: 141-160 - А£№550, 140-160 - 01№194 и 140-153 - Азия 1 №48 - пригодны для обнаружения в РИА антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ: "Методика по применению радиоиммунологического анализа на полиэтиленовой пленке для определения ящурных антигенов и антител", утверждена 23.01.90. и "Методика оценки специфической активности антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных с применением РИА и синтетических пептидов", утверждена 03.07.95.

Даппые по аффпппссти аптптсл в сыворотках хсровп иммунизированных пептидами животных позволяют рекомендовать этот показатель к использованию для оценки иммуногенной активности пептидов наряду с определением титра антипептидных, антивирусных и вируснейтрализующих антител. Методические подходы, использованные нами при анализе антигенных и иммуногенных свойств синтетических конструкций, содержащих фрагменты VP| вируса ящура, могут быть

рекомендованы для проведения аналогичных работ как с вирусом ящура других типов, так и с другими вирусами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Синякова О.Н. Изучение возможности использования радиоиммунологического анализа на пленке для дифференциации типов вируса ящура // Актуальн. пробл. вет. внрусол.: Тез. докл. конф. молодых ученых и специалистов ВНИЯИ и ВНИИВВиМ - Владимир, 1987. - С.41-43.

2. Синякова О.Н., Луговской A.A., Петров В.Н., Рыбаков С.С., Чепуркин A.B., РГванющенков В.Н. Изучение возможности использования радноиммуноанализа (РИА) для характеристики

синтетических пептидов и антисывороток к ним /'/ Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. научн. конф. /ВНИЯИ -Владимир, 1988. - 4.1. С. 19-20.

3. Луговской A.A., Чепуркин A.B., Синякова О.Н., Павлов A.B., Рыбаков С.С., Иванющенков В.Н., Лядский М.М. Синтез и изучение антигенной и иммуногенной активности пептида

141-160 вируса ящура А22 // Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. научн. конф. / ВНИЯИ - Владимир, 1988. - 4.1. С.21-22. -

4. Синякова О.Н., Глобенко Л. А., Иванющенков В.Н., Рыбаков С.С., Кирюхнн С.Р., Молчанова А.И. Изучение моноклональных антител к вирусу ящура Oi№1618 // Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. научн. конф. / ВНИЯИ - Владимир, 1988. - 4.1. С. 55-56.

5. Рыбаков С.С., Ханаева Л.Д., Иванющенков В.Н., Синякова О.Н. Применение твердофазного радионммуноанализа для определения антигена вируса ящура и противоящурных антител // Матер. II симпоз. специалистов стран-чл. СЭВ по пробл. "Профилактика и эффективн. борьба с ящуром, а также создание высокоэффективн. противоящурных вакцин" - София, 1988. - С. 339-341.

6. Рыбаков С.С., Хапаева Л.Д., Синякова О.Н., Иванющенков В.Н., Шажко Ж.А., Фомина Т.А., Камалова Н.Е., Молчанова А. И. Применение твердофазного радионммуноанализа на полиэтиленовой пленке для обнаружения вируса ящура // Ветеринария, 1989. №6. С. 53-57.

7. Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Луговской A.A., Петров В.Н., Иванющенков В.Н. Изучение антигенных свойств синтетических пептидов методом радионммуноанализа (РИА) / /' Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. научн.-теорет. конф. молодых ученых, ноябрь 1990г. - Владимир, 1990. С-.87-88.

8. Петров В.Н., Рыбаков С.С., Павлов А.В:, Луговской A.A., Чепуркин A.B., Петрова О.Н., Лядский М.М., Дрягалин H.H., Кожаева Г.И., Холин Ю.А., Савельев В.Ю., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Синтез и изучение антигенных и иммуногенных свойств пептидов-фрагментов VPj вируса ящура типов А, О

и Азия 1 // Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром). -Владимир, 1992. - 4.2. С.77-93.

9. Луговской A.A., Савельев В.Ю., Петрова О.Н., Чепуркин A.B., Лядский М.М., Рыбаков С. С. Адъюванты для синтетических антигенов // Вопр. вет. вирусол, мнкробнол. и

эппзоотол.: Мах. научн. конф. /' ВНИИВВиМ - Покров, 1992. -4.1. С. 184-185.

10. Петрова О.Н., Луговской A.A., Мудрак Н.С., Рыбаков С.С., Чепуркин A.B., Лядский М.М. Изучение антигеннных и иммуногенных свойств синтетических пептидов VP} вируса

ящура типа О // Вопр. вет. внрусол, микробиол. и эпизоотол.: Мат. научн. конф. / ВНИИВВиМ - Покров, 1992. - 4.1. С. 185.

11. Петров В.Я., Порога O.K., Козаева Г.П.. Рыбаков С.С.. Чепуркин A.B., Лядскдй М.М. Локализация функциональных эпитопов в структуре антигенной детерминанты белка VP}

вируса ящура Азия-1 // Вопр. вет. вирусол, микробиол. и эпизоотол.: Мат. научн. конф. / ВНИИВВиМ - Покров, 1992. -4.1. С.181-182.

12. Луговской A.A., Савельев В.Ю., Рыбаков С.С., Петрова О.Н., Чепуркин A.B. Синтез пептидов VPj вируса ящура А22 и

изучение влияния липополисахарида на их иммуногенную активность // Вирусные и микробные болезни животных. Сборник научн. трудов - Владимир, 1995. - С. 19-27. 13 Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Луговской A.A., Чепуркин A.B. Аффинность антител к синтетическим пептидам вируса ящура А22 // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Тез. докл. Всерос. научно-практич. конфер. 17-21 апреля 1995г. - Владимир, 1995. - С. 17.

отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и научной информации ВНИИЗЖ тираж 70 экз.