Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ некоторых параметров эмбриогенеза нормальной и трансгенной радужной форели

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ некоторых параметров эмбриогенеза нормальной и трансгенной радужной форели"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ нм. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ДЖАББУР Рами Нофал

575.113:597.5:597.553.2

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ПАРАМЕТРОВ ЭМБРИОГЕНЕЗА НОРМАЛЬНОЙ И ТРАНСГЕННОЙ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ

03.00.11 — эмбриология, гистология и цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1991

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Шсковского государственного. университета имени Ы. К Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Голиченков а А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мамонтов С. Г.

кандидат биологических наук йакеева А. а

Ведущее учреждение - Институт биологии развития ьН СССР им. Н. К. Кольцова

Зашита состоится "17" октября 1991 г. ь _часов на заседании специализированного совета Д. 053.05.68 при псковском государственном университете им. 11Е Ломоносова по адресу: 119899 Мэск-ва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан " 16 сентября 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

■г svp .............

vGW'' г'J * i* г. u'- j -

*r j

.,. Актуалы гость пробхаыа. Раскрытие генетического кода и последо-

вавшее аа этим развитие молекулярной генетики сделало возможным ■.^конетртирование специальных нуклеотидныХ последовательностей, состоящих из функционально завершенных блоков, включающих сигналы управления тран- :рипцией и собственно гены или. их кДНК-копии (Щелкунов,1987). Использование техники рекомбинации фрагментов ДНК позволило создать конструкции, обладающие способностью встраиваться в геном организмов любых систематических групп и там нормально экспрессироваться (Горман, 1988). Тем самым была открыта возможность клонировать отдельные гены и использовать их для генетической трансформации отдельных про- или зукариотических клеток, а гагаке многоклеточных организмов (Jaenisch, 1988).

Новая область естествознания, получившая название генетической инженерии, привлекла к себе внимание биологов не только потому, что с ее помощью стало возможно получать животных с такими признаками, которых ранее у них не было, но и в силу того, что инеерция трансгена в хромосомную ДНК представляет собой введение в геном информации, написанной на том языке, который геному понятен, и следовательно, ответ на интеграцию новых фрагментов ДНК будет всегда адекватен. Надо полагать, изучение функций генома, особенно в плане его онтогенетического раскрытия, получит значительный толчок благодаря развитию генной' инженерии.

Начало эпохи трансгенных жив&гных может быть датировано 1982 г. Именно тогда Шльмитер и Бринстер опубликовали первые результаты по введению с помощью микроинъекций гена гормона роста человека в пронуклеус и цитоплазму зигот мыши (Palmiter; Brinster, 1982)

Уже через 2-3 года стало ясно, что быстрых положительных результатов, используя в качестве модели млекопитающих, добиться не удается. Тогда, практически одновременно в разных странах внимание исследователей было обращено к рыбам (Maclean, Talwer, 1984; Rokkones, et al. ,1985; Chourrout, et al. ,1986).

Особенности биологии развития: большое число созревающих практически одновременно яйцеклеток, наружное оплодотворение, относительной короткий период эмбрионального развития, проходящего полностью в контролируемых и доступных для наблюдения условиях, необычайные возможности по клонированию, получению гетероплоидных жизнеспособных потомков, пол которых можно переопределять гормональны-

ми воздействиями,- а также высокая хозяйственная значимость и доступность - сделали рыб самым перспективным объектом генетической инженерии и прекрасной моделью для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины (Lewis, 1988} Maclean, 1989).

Генетическая трансформация высших эукариотических организмов, за исключением некоторых специальных случаев, выполняется на стадии зрелого оплодотворенного яйца. Поэтому весь эмбриогенез протекает под влиянием трансгена,, который в этот период может пребывать в самых разных состояниях: эписомном, ассоциированном и интегрированном, В первом случае это - относительно устойчивые, объединенные в кольцевые формы структуры, обладающие способностью к редупликации, не конъюгированные с хроматином ядра Во втором - ядерные формы, временно связанные с хромосомами, и в третьем - интегрированные в них. Понятно, что как присутствие трансгена, так и его возможная экспрессия могут нарушать ход нормального.развития. Кроме того, сами генноинженерные манипуляции часто являются причиной появления уродств и аномалий развития, нередко приводящих к лета^ному исходу (Мерфи, Хэнсон, 1989; Capscchi et al. ,1989; Chen, Powers, 1490).

