Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящера А22 и О1

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящера А22 и О1"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ .

! ■: Г1 . ВСЕРОССИЙСКИЙНАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ '

На правах рукописи

ЛУГОВСКОЙ Андрей Александрович

.УДК 578.112.083.3:578.835.224:615.371

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ -- ФРАГМЕНТОВ УР1 ВИРУСА ЯЩУРА А22 и О,.

' " 03.00.06. "Вирусология*

АВТОРЕФЕРАТ " . диссертации на сонскрние ученой степени, кандидата биологических наук

г. Владимир, 1923 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных ГУВ МСХ РФ.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: РЫБАКОВ Сер! ей Сергеевич

кандидат £: логических наук, старшин научный сотрудник,

ОФ»!иИАЛи! 1УЕ ОППОНЕНТЫ:

Чь!"!Мп£В' Ю.пий Александрович, доктор ветеринар-1(1(1 л я,!1.^. профессор.

- ![[;.;Г)АпОг1 Сопиом ЖампАноьич, кандидат оиологичес-' кия наук, с гагииий научный сотрудник. #

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно- ■ 'иоопеаовагелпокии и геммологический институт биологической промышленности РАСХН, г. Щелково Московской области,

Защита состоится "л^г апреля 1303 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 120. 60, 01, по защите диссертации ' на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно- . исследовательском институте , защиты животных по адресу: 600900, г, Владимир, пос. Юрьевен,'ВНИИЗЖ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института оаши-V. животных,

Автореферат разослан марта г.-

/ченьи -секретарь специализированного аовета - Узюм-ов В..Л,

-11 ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

• Актуальность темы. Ящур является одним из наиболее опасных заболеваний животных, что осязано о контагиозкостью, широким кругом хозяев, антигенной вариабельностью возбудителя и рядом других факторов, В нашей стране основное мерой борьбы с ящуром является вакцинация'животных с обязательным выполнением ветеринарно-оанитарных мероприятий, "акаины, полученные классическими методами из целого вируса, имеют ряд серьезных недостатков. Некоторые штаммы вируса не удается получить в высоких титрах, вирусные частицы очень чувствительны к воздействию физико-химических факторов, например, к температуре, поэтому вакцины, изготовленные на их основе, необходимо хранить и транспортировать в рефрежираторах. Такие вакцины содержат значительную долю примесей, которые часто оказывают побочные эффекты при введении животным, особенно при ревакцинации. Наиболее серьезным недостатком протизо-ящурных вакцин, используемых в настоящее время, является опасность возникновения заболевания в случае неполной инактиваций вируса, Перечисленные выше и другие недостатки вакцин, изготовленных из целого вируса, побуждают к проведению иссле- ' дований, направленных на разработку п-ротизоящурных вакцин на основе синтетических пептидов, имитирующих небольшие участки капсида вируса ящура и способных вызывать у животных образование вируснейтрализующих антител в количествах, достаточных для защиты от ящура. Такие вакцины, в случае их получения,-будут лишейы основных недостатков, присущих классическим вакцинам. •

В начале 80-х Годов появились первые сообщения о синтезе пептидов, представляющих антигенные детерминанты вируса ящура, и изучении их антигенных и иммундгецных свойств. Публикации, появившиеся в литературе за последние 5 лет, указывают на. то, что.исследования в .этом направлении интенсивно ведутся1 в ряде институтов, занимающихся проблемой ящура.

Цели и збтчи исследований. Основной целью работы являлся синтез пептидов, индуцирующих-у животных образование .,ируснейтрализующих антител и защищающих их при заражении вирусом ящура типов А и О.

Для достижении поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- пргвести поиск антигенных детерминант (АД) УР1 вируса ящура А22550 и О [194;

- провести синтез пептидов, включающих последовательности аминокислот УР1 вируса ящура А22550 и 01194;

- изучить физико-химические свойства полученных пептидов:

- изучить антигенные и иммуногеиные свойства синтетических пептидов - фрагментов \/Р1 вируса ящура А22550 и 0(194;

- локализовать АД РНК-полимеразы,. проьести синтез пептидов, включающих основные АД, и оценить возможность их использования для выявления антител к У!А-антигену в сыворотках крсси животных, переболевших яшуром. Научная новиснз работы. Впервые получены пептиды, представляющие собой АД белка УР1 вируса ящура А22550 и 01194. Показано, что при введении данных пептидов' лабораторным животным еырйСатывйлись . вируснейтрализующие' антитела, обеспечи^дни*; защиту животных при заражении их вирулентным вирусом. I|рй иммунизации пептидами, вируса ящург А22Ь50 получена защита естественно-восприимчивых к ящур;

животякх; " ' . -

Синтезированы пептиды из РНК-полимеразы вируса ящур; А22550. Показана принципиальная возможность использовани данных пептидов для обнаружения антител 'к У!А-антиген/ сыворотках крови животных, переболевших ящуром.

Н«уч1Т5>\ новизна дополнительно подтверждена положится! »:«;• решением ВНИИГНЭ на выдачу патента.

^ Практическая значимость работы. На основе синтезированных пептидов получены экспериментальные образцы противо-ящурных вакцинных препаратов, которые используются для создания "пептидных противояиг/пных вакцин. Синтезированы пептиды, представляющие собой антигенные детерминанты РНК-поли-меразы, позволяющие выябяять антитела к У1А-антигену в сыворотках крови животных, переболевших ящуром. Разработанные методические подходы применяются с настоящее время для выполнения аналогичных исследований с другими типами вируса ящура и могут быть использованы при проведении исследований с другими вирусами с целью получения на основе синтетических пептидов эффективных иммунногенов и создания более совершенных диагностических препаратов.

Положения, выносимы'е на защиту:

- Синтез пептида \/Р1-(142-158)-МАР вируса ящура ДггббО, обладающего иммуногенными свойствами и защищающего лабораторных и естественновосприимчивых к ящуру животных при заражении гомологичным вирулентным вирусом. .

- Способ повышения иммуногенности пептидов \/Р1-(142-158)-МАР и УР1-{Ра!т21уз-141-160) вируса ящура АггббО при введении их лабораторным животным в смеси с липополисахаридом.

