Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особнности ультраструктурной организации бластомеров на ранних стадиях развития и участие внутриклеточных фракций в процессе гаструляции

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Особнности ультраструктурной организации бластомеров на ранних стадиях развития и участие внутриклеточных фракций в процессе гаструляции"

ТБИЛИССКИЙ" ОРДЕНА ТРУДОВОЮ КРАСНОЮ ЗНАМЕНИ ЮСУиРСММЬИ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. И.А.ДДАШШШШШ

На правах рукописи

КШИАШШИ ТАМАРА ДАЕЩОВНА

. , ' УДК 576.312:5%.554.3:591.3

ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРЛСТРУКТУРНОИ ОРГАНИЗАЦИИ БЛАСТШЕРОВ НА РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ И УЧАСТИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИИ В ПРОЦЕССЕ ГАСТРУЛЩИИ ВЫНА

03.00.11 - Цитология, "отология н эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кащщцата биологических наук

ТБИЛИСИ - 1350

Работа выполнена на кафедре цитологии, гистология и эмбриологии Тбилисского Ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им. И.А.Джавахишвили.

Научный руководитель: доктор биологических наук.

член-корр. АН ГССР, профессор Г.Д.ТУМАНИШВИЛИ.

Официальнке оппоненты: доктор биологических наук

Г.К.ГОГИЧАЛЗЕ. кандидат биологических наук Г.С.КВИНИХИДЗЕ. Ведущее учреждение - Институт экспериментальной морфологии им. А.Н.Натншвшш АН ГССР.

___ Защита состоится *$£)" /¿ЮКаЯ^ 1990 г. в ^ часов на заседании специализированного совета К 057.03.17 Тбилисского Ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им. И.А.Ддавахшзвили (г.Тбилиси, 38Ш43, ул. Университетская, 2).

С диссертацией шано ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " 1Ш0лЯг_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук,

доцент ¡ккм--Н.Ы.ЩНГЩЗЕ

л.....!"-- ; . - 3 -

1

^ I ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Одним из ваггнейших этапов развития организма являются ранниз стадии его развития. Именно в этот период определяется основной план развитая, сводящийся к относительно небольшому числу траекторий (Уодннгтон,1964). Естественно, смена одного этапа лругш требует как запускающих сигналов, так п различных факторов, определявдих выбор траекторий из их генетически заданных вариантов. По всей вероятности, первоначальные ответы на эти сигналы возникают в каждой из клеток зародыша, что, по-видимому, должно найти отражение в их ультраструкгурных изменениях, в особенностях и длительности клзточного цикла и свойствах, приводящих впоследствии к становлению относительно стабильных дифферэнцкровочных фенотшов. Сведения о разЕпиш организма и, в частности, его ранних стадий не будут полшага до тех пор, пока не будут вскрыты механизмы последовательного запуска этапов развития, цитологические особенности клеток зародыша, в частности, их ультраструктуры, пролиферации и т.п.

По всей видимости, взаимодействие клеток является кардинальным вопросом развития. Эти взаимодействия становятся возмокными благодаря новы?,! ассоциациям, фср.стр.ухщимся впервые в процессе гэструляцга. Гаструляция и в этом смысле представляет собой критический этап развития и диф$ерекцировкй зародыша. Выесте с тем, гаструляция является критическим моментом как для развития зародыша в целом, так и для дифференцнровки отдельных груш составляющих его клеток. Таким образом, изучение хотя бы некоторых сторон межклеточных взаимодействий и их. механизма в раннем развитии представляется несомненно важным и актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было более ил: менее комплексное изучение изменений, возникающих в клетках заро-

дапа в процессе запуска гаструляции, а также при действии внутриклеточных Факторов как одного из возможна механизмов, определяющих переход от бластула к гаструле.'В связи с этим, в задачу исследований входило: 1. Установление соответствия кзкду функциональным состоянием клеток и их ультраструктурной организацией на ранних стадиях эмбриогенеза вькка; 2. Исследование роли внутриклеточных факторов в процессе наступления гаструляции; 3. Установление участия внутриклеточных факторов в регуляции меточного цикла на ранних стадиях эмбриогенеза вьюна и 4. Установление связи кэхаду рост-регулярущими факторами и факторами, участвующими в процесса наступления гаструля-цил.

Научная_ровизнэ. Впервые показано, что в. ядрах зародышевых клэ-ток вьша локализован фактор, при воздействии которым происходит ускорение перехода зароднса от стадии бластулы к стадии гаструлы. Была выдвинута гипотеза, согласно которой, в процессе раннего развития в, ядрах зародышевых клеток накапливается соответствующий фактор и при достижении ш критической концентрация происходит запуск следугцэй стадии - процесса гаструляюш. Экспериментальная проверка этой гипотезы показала наличие фактора, ускорявшего наступление гаструляции в ядрах зародапзвах клеток вькна, начиная со стадии поздней бла-срулы (8 час.развития при 21°С). Вступление в гаструляцшо довольно четко связано с определенны},ш ультраструкгурнымл изменениями, поскольку их возникновение ускоряется в условиях сокращения времени наступления гаструляции, вызванного внешними воздействия!,® на зародьщ. Кроне того показано, что распределение рост-регулирущих факторов в клетках зародышей такое се, как и во взрослых тканях: ядра зародышэ-вих клзтск, начиная со стадии средней бластулы, обладают рост-тормо-зяцей активностью. Имеете'с тем факторы, ускорявдю наступление га-

- !э -

струляции, действуют независимо от рост-тормозящих факторов, локализовавших токе в ядрах н рогу жрущих пролиферацию.

