Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование моноклональных антител для изучения антигенных детерминант вируса ящера типов А, О, Азия-1

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Использование моноклональных антител для изучения антигенных детерминант вируса ящера типов А, О, Азия-1"

ВСЕРОССИЯОШ Е^ШО- ИССЛЕДОВЛ?£ЛЬСЮ2! ЖЗТИТУТ

ЗАЦИТЫ ливотках

~ "" .-ч ^

11?. правах рукописи * - .. • УДК. 619:578.835.1: 576.8.097

АМИНЕВА Светлана Петревпа

ВаЮОЗЗДгВ ЖЯОКаЗДЯШК ШШЗ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ .ГГГКГЕМГ.'З ££1ЕКЯКАНТ ЕНРУСй ЩУРА ТЙПОЗ А . 0 .ЛЗХЯ1

03.00, Об "ВИРУСОЛОГИЯ"

Автореферат • .диссертации на соискание учено?, степени кандидата бисдогичоск:?*- нзу.<

Едадн«ар - 1953

Работа выполнена во Всероссийском научно-псе ле до а тельском институте зашиты животных МСХ РФ. НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

- МИЩЕНКО Е А. - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник; %

- ГЛОБЕНКО Л А. - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- ЧЕРНЯЕВ НА. - доктор ветеринарных наук, ■

профессор (ВНИИЗЖ, г. Владимир);

- ЧЕРЕДПККОВА Т. Е - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник (Институт биохимии ил Баха РАИ, г. Москва).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Всероссийский научно-исследовательский и технолог: ческий институт' биологической про.лышленкссти, . г. Шэлков< Московской области.

заседании специализированного совета К. 120.60.01. по заш те диссертации на соискание ученой степени кандидата на при Всероссийском научно-исследовательском институте з щиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, .п. Юрьеве ВНИИЗЖ.

С диссертацией шкно ознакомиться в библиотеке Ее российского научно-исследовательского института защи животных. ' ,. дг- г ..

•Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета - Узюмов К

Занята состоится

в 10 часов

«

«

Актуальность тем* С открытием Велюром и йиътштейнлм ' (1975) возможности лрименеяия гибридизации соматических клето.с для получения стационарных клонов гибридных клеток, "гибридом", продуциоущнх монокловальные анти7ела (МАТ), началась ноган эра Часмунологически? исследований

; Первые МАт к вирусу ящура были подучены в 1982 г. (MtCullough е.а, 1982) и с тех пор они широко применяются для длг гногтики забелевший и характеристики лирусных антигенов. Изучение антигенной струкгугы вируса ящура требует анализа ззаимодействгя вирусньтс частиц с широкий спект-; ром антител. .

С испо.тьзоваиигм МАт ухе идентифицировано наличие на ¿ирионе конформационных и линейных (последовательное!ных) ■ эпитогэв, участвующих в нейтрализации вирусной инфикциоп-ности (Barnett P. V. е.а ,1889;Baxt Re.а ,1969;Boíl»el С. е. а,1988; Crowther J. R.. 1987; Kitson J. е. а .1989). Такие данные, кроме научной значимости, находят и прзсгическое применение. Так , например, вы тление и идентификация линейных нейтрагизуюадх зпитопов на поверхьост" вирусигх частиц позволяет отбирать синтетические пептиды с необходимей аминокислотной последовательностью , при разработке п;ютивояпуркых вакцин (Alonso,1931; Aporiolo,lQ91).

Показано, чт) кекэторкэ эпчтопы являются' консервативней для различных'серотклоа вируса зкура. Ранее считалось, 'г:о нейтрализующие эг.ктопы уникальны. Однако, зыяв-лс-кы нейгрализуюзи« эпстслы, об^;е для гетерологкчкых подтипов (Ba-Tiet.,1939). Наличие широкого спектра МАт' и знание структуры нейтрализующих зпктопоъ позволяет усокершезство-вать существующие методы диагностики. Кроме того, МАт к у?1К}садьньп1 эпитспаи мог/т быть использованы ;лн контроля *'- .качества впускаемых вэ.»а*«н s процессе кх производства.

Наиболее детально неучены детеркактлты вируса яву^г Типа.О (Oí ) и типа Л (!.-. Л«)» как наиболее часто

встречах» ¡хеи з 03p¿;k-ncn:v странах . Исследован;!-? струк-

• . ' ■ - 3-

туры эпитопов частиц штаммов 04N194,АггМ550,Азия-1Ы48,ранее выделенных на территории СССР, не проводилось. Для Нас эти. штаммы представляют наибольший интерес, . поскольку используются в нашей стране в качестве производственных при получении противаяшурной вакцины и диагностических препаратов.

Цель и задачи исследования: Основная цель работы - показать возможность использования моноклональных антител к вирусу ящура типов А, . О и Азия-1 для изучения антигенных детерминант вируса кшура.

• Для достижения поставленной цеди необходимо было решить следующие задачи;

- получить ЫАт к 1465 компоненту вируса ящура типа Азия-1 штамм N48 , 125 компоненту вируса типа А (А^ штамм

' М550), синтетическим пептидам, соответствующим фрагментам вирусного белка УР1 вируса ящура типа А (А^штамм N550);

- отработать методы выделения и очистки МАт га асцити-ческих жидкостей мышей; -

- получить коньюгираванные с пероксидаэой хрена препараты МАТ ;

- провести характеристику апитопов., взаимодействующих с МАт, на.поверхности'вирусных частиц типов А, 0 и Азия-1:

a) определить Бируснейтрашиуюцую активность МАт,

b) изучт*> зависимость эпитопов / взаимодействующих с МАт, от конфорыащш-вирусных-частиц,

о) исследовать «огаствительность апитопов к воздействию протеолитических ферментов,

<3) определить локализацию эпитопов с использованием синтетических пептидов, соответствующих фрагментам белка УР1,

е) провести топографическое картирование эпитопов на поверхности частиц вируса ящура. . ■ . . .

Научная новизна: Показана возможность применения ЫАт для антигенной характеристики вируса яшура штаммов А^Я550, О^ И194 и Азия-1 N48, используемых в стране при произ-■ водстве вакцинных и' диагностических препаратов.

' . . " " ' - 4 - . • : .

Впервые получены ЫАт к 146S частицам вируса ящура Азия-1 Н48, 12S частицам вируса ящура htg N550 и синтетическому пептиду, соответствующему аминокислотной последовательности 141-160 белка VP1 вируса ящура AJJ550.