- Синтез, пептидов Л/Р1-(140-160Су5(Аст)) и \/Р1.-(200-213) вируса ящура О^Ш и их КШ-коньюгатоз, обеспечивающих защиту лабораторных животных при заражений гомологичным вирулент-нымвирусом. - . * ' • •. '

• - Синтез пептидов - фрагментов РНК-полимеразы и доказательства возможности-их использования для выявления антител в сыворотках крови животных, переболевших ящуром.

Апробация результатов исследования. Результаты исследовании доложены на конференции, посвященной 30-летию ВНИЯИ (Владимир, 1988), на научно-теоретической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ветеринарной вирусология* (Владимир, 1990), на международной симпозиуме "К новой стра-

-4- '

тети борьбы с ящуром", (Владимир,1991), на-научной конференции "Вопроси ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпи^ зоотологии' (г. Покров, 1932), на Ученом совете ВНИЯИ (1988-92 г.г.).

Публикации по работе. По материалам диссертации onyö линовано 14 печатных работ м получено положительное решение БН'ЛИГПЗ на выдачу патента.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложен с на 161 с.ранние машинописного текста, состоит из введения обзор! литературы, результатов собственных исследований, об суждения результатов и выводов, содержит 21 рисунок и 23 таб ли:'Ы. Список цитированной литературы включает 156 названий.

•2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы . Математичсс-зя обработка аминокислотных последова телыюстеп белков. Теоретический анализ аминокислотных по сладователоностей белка Д/Р1 вируса ящура А22§50 и 0)194, < также РНК-полимеразы проведен с использованием различны; методов. Были получены профили: - гидрофильное™, Т. Норр К. Woods et al. 1384, J. Faushere, V, Pliska et al. 1983, R. Eisenber* et a!, 1965; - экспонироеанности, J. Kyle, R. Dooiiiiie et al. 1985; - акрофильности, Т. Hopp, К. Woods е! al 1986; - антигенностя G. Welling e! al. 1SS-J; - подвижности, P. Karplus, G. Schub et al. 198c Синтез пептидов проводили твердофазным методом в.руч ном варианте последовательным наращиванием цепи с С-конца Все пептиды, за исключением пептида (V), были синтезированы н хлорметилированном сополимере стирола и дивинилбензояг Для защиты а-аминофункцни использовали Вос-группу. C-koi: цевуга аминокислоту к хлорметилироьак^му полимеру пцисс ециняли с помощью цезисвых солей в DMF. Boc-Gly-Pam-noni' мер получали из Вос-глицил-4-(о.хсиметил5фенилуксусной кис лоты и амяч^метилполимера ОСС-НОВТ-методом",

Ahjhh? пепгилс-з. Аминокислотный анализ пептидов, поел кислотного гидролиза', сысушяп пия и дериейтиаации феиилизс

тиоцианатом, выполняли метопом ВЭЖХ. Гомогенность пептидов контролировали обращеннофазовой ВЭЖХ.

Конъюгур'ование Синтетических пептилов с белками и полиэлектролитами. Пептиды коныогировали глутаровым альдегидом и -водорастворимым карбодиимидом по. общепринятой методике (Е. РШ е1 а1., 1982).

Получение липофильных препаратов с пептидом \/Р1-. (,Ра/ту$-14 /-160) вируса тура А2^50.

а) Эмульсия. Эмульгирование'проводили в 2% растворе Т\УЕЕЬ1-65 в 1/15М ФБР рН 7,6 при соотношении водной и масляной фаз 3:1 (по объему) с помощью ультразвукового дезинтегратора. Получали устойчивую 25% эмульсию типа масло в .воде с концентрацией пептида 200 мкг/мл. Эмульсионный препарат, содержащий пептид и липополисахарид готовили аналогично..

б) Липосомы. Липосомальные конструкции были получены методом дегидратации-регидратацми. При этом соотношение компонентов пептид: липополисахарид: липиДы при получении липосом составляло 1:1: 200.'

;> : . : в) 1ЭСОМ. Иммуностимулирующий комплекс получали мето- • дом диализа.(К.Хоудгеп е! а1.,1984); Включение пептида в 1БСОМ контролировали по методу Вга(Когс1 е1 а1., 1976. .: - Иммунизация животных. Для иммунизации использовали •крупный рогатый скот «/ерно-пестрой породы, овец романовской • породы, кроликов и морских свинок. Пептиды вводили в сочета-' нии с масляными адъювантами, крупному рогатому скоту и овцам - подкожно в объёме 2 мл, морским свинкам и кроликам -внутримышечно в.объеме 0,5 мл. .

• Заражение животных. Для'заражения использовали вирус ящура А22 и 0^194, полученный из афт крупного рогатого Скота. {Крупному рогатому скоту вводили вирус интралингвально в дозе 104 ИД501 овцам - адаптированный вирус. в венчик копыта в той же дозе. Морских свинок заражали интраплантарно вирусом,

адаптированным к этому виду животных, в дозе 500-1000 ИДбс Учет результатов заражения проводили через 7 суток и оцен^ вали по генерализации ящурного процесса. Серологические исследования,

а) Реакция нейтрализации. Титры вируснейтрализующих' ат т и г ем в сыворотках кро^и животных определяли в кулотуре кж тег. яо«ки горегяг, как описано в работе Павлова А. В. и соавт., 1991 С) Реши.оиммунологическия анализ. Антигенные свойств ¡,&а*ы oi. и vu хонъогатов, а также антипептидные антител ьпрелн/ти в непрямой реакции (Рыбаков С. С. и соавт., 1989 в; Иг '^.'унофзрмбнтннй анализ пептидов и сывороток кр< л^отпы;: осуществляли по общепринятому методу (ДЬ . LisdiTj L-.. M. Е. et ai.,1978).