Практическая значимость'робота. Поскольку управление онтогенезом имеет первостепенное значение для получения здорового потомства зкивнх организмов, изучение мохсшз;.:ов, регулирующих точение развития и последовательную смену стадий, имело Он безусловное значение для соответствующих отраслей медицина и мшотиоводства. Поэтому исследования, проводимые в данном направлении, несомненно являются практически значимыми. Действительно, вмешательство в процесс развития с целью управления развитием на уровне экспрессии генов едва ли мотет Сыть болео перспективным, воздействие на .опрэделешше звенья цепи, реалнзущей генетическую программу.' Таксе вмепательство монет оказаться болео доступным и, следовательно, технически оправданным, чем тонкие генно-инЕенэрные макнлуляции. Хотя в настоящее время нет вогмогсюсти предложить конкретнее нута такого Емс-иатель-ства в развитие организма, разработка подобных способов в недалеком будущем на основании полученных знаний в этой области, я в частности в настоящей работе, какзтся нзсс?/декно реалыюЯ. Результаты работы могут быть использованы при чтении курса лекций по цитологии и клеточной дифференцировке в высших учебных заведениях биологического профиля.

Апробпиия_работы. Материалы диссертации были прздставлены в виде докладов и демонстраций на 9-ой Международной эмбриологической конференции (Москва, 1569), Всесоюзном снкпозцуке "Механизмы контроля раннего эмбрионального развития" (Москва, 1974), Меяуниверситетской конференции "Современные проблема биология" (Тбилиси, 1978), Всесоюзном сг.тознуме Тогуляторные системы обмена веществ в раннем эмбриогенезе" .(Львов, 1979), Всесоюзном совещания эмбриологов (Ленинград. 1936), Республиканская научной конференции биологов (Тбилиси,1983),

а также на расширенном заседании кафедры цитологии, гистологии и эн бриологии Тбилисского государственного университета (1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения четырех глав изложения основного материала, заключения и выводов. Работа изложена на 132 стр.машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 8 таблицами. Список литературы насчитывает 197 наименований, в том числе 97 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на изолированных бластодермах и зародила* костистой рыбы - выша (Misgurmis fossilis L ).

Для изучения ультраструктуры бластомеров вьюна на ранних стада ях развития брали изолированные бластодермы на 6,7,8,9,11,13 и 15 часы после оплодотворения, инкубировавшиеся при температуре 21°С.

.Обезвоживание проводили по обычной схеме в этаноле и ацетоне, после чего материал заливали в эпон. Ультратонкие срезы готовили на ультратомз LKB-111, окрашивали 2%-шм раствором уранил-ацетата (на 50% этаноле) и цитратом свинца и просматривали в электронных микроскопах Hitachi ШЫ2 и SMB-100A. Подсчет количества пор на 1 мкм* производили на 40-50 электроногражах тангенциальных срезов ядерной оболочки.

Для определения изменений митотнческой активности в клетках блз стодврм вьюна при воздействии внутриклеточными фракциями проведены опыты с добавлением в среду с бластодермами, изолированными от желт кэ на стадиях средней и поздней бластулы, внутриклеточных фракций зародышей вьюна тех же или более поздних стадий развития. Наблюдали влияние ядерной или цитоплазматической фракций и ядерного экстракта

клеток бластодерм на гэтотечосгуто ятстлглосгь. Ро!!пп:тента:я слупил бластсд«5р:ш, гоо.-зфовап'пге от яалтка па сталяях В,7,8 и 9 час.развития. Прсподспг пгбггёсгся л":- 'яучошш соззгайствтя: ядэрпой факцип клоток бластодср-« ггяпг розглгх стздвЗ рлзкггпя; шпонлзтт-птлческой Фроюзп! ззродлэвы;: яхоток сына тот. та стадий; ял-эрлого гкстрзкта зародаизвюс клзток вьшз со стадпл средней гзстру.щ; ядерной л нлто-плззматичесноА фракций клеек: пзченя взрослого пыла; 7-глобулша сыворотмт бычьей кропл; 0,5М саг.рроэп. Клоточнла фэкщт приготовляли из расчета 10 бластодерм - лопоров на 1 бластолотзму - реципиент.

Kpov:e того, ядерную датопхг'зма'ппескую »¿рзкция, а тэк-:о ядер-пай скстракт кготск зарэ/кггЯ вькда, вводздгт путэл ^»кротнгеэкцпй за-poz;;nsM in 7ivo в с5ъг::о <0 гл по потоке» КПязезоЗ с сссгсгоряяя (1532).

Для спрэделзппя газпокй ютотоксксй пгяпкюстк сспостаплял.; гзмзнзкпе жтоклеского.пддмсса с язкозг!г:гм колпэствз клзток в за-роднп-э.' Количество клзтск опрэдояжпГ по числу адор. ?-йтотйческпй индекс определял: кегс отпепопг-з числа глете?: в поздней npof-ззз, про-кэтафзгэ. т'стййззэ п гга£зса к обгону ттслу клзток, внрагзппое в промилле. (Ротг, ШзвзлеЕа, 1957).

Во всех прогедешшх сериях опдаез, параллельно с опродолокием t.GiTOTiraccKoii ектсЕНости, сравнивала, количество бластодерм, достигни* стадтш гаструл! в опыте л копгролз. Показателен для идентификация стадии гастру.чч ерзпн&ла полвлепзо чоткого разграничения клзтох на два слоя, утолцешкз краевых участков и у:.!зпь::екке диаметра клеток.

Кроме того, рассмотрена ультраструктура блсстомэров зародаге?. вьша на стада: ранней гаструлы в условия* предварительного гаядействия ядэркой Фракцией кгэкас блзстодзри со стадия 12 час.рззртжя. Т;лс:-з сровздзко ра/а'сазтотр.зфачоское - лзучоянэ лзмэкекг';. /лтзяепь-кости бэлксиого спнхога и rcccszsz нгту?]:.'клзхсчз':"сг

- б -

фракциями зародышевых клеток. С этой цель» в среду с бластодермами, изолированными от желтка на стадии 7,5 час.развития, помимо внутриклеточных фракций, добавлялш меченые аминокислоты- лизин-!? к трип-тофон-С14. Материал заключала в параф:«!, изготовляли среза, которые после депара<1инирования покрывал? ашдкой эмульсией типа М (ГОСШИ-ХИМФОТОпроект). Экспозиция длилась 1 месяц при 4°С. После проявлении считали количество зерен восстановленного серебра на клетку.