Впервые проведен сравнительный анализ антигенных детерминант на поверхности ящурных вирионов штаммов вируса ящура трех типов. Исследована структура (линейная, конфор-мационная, выраженность на интактных 146S частицах и их производных),определена зависимость функционирования эпи-топов от обработки вирусных частиц трипсином и участие эпитопов в нейтрализации вирусной кнфекционности.

Построена схема взаимного расположения эпитопов на поверхности вирусных частиц типов 0 и Азияг1 для. использования в дальнейших работах по изучению структуры и функций этих эпитопов.

Практическая ценность работы: Для дальнейших исследований антигенной структуры разработана схема идентификации антигенных детерминант вируса ящура.

Оптимизирована методика получения очищенных и концентрированных препаратов ЫАт,"и препаратов, коньюгирован-ных с пероксидазой хрена, которые используются в качестве диагностикумов.

Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. . - продуцент моноклональных антител к 146S компоненту, вируса ящура Азия-1 (положительное решение на изобретение по заявке N5003629/13/157772 от 0J.07.91). Результаты исследований были .включены в : -"ЩД на набор для определения типов вируса ящура в ЙФА на .основе поли- и моноклональных антител",

МАт, взаимодействующие с уникальными нейтрализующими эпитопами, экспонированными только на 14GS частицах, могут быть использованы при производстве вакцин для : " • - контроля качества антигенов разных типов в составе поливалентных вакцин,

-' определения вирусспевдфических компонентов ,

о

- й -

- определения концентрации антигена на дозу вакцина* Использование МАт позволит заменить трудоемкие серологические реакции быстрым, чувствительна и стандартным мето- . дом МА.

МАт, обладающие высокой специфической активностью,рекомендованы для идентификации штаммов вируса ящура; реагирующие с -консервативными эпитипами - для дифференциальной диагностики заболевания.

Нейтрализующие МАт, отнесенные к разным группам, предназначены для дальнейшего изучения структуры и функций нейтрализующих сайтов : /'.ля изучения механизмов нейтрализации вирусной инфекционности; д/я получения мутантог вирус-а, иг бежавших нейтрализации, с цел! ю определения аминокислотных остатков, формирующих апитопы данных антител.

Мйт, взаимодействующие с ненейтрьлизуютгс сайтами, могуг быть использованы для исследований взаимодействуя вирусных частиц с имм/нно;1 системой организма.

Апробация рабсилы : Основные положения диссертационной работы докладывали зь И обсуждались: на Всесоюзной науч-но-техническсЛ конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине " (г. Ни;иий Новгород, 1990); 1сесоюз-нсй научно-теоретической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии "(г. Суздаль, И9Л; на республикански научно-технической конференции "В теринарная мэдицина: экономические,.социальные и экологические проблемы "(г. Харьков,1990); «а Всесоюзной научно-теоретической конференции "Использование достиже-. ний биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (г.НЬ-воси5/рск,199.); на. Первом съезде иммунологов России (г.Новосибирск,1992); на научно-практической конференции "Биотехнслсл ил ветеринарных препаретов'Чг. Харькоь,1993); : нч ученых советах ВН>^И (г. Владимир, 1990-1993г.),.

Гублккацил каучньк исследований: Осноьные положения дюсеггацщ ктражэны в 10 печатных публикации.

- 6 - /

Структур* и объем жжсер/адм : Диссертация содержит следующие разделы: iведение, оозор литературы,собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, с.тисок литературы, .включмщий 109 ссылок на источники литература Работа изложена hi 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована И рисунками и 16 таблицами.

¡оложнхя. внюсмшв на аадеу:

1. Гибридомы, продуцирую дие мон-экдоналъные антитела к 12S частицам вируса ящура А*¿N550; синтетическому пептиду, соответствующему аминокислотной последовательности 141-100 белка VP1 вируса ящута АггУ550; 146S частицам вируса ящург. Аэия-1 N48.

2. Методика выделения моноклональяых антител из асци-тической жидкости мышеи и коньюгирования их с пэроксидаой хрена. ■ _ - , •

3. Схема идентификации антигенных сайтов на поверхности вирусных частиц AaN550, 0^4194 и Азия-1 N48.

4. Характеристика сайтов связывания МАт на поверхности вирусных частиц штаммов Ал<¡N550, 0^194, Азия-1 N48 по их активности в реакции нейтрализации, в различных вариантах ИФА с вирусными частицами гомологичного типа и их произ-ьо/:ничи, на основании перекрестной активности с частицами ге' ерологичных' типов и подтипов, чувствительности к обработке трипсином, активности с синтетическими пептидами.

СОБСТВЕННА ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МШЩЦ.

Антигены. В работе использовали 146S анттен следуюп^х штаммов вируса я'цура: А«, A«, AZJ(M550), O-iСN194 и 1613), Ci (N564), A3lwl(N48). САТ1 (N95).- 12S антиген подучаяи ' кз 1463 антигена кислотным гидролизом. Лия обработки вируса т'ригюикрм к препарату 14CS вируснмх частиц дсбгвлдли раннее количество (по массе) фермента .и инкубировали 1час при 37С. Разрушение вируса до ло.чипептидов проводили нагреванием при 100'С в присутствии 8М мочевины. В работе использо-

вали набор из 22 синтетических пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям белка VP1 вируса ящура штампов AaN550, 0^194, Азия-1 N48. Пептиды синтезированы в лаС. гейетики ВНИИЗЖ. •

Лиши клеток и янвотш/е. Использовали гибридомные клетку, продуцирующие МАт к вирусу яшура Асе, О¿ , Азия!. Гибридомы получали по методике Глобенко JI А. с еоавт(;у$Для' получения асцитической аидкости использовали инбредных мышей линии BALB/c обоего пола с массив тела 18-20г. Для получения поликлональной антивидовой сыворотки использовали кроликов породы Шиншилла' с массой ;тела 1,5-2,0 ,чг. ...

по. ¡уюшю ирепаржх в алтивидошх авг'ите. , коньюгироваи-шх с пс роке идос ой хрена. Донорами антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши, слуялли кролики. Кроликоэ иммушзи-ровали 3-х кратко препаратгш иммуноглобулинов мышц, содержащими 100мкг белка в сочетании с равным по обьему количеством масляного адьюванта Иммуноглобулины выделяли из гипериммунной сывоготк/ и коньюгировали с перокоидазой. хрена методом прейодатного окисления.