2.2. Результаты собственных исследований

Выполнение задач, стоящих перед нами, было начато теоретических расчетов гидрофильности. ангиген+юсти, подви; кости, экспон-ированности, акрофильности отдельных участкс белка VP1 вируса ящура А22$50. О^Ш и РНК-пслимеразы. Пел ченные результаты подтвердили наличие в районе .140-160 амин кислотных остатков VP1 антигенных детерминант. В качесп минорной -антигенной детерминанты был выявл&н С-кониев! фрагмент белка VP1. Обращает на себя внимание также уча ток 16-22 VP1 вируса ящура Агг^бО, обладающий сегментал ной подвижностью, акрофильностью и окспоипрованность.ю.

На основе компьютерного анализа было выявлено н сколько участков - предполагаемых, антигенных детермина РНК-иолим^разы. Фрагмент ЗБ8-373 имеет высокую гидрофи; «ость, сегментальную исасижиосгь, антигенность и акрофи; несть. Еще ^сдим пшрвфильныи участок лежит между амш кислотными остатками 151-156. Высокая гидрофильность окспо»мрованность предсказана для фрагменту 436-443. Уч? юч 2'iî-?14 имеет Р.меокую подвижность, акрофильность, но

является - гидрофильным и антигенным. Высокая антиг?ж:ооть обнаружена для фрагмента 58-64. Таким образом, п ргзулмате теоретического анализа - аминокислотной последовагельгк>оти РНК-полимеразы показано, что ее основные АД распределены по всей последовательности оелка.

2.2.1. Синтез пептидов На основании компьютерного анализа последоьагелькости аминокислот VP1 вируса ящура АогобО, Oí 194 и PHK-noiWop-iчы были выбраны, а затем синтезированы следующие пептиды (рис. IV , 8 хопе синтеза применяли следующие производные гри-функциональных аминокислот: Boc-Arg(Tos)', Boc-Atg(M(s), Roo-Asp(GBzi), Boc-Asp(OcHex), Bg>G!u(Q3zî), -Ooc-Lys(CI2Z)( 8oc-Lys(Boc), Boc-Thr(Bzl). Boc-Ser(Bzl). Boc-Tyi(C!2Bzn, Ooo-His(Dnp).

Реакцию конденсации проводили двукратно, первоначально; с помощью симметричных ангидридов, а затем DCC-НОВГ метопом. При неполном протекании реакции конденсацию провопили третий pa3"DCC-HOBT методом. При этом полнота протекания решим достигала более 99%. Остатки Boc-Asn и Boc-Gln вводили ï реакцию первоначально с помощью пара-нитрофениловых эти- ' jos, а затем - DCC-MOBT методом. Каждый цикл, синтеза -акан-1ивали ацилированием непрореагировавших аминогрупп уксус-1ым ангидридом. После.введения в пептидную цепь остатка мети-шина удаление Вос-группы.во избежание окислёния и алкилиро-ания атома серы, проводили в присутствии диметилсульфида, 1ри присоединении защищенных аминокислот к остаткам Glu и ¡In, заменяли растворитель на DMF для предотвращения побоч-ой реакции образования, 'пирогйутаминовой кислоты. Каждый икл синтеза состоял из следующих стадии, при этом на 1 г элимера брали 10-15 мл растворителя :

1) диоксан (2 промывки по 1 мин);

2) 1 н. HCl в диоксане (1 мин);

3) 4 н. HCl в диоксане (30 мин);

4) диоксан (4 промывки no 1 мин); в СН2С12, (2 часа);

10 24

РУТТТУЕМУССЕТОУ 197 213

Бсшнкакилрлкаи. ■

141 160 .. !.ХВГ1аП1ЕР1.ДАПУАЛа1РТ

141 120

Рд1тХ!^ЗВГШ01ЕРЬ\ЛПУААа1РТ '

14,; 158

г Р1ААНУААП1.6С6)8К76

■ 1 со

Р У т м 7! Ю ОIО VIЛ С К. Л А П ТIР - Су Э (А сгг>} / 14,'; 160

н:тпс;п1.а\'1А0КАЛят1Р-Су5(Лсгп} 144 160

ТПС010\'1АаКЛАР,Т1Р-Сус.(А=гл) ,

142 ¡60 • . \ СОЮУиЛОКАЛНПР-Суз^Лст) ■■ ■

143 160 10У1ЛаКАЛВТ1Р-Сус(Асш) ,..

200 ' .'213 '■ ЛЯ!!ШК!УАР!Ш1Л. V ' : ; • . •

62 71 ' : .

СОТКо'ТАЕОК '.. , 5В ' • * . 71'' ' г . , ; . •

ЭКИКСОГКМТАЕОК.

147 .153 >'*

1Е1Ы1ГКПС=ГКРТС

201 -214, -'А'.- : ЛОМИЗМСРОЮЗА ■"/...•■

304 .376 " . '

!ТРА0К30КС>ГУ1. •

53

376 •

(II)

К51СаТ1ТРАОКЗОКЗГ\'1 . 433 443

■ HSGpVEYF.nL

Рис. 1. Амм'схисязтнии послздоЕатйпьиости п2Я1«доБ УР! вируса ящура Агг550 (1)-{У),' и РКК-папичеразы вируса ящура Аг2550 (ХННХОД!).

. он) :

.(IV) ' (VI

; . (VIII) .. - (|Х) ' ■

{х\ . '

(XI)

(XII) " . (XII!)

(XIV)

(XV) л.";

(XVI)

, (XVII)

.(XVIII). сишозиросан-0,134 (У1)-(Х!)

-9.5) СН2С12 (2 промывки по 1 мин);

6) 5% 01ЕА в СН2С12 (2 промывки по 1 мин):

7) СН2С12 (о промывок по 1 мин);

8) 3 экв. симметричного ангидрида Вос-аминскислоты

9) СИ2С12 (4 промывки по 1 мин);

10) Ь% 01ЕА в СН2С12 (3 промывки по 1 мин);

11) СН2С1;, (2 промывки по 1 мин);

12) ОМР (3 промывки по 1 мин);

13) 3 окв, НОЗТ-эфира той же Вос-аминокислоты в СН2С12: ОМР (2:1) (2часа);

14) ОМЁ (3 промывки по 1 мин);

15) СН2С12 (3 промывки по 1 мин);-

16) аиилирование смесью СН2С12:Ас20:пиридин (6:2:2) (1 час);

17) СН2С12 (3 промывки по 1 мин);

18) изопропанол (3 промывки по 1 мин).