Сравнение экспериментальных данных (опыт - контроль) производил; ПО I—КрИТЭрШО Стыодэнта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 15 ИХ ОбСУЯДЕНИЕ Улътрзструктурная организация бластомероввьгяа на .ранних, стз-

Поскольку наши исследования неразрывно связаны с динамикой ультраструктуры бластомеров, мы были винуадеш рассмотреть структуры, определяющие степень диф^решврованности, т.е. могуииз послу-гать как бн критерием перехода от стадии бластулы к стадии гас-трулы. Следует подчеркнуть, что в этом отношении мы опиралась на работы, опубликованные ранее (Челидзе и др., 1332), которые послугсиш для нас отправной точкой. Наряду с этим, указанные нами данные оказались очевидно неполны?« т.к. оставалась неисследованной цитоплазма бластомеров вьюна на стадии бластулы, а также ультраструктурная организация клеток бластодерм на стадии гаструлы. Нам исследования в некоторой степени восполняют этот пробел (Ктаналтшв! и др., 1933).

При исследовании ультраструктуры цятоплаз?ш клеток на стадии бластулы, мы рассмотрел! ультраструктурнуа организацию ядер тех х;з клеток. Полученные результаты полностью совпадают с данными Челидзе а его соавторов (1982) и подтверждают прздпологлкне о том, что ядра 'лэстсмеров вьюна на.стадиях ранней, сродней и поздней бластул обла-рядом морфолопггеснах признаков, характерных для нкзкодгЗфэрен-

дарования?. течете:;.

Цнтоплззма Оластог'-зроз развквакитася ззродняей вьюна на стадиях рзинеп, сродной л поздней бластула морфологически не имеет четко вирахенкш: отличий. На стадии средней бластулы в цитоплазме содержится большое число полисом, г.зтохоидркй с электронно—плотшш матриц— сом, йелточшх гранул, отлнчакяпхея друг от друга по размеру, встречаются мембранные пузпрьки ке пэсуплз па своей поверхности полисом, что дает основание отнести их к гладкой эвдонлазнатяческой сети. Отличительной чертой бластсшроз вила на данных стадиях является очень слабое развитие сесоковйтоа зидоштазкатической сети.

При болзз евльнон увэлачонзи по:ло обнаружить кекбранпые пузпрьки, котогиз щ-тштру^тсл в :■ ■•,:;) скаггпга" л чзего ?а:с.:э ско-илониа находятся вблизи щх-ыо офзршдного ког.илеггсз Годьдгг!. Иногда видно, что кокбрангше птзкрыс: хазпикгз? пз парной ядерной «забрани. Как отмечалось мзз, <>Зор:конзэЗ гэрохогатез зндоплозматячес-кой сети на дакшх стадггпх пет», однако встрзчаютсл гладкие мекброз-дао пузирыет, Е-зсздаз на сбооО по^орглос**"! о^пгочпнэ талпссиз. Хорошо развит шашке Гольдгз. Наличие впросгов церуагой кеабраза ядерной оболочки в цитоплазм в зону кодазохса Гольдгз, заншгпязакдася пузырыс£".и и щ'етерлгг:."., лзэт оспегагпе црзлюлогкть, .что у зародч-пзй вьюна формировал» ксмиокса Гольдаз, скорее всего, происходит путем отпочкопизепля пузырьков ц цистерн о? ядерной оболочки, подчиняясь направленному кзибрапнегау потоку. Эти данные согласуются с со-обрзЕешя:л*л Иорре и его соавторов (Цоого «Л а!., 1379) Не иашпопо, что в раннем развитии ззродцсеП шло образованно плазматической иамбрана происходят Гольда-ззвас^ял! путем, тают подчиняяет- угопл-цапу кзибрашого пото;:а, ко:: это описало для ппорцевой лягуахк (Моо-гз, 7алВзгСоийо, 1974). Т.к. со-первих, шмл отмечено болеете количество «ккбрежж: луакрькав, прождудастнопно рзсполог^тг^гх з гоио

комплекса Гольда! и, во-вторпх, наличие хорошо оформленного комплег са Гольдки в период, когда не происходит активной секреции, при вас кой митотпческой активности н в отсутствие роста, характеризующих стадию бластулы, трудно представить, чтобы клэткк запасались структурами, не икокеики конкретней функции. С началом процесса гаструля щгл комплекс Гольдаи приобретает более чгтко вирахлшую функцию. П{ клеточках пэрзыещекшх, нэсбходшзх для процесса гаструляции, одну из вйгких ролей игрезт адгезия клеток. Компоеонтп вас неточного ма: piu.ee, осуцоствляк^гэ едгозигааэ свойства клеток, синтезируются г ксжлс-ксо Гольда: и пзрехгравллются к :ж?оч?.оП поверхности через кексрагааэ пускрнгл, опороатазиася путем экзэютоза. Слодоьателън: иалэтга хорого сфок,-лонного хс;,плебса Гоеьд-С! уги за стадии бласту.': обусловлено не готовностью клеток к далыизменениям, связанна с дайсрзпцяроБКОй, а необходимостью пополнения мембракызго матера: лз в быстро разгтогзхг.оЗся ЕлззочьгЛ популяции.

Ультраотруктурпму '¿с; опекая, 02.;£чсшшз нагл: ни стадии гаснул согласуются с бяотяяеех?.® изменениям, харзитернжк для донке стадии. В отлпве от стада: бластулы, гдз общая юрфологяя бластсмо ров :ш стадиях ра:гпо^, сражай и яоздаей бластул приблизительно однотипна, при г£струллшш появляются розлдчш: мзгду ультра структуре;; ранкой, средней и иоздяэа гаструл. При эхом, ультрзструктура блас-токороз на стада: ранпоЛ гаструщ мало отлпчаэтея сг таково:! стадии бластул^. Хотя, в оътдмо от сгагяа блссгуи, в ядрах пдаы нзболь-гт,;э но разрнхлоннир щрвхш с хорошо варазеназа грэнуяярагм гхюаю-кентом, расиологсэнЕы© хгрэаибранно что, дзжно быть, соответствует интевсЕфЕсащга белкового сикоза к началу гаструллцпл. На стада средней гаструли количэстео пор, подсчитанное на 1 ¡¿зг, уввлачлвг отся в 1,5 раза. 11а стадия бластула у ервддем 43 пэр на 1 на стадия ранней гаструли - 49,7±1, а на стаде; средней гссгрулц -

71,7± 2. Значительно чаще встречаются пор:з с низкой электронной плотностью, что ногат указывать на охтизацая екпгеза Р!Ш п белков. Ядргако заметно разрыхляется, в нем погл'.тотсл признаки пуклоолоием-ной структуры, возрастает колгтзетво гранулярного компонента. На стадии поздней гастру.ш встречайся прсг>р;остазшго поры с низкой электронной плотность» и, при налгал хорошо развитого щж-гамбратюго хромаиша, когетт отражать дк^репцгаяьиуй работу гешмэ.