Hiмуноферчеитный анализ. При проведении экспериментов использовали непрямой."сандв:1ч",хидкофазный и конкурентно-и: 1гибиционный варианты ИФА.

Определение вирусвей'рализунарй активности ЧАт. Определение вирус..ейтрализугацей активности МАт проводили в реакции нейтрализа'цт по редукции бляшек, которую выполняли на культуре .клеток свиной почки . Вируснейтрализуюшлй титр МАт

расчитывали по методу Рида И' Менча .

• ' •

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Получение моноклональны. анзжел .

Целью данной работы явилось изучение антигенных детер-мичант вируса яшура типов А, О и Азия-1 с помощью монокло-нал! ных антител. Для выполнения этой зад'ач:г необходимо бы-, л) иметь препараты МАт к 3-м типам вируса. 1Шаммы гибридчых

клеток, секретирующих МАт к 116S компоненту вируса ящура типов А и О бы/и полечены во ВЫЖ ранее (Глобенко JL А. и др. .1937,1989). В процессе исследований были п элучены МАт к 146S компоненту вируса ящура типа Азия-1. •

Антитела, полученные только на интакгный виркон, не могли дать полной информации об анти/енных и иммуногенных детпрминёнтах вируса. Поэтому нами были молучены М4т к 12S компоненту вируса ящура Агг , а также к синтетическому пептиду 141 • 160,соответствующему фрагменту белка VP1 A?;N550. Работа проводилась совместно с сотрудниками группы гийрк-домной технологии ВВДШ.

;Активность полученных МАт с гомологичным антигеном определяли в непряшм ИФА. Все МАт нарабатывали в виде аецитических жидкостей мышей. Поэтому, на следующем э'^апе работы необходимо было отработать методы выделения и очистки полученных МАт.

Получение очодеккьк препаратов МАт.

Очищенные препараты МАг шнучали , применяя высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) на анионосбмен-ноП колонке PR01EIN РАС DEAE 5PW и .-чффинную хрсматогр^ию с использованием белок А-сефарозы. .Три проведении эксперимент* было - показано, что наиболее эффективным способом 01ноетупенчатой очистки является использовелие аффинной хроматографии на белок А- сефаюге с предварительным осчд-дением иммуноглобулинов сульфатом а.шогля. Оптимальным буфером для сорбция антител является 1,5М глициновый буфер .рН 8,9 2 ЗМ NaCl . рН элюирующего раствора необходимо подбирать индивидуально для каждого МАт. Процедуру подбора условии элюции мои;о облегчить. . определив подкласс иммуноглобулинов.

Получение прел, фатов UAiv коньюгарсваншх с пергахи-дазой хрена. * .

Как правило, процедур;! коньюгиров^'ия занимают не w-nee 26 часов . Мы ввели ряд модификаций ь ш;:рэко примой л».- •

мую методику Nakamura R., в резул>тате которых время конь-югипования сократилось до 18 часов.. Определение активности препаратов МАт, коньюгированных с пероксидааой по методике Nakamu'-a R. и модифицированной нами показало, что активность препаратов и стабильность при хранении одинаковы .

В результате быхи получены шестнадцать коньюгированных с пероксидаэой хрена препаратоь МАт (коньюгатов) к вирусу ящура типов А , О и Азия-1. Активность полученных препаратов в ИФА бы/а не ниже 2.8 lg. 1оныогированные препараты МАт использовались при установке конкурентного ИФА.а также в составе диагностических наборов.

Изучение антигенных детерминант с использованием мо-

H-jKJíOHójibHbK ант пел. '

Принципиальнее значение иь.еет выявление антиголннх детерминант, связанних с вирулентностью и патогенностью вирусов, с ■ процессами биологической нейтрализации (Crowther J. 1. ,1987). Поэтому, в первую очередь мы выявляли МАт. взаимодействующие с нейтрализующими эпитЬпами .

Определение пейтраяизуктх и аеяейтралнэуищнх сайтов. В процессе исследований былз выявлена неодинаковая зффек-,

тивнссть ясурных антигенов разных типов е индукции нейтра-, • - - <* лизуюцих ¡чтител: девять из десяти полученных на 146S

компонент вируса ящура Агг (90%), 8 из 12 МАт к вирусу ншура Oí (66%) и только 3 из t (37?.) МАт к _тппу Азия-1 нейтрализовали вирусную инфекциошкпть. Индийскпе исследо-Е.тге/ц Butchaín С., и Rao Б. ' (1989) получилл подобные результаты для ÍÍAT к вирусу яцург типа Азия-1 шт.68/73 .Вероятно, это связано с неодинаковой выраженностью нейтрали-" зуюких эпитопов на поверхности вирусных чзгтиц разных ти- : no!, bi одно иа МАт, .полученных.на 12S компонент вируса я.чуга ktí и синтетический гепгид.вирузкеьтрадизующей активное тью (В!(А) не обл:'.дало. '

Оправление асгивгюсти ИАг с еоюжгтнш ти юн ви-'руся я раз/тиьх вариантах Лсследовачия антигенной

. - 10 -

структуры вируса ящура показали, что активность ан^игенних детерминант может в значительной степени зависеть от кон-формации вирусной частицы. МсСиИоиеЬ с соавт. (1985) показали, что способ, с помощью которого частицы вируса ящура 'иммобилизуют на твердую фазу оказывает влияние на активность антител в ИФА. При .непосредственной сорбции на плестикозую поверхность (в непрямом ИФА) прсявллется экспозиция внутренних зпктопэв, .не представленных на на-тивных вирусных частицах. Одновременно, изменяется струк-* тура эпитопов, определяемых конформацией вирусной частицы. Иммобилизация антитела через улавливающие антитела не оказывает такого вхияния на конформсдию вирусной частицы . Наиболее . приближенным .к - естественным условиям оказался жидкофазный ИФА. при постановке которого антитела взсимо-дейс/Еуют с антигеном в растворе (МсСиПсигЬ. 1987). Таким образом, целью наших следующих экспериментов было определение активности МАт в различньх модификациях ИФА для определения зависимости эпитопов МАт от конформ'-ции вирусных частиц.'