Для получения симметричного ангидрит защищенной аминокислоты к 6 зкв. Вос-аминокислоты в 15 мл СНгС^ приливали 3 экв. ОСС в ОМР при 0°С. После перемешивания ь течение 15 минут, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывали, раствор использовали для проведения реакции конденсации.

Гидроксибензотриазоловые зфиры получали в смеси СНгОг-ОМР (2:1) при 0°С в течение 10 минут. Образовавшуюся дициклогексилмочевину отфильтровали,"раствор использовали для проведения реакции конденсации..

За полнотой протекания реакции конденсации-следили с по-'мощью пикринового и нингидринового тестов,

Общая схема синтеза пептидов РНК-полимеразы была несколько видоизменена. Для первой конденсации (пункт. 8 общей схемы) вместо 3 зкв. симметричного ангидрида использовали 3 экв. НОВТ-зфира Вос-аминокислот в системе растворителей

CH2CI2-DMF (3:1). Таким образом к растущему лептидилполимеру присоединяли первые 6-7 аминокислот. Остальные аминокислоты конденсировали с помощью HOBT- офироь в OMF, которые получали упариванием хлористого метилена из раствора активированной аминокислоты, и добавляли к промытому DMF полимеру. Повторную конденсации (пункт 13 общей схемы) проводили тем же способом. Преимущества данного метода состоят в том, что сп пригоден для присоединения всех аминокислот без исключения, при зтом расход реагентов в два раза ниже по сравнению с методом симметричных ангидридов.

Все защитные группы для боковых функций аминокислот пептидов (l)-(XVIII) были выбраны с расчетом на конечное деблокиро-

• еание жидким Фтористым водородом или с помощью трифторме-

• тансульфокислоты. Перед деблокированием пелтипилполимеры обрабатывали 4 н. HCl в диоксане, промывали диоксанем, хлористым метиленом и высушивали в вакууме. Данная процедура необходима для удаления Вос-груплы, так как при деблокировании сильными кислотами образуются очень реакционноспособ-ные трет-бутильные -карбокатиоиы, которые могут повреждать пептидные цепи и, следовательно, снижать выход целевого продукта.

Пептиды (I) й (II) деблокировали жидким, фтористым водородом, lovAhigh метод: HF-DMS-n-крезол, (25:55:10)"и затем HF-п-крезол (9:1); пептиды (Ш) - (X) - трифторметансульфокислотой,

low-high метол: TFMSA-TFA-DМ S-к-крезол (10:50:39:10) и сатеМ 1С% TFMSA с TFA в присутствии 10%-,м-крезола; пептиды (XII), (XII!), (XV), (XVI), (XVii) - трифторметансульфокислотой. • lGW-метод:

7FMSA-TFA-DN',3-м-крезо л (10:50:30:10); пептиды (XI), (XIV), (XVjl!)-ь системе 1 М (TFMSA- тиоакизол) ь TFA. Последнюю деблокирующую систему применяли для тех* пептидов, которые содержали остаток аргинина, защищенный меоитияенсульфоиильиой группой Наилучшио результаты при деблокировании пептидов

получены в системе ТРГЛ SA-TFA-DMS-м е! а-кр е г о л (10:50:30:10

(Low-TFMSA метоп). Однако данным методом не удалялась Tos-защитиая группа с остатка аргинина, поэтому деблокирование аргинин-содёржащих Пептидов (Ш)'-(Х) повторяли в 10%-ном растворе-TFMSA в TFA (high-TFMSA метод). Чтобы избежать столь жестких условия нами для защиты остатков аргинина в процессе синтеза была использована более кислотолабильная мезитиленсульфонильная-(Mis) группа, предложенная H. Yajima et al., 1978 . Данная защитная группа, так же как и тозильная, не удалялась в условиях low-TF''SA,однако легко отщеплялась з системе 1М (TFMSA-тиоанизол) в TFA. Дополнительным преимуществом этой системы является то, что она позволяет одновременно удалять все кислотолабильные- защитные группы, aé исключением Tos- и N02-rpynn с остатка аргинина (J. Tarn et ai. 1936).

Выделение пептидов из реакционной смеси после деблохи-. • рования-осуществляли осаждением в 10-20-ти кратный избыток эфира, содержащего дс 1% пиридина, с последующим центрифугированием осадка, растворением его в 10%-ноа уксусной кислоте и обессоливанием на сефадексе G-10 или G-15. Указанная процедура эффективна для отделения пиридиновых солей от пептида. Пептиды (I) и (II) дополнительно очищали с помощью ионообменной хроматографии на DEAE Trisacry! 650М и СМ Тоуо-pearl 650М соответственно, а-остальные пептиды - гель-хроматографией иа сефадексе G-25, Toyopearl HW40S и Toyöpearl HW55F. Использование' Toyopéart HW40S оказалось более эффективным по сравнению с сефадексом G-25..Разделение пептидов на Toyopearl HW40S проходило с более высокой линейной скоростью, за более короткое время и с лучшмм'разрешением пиков.

Синтезированные пептиды характеризовали с помощью- аминокислотного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и гель-хроматографии на Био геле Р-30. Результаты аминокислотного анализа .совпадали с теоретическим составом пептидов в пределах ошибки опыта. Короткие пептиды, содержа-

щ ие 9-15 аминокислотных остатков, покавали лучшее соответствие со своей структурой по сравнению с более длинными пептидами и были более гомогенны в обращеннофазовой ВЭЖХ." Ля-п нептипов я лимон- • ■ оолее аминокислотных остатков необходима. г..д правило, исполнительная очистка с применением препаративной ВЭЖХ или некоторых других- методов. Высоко молекулярная природа пептидов VP1-(Pa!in2Lys-141-1P0) и VP1-(142-!Ь£')-?='АР была показана с помощью гель-хромагографии на Био голо Р-30. Колонку калибровали по BSA, трипс.иногену, лизо-¡шму и инсулин/. Пептид VPI-(Paltn2Lys-14l-l60) е фосфатном С/.;,ср:-. вероятно, образует агрегаты, поэтому его время выхода близко к таковому для BSA. Пептид. VP1-(142-158)-MAP представляет собой соединение с молекулярное массой, около 24 кДа оеj низкомолекулярмых примесей. Эта величина больше табличной (1G.52 кДа), что, возможно, отражает-отличие, структуры исследуемого пептида от глобулярной структуры белков., использованных для калибровки колонки. .