Что касается ультраструктуры цитоплазмы, в клетках зародышей на стадиях ранней и средней гаструл суаестЕЗКтгых изменений но отмечается. Органоиды распределен!; по рзЕнс>,:зрпо, з основном, вокруг ядра, на переферкм цлтопласш много сссбодкс: рибосом. Одзнжо пообходгао отметить появлеютз одзио'жнх округла цястзря, похргинх рабесомка, часто располог-липдруг'над друге:;. Их !.:о;яо сопоставить с пзрохо-вэтоЗ ощоплзз.'.мтнческоЛ с<зткз. 111 стядгп .гэ позтзШ г.?струл!1 "ог710 обнаружить яорспо озгоргглеалуэ гшдошгзгаатзчзскуз езть о тгшгшой структурой: цистерны эвдовласшгтлчзсксЗ со ¿а удшизпжо а исхргтио рибосомам. Появлзпкз сфрчлезпгаго порохогатого рпттсулугуп пп стадяп п&здаей гаструл? совпадает с началом производства кпогоства различных белков, гообходаглх для да'кгейлг Сргаяояян распределены равномерно по всей 1птопяг^:о. УКажяоясэ спзциалнзащш цитоплазмы, со своей стерс:т, повшгаэт здгезшшо свойства ккеток а их подвишюсть, что такго прздетахштэт собой одну пз форл даФ&зрен- • цировкл ни данных зтапах разЕптая.

Получению нз?я результата лапт ссшзсшгэ прэдпологпгь, что бластомерн вькиа на стадия блзстулы обладая? цолам рядом иорфологп-ческих признаков, характерных дал ктасодпф^рзгагароБатт клеток. Ультра структурно л организация клетстс па отадпи гаструлы, по-елдомо-му, приобретает черты, гзрактеркые для более даИорешщровааниг ток. Указанные морфологические краторгп могут служить определению

станет; дафрорешшровашюсти клзток. Кроме того, получение результата дают возкозиость судить о функциональной активности кок ядра в целом, так и отдельных его ко.'.шокентов. Особого вшианил заслукгзает факт, указывающий на то, что высокая частота нор и сильная инвагинация ядерной оболочки не всегда свэдзтельствует об интенсивном здер-но-шггозишзаатичэскогл обмене.

Одам из штересувднх нас вопросов было языеневав лролкфераяш-но2 актзшйости в кхзшзг бластодерм зароетой вьюяа на стадии позд-яэ1; бластула прп воздоЯотвгн вяутршшзточиша фракциям оародапюьых клеток вьюла разного возраста.

Получешшо па;,з! роультаты свидетельству»/? о тем, что ядерная фракция или ядзряыЗ экстракт зародшзвЕ:л. клеток вьюна вызывает торможение про^Горатпвяой активности в клетках бластодэрм выла упз на ранних стадиях скбриогепеза. Поскольку при добавления ядерной фракции и сроду с изслировашимл бластодерюга-решотентгш в бластодер-.-.и проникают не целые ядра, а вещества, ьыделяашо последшат, существенная разшащ в воздеКсхв;!™; ядэриой фракцией и ядорным экстрактом из наблюдалось. Однако воздействие ядзрнкм экстрактом проявляется несколько сильнее, так как ир* добавлена: ядерной фракции, прэдетав-лгасо.-й собой коловрездзшш ядра, при равном времени инкубации, необходимо некоторое время для поступления в среду, а затем в блзсто-'«орш, Факторов, осуществляющих рост-тормозязее влвкш (Таблица !).

Анализируя дакшо, полученные при различных соэшсшеншк возраста донора и реципиента, создается впзчатдзнле, что зародазешо кла-.•;*л, йчшя со стадии поздней бластула, содержат рост-рсгужрукцла . .1К1г,рл, которце внеиваэт изменение пролкфератЕБПой акткгностп в *.лпстодермах-рецяпиентах, но эффект их воздействия проявляется с

ТаЗлтща 1.

Изкепзпио колглэства клзток и гатотячзского гшдокса в бластодермах пьша при ЕоядеЯсгвка ядерной и кптспл5скзг:г:есг:ой <5ргот??яг«к зародкшешх клеток выжа резного возраста.

Зозрсст (донор/ рещш^оп?) Вариант опита к 1 Р ИШ Ь Р

1 16/6 К Я И 257 +11 езо±17 Ю?Л±23 3.0 2.5 <0.001 <0.0?, 35+2 15±2 ■1! +2 3.5 2.1 <0.002 <0.05

2 15/7 К .4 и 692112 575+9 5-"9±7 7.8 8,8 <0.001 <0.001 32+3 25+3 55 ±4 1.4 4.6 >0.2 <0.001

3 8/8 . к а /А ц 225+13 772±12 753±15 3.0 <0.01 <0.002 55+3 46+2 ЕО+З 2.5 1 Л <0.02 >0.2

/ 12/8 я ц 311+13 678±11 Р'ЛЗ-д 7.8 4.7 <0.001 <0.001 БО+2 46±2 55+3 1.4 1.4 >0.2 >0.2

5 14/3 к Я Ц 607 Б57±10 ¿43±3 3 Р и Гз <0.01 <0.001 45+ 31 ±3 4.1 2.0 <•0.001 >0.03

о 15/8 • . 1С ЯЭ 602+9 66о±12 2.4 <0.02 62+2 4.3+2 6.7 <0.001

7 15/8 л я ц 1.-56±10 559+М 723+14 5.0 4.1 <0.001 <0.001 29±2 20x8 53 ±2 . О 3.5 <0.02 <0.001