Проанализировав взаимодейтвие МАт к вирусу яшура типа А, мы отметили значительную разницу в активности антител с /гомологичным'вирусом в различных вьриантах ИФА (таблЛ). позволило разделить исследуемые антитела на 3 группы. Антитела 1. группы, в которую вошли нейтрализующие МАт 2А4, 4, 6-2, взаимодействовал л : конфэрмационно-зависимым эпитопом , полностью разрушающимся при сорбции антигена на пластин • ; , . •

Антитела второй группы АШ.А2А2. А2Д2, А7А;2 , нейтрали-•зующие вирусную инфекционность, также взаимодействовали с ' конфоруационно-зависимым зпитопом.- Однако его зависимость от конформации была выражена слабее, чем у. зпигопа 1 труп. гш, .поскольку .антитэла .этой группы пзамэдейстповали с ви-. русом в непрямом варианте ИФА намного слабее, чем в "сандвич" и жидкофазном.

Ангитела 3 группы , в ¡сотсрую вошло 1 МАт, полученное

Таблица 1. Характеристика МАт к вирусу ящура А^N550.

МАт

ЕНА1 Активность в различных вариантах ИФА (1г)

I

Гсандвич" 1иид-1 конкурвн-1 У

I ' 1кофа1 тно-ингк-1 П

i . 18ный1 биционный! п

.!___II' I А

1485 146-Г 123 ПШ1465 145-11146311465 143-Г1 ' '__.1_'_I_1_____1.

К 1463 А1гН550:

4 " + 2,1 0 " О 0 4,2 3,5 4,2

е-2 +2,1 О О 0 3,5 3,5 4,2

2А4 + 1,4 0,0 0 3,5 3,5'. 4,9

2;б* 2,6

2,6

О

О О

А1Д4 + 2,8

А2А2 + 4,2

А2Д2 + 4,2

А7А2 + 2,8

1,4 1,4 О

2,8 2,8 О

2,8 2,8 О

1,4 1,4 О

3,5 4,9 4,9-' 3,5

3,5 3,5 2,6 2,6

4,9 4,9 2,2 2,4

4,9 4,9 2,4 2,5

3,5 3*5. , 2|9

2 и

к 125 А22Ы550:

АВ4 -0 4,2 4,2 4,2 . .2,8 2,8 2,8. 0 0 0 3

4В2 - -3,5 4,2 >4,9 2,8 2,8 2,8 . 0 • 0 0 1«

4ЕЗ - 4,2. 3,5 >4,9 2,8-2,1 2,8 /О,- •о.. • 0 »1

5В4 - 4,9 4,9 >4,9 2,8 2,8 2,8 о • 0 ' 0 *«

504 - 2,8 2,8' 2,8 2,8 1,4 1,5 0/ 0 0 <1

4А5 - 2,8 2,8 4,2 2,8 1,4 2,8 0 0 0 з'

4В4 - 4,2 4,2 >4,9 2,8 2,8 £ 8 0 0 0 II

4Д5 - 4,9 2,3 >4.9 2,8 2,8 2,8 0' ' 0 0 •1

1

и

* - величины обратного разведения антигена, дающэго ,5йХ ингибированин реакции со 1463 компонентом.

на 146S компонент-вируса ящура А^ и все' антитела к 12S компоненту, взаимодействовали с внутренним линейным эпито-пом,.наиболее выраленным на вирусных частицах, сорбированных на пластик.

Антитела, полученные на вирус ящура типа О, в различных вариантах ИФА также проявили неодинаковую активность (табл.2). . МАт 2Д2, 7Дб,1дЕВ5<ГБЗ .нейтрализующие инфекци-

Таблица 2. Характеристика МАт,полученных к вирусу ящура Ог

MAtI ЕКА I Активность в различных вариантах ИФА (Is) 1 Г I I I______I Р I

I I непрямой Г'сан1жид-1 конкурентно- I У I

II 1двич1кофа1 ингибиционный I П I I I I 1зкый1 I Л I

I !______1_I__I__I А I

I 11465 146-Т 125 ПП1146S11¿651146S 146-Т 125 I I

I

2Д2 + 4,2 <1,0 2,8 2,8 .5,6 4,9 2,5* 1,4 G • 1

7Д5 ' + 4,2 1,4 1,4 1,4 3,5 3,5 2,1. 0 0 II

4Д5 . + 4,9 <1,0 2,1 1,4 3,5 2,1 2,0 1 0 ■. 1«

ГВ2 + 4,2 3,5 0 0 3,5 2,1 2,6 2,3 0 2

Г35 + 4.9 4,2 0 0 4,9' 3.5 1,7 1,7 0 И

ГЕЮ >4,9 4,2 0 Я 4,9 3,5 2,1 2,3 0 К

гв:4 + >4,9 4,2 0. 0 4,9 3,5 1,7 1,7 0 - V»

19ВВ5 + 4,9-4,9 4,8 4,8 4,9 •4.2 2,3 2,3 •0 3

БА4 ■• - 3,5 2,8 С •0 2,8 1,4 2,6 2,5 2,3 4

ГА6 • - 2,8 3,5 0 •0 2,1 1,4 2,3 п п 2,3 (1

17Д5 - <-j Щ о ц 0 0 ■1,4 0 2,3 2,С 0 и

V- ig величины обратного разведения аптягенз, дачщ/гго 5Qt ¡;нг::б1:;:оГ'Зк;!Я реакции со 1453 кокпонечтол - -

онность вир/с'а, распознавали лилейный эпитоп,.' поскольку' активность этих антител во всех вариантах ИФА была одинакова . МАт ГВБб, гв:4, 4Д5, ГЕ2 .нейтрализующие, также распознавали линейный эпитоп. Поскольку антитела этой ' группы наиболее активны в непрямом ША, мы предположили, что ка поверхности нативной вирусной частицы этот эпитоп ч?стично маскируется конформационными складками. Антитела, не активные в реакции нейтрализации,' также как ненейтра-лизушще МАт к вирусу типа А,, взаимодействовали с виузрен-h:im элитопсы, недоступным для антител в растворе.

Изучение взаимодействий МАт» подученных к вирусу яиурп Агпя-1,в различных вариантах №. с гомологичным вирусом i-ггол;:ло выделить толькс одно антлтело 1В4, взаимо-^яотиукщге с линейным зпигопсм (Табл.3). В реакции нейт-гйлизтдг..! 5то ант гсело' не нейтрализовало вирусгун инфекци-,смнссть. Эпитопы остальных МАт - нейтрализдвдх A4, 1А13. 1А14 и ненейтр.1лнзующих 2АЗ,2В4,2С4 и 2Д2 - конформагион-, •нс-зависимыэ, при сорбции вирусных частиц на пластик ак-, тивкость МАт с этими эпигонами значительно снижалась. Необходимо отметить, что нейтрализующие МАт активно взаимодействовали с антигеном в жидкофаэном варианте И5А.