2,2.2.-А!Ттигенные и иммуногенные свойства пептидов ■ VP1 вируса ящура А;2550 и 0^94 • ' Первоначально в.непрямой реакции твердбфасного радио-йммуноанализа исследовали антигенные свойства пептидов VP1 вируса ящура Аг?550 и 0^194. Все пептиды из района 140-160.а. о.

'ч - . •

VP! были высокоактивны в связывании с соответствующим иммуноглобулином кролика, полученным на 14OS частицы вируса ящу-рI! Агг^иО и 0^194 (табл.1). Активность «сражена в 'логарифмах величины cOpaiiioro pi; с ведения раствора пептида или его конъ-с исходной коннешыщяеи 1 мг/мл при постоянном разве--нпни« :*ииуцопю6уп>т на U OS частицы вируса шкура 1:5000.

Дня пептидов VPi-(! Iî-130) н УР1-(1Э?:213) вируса яиг'ра A/^SGC '.i прпготоалгнпих из mu препаратов-высокая антигенная п'т.ч:чпси>, V-jijpen,2пенная в РИА, коррелиромла с- иу'-протек-ï/.B:ii.;:-!;i ссойцтеами вля морских сгинэк (таЭД. 1 А).

Таблица 1.

Антигенизя и иммуногеиная активность пептидов VP1 вируса ящура Aj}550 (А) и Oj « 34 (В).

А активность морские свинки

препарат з РИА, •1g реакция нейтрализации, - (одгНДгг защита

141-160 4,1 2,0 5/5

(141-tS0)-BSA 5,3 2,1 5/5

¡41-160 и 137-213 смесь 4,4 2,5 5/5

(141 1 СО) KLM и (197-213J-4LH, смесь 3,4 2,2 4/5

(141-160 и 197-213) ГА, смесь' 3,4 <1,0 3/5

(197-213)-KLH <2.0 <1,0 3/5

.197-213 <2,0 <1,0 0/5

10-24 <2,0 <1.0 0/5

(10-24J-KLH <2,0 <1,0 0/5

В активность морские свинки

препарат в РИА -19 Титр АЛА ИФА, - !д защита

140-160-Cys(Acm) н.и." 6,2 1/5

142-1w3-Cys(Acm) 3,9 н.и. . 0/5.

144-180-£ys(Acm) 3,7 н.и. 0/5

2СС-213 «2,0 • ы : ьъ

140-l60-Cys(Acm), ' ■ ' 200-213, смесь. н. и. > 5,2 2/5 ■

. (ИСМР.0-Сус(Лст}КШ • 4,1 . -6.1 . 3/5

(142-160-0/з(Лсгп)) -KLH ' 3.9 . • 1/5

(l44-l6Û-Cys(Acmj)-KLH 3,0 .4,0 . 1/5

' (140 UiQ-CysfAcrri!}- KLH, •(2aO-213j-KLI-l, смесь ' 3.0 4,1 4/5

(2-:>2!3)-КШ 2.7 1,0 3/5

' Омьсь пептидсч, ппяимпризованных глутарогмм альдегидом " :;.л. - »1 к^следсгали. '

•Антигенная активность свободных пептидов вируса ящура 0}194 и йх конъюгатов с KLH в РИА возрастала с увеличением' длины пептида (табл. 1 В). Обнаружить коррелятивную зависй-. мость' между антигенной и "иммуногенной активностью с одной стороны и протективным эффектом на морских свинках с дру-.гой для пептидов VP1 вируса ящура 0)194 не удалось. Наиболь;^ ший протективныя эффект (80%) был получен только при иммунизации смесью коньюгатов пептидов VP1-(140-160Cys(Acm))-KLH и VP1-(200-213)-KLH, хотя все коньюгаты и свободные пептиды, за исключением пептида VPH200-213) и его коньюггта с KLH, были высокоактивны с. иммуноглобулином кролика, полученным на 140S частицы вируса ящура 0^184. Кроме того все исследованные пептиды были кммуногенны' для морских свинок, о чем свидетельствовали высокие уровни антипептидных антител, полученные на препараты,, приготовленные на их основе. Животных иммунизировали двукратно через 42 дня в*ПАФ и НАФ по 200 мкг каждого из пептидов и заражали «а ,56-е сутки. 500 ИД50 гомологичного вирулентного вируса.

Свободные короткие пептиды часто неспособны индуцировать образование антител из-за генетической рестрикции иммунного ответа на тимусзависимые антигены. Так при иммуни-■ зации кроликов свободными пептидами VP1-(141-160) и VP1-(10-24) вируса.ящура Аггб.бО не было обнаружено ант ипептидных антител.

Из неспецифичес'ких стимуляторов иммуногенеза чаще всего используется полный адъювант Фрекнда. Однако его практическое применение по ряду причин ограничено. Неспецифическая стимуляция за счет использования синтетических носителей с иммуномодулЕТорными свойствами (Р. Петров и соавт.,1983); ковалентное соединение пептидов с адъювантами (j. Bittie. et al. 1982, К. Wiesmulier el al 1989), использование-пептидое. в составе липосом (М. Francis et а!. 1985), иммуностимулирующих комплексов (К. Lovgren ei ai. 1S86), добавки 'иммуностимуляторов в вакцинирующие комплексы (J. Blute et а!. 1S8S, L. Cftedid

е( а1. 1986) дают реальные возможности повышения иммуноген-иости синтетических пептидов. Однако для создания таких структур, как правило, необходимо, чтобы пептид содержал липофильный остаток, например, пальмитиновую кислоту,

С этой целью нами был получен пептид УР1-(Ра!т21-у$-141-1еО) вируса ящура А22559, который вводили в эмульсию, липосомы, иммуностимулирующий комплекс. Кроме того, для повышения иммуногенности пептида к эмульсии и липосомам добавляли липополисахарид (ЛПС). Были также приготовлены коньюгаты пептида \/Р1-(141-160) с полиэлектролитом.