0 9/9 к я ц гем+ю б1п "О.Б <О.Ш! 23+2 12+2 25 ±3 5.7 0.8 <0.001 >0.4

д 10/9 к я 460+Э •'.34 + 10 ' 15±10 3.9 П 'л чО.С5 <о*.сЬз 55+3 25+2 19+2 8.3 10.0 <0.001 <0.001

10 17/9 я ц 645=1Д В75-!;11 »313*14 2.9 1.6 <0.С01 >0.1 57+4 25±2 22+2 7.1 7.7 <0.001 <0.001

11 13/3 1С я ц 507416 5С0МЕ> 04СШ7 2.1 1.4 <0.05 >0.2 25±3 22+2 50±3 I 0.8 5.9 >0.4 <0.001

К - контроль; я - воздействие ялегаой Ц - цнтоплг:

ЧОскол фоакгазЛ, ЯЭ - я-евни-м экстрактом; !>• - число клеток в % г.г-о-дэрмэ, ютготлчоскгЯ индокс, г - кратерай Стыздзнта, Р - вьрм:-

поать случаЛпоЗ сииСкн.

различной пнтенсшаюстьз и оашкяаюстя и от возраста донора, и от возраста реципиента, и от разгоща мззду возрастом донора и реципиента. При сравнении этих соотношений оказалось, что действие ядерного рост-тор:озя!;эго и цитоплазыатического рост-сткмулирувдого фзктороь проявляется по разному в том отношении, что ядерный (¡актор вызывает подазлезиэ пролкфаративноя активности во всех вариантах проведанных опытов, действие ей Ц'логошматичэского фактора проявляется не однозначно. В некоторых вариантах огатов цнтоплазматичоскиа фактор сти-иулфгот ирол:г.ф)ра'ИЖ11ун активность. Б другие случаях штотнческий нндакс шшадогся по срашш» с контролем, однако сопоставление с И2а»н-3!ЕШ кшкчоегга хуйток помазало, что, б основном, полагаю» 1е,токкзс.чого явдокса лрззегодат за счет изменения продолжительности фаза ьзтоза, поскольку цзианвнка даших двух парамотров происходит в противоположно:.: исправлении В то врогля, как подавление клеточных деланий вслэдствнэ воздэАстаия ядерной фракцией или ядерны;-,! экстрактам в бол1ИЭ1! мор пропеходгт за счат увеличения продолжительности остальных фза клзточвого цш:ла. На это указывает однонаправленное изменение мито.тичзского якдаса и количество клеток.

Сравнивая результаты, получэшше на изолированных, бластодермах и нятшетшх зародавах, оказалось,, что рост-тормозящее воздействие ■ ядерной фракции или ядоркого акстраигго клзток Олгсгодзрм-доноров од-с кого и того возраста сильное проявляется в изолированных бластодермах. Это, на наш взгляд» вызвано таи, что в опытах с применением микрошьакццИ, рост-тормозяцио факторы, до того как они достигнут бластодэрм, разбавляется в полчка и пх дэйствиа опосредовано влиянием веществ, находящихся в :;олткз. Что. касается рост-стямулнруюцего действия цатоплэзкатачзскоа §ракцш, необходимо откатить, что повышения пролпфзративноИ активности при введзшш послэдиэй путем микро-ияъекщй, ш не обпарутш (Таблица 2). На «газзвьот рост-стимулиру-кцего действия п цятоплазматическая фракция клзто:: печени взрослого

выча. в осталышх го случаях цатропласкатггас^л фрамш повтсаот нролпфорэтивную активность В бЛЧСТ0ДОр:?аХ-р01С.аШ0НГаХ, 'Л с уволпо-нкен возраста донора эффект усаяяЕзотся.

Таблица 2.

Изменение количества клеток и матотшеского алдокса а бластодормах вьюна при возг<ейств?т ядерной и цитоплазматиаосхсй фракцажи зародышевых кл-этог. пьенз.

Л Возраст (донор/ реципиент) Вариант опыта I) г ? иш V- р

К 437*8 74*4

Я •117*10 1.5 >0.2 67+3 1.4 >0.2

1 15/8 ц 420±Э 1.4 >0.2 74*3 - -

ЯЭ 359±8 в.9 <0.001 59*2 2.Л <0.001

с 565*11 9.4 <0.001 10Э*4 в. 2 <0.001

2 17/8 к я ц 621*11 445*12 507*6 10.8 9.1 <0.001 <0.001 59±3 47 ±3 ё8.'3 2.8 0.2 <0.01 >0.5

К - контроль; Я - воздействие ядзрной фрзющзй, Ц - шггсплэсчати-чоской фракцией, ЯЭ - ядерным экстрактом, С - 0,5.4 сахэвояа; И-число клеток в бластодерме, М - митотпчесгатй кпдо;сс, X - 1срат6ргЗ Стьпдэн-та, Р - вероятность случайной оиабка.

Необходимо отметить, что поЕшензм пролл^орэтавсой актаваостп четко внрахено при введении путем какрошгьекцля сахарозы. Этот факт деот основание предположить, что действио ядерного рос-г-торглозягцего фактора додало бить значительно сильнее, чеп га обнаруживаем. То па самое ыояао предположить а отЁосотшьно цятоплазматачэскоа Фракции. В последнем случае сгацгдирукЕкй аффект ксгт.о приписать не столько цатошпоматачзской фракция, сколько сахарозе, а датоплазма-тпчвская фракция вовсе ко оказывает действия.

Следовательно, полученпиз нзг.и результаты показали, что способность» вырабатывать рост-тормозяцио фактора обладают на только дифференцированные клетки, но и зародаювкв.