Таким образом, нейтрализующие МАт к вирусу типа А распознавали 2 кшформационно-зависимъэ: сайта, антитела к вирусу'тип: О взаимодействовали»с линейными нвйтрализущи-koi сайтами, МАт к вирусу' ящура-типа Азия-1 в-различных вариантах ИФА -распознавали один тлкейны 1 и два.конформацион-ных сайта •■ на поверхости вирусных частиц гомологичных • типе в. .•

¡'яэииодей^твие МАт с гоъюлагтяш ттнгенаи и его производным . фш выяснения характера ¡^информационной зависимости 'мы определяли активность МАт с различными произ-водкыми 146S частицы гомологичного вируса .

Изучение активности в непрямом,-"сандвич" и конкурент-но-йз.гпбкцпокком вариантах 'JKA показало (тавл.1 ),что эпи-толи к вирусу ящура типа А .отнесенных ргнее к первэй'

; ,л. - 14 - , -

Таблица 3. Характеристика МАт .полученных к вирусу ясурз Ааия-î N40. *

MAtI.EHAI Активность в различных Еариактах ИФА (lg) I Г

I___

1 непрямой I___Ц.

I146S 146-Т 12S I__

A4 +. 2,8 2,1 <1,0 <1,0 1А13 + 2,8 2,1 <1.0 <1,0 1А14 + 2,8 1,4 <1,0 О

_.__5_I Р

Г'сандЕич'Чжкдксфазный I У

I_!___I П

I 1453 Г 1463 I П

.1__1___1_А_

1

4,9

о с

и, и

4.2

4,2 3,5' 3,5

134 - 2,8 3,5 4,2 2,1 2,8

0

2 A3 - 2,8 0 0 <1,0 3,5 О

,2В£ - 3,5 <1,4 <1,0 <1,3 4,2 О

2С4 2,1 <1,0 <1,0 <1,0 2,8 . О

2Д2 - -2,3 <1,0 О О V. 3,5 О

I

VI

3

И

группе,экспонированы только на интактных вирионах, т.е. являются 146S-с'пе цифичными. По-видимому, они формируются при сборка 1453 части!-, из 12S, пентамэров . Эпитспы связывания антител 2 группы выявлялись на 1453 и слабее на 125 субъединицах . Антитела 3 пуппы взаимодействовали,пс- видимому, с 12S специфичными'эпитопами, поскольку проявляв: наибольшую а-стивность с 123.субъединщами. ' MoÇullou^n с соавт..(1987) описали подобный эгштоп на вируснчх часгиггзх типа 0 , a Robercsôn с соазт. (1984) идентифкцярона с:: тут рекний, '123 сявгдфг-шый ?питоп• с использованием Мат ченньгх к вирусу яау.эз А12. ;

Определение ачтивкости МАт к вир/оу ящура та 0 пс?-волило зьтелить 1 ликэйкый зшггоп на no-iif/носги злуускь:: частиц," ;взаиюдейгтвущий с антителом 19ЕЕ5- (табл. 2). Af

тивность этого антитела со всеми производными 14SS компо- .. нента Шла одинакова. Stave с совет. . {1986) и Xie .с соавт. ■ (1987) идентифицировали подобные•линейные эпигоны ка поверхности част mi вируса ящура ■ штаммов Q1- BFS и 01 \ . Switzerland 1965," • ^ .'"

.' Эпитопы МАт £Д2, 7Д6 и. 4Д5. выявлялись на всех производных 146S компонента , однако нагого слабее, чем на ин-тактном вирионе* По-видимо ¡г/, эпитопы этих МАт в опреде- * .денной степени зависят от ' -кснформации "вирусных частиц.^ Эпитопы связывания нейтрализующих'МАт РВ2, ГБ6, ГБЕ5,Г£С4 и ненейтрализующего 17Д6 выявлялись только на 146S частицах/ Актятеда ВА4 'и ГА6 взаимодействовали с эпитопами, on- -ределяемыми кояфсрмацией 1455 и 12S субъедкниц. .

Таким образом, эпитопы связывания МАт к вирусу ящура ■ типа . 0 , за исключением Mat 19ВЕ5, в той иди иной степени зависят от кэнформацки антигена. Такую зависимость от кон-формации частиц можно объяснить, используя данные рентге-. но-структурнсто анализа частиц вируса ящура . Показано, _ что бс-лки VF1 и VP2 вирионов типа 0 , в отличие от типа. А,имеют между остатками Cys в позициях 134 и 130. соот-' ветст2-нн0 дополнительную дисульфйдную связь (Acharia R. ,1990). Это приводит к стабилизации конформационной структуры вирусных частиц. Ш-Екдимому, сорбция на пласти- . новую поверхность значительно слабее изменяет конформацию частиц типа О по сравнению с, типом А. Вээтому активность 1-5Ат к вирусу типа А намного, сильней зависит от -способа иммобилизации антигена при постановке KSA.

Изучение-взаимодействия . Ют к вирусу , явура типа Аэкя-1 ■ с различными производными 146S частиц показало,что только один, линейный, гпитоп МАт 1В4 выявлялся на' всех ■ производных J46S .компонента (табл. 3); По-видимому, он оп- . р&деля<?тся ' первичной аминокислотной последскателькостью•' вирусного белка. Эпктопк остальных МАт, определялись конфор-мацией интахных вирусных-частиц. '.-....'■

Б результате многочисленных исследований показано, что

на функциональную активность - зпитопов оказывает влияние обработка вируса различными лротеолитическими ферментами, такими как трипсин (ЗЁгсЬпшег К., е: а ,1982). Изучая влияние трипсина на интакгность эпктспов частиц вируса ящура, ■можно определить локализацию апитспов на УР1, а также взаимосвязь эпитопа с сайтом прикрепления к клетке .