Полученные структуры оценивали по их способности индуцировать образование антипелтидных и еируснейтрализующих антител, а также по защите морских свинок при заражении гомологичным вирулентным вирусом. Животных иммунизировали однократно в дозе 100 мкг без адъюванта и заражали на 28-е сутки 500 ИД50 вируса, адаптированного к данному виду животных. Сыворотки отбирали на 28-е сутки после иммунизации.

Внесение липсполисахарида в эмульсию и липосомы, содержащие пептид,, приводило к заметному (с 3,25 !д до 3,9 !д и с 3,4.1д до 4,11д соответственно) увеличению титров антипептидных антител. При этом протективмый эффект увеличивался незначительно, только одна морская .свинка из пяти не' заболела генерализованной формой ящура. Высокие тйтрь£ антипептидных антител были также получены' при иммунизации Пептидом в составе 13СОМ (4,1 В этом случае, при заражении гомоло-• гичным вирулентным вирусом были защищены две морских свинки из пяти. Достаточно высокие титры антипептидкых антител (3,4 !д) наблюдзли и при иммунизации морских свинок .коньюгатом пептида УР.1-(141-160) с полиэлектролитом - сополимером винилпирролидона, кротоновой кислоты и пара-крото-нсиламинофенола. Однако протективного эффета при введении данного препарата морским свинкам не было обнаружено. Низкий протективный эффект, полученный на все исследован-

Таблица 2

Иммуногенная и протективная активность пептидов УР1 вируса ящура А22550 для крупного рогатого скота * •

Иммуноген .Адью- . вант Доза (мг) Интервал введения, ' (сут.) Титр ВНА. - 1оё2.НД$о Наличие поражений

21-е сут. 42-е сут. 63-е сут. язык конечности

141-160 ■ ■ ПАФ. : НАФ .1 42 1.0 2,0 6,2 + ■ ■ +

141-160, . ■' ПАФ. НАФ 1 42 з.о ■ 4.0 6.3 + +

141-160.197-213 смесь ПАФ. НАФ 3.6 1.0 1.0 1.0 + ' +

141-160.197-213 смесь ПАФ, • НАФ 1*2 36 3.5 4.6 5.2 + - ■

' 141-160,197-21-3 смзсь ' НАСМ*3 i *2 42 2.3 2,8 4,0 +

141-160,197г213 смесь .. НАСМ 1*2 42 ' 3.0 5,8 6,1 + -

(Н2-153)-МАР .НАСМ . ' 1.5 42 5,О*4 7,6 11,0, - -

: (142-158)-МАР НАСМ 1.5 42 ' 6,5^ 5,3 10.2 - -

* ". Двукратная иммунизация и заражение Ю4 ИД$о на 63-е сутки. ^ по 1мг-каждого •

и3 НАСМ - неполныйадьювант на основе синтетического масла, титры ВНА на 30-е сутки. . "

■:.'■■'•'.".■ - -17- '

ные препараты, можно объяснить тем, что большая часть индуцированных антител не являлись вируснейтрализующими.

Из данных, опубликованных в литературе, известно, что использование для. иммунизации животных смесей синтетичес-: ких: пептидов из области основной и С-концевой антигенной детерминанты белка VP1 повышало иммуногенную активность приготовленных из них вакцинирующих прёпа'ратов (К. WiesmulLer et al„ 1989), В нашей работе £ыла использована смесь пептидов VP1-(141-160) и VP1 -(197-213) вируса ящура А2г550. Двукратная иммунизация крупного рогатого скота пептидом VP1-(141-160) А22550"вызывала образование относительно высокого уровня вируснейтрализующих антител (табл. 2), однако не обеспечивала ' защиты животных при контрольном заражении вирулентным вирусом в дозе. 10^ . ИД5о. Иммунизация смесью свободных пептидов VP.1-(141-160) и VP1-( 197-213) в тех же условиях предотвращала развитие генерализованной формы ящура у трех животных из четырех. В данном случае, вероятно, происходило образование, антител к различным антигенным детерминантам, что ' обеспечивало нейтрализацию вируса.

' С.целью.повышения иммуногенности пептида \/Р1-(141-160) ..вируса ящура Адг^бОнами была синтезирована структура, состоящая из трех уровней остатков лизина, связанных друг с другом, и восьми молекул пептида VP1-(142-158) (рис. 2). Введение 20 мкг пептида морским свинкам с ПДФ•защищало их от заболевания', щуром .при заражении вирулентным вирусом в дозе 500.ИД50. Однократная иммунизация овец в дозе 1 мг-вызывала образова-. ние высокого уровня 8НА уже на i4-е сутки после введения (табл. 3). •При двукратной инъекции пептида крупном1) рогатому скоту в до-:зе 1,5'йг с неполным адъювантом на основе синтетического масла индуцировался высокий уровень вирусспецифическиэ? антител как после первой (5,3-7,6.1одг Rflso'ü.l, мл), так и после второй иммунизации (10,2-11,0 1од2-НД5о/0,1 мл) (табл. 2). Заражение

-18- v

• Ас—(142—158)—Gly3 -Lys-Lys -Lys -Gly-OH Ac-(142-Î58)-Gly3 —^ . Ac—<142—158)—Gly3 — Lys—J ' . Ac—(142—158)—Gly3 —J Ac—(142—158)—Gly, — Lys —Lvs-

I

Ас—(142-15S)-GIy3 —' Ac- (142-158) -Gly3 - Lys — Âc—(142—158)—Gly3 -—I.

Рис. 2. Структура пептида VP1-(142-158)-MAP (Vj вируса ящура A22550.

Таблица 3.

Иммуногенная и протективная активность пептида УР1-(142-158)-МАР для овец/

Вирусиейтрплизующие антитела, - ЬдгШ^у '^защ.^зар.

7-е сут. 14-е сут . 21-е сут. 31-е сут.

<1.0 ' 8.17 7.43 . 7,50 1/1

' <1,0 4.76 •' и.о. • .7,00 1/1

<1,0 7,50 10,50 10,17. ■1/1 .