С'Д'лсг:зуьт прэдполокение, что рост-тормозящий фактор мокет дей-

ствозать на клетка как апокрзнным так к пара- и ондокришши способа-га (Кусзнь, СтоПка, 19(35). Следовательно такая модель подразумевает роцопторный кзхснцзм хойсткш фактора на клетки. Ь'окно предположить,

азрод^евш) ¡татке обладай? разлпчншл! рецепторами, способными рэагаровзть из рожчкзэ всздойс-итзя, а по мере развития и дифферен-иярокса, галачосгво рецепторов для каждого определенного типа клеток ограничатся н на урозие клетка способны реагировать лизь

пи гдулоспз«г.£:лескео ьоздайстлчз. Кроме того, ограниченно количества рацезт-.'оров и ех Ешровлвккс "?ь делают возкогзша усилить эффект подобного Бй'ЗДЭ&сжшл. Следовательно, кото допустить, что в регуля-щш нрол:вХорг\,гЕНОй активности сукэстваннуэ рож-, играет не только возраст дошра, но к рзцпзкэыта. Крош того, поскольку к концу блас-яуляща (сгадпл цсшлъзусжх нагл бластодергл-рэцшпгеитов) в клетках вройохолих- собапк, сбоеиачивакщэ дальнейшее развитие, по-вздимоглу, в зтог нсрлод гиль еплыплз сигналы когут достичь цели и выз-

вать сооувотствукцую роаэдаз.

На 0С20ВСПЯ2 Еолу-юисгг дсншгх, нам кажется вероятна; щтшшт суи,9сгБо;г-:з2 роет ^оы^еъочя^. Егажэдействий в регуляции проягБира-■пзной. акэта^сстй на иас^едуе:'32. стадиях развития зародышей вьюна. Одгк^л ка взи,агкх кэхажшсв дал осуществления данных взаикодэйст-вий цс>115'Г с^г^хь ьжиэшдл едзряо-шяошазыатического отпзгзкгя. Однако 1ш с&зе раннсп. аа&из. рссвзгпя (сэрззод дрсбхзааг) по гго-Роту (1834), 'в*шяи£ ядерао-ц^топлзжлатпчоского откэпенпя но |.юг:зт бать запуска долена клеток, гак как сна постоянно

ШХЭ порогового урС£Ш. В ЫЕ2НГ ОШТЭХ КЕЦ ЕКСвМ ДЭЛО с ЗарО/уДЛг.'К на более поздних етздкях развития и, следовательно, факторы, осуществляющие взагггодвСстхо "зкду кпеткамя соответственно когут рзгули-ровать прол:;ферат1шиуы активность в зародышах, блокируя клеточные деления на определенных этапах дазйереншровкн.

лаш-

Во всех сериях опытов т веля пабгэдокио аз ваступязпвеи процесса гаструляшга в условиях воздействия ваутрЕсл>точапдаа фрашвага сародасевнх клеток из изоляроваяшэ бдастодор:а зкгяа. О заступлении гаструлчции т судили по морфологической ::зр1нго па гистологически. препаратах. Однако пг*©пэния, наступсетяо а бластодермах, полностью отождествлять с гаструлягжой ta vivo аз совсем прзгсмочло, поскольку получить на изолированна бластодэрмх те гэ щшиг;ш гас-трулягла за столь короткий срок инхубзшп, новозмогаю. Но кесг-онше показатели, такие, как появление разграничения нелегок за диз слоя, уголдзшьз кргсг'.а: участков и укэньгешге дазкэяра клзге;:, а та:-» даякпэ, полученные по ультраструтстурз <йасто?£Зрэв ~л рззулздата рэ-даозвтогргфпеского изучения синтеза тотального Солка, izi спггйсм, даст основание судить о пролеходщзх аз^ЕОГПЛз, как о протеса наступления гаструляцпи.

По предварительному предпологонизо гн-самая» t чю нзетупленио гас-трулянш долгзо било произойти в тех случаях, :сох\ца в сроду с изолированная бластодеркачн добавлялась ядерная фракция зародазеЕШс кл-этсл. Рассматривая результаты оказалось, что наступлэнпо гаструля-ц;гя ут'.скоряэтсл как кри воздействии ядерной фракшзй, так к нвтопла-зматкческой. При этом, процент ебнаруизнных "гаструл" всогла вкше при использовании ядерной фракции. Особо елодует ответить, что при пнкубзнии в течение Зх часов при текпэратуро 20°С 8-часовых зароды-пс-й без какпх-лгбо воздействий в контроле па удавалось обнаружить пи одноЗ "гасгрулы". Это обстоятельство делает факт ускорения гаст-руляшш ко со1-не itmtx.

Нш* д?1 снп-етельствуйт о тем, что фактор, ускоряющий наступление гаструляцип локализуется, в основном, в ядрах, хотя он име-

отся к в цлтоплагке. Крс.чэ того, интересно отметить, что данный фактор обнаружен на разншс стадиях развития, начиная со стадии поздней бластулы (8 час.развития). По нащкм результатам, наиболее высокая концентрация фактора, регистрируемая по числу "гаструл", наблюдается в случае использования в качестве доноров 12-часовых зародышей, стадия , когда зародыли активно вступили в гаструляцию. На более поздних стадиях активность фактора заметно уменьшается. Немного его и в клетках зародышей со стады поздней бластулы. Если инкубации с внутриклеточными фракциями продлить на один час, т.е. проводить ее в течение четырех часов вместо трех, несмотря на то, что в контроле уяе косно обнаружить "гасгрула", действие неточных фракций на процесс нзс^ушгзнш гаструлящн шракоко четко. Активность фактора при воз-доСстшв ядеркоа фрадцаеЯ п здесь относительно вале при использовании 12-часовых зарод&зй-доаороз. Кроме того, м в этом варианте опыта подтверждается пред:»уцествз1шая локализация фактора в клеточных ядрах.

si'oro, ечнтазм очень вяггным подчеркнуть, что ни 7-гло-булш сыворотки бычьей крове, ни ядерная, ни цитоплазматическая фракция клеток печена взрослого вьюна не ускоряют наступление гаструля-ции в бластодерлех-рэцашеитах. Следовательно, действие фактора, ускоряющего гаструляцию, снецй&гшэ для зародышевых клеток. То, что ядра клеток нечвЕЕ вьвиа не обладают способностью ускорять наступление гаструляшш, кз позволяет приписать ускорение гаструляции какому-то неснэцздическоку фактору, например, обогащению среды калием (Ротт п др., 1978) п т.п. и служат однш из аргументов в пользу направленности его действия.