Наши исследования позволили выделить 3 сайта на поверхности частиц вируса ящура типа А. Первый полностью разрушался при сорбции на пластик, обработанных трипсином 1465- частиц (146-Т), однако в растворе его зкепс-зишя не изменялась. Активность МАт ко 2 сайту в непрямом ИВА снижалась на 50% , однако, в конкурентно-ингкбиционном КФА она не изменялась по сравнению с активностью со 1465 компонентом. Повидимому, участок взаимодействия с трипсином не входит в состав эпитопов данных антител,' однако он оказывает , влияние на ' конформацию этих зпитспов. Антитела 3 группы взаимодействовали с трипсин-резистентным эпитопом.

Антитела к" вирусу яшура типа О проявит неодинаковую активность с обработанным трипсином вирусом. МАт 19БВ5, БА4, ГА6, 17Д5, ГБ2, ГЗб, ГБВо, ТВС4 (2,3 и 4 группы) в непрямом и конкурентно-ингибиционном ИФА с одинаковой активностью взаимодействовали с инт-актными и трипсин-обраб?-■ танвыми вирусными частицами, т. э. эпитопы. зтих анител являются трипсин-резистентными. . Антитела 1 группы не проявляли активности с трипсинизированным вирусом. Сайт взаимодействия с этими .антителами разрушался при воздействии фермента на вирус и расположен-, по-видимому, рядом . или является участком прикрепления к клеточной поверхности.

Вишшит унккальшлк и новеервативных сайтов . Ндк показано зарубэжныш' исследователям!, на поверхности вирусных частиц присутствуют как консервативные.'т.е. обцие. , так -и уникальные^ Характерные для отдельного типа' пли штамма, вхфуса яшура эпитопы (Сго'ЛЬег ,1987); Для вы-• явления атих зпитопсв _ ш -опрвд-^лйта г.^рекрёсткун ьктиг-.ность МАт с различны»,ш типами вируса яяура ь н*пряисы

' ' ' . - ''-"17 . - "'

. МАт , . полученные на 1153 вируса ящура 'А , . отнесенные ранее 1 групг"?, ,по акт;шноети' с ге'терологичньш!. "типами . -мы разделили на 2 подгруппы. МАт 1а подгруппы. (4 и 6-2)' . раапоанавали уникальный' сайт, на поверхности част.щ гомоло- 4 гкчного подтипа 'А . Одно МАт 2А4.(1в;подгруппа) взаимо-. ;' действовало' с 'одинаковой активностью с частицами. тилор . А (А^) и О £00. 2 груша ЫАт А1Д4," А2Д2, /2Д2, А7А2 реагировала с уникальным,-', характерным только, для частиц - А .сайтом. МАт ■ 4Е2, 4В£, '5В4, 504,'полученные на 125Л"

компонент , взаимодействовали с частицами типов А .(А^, и А? ) и Азия-1 ..( группа.За) . . Ангите-ла Зв подгуппы 1А5, 4Ь4, . 4Д5 взакмо действовали со всеми исследуемыми типами (А, 0,. С,.Азля-1 и САТ-1), распогнаЕая выеоксконсерзаткв-

ный эпитоп.

Игучение перекрестной активности МАт к вгрусу я дура . тштс. О показало, что все-они. распознают уникальные для типа 0 эпитопы. МАт 19ЕВ5 ввг_имодей-.:::вовадо только с :;ир':о- 1 каш подтипа-0}, остальные л£Ат-- с вирионами подтипов, 0] и

Ое- . ' ■" ' : .

'Анализ тшгоспецнфичнссггк' МАт , к вирусу ящура- типа Дач к-1 показал, что .нейтрадизувшие ЫАт.ваанмсгдейзтЕовали с ггзиопами, гьквлке:&нли только на гомс№г"ичном антигене, т. е '{5ьии типоепецифични. Гз-видигосу, -нейтраяигуЕВ^я детерминанта вируса кщ/ра т!.та Азия-1. так*;? как 5р.:ышнетЕС 1шй,рализую,дк>: детерминант В1фуса тиков А и О , является уникальной . .Некейтгащ;зуйШ5:е МАт 2АЗ, 2В4, 2С4 и 2Д2 перекрестно реагировали с частицами типов А и С. Ш.Т гЕ4 ьзгиаъдейгхвовалр со ~;ем'к исгледован^гыми типами вируса. Э?с> актитело,- по-ы;димом:л распсгнаб-т гысакоконсерватизпый г-питоц. _

А;опза А.' а соагт. '{1951.) посзади; что н^йтралнзук^е' 5Э2Ш?д?-йстпуг'4ие с: ; кикальнь'-о{ неП'грг.д;<.зуюцимн -¿пл-тозаки, могу: бш->. король Е-овгик для контроля качества кяк и:-*.-, г ж и ¡юлагалекг.ч^' вгчапг в процессе ярсиоводетза. •• & антител.-». раслогканаке такие апитоцы на по-

верхности частиц вп::>уса яшура А2гМ550, ,0^1194 и Аэия-1 N48 могут быть, рекомендованы для использования при производстве вакцинных и- диагностических препаратов.

Локализация amovaos на вирусной белке VP1 явилась следующим зтапо!/ работы . Одним из способов определения локализации эпитопов явл;этся постановка различных вариантов ИФА с использование)« синтетических пептидов в качестве акгпгзнэв (Parry N. R. е. а. , 1'.}37).

Из всех исследуемых МАт к вирусу ящура тина А, только сдно нейтрализующее МАт 2А4 взаимодействовало с пептида¡.з». Активность зтого антитела, перекрестно-реагируюЕгзго с час-типами типов А и Q , со смесью синтетических пептидов (СП) (173-189) А.дИ (1 Зо-152) Oí не отличэлась от актизнсст.! с на:ивныыи вирусньвлк частицами. Акалиа аминокислотной последовательности облгсти 135-152 VP1 этих двух типов вируса показал, что гомологичные только для 2-х типов.А и О апшоккслотные остатки (i. о.) расположены в позициях 151-152. . Последовательность 175-189 включает несколько участков гомологии. Таким образом, а. о. в позиции 151-1С2 (Leu-Ala) и а. о. области 175-139 , по-видимому, формирувт эпитоп данного антитела.

Более точно локализовать эпитопы нейгрализуших антител можно только после получения вариантов вируса , вбежавших нейтрализации , и секвэнированпд' генов структурны:-: белков этих вариантов-

Сстальные Мйт, полубаке к вирусу ящура типов А и О , не взаимодействовали с е^еотг-йС-киш пептидами в неп;:нмс-м КОА. что,по-видимому связано -с высокой степенью зависимости эпитопг'в этих МАт от аснформации вирусных чз^гиц (Parry N. R. .¿. а ,1989). Особенно это характерно длг- -гг.* '¿>.