<1,0 7.32 7,33 7.48 . 1/1

<1.0 9,24 9,50 Э.0'0 . 1/1 '

: . .контроль.

<1.0 <1,0 . . . <1,0 .<1,0 0/у.

V Животных иммунизировали однократно в дозе 1 мг с добавлением ' 1 мг СМБР и НАСМ и заражали гомоло-, гичным вирулентным вирусом е.дозе-104 ЙД50 на 31-е. сут. после иммунизации. . ...

гомологичным вирулентным вирусом в noce 1G4 ИД50 не вызывало заболевания животных. Использование в качестве добавки липополисахаркда (ЛПС) увеличивало протективную активность пептида VP1-(142:158)-MAP. Однократная иммунизация 5 мкг пептида с ЛПС в соотношениях 1:1 или 1:5 оказалась достаточной для защиты от заболевания ящуром при заражении морских свинок гомологичным вирулентным вирусом в дозе 1000 ИД50. Пептид, введенный без ЛПС, в данной дозе протектиеным эффектом не обладал.

Таким образом, в результате пров.еденных исследований было показано, что пептид VP1-(141-160), его смесь с пептидом VP1-(197-213) и пептид VP1-(142-158)-MAP вируса ящура А22о50, а также конъюгаты пептидов VP1-(140-100-Cys(Acm)) и VP1-(200-213) вируса ящура 0^194 с KLH обладали протективными свойствами и защищали лабораторных и/или естественновос-приимчивых к ящуру животных при заражении соответствующими штаммами вируса.

2.2.3. Изучение возможности использования синтетических пептидов - фрагментов РНК-полимеразы для выявления антител к VIA-антигену вируса ящура

Выявление антител к VIA-антигену б сыворотках крови животных имеет важное значение для борьбы р ящуром. Обычно для этих щелей используют РНК-полимеразу, выд'еленную из инфицированной вирусом культуры клеток. Для повышения санитарной безопасности ранее была выполнена работа по получению этого антигена методом генетической инженерии (F, Villin-cjef et. .al., 1939). Нами был проведен химический синтез пептидов, включающих антигенные детерминанты РНК-полимеразы вируса ящура Аог^ВО. и изучена возможность их использования для выявления антител к данному антигену в сыворотках крови животных, переболевших ящуром.

Первоначально в непрямой реакции твердофазного иммуно-фермёнтного анализа были,испытаны свободные' пептиды с пос-'

• ледовательностью 364-376 и 358-376 РНК-полимеразы и их конью'-» гаты о овальбумином, тиреоглобулином и полиэлектролитом -сополимером винилпирролидона. и М-гидроксисукцинимидного

. эфира акриловой кислоты.. '' ;

Титры антител на Д/!А-антиген в 8 сыворотках от переболевших ящуром животных, выявленные с помощью указанных пептидов, составляли от 1:20 до 1:160., При. этом с \/1А-антигеном, лолученным из клеток, инфицированных вирусом ящура, данные ' значения были выше и колебались от./1:80 до 1:640. Использование коньюгатов пептидов с различными белкамичюсителями и поп-электролитом не приводило к повышению чувствительности метода.

С. пептидом 358-376 испытан также жидкофазный вариант ИФА,

• Для этого были получены гипериммунйые антипептидные сыво-4 ротки от кроликов и морских свинок. Результаты, полученные в

жидкофазном варианте ИФА, аналогичны таковым, в непрямом методе, При использовании свободного пептида 358-376 антитела на \/!А-антиген выявляются в. разведениях 1:40 - 1:80, а с У1А-анти-геном-1:40-1:160. У.,■■;■;чУ'УУУУ.У .■';'-.'

С целью поирка антигенов более актйвно реагирующйх с антителами, к. \/1А-антигейу были ' синтезированы пептиды из У других участков РНК-полимеразы.,: Пептиды, и - непрямом ИФА". на - способность/^ связьшания :с ^антителами /.в сыворотках переболевших ящуром живдтных.-.С' помощью пептидов 147-159, 364-376 и 358-376 антитела .выявлялись в титрах •У 1:80 - 1:1-60 обратных разведений сывороток.Активность Ьсталь-. ных пептидов не превышала титра 1:40. ..

Таким образом, в результате проведенных исследований показана принципиальная возможность использования синтетических пептидов фрагментов РНК-полийеразы вируса ящура .- для- выявления антител к \/1А-антигену в сыворотках крови животных, переболевших ящуром.

-213, Эывопы,

1. Синтезировано 11 пептипов, содержащих основные антигенные детерминанты УР1 вируса ящура А22&Ш и 01194, получены их копъюгаты с' синтетическими и природными макромолекулами.

2. Синтезировано 7 пептипов, содержащих основные антигенные детерминанты РНК-полимеразы вируса ящура Агг^оО, показана принципиальная возможность использования не-которьч из них для обнаружения -животных, переболевших ящуром.

3. Получен пептид УР1-(112-153)-МАР, обеспечивающий защиту есгесгвенноь-осприимчивых к ящуру живтных от заболеаа-ния при заражении гомологичным вирулентным вирусом А22-!50.

4. Добавление липополисахарида к препаратам, приготовленным на основе пептидов УР!-(142-!58)-МАР и \/Р1-(РЛт2!..у»-14!-!оС). посещало их пммунсгонпость.'

5. Показано, что смесь пептипов УР1-(141 -1 СО) и УР1-(197-213) вируса ящура А2;550 является более иммуногенной по сравнению с отдельно взятыми пептидами.

6. ' КШ-коньюгаты .пептидов УР1-(140-1й0Су5(Аст)) и У/Р1-(200-213).

вируса ящура 0(191 в смеси обеспечивали зашит1/ 60% морских сшок при заражении гомологичным вирулентным вирусом.

.' ' </. Практические преппожения. .

1. Синтезирован пептид УР1-(142-1о8)-МЛР, на основе которого в дальнейшем может- быть создзна вакцина против, вируса ящура штамма Агг^^О. ..