Подсчет клеток з&родааай показал, что ускорение гаструлящш не связано с увеличением числа клеток в зародышах, и следовательно, фактор, ускорявший гаструлядаю, не действует на митотичеекпй цикл. Под

Еоздействкем данного фагстора зароды вступает в гзструляцаи приблизите лъко'с том гэ числом клеток, которое характерно для контрольных бластул. В тех случаях, когда число гаструл иовзлкко, oici вряд ли могут повлиять на среднее число клеток в бластодерме. В опыте с применением 12-чэсових доноров, разница долкяз била быть супсствзянсй, т.к. количество "гаструл" здесь бользго я среднее число клэтск на бластодерму долггно было быть, соответственно, зкгз. Однако а в зтсм случае количество кготеж не прэв'_гйэ? такового в коптроло. Следовательно, имеем основание прэдгголегаггь, что фактор, ускорпэ-наступгетге гэструллгапх - от^елилтй 'фактор, д-зйствуггднй пзчзвп-с:гю от рост-рзгулпрзгсстз: чсктороа, скаьчзвс: - :,пх 15:;пл;л:з из iipcjar.c— рлщпз еттгок в бластодерме.

Посгдпннмм подтвередзв^м ус:ссрзк;;я процессов ;с:4&эргшсг!ровкп, на П2П взглл", являтся результат изучения удьтрдструктурм блесто-мерев п услсЕмях сосдс-йствпя ядзрпей ¿узхцтл з^ро;j:fOKAx ясо^ск зьп-нп. Iis:: отмечалось зпзгз, прл опасснш деявге.» imy^cEffiii глектроадо-• спсроскоппческга !.:етодом, раннее расшитое характеризуется четко вц-рамонкол сменой ультраструктурнсЗ ортавизацги зародк-'окп: клеток. Особенно отчетливо эти различая ксгзю ебнаруггять в процесса гастру-лятггл. По ультраструктурной карталз мо^дю отличить клетки бластодерм:.? со стадии равной гаструлц от тгжовах со стадии поздней гаструл;, о го отражено а в строения ядра (степень ксндонсаши хроматина, прэоблг!дайг:п пер с низкой элзэтрспюа плотпостьп) и п строении шпоил53!.а (наличие хоропо офэрмлс?шой' газрспсватсй эндоплазма-пиеской с-этп). При воздействия ядерно»! фракцией зародив пых клеток вьюна з бсистодэр'ах-рзцщшентах ультргструктуряаэ • изменения, характерные для стадиа поздней гаструлн, появляются упе на стадии ранней гастру-ла: в ядрах обнаруживается кевдопеярозгашй хроматин (в ядрах клеток ковтроль:ша бластодерм преобладаем двфЗузшй хроматин), а в цитопла-

зыэ клеток блзстодерц-рэцшшентов отмочено наличке оформленной ендо-плазкатичвексЗ сети, цистерны которой удлинены и покрыты рабосоти. Такая каркша задошиазматЕческоя сети, в интакткнх зародааах, характерна для клеток С.-зстодерм со стадии поздней гаструлы. Следовательно, ми аюз;.5 основание утверждать, что воздействие ядерной фракцией зародазекк кяэтох вызывает в бластодораах-рецшшентах ускорение процессов даЗ$эронцаровкп, в /••¡ътраструктурныэ изменения," происходящие в клотках бластодерм выела из стадии поздней гаструлы, отчетливо проявляется, в данных условиях, ¿а» на стадии ранней гаструлы.

Нэскогря на то, что морфологическое проявление ди?феронцировки, Усткювлэнеоэ на газ-тологЕчэсгаа препарзтах в ссотовом микроскопе, подтаэрэдзатся якавши, по кзучеыш улътра'сгруктурной организации бластокаров, о сочли необходима* проворить изменение интенсивности евнтезо бехков - дпгичэского критерия дафференцировкк на зтпх стадиях развитая - в условиях воздействия внутриклеточными фракциями. С этой целью были проведены оздга с применением радиоавтогрзфин к полученные результаты, на нас взгляд, подтвердили факт ускорения гас-труляцкп. Елосто с тем, в зависЕлостн от того, какое время длилась инкубация с внутрикхеточными фракциями,' изменение внтонсибности сип-теза белков происходит по разному под воздействием ядерной ели цято-плаэматкчзской фракции. Через 1,5 часа после добавления внутриклеточных фракцЕй' хштенсивкость белкового синтеза усиливается под воздействием цктоилазкатической фрщщки, действие ядерной - проявляется незначительно. Б то врзмя как в первые 0,5 часа происходит заметное повышение интенсивности синтеза белков исключительно под воздействием ядерной фракции. Обращает па себя вншлашз то, что, как следует из результатов наяпх опытов, отмеченные изменения зависят не от момента введения в среду меченых аминокислот, а от продолжительности инкубацаи бластодерм с соответствующими внутриклеточными фракциями.

Единственно возможным объяснением нам представляется предполо-кение о том, что при повышении скорости сштезз белков, повышается скорость их деградации. Поскольку поя влиянием ядерной фракции скорость синтеза белков повышается резчэ и раньше, распад белков проявляется раньше, компенсируя к определенному мсыенту опыта поЕвшение скорости их синтеза. При воздействии цитоплззматкческой фракцией по-Еииеняе скорости включения ашшокислот происходи? медленнее и через 1,5 часа с начала инкубации еще не скомпенсировано ускоряющейся деградацией белков. Такал образом, фактор, ускоркхпкй гаструляцню, очевидно влияет не яз какую-нибудь из фаз обмена белков, а повивает интенсивность белкового синтеза в целом . Наши данные являются косвенным подтверждением результатов Казо (Liano, 1Э70, 1975), также показавшего деградацию белков в ходе цжлпческах колебаний интенсивности синтеза белков л' зародышей иглокоаих.