- 1фк 'изучении взаимсдействия МАт ', полученных к вл: яд;,фа тш'.а Азия-i. i синтетически.с* пептидами было а-

что нейтрализующие !.1Ат ззапмод'йгтвсвгдк с педгл.: соответствующими 140-153 и 133-203 г. Q. 7-1 вируса лзура Агия-i,- Это позволило предположить, что нейграл^зутслпе

• ' ■ . , : • * - 19 -

гшпопы частиц вируса ящур? Азкя-1, также как типов А'и О. . (Ргггу V. е.a. 1935;Saiz j.е.а. ,1983) . формируются'-двумя областями VPi -140-1Б0 и С-концевым участком. 193-208...

. Бее ненейтрз^шзующиэ МАт • взаимодействовали ' только с v пептидом 140-153. " Вероятно, аминокислоты этой области'принимают. участие в'формировании эпитопсв данных MA'.'.

Локализация эпитопа МАт ,1В4 согласуется - с данными о присутствии высакококсервативного трипепт.гда Arg-Gly-Asp .внутри гиперварйабельной области 140-150: во-пёрвых, это-J антитело г35иьюдействует со'.всем» Типами ЕИруса, . во-вте-рых,взаимодействует с .пептидами,' со^ветствующкш _этой об-' ласти. .. Вероятно, МАт ДВ4 связывается, с данным трипептндом, и он полностью или частично, входит, в.состав зпитопа ханно- ' го антитела. - 1-

Та:жм образом, - на'.поверхности..частиц вируса ясура~А22 было выявлено шесть сайке связывания:-МАт, Oi - четыре -и . Азпя-1- три сайта взаимодействий с ! Ат.

Оиреде -¡зяю вззчияого риатжгсиш апнтопов Мт, формирующих эти сайты, стало следующим1этапам работы. Топографическое картирование эпигонов проводили в. конкурентном КОД При постановке, конкурентного ИФА с МАт .,,пслученными к вирусу ян ура типа А , быш отмечено, чте .вопреки ол-идз- . емому икгибированию свяеьп'щия мМАт в присутствии нбь.эченньз-, наблюдалась етшулдцил лзхзыв&нпя меченых МАт с Lirp/екыми частицам. Подобный отмечали некоторые

исследователи на" моделях других вирусов • (Матвеева H. JL , 1S87).'_...

По результатам постановки .^оккурелтнето ИФА с- использованием МАт к вирусу ятура 0 бала лостроенз схема взы'-М-■ ного распслслйиия ьпитопов на гое-рхкости вирусных частиц типа С . ' Кейтраж»увд:ё антитела формируют нейтрали-5уюалй • ¿.омея и?, пг-вб-рхчости ьируо^х частиц, состсящШ из перек-ркззкгскс? или й^екоргеполохб-нных эпитопов связывания с sef:: ралчзуацыми анти-^елалч1..1 Оки. взаимозависимые, дрякрел-ленлг j-jx'oro. îid .этих г.нтител более чем на (¡ОЛ п;сц--ктоз

v. - 20 - \ "

снижает активность других зпитопов.'

Определение вазимного расположения зпитопов на.поверхности -вирусных частиц типч Даия-1 показало . что эпи-топы нейтрализуют;::: МАт.так же как на частщах типа 0, на поверхности вприонов формируют нейтрализующий домен. Однако, в отличие от типа 0, з состав этого домена входит эпитоп ненейтрализующэго МАт 1Е4.

Б предыдущих исследованиях было показано, что МАт к 125 компоненту, отнесенные к.Зв rçynne (4А5,4Е4,4Д5) и антитело 134 к 146S' компоненту вируса ящура типа Азия-1 п:о- ^ являли одинаковую специфичность. Поэтому най интересно было выяснить, распознают эти антитела'разные сайты на поверхности частиц или элин.

При постановке конкурентного ША было отмечено, что связывание' коньгагата 1Е4 в-присутствии антитела 4А5 (группа Зв) не только не ингибировалось, а, наоборот, усиливалось с вирусным частицами осоих тлпов. То есть, наблюдался эффект,- аналогичный описанному для типа А. Присутствие не-меченкых" актител группы За не отражалось на результатах реакции.

Таким образом,результаты экспериментов свидетельствуют .о наличия"на 12S частицах по,меньшой мере 3-х сайтов : два из них являются консервативными и присутствуют на 125 частица:: всех исследованных типов (заявляются МАт 1В4 и МАт 4А5,4В4,4Д5) и один экспонирован ка вирусных частицах типов А и Азия-1 (МАТ 1В4,4Е2,4ВЗ,5В4,5С4).

■ Изучение свойств ЧАт, получению. . на . сиятеттьсияй пептида показало, что последовательность 141-160.белка УFl вируса Агг включает в себя по меньшей мере 4 сзЛта связь-, вания с МАт,. однако,' ни одно из полученных МАт яе e??,;:v. дйлствойало со 146? част:.и;ами вируса Ящура-'А^'а Это. вероятно" , объясняется Iем, что на поверхности вирусных частиц конфоумацпя svöi'ronos строго определила, а пептиды в растворе могу г- пришил."») различные конформаииогные фс-ptx.

• ' ВВОДИ ' . t.. ';.;.'.-

1. Проведено изучение антигенных детерминант- вируса •ящура с помощью моноклональных антител, полученных к 146S и 1Й частицам вируса-ящура АдИбБО, 0^194. ' Азкя-1 N48 . .

2. Разработана схема идентификации антигенных детерми-' нант вируса ящура; предусматривающая характеристику сайтов связывания моноклональных антител по их активнрсти в реакции нейтрализацию! и различны* вариантах иммуноферментного анализа .

3. С использованием моноклональных антител на поверхности частиц вг.руса ящура A^N550 идентифицировано пять сайтов связывания МАт;, нэ поверхности вирионов 0{ N204 выявлено четыре сайта взаимодействия с моноклональными антителами; ка вирусных частщах Азия-1 N48 выявлено, и охарактеризовано три антигенных сайта связывания МАт. построена схема взаимного расположения эпитопов на поверхности вирусных частиц 0iN194 и Азия-1 N48.

4. На 12S частицгрс вируса ящура А^550 идентифицировано 3 различных сайта связывания МАт, -два"из которых являются высококонсервативными и экспонирозакс на вириона:: вируса типов А, О, С, Азия-1 и САТ-1 .