2 Для повышения имму.чогенной активности пептида УР1-(1 !2-153)-МАР предлагается использслть в составе вакцины липополиоахарид, '

3. . П^еаложены-пептиды - фрагменты РПК-полимеразы, которое могу, оыть использованы при определении антител к пан-ному антигену в сыворотках крови животных, переоолевши.-.

- -• --пщупом.---.....-

Основные результаты диссертационной работы изложены в • следующих публикациях: 1.. . Гуленкин В.' М., Дрыгин В, В., Луговской А. А., Перевозчикб-. .. ва Н. А., Иванюшенков В.Н. Изучение гидрофильных, антигенных, амфипатичных и a-.'ß-структурных участков белка VP1 вируса ящура АггббО,-0^94 с помощью компьютерного;: анализа // Актуальные проблемы ветеринарной вирусо-' логий. Тез. докл., г. Владимир, 1988, ч. 1, с..10-11.

2. Синякова 0. Н., Луговской А. А., Петров В. В., Рыбакоз С. С., Чепуркин А. В., Иванющенков В.Н. Изучение возможности использования радиоиммуноанализа'для характеристики синтетических пептидов и антисывороток к ним /' Актуальнее' проблемы ветеринарной вирусологии. Тез. докл., г. Влади-. мир, 1988, ч. 1, с. 19-20.

3. ' Луговской А. А., Чепуркин А. В., Синякова 0. Н„ Павлов А. В., .

Рыбаков С. С., Иванющенков В. Н„ Лядский М. М. Синтез и\ изучение антигенной и иммуногенной активности пептида^ 141-160 VP1 вируса ящура Кц//Актуальные проблемы ве-, теринарной вирусологии. Тез. докл., г, Владимир,.-1988, . ч. 1, с. 21-22. .

4. . Петров В. Н., Луговской А, А., "Павлов А. В., Рыбаков С. С., . Иванющенков В. Н. Контроль конъюгирования синтетических

пептидов с белком-носителем методом ВЭЖХII Актуальные проблемы ветеринарлой вирусологии. Тез. докл., г. Влади; ' мир, 1988,4.1,с.24-25. •

5. Яров А. В:, Гельфанов -В. М„ Гречанинова Л. А., Суровой А. Ю., Волъпина'О. М., Иванов В. Т., Чепуркин А. В.,'Луговской А. А., Дрягалин Н. Н., Иванющенков ВТ Н.,.Бурдов А, Н. Антигенная, структура вируса ящура.-4. Синтез и иммуногенные свойства

. новых фрагментов белка VP1 вируса ящура штамма А22 Н Биоорганическая химия. 1989, т. 15, N 9, с. 1193-1205.

6. Петров .В. Н.р Рыбаков С. С, Луговской А, А., Иванющенков В. Н., Перевозчиков В. А., Мудрак Н. С.,'Быкова Т. В. Получение и характеристика иммуностимулирующих комп-

лексов, содержащих синтетический пептид вируса ящура II Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Тез.докл,, г. Владимир, 1990, с. 4-5.

7. Петрова 0. Н., Рыбаков С. С, Луговской А. А,, Петров В. Н., Иванющенков В, Н. Изучение антигенных свойств синтетических пептидов методом РИА//Актуальные вопросы вете ри-нарной вирусологии. Тез. докл., г. Владимир, 1990, с. 87-38.

8. Павлов А. В,, Луговской А, А., Петров В. Н., Рыбаков С. С., Иванющенков В. Н., Бурдов.А. Н., Холин Ю. А. Синтез и изучение антигенных свойств пептидов - фрагментов \/Р1 вируса, ящура А22550, 01194 и Азия-1 II "К новой стратегии борьбы с ящуром." Международная конференция, г. Владимир, 1991, с. 93.

9. Луговской А, А., Рыбаков С. С., Шажко Ж. А., Камалова Н. Е., Беляева Н. В. Изучение возможности использования синтетических пептидов для выявления антител к \ЛА-антигену. вируса лшура ¡1 "К новой стратегии борьбы с ящуром." Международная конференция, г. Владимир, 1991, с. 165-168.

10. . Петров В. Н. Рыбаков С. С., Павлов А, В., Луговской А. А.,Че-

пуркин А. В., Петрова 0. Н., Лядский М. М., Дрягалин Н. Н, Ко-жаева Г. И., Холин Ю. А., Савельев В. Юм Иванющенков В. Н., Бурдов А. Н. Синтез и изучение антигенных и иммуногенных свойств пептидов - фрагментов УР1 вируса- ящура типов А, Он Азия-1 II Ящур:- "К, новой стратегии борьбы -с ящуром." Сборник яауч; трудов, г. Владимир, 1992, ч. II, с. 77-93.

11. Луговской А. А., Рыбаков С. С., Чег.5ркин А. В,, Петров В. Н.. Лядский М. М., Иванющенков В, Н„ Дрягалин Н. Н., Бурдов А, Н. Положительное решение ВНИИГПЗ от 30,03.92. на заявку на

• . ' патент: "Пептид для защиты животных о: вируса ящура Ац."

12. Луговской А. А., Рыбаков С. С., Иванющенков В. Н.,Чепуркин А. В., Петров В. Н.) Лядский М.. М., Дрягзлин Н. П., Бурдов А. Н. Защита естественновосприимчивых животных от ящура пептидом, синтезированным на лизиновой матрице II Биоорга-

--------ническая химип.-1392;-тт-»8г.ЫЛ1_с. 942-950.

*' . -24- '

13. Луговской А. А., Савельев В, Ю„ Петрова О.- Н„ Чепуркин А. В., * Лядский М. М., Рыбаков С. С. Адьюванты для синтетических . . антигенов'// Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиб-логи^ и эпизотоологии. -Материалы научной конференции ; ■ ВНИИВВиМ, г. Покров, 1992, ч. 1, с. 184-185. 14,. Петрова 0. Н„-Луговской А. А., Мудрак И, С„ Рыбаков С. С,,; Чепуркин А, В., Лядский М. М, Изучение антигенных и иммун-ногенных свойств синтетических пептидов УР1 вируса ящура типа О // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизотоологии. Материалы научной- конференции ВНИИВВиМ, ч. 1, с. 185, г. Покров, 1992, .