Полученные нам результаты согласуется с эдеказаппой гипотезой о роди ядер и ядерных факторов з "запуска" гаструляцян. Нетрудно предположить, что таюми "запускаша^-и" факторами являются определенные вещества, локализованные в ядрах зародкпзй, концентрация которых позывается с повышением числа ядер на зарода; по мере дробления и бластуляции. Подобное повшениэ концентрации действительно монет происходить, поскольку объем зародцией на этих стадиях не меняется. В настоящее spein было бы неостороаным утЕерлдать, что механизм "запуска" гаструляшш полностью исчерпывается подобным механизмом. Однако вполне вероятно, что он является одним из звеньев или этапов процесса, обуславливающего начало гзструляции. Определенным препятствием для обоснования наше£! гипотезы могут оказаться данные Кука (Cooke, 1975), показавшего возкошость развития зародыша в то Ерэтля, когда деление бсдьсей части бластомеров зародыза шпорцевой лягушкя остеновлзно з кетафазе действием колхицина. Однако, возможее

скорость сшгеса фл-лора, спзсойствукцего наступления гаструляции, тьк^э его Еакоддэюхо в ядрах, опрэделяется ко числом ядер, сг.\тЕ,5 по себо, а чьсло;.: геномов, которое возрастает независимо от остановки катозоз в кагафазо. продиолох-счспэ там Солее правомочно, чт

ядерная фракция ьародашйД! клеток высаа скорее торг.озкт мятотичес кую активность, чэ;; швааазт >:-*з. В то г:з время, цнтошшзматпческгя• фракция Либо по£&дшт ?."Лтох;.-:; сгув активность, диЗо вовсе не влияет на нее. Хотя цитоллаг^атичус^я фракция такш ускоряет наступление гаструлкцйи, ко ь цень^аС г;.зро, чем ядерная. Полученные даннне еще раз шдтБэр^дзш' ьисказаккоэ ралзо предположение, что днффзренциров ка на всегда еосхко связана с ьатотячзехиы шааом с см. обзора: ту-ьзшээдда, 1&?7; Сигл1п£з, Войз, 1534; Ушайа, 1534) и нодавлоЕпз ютоастэского пасла ез значит подавления да®еренцпровки, если зз одно из ее проязлзний считать таструдяцн». Напротив, по-видагоыу. ускоренна геструляцш: (дайзренцпровкп клеток) ыо^зт сопровождаться поЕшениам щхихфератнвноЁ активности. Судя по налим даншг, кастун лешю гаструляцпп не являемся непосредственным результатом увольнения числа клеток, а представляет собой следствие повнвзнея концентрации одного из ядерных факторов. При введении зтого Актора извне ззродьа для вступления в гаструляцпи не нуждается болзе в угеличеш: либо числа геноков, либо числа ядер в нем, поскольку критическая концентрация ядерного фактора оказывается достигнутой. Следует подчеркнуть, что изложенные выле соображения требуют для га полного доказательства, дополнительных исследований и представляют собой лшь одно из звеньев цени событий, приводящих зародыш к гаструляцпи.

ВЫВОДЫ

1. На основании исследования процесса наступления ггетруляц.:;; путем изучгння обцэй кэрфагоии, удьтраструктуряог организации, а

таете радиоавтографического анализа изменений интенсивности синтеза белков в бластодермах вьюна в условиях воздействия внутриклеточными Фракциями зародыпевих клеток разного возраста, выявлено, что ядра клеток зародышей вьюна содержат фактор, ускорявший вступление в гас-труляцшо бластодерм-реципиентов.

2. Ультраструктурная организация бластомеров отрэнает их функциональное состояние. Вступление в гаструляшга довольно четко связано с определенными ультраструктуршш изменениями в зародышевых клетках, поскольку их возникновение ускоряется в случае сокращения времени наступления гаструляшга, вызванного внешни,® воздействиями на зародыш.

3. Ядра зародышевых клеток вьша на ранних стадиях развития, начиная со стадии поздней бластулы (8 час.развития), обладают рост-тормоэящэй аЮТБПОСТЬ».

4. Имеются основания предположить, что распределение рост-тормозящего и рост-с табулирующего факторов в клетках зародышей выша такое se, что и во взрослых тканях.

5. Факторы, локализованные в ядрах зародышевых клеток вьюна и ускоряющие наступление гаструляции действуют независимо от рост-тормозящих факторов, таете локализованных в ядрах а регулирующих пролиферацию клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TS.ffi ДИССЕРТАЦИИ

1. Внутриклеточные факторы, регулирующие процесс гаструляции. в кн.: "Демонстрации на IX швдунзродд.эмбриологической конференции". П., Наука, 1969, с.80 (соавт. Г.Д.Туманишвили, Н.А.Дданашвили).

2. Исследование внутриклеточных факторов, регулирующих процесс гаструляшга. В кн.:"Механизмы контроля раннего эмбрионального разви-

тия", Тбилиси, Кецнкэреба, 1974, с. 105-107 (соавт. Г.Д.Туманишвили)

3. О механизме "пуска" гаструячции. Известия All ГССР, серия биологическая. 1975, 1, & 2, с. 142-147 (соавт. Г.Д.Туманишвили).

4. Изучение зависимости синтеза белка от факторов, ускоряндих процесс гаструляшш. Тезисы i-'.е гуняворсите тской конференции "Современные проблемы биологии", Тбилиси,' 1978, с. 44.

5. О механизме запуска гаструлядаи. В кн.: "Регуляторные системы обмена вецзств в раннем эмбриогенезе", Киев, Наукова Дуика, 1979, с. 47-49 (соавт. Г.Д.Туманишвили).

6. Ультраструктура кнтерфазннх п делящихся бластоыеров вькт в норме и при воздействии ядерными факторами. В кн.: "Закономерности индивидуального развития кквых организмов", F.5., Наука, 1936, с. 58 (соавт. П.В.Челидзе, Г.Д.Туманишвили).

7. Изменение глттотической активности клеток бластодерм вьша на ранних стадиях развития. Труди конференции "Проблеш экологической биофизики", Тбилиси, 1933, с. 69-72. .

8. Изменение интенсивности синтеза белков в раннем развитии вьюна при воздействии внутриклеточными факторами. Материалы республиканской научной конференции биологов. Тбилиси, 1988, с. 32-35.

f'CjMdUL