5. Получено девять клоков гибридных клеток, акретирующих моноклональные антитела к 146S частицам вируса ящура типа Азия-1 .семь - к 125 частицам вируса ящура Адат. N550, пятнадцать - к синтетическому пептиду 141-160, соответствующему фрагменту белка VP1 вируса ящура A2iN550. , ,

6. Разработана методика получения очищенных и кош ект-"рированных препаратов моноклонсшыь'х антител из асцити-.

ческнх *идкоотей и коныопрования их с'перэкочдазой хрена для использования при изучении антигенных детерминант вирус'. ящура трех типое' ( А ,0 ,Азия-1) и комплектования д.1-.; агностических наборов.

ПРАКТИЩ-ОШЕ ПРЕДЛСИШНИЯ .

' 1/ Разработаны*и утверждены директорам ВНИИЗЖ:

- "Методика' выделения моноклональных антител из зсци-тических дащкоот&й мышей г использованием аффинной хроматографии и их коньюп рованне С( пероксидазсй хрена", 13.11.1993.

- "Методика идентификации антигенных сайтов на поверхности" частиц вируса ящура с использованием моноклокалььих ант шел в иммуноферментном анализе", 15.11.1993.

2. Материалы работы были использованы при составлении: -"НГД ^а набор для определения типов вируса 'яшура ь йЕА па основе поли- и моноклональнцх антител",

- паспорта на "Штамм гибридные культивируемых клеток животных Mus Musculus L. - продуцент моноклональных антител к 146S ксмпсн:н?у вируса яшура квт-1" по заявке на изобретение N5003629/13/157772 от 01.С7.91.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Аминеза С. И , Давыдова Е Л., Глобенко Л. А., Изакю-еэнков В. Е, Перевозчиков Б. А. Оптимизация условий аффинной хроматографии мышиных моноклональных антител на белок А-сефарозе. //В кн.: Акт. вопр, вет. вирусол.: Тез.'докл. конф. молодых ученых ВНИЯК - Суздаль. 19Э0, с. 57-5S.

2." Давыдова EJL , Амикева -С. IL , Кирюхин С. Р. ,. Глобенко Л. А. конкуреиг-шй анализ-связывания моноклональных антител с антиген-ми- вируса яшура Ot. //В кн.: Акт. vcnp. нет. гп-русол.: Тез-, докл. Молодкх*-учёных ВЕИШ. -Суздаль, 1990. с. 53-33.

3. Глобенко Л А. „ - Давыдова Е .1 , Аминева С. IL , водчиков.В. А.,. Бурдеа А. Е Анализ антигенных •детерминант, .вируса ящура ¿¿р помощью моноклональных антител.// В

■Вет мед1;цкна:-эконошческие, социальные -экглсглческ;^ проблем:.: Тез. докл. конференции - Харьков, 1990,с. 255-255.

• 4. Гдо?знко Л. А. , Давыдова IL Л. , Клрнхин С. ?. , А;л-:-:г-га С. П.,. Нзанющенков. 3. Е , Худяков, Г. к. ,Вурдоз А. Ы

- £3 - :

н»е. основной нейтраиизухщ&й .детерминанты вируса ящура О с. помощью мо'ноклональных антител.//В'кн. : Современные проблемы -иммунологии, биотехнологии, генной и клеточкой икжене- % рки в 'ветеринарной медицине. : Тез. докл. конференции, -amtmîr Новгород, 1990, с. 31-32.

5. Давыдова Н. Л., Амкяева С. П. * Глобенко Л. А., Мамаг-кулова -Л. У., йганшэиксв В. Н. Активность противоящурных -'мсноклоналъных антител в различных вариантах, иммунофер-ментного анализа. //В кн. : Современные проблемы иммунологии, 'биотехнологии. генной л клеточной инженерии в ветеринарной медицине: Тез. долл. конференции. - Нижний Новгород, . 1990, с. 37-38. . ••. * • "'.

6. Глобенко Л А., Давыдова H. JL , Йванщзкков 2. Е , Амикеза С. IL , Паревозчиков В. А., Вурдов А. Е Анализ антигенных детерминант вируса ящура А с поколью моноклональных. антител.// Иммунология, 1951, N1, с. 66-68.

?. Глобенко Л. А., Красоткина А. С. . Кирюхин С. Р. , Амине-за С. IL ■ Ззстосування мсноклональких ангин л . при рсаробц» молекулярно-бюлопчных метод!в вивчення '.' структури enircnis вхрусуншура С ..//Тез. докл. научно-практической конференции ■ "Биотехнология • ветеринарных. препаратов. "- -Харьнон,1993, в печати. : -

8. Шажко Е. А. , Глобенко JL А., Давыдова К' Л. Камзлова" Е Е,, Карпова Е П., Кирюхин С. Р., Дуднккова Е. К., Аш:нева С. П., Маыаткулова Л.У. ■ Розробка наборов , для ^выявления. Eipycy ■ с-а дэпомогого 1ФА на ochobî шно- i-no.niклонадьних •aswrriaL /VTc-з. докл. лаучяо-прантическоЛ конференции "Вю-' , аехнология ретерйкаркчх препаратов.и - >&рьког, • .1S93, ;в

■ печати ''.*.'.' ' . '

9. Глобенко Л. А., -Киргайш С. Р.,Амкнева С. П. , Давыдова.; Н. Л , Перевозчиков В. А., Луговской -А. А., Рыбаков С. С. Мо-нокленальные антитела на синтетически пептид - фрагмент VPi вируса я аур а А , / -"Тез. докл. I ' съезда кммунелогсЕ'-Росой:. . - Яогос-иблрск, -23-25 аж, 193£г. -Новосибирск, 1992; •3.107-109. ■ •

- 24 -

10. Глобенко Л. А. , . Маматкулова Л. У.. , Белокспытова А. Ф., Давыдова Е Л,, Аминева С. П. , Молчанова к. И., Баранов С. Г., Бурдов А. Н., Худяков Г. А. , Спирин В. К. Положительное решение .на изобретение: "Штамм гибридных культивируемых клеток рвотных Шз Мияси1из Ь. - продуцент ' моноклональных антител к 1433 компоненту вируса яшура Азия-1."- по заявке N5003629/13/157772 от 01.07.91.

М-/А

(Ж^. :

3 с.'к \ЬЛ£5