Нормальное эмбриональное развитие рыб, в том числе лососевых, представитель которых - радукная форель - была объектом данной работы, исследовано достаточно полно (Игнатьева Т. Ы. ,1975,1985.; Павлов Д. А., 1990 ). Данных же о девиациях нормы и тем более о ее нарушениях крайне мало, а в отношении влияния на нее процессов генетической трансформации - просто отсутствуют.

Цель и задачи исслэдования. Цель настоящей работы состояла в том чтобы охарактеризовать - некоторые достаточно общие параметры эмбрионального развития зародышей радужной форели в норме и при генетической трансформации. Достижение указанной цели связывалось с решением следующих задач:

1. Определить статистические свойства безразмерной единицы измерения биологического возраста зародышей (to) (Детлаф,1977)в отношении группового развития и исследовать корреляцию между ядерным и клеточным циклами в раннем эмбриогенезе. Выполнить сравнительный анализ продолжительности клеточных циклов у контрольных и трансформированных эмбрионов.

2. Исследовать характер распределения зародышей нормальной и

трансгенной радужной форели по времени вступления в стадию для выявления (а) ее начала - по передовым зародышам, (0) среднего времени - по вхождению в нее 50% зародышей, (в)'максимума развития - по удельному весу зародышей данной стадии и (г) времени существования стадии - по г 'риоду прохождения череь нее 957. зародышей данной группы.

3. Изучить характер дробления Оластоднска в цитотипическом периоде развития и определить пределы дисперсии размеров бластомеров в норме и при генетической трансформации.

4. Классифицировать аномалии развития и уродства у. трансформированных и нормальных эмбрионов радужной форели.

Научная и практическая значимость результатов исследования.

Впервые "показано, что распределение эмбрионов одинакового астрономического возраста по признаку достижения определенного биологического возраста происходит по закону, близкому к логарифмическому. (Лог-нормальное распределение). Установлено, что нарушение синхронности клеточных делений тесно связано с нарушением равномерности дробления бластодиска. Впервые установлено, что избыточное количество рекомбинантной ДНК, вводимой в цитоплазму яйца, приводит к тран-зиентному увеличению продолжительности клеточных циклов. Доказана применимость метода "генетического пистолета" для стабильной генетической трансформации'рыб. Определено, что интеграция трансгена и его экспрессия может служить причиной с/величения частоты аномалий развития. В целом, полученные результаты позволили значительно уточнить некоторые общеизвестные параметры нормального развития радужной форели и создать важную для практического рыбоводства шкалу стадирова-ния эмбриогенеза по статистическим признакам, а созданные с применением генов гормона роста трайсгенные особи радужной форели отличаются от контрольных более крупными размерами и могут быть использованы для генетико-селекционных целей.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на семинарах кафедры эмбриологии, представлены »а УШ Всесоюзном совещании эмбриологов (1991).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, об-гора литературы, описания материалов, объектов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на страницах, включает в себя таблиц, рисунков. В библиографическое описание включено названий.

ОБЪЕЭТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась в течение экспериментальных сззонов 19871990 г. г. на кафедре эмбриологии биологического факультета ЫГУ. Сбор материалов по нормальному эмбриональному развитию радужной форели проводили в форелевом хозяйстве "Аравузе" (Эстонская Республика) , Эксперименты по генетической трансформации проводили в том же хозяйстве и на кафедре эмбриологии. Обработка полученных данных выполнялась с привлечением методов вариационной статистики. Мэлекуля-рно-биологический анализ выполнялся в Институте молекулярной биологии им R А. Энгельгардта АН СССР. Бее остальные способы исследования и обработки материалов применялись на кафедре эмбриологии.

Объект исследований: Основным объектом исследования служили развивающиеся эмбрионы радужной форели. Радужная форель (ранее -Salmo gairdneri Rich., о 1989 г. - Oncorhynchus mykiss Walbaum) содержалась в форелевом хозяйстве "Аравузе" , где в период ее естественного созревания проводили искусственный нерест. Икру и сперму получали сцеживанием у предварительно наркотизированных хинальдином самок 4 - 6-летнего возраста и 2 - 4-летних самцов. Парта» икры от отдельных самок оплодотворяли смесью предварительно тестированной спермы т.н. сухим ("русским") способом и инкубировали при постоянной или переменной температуре. В некоторых экспериментах модельного характера использовали яйцеклетки данио рерио (Brachydanio rerio). Производителей данио содержали в аквариалыюй. Использовали естественно созревавших самцов и самок, которых- в ночь перед экспериментом ссаживали в нерестовый аквариум, в котором поддерживали температуру около 26 °С. Вымет икринок начинался с рассветом и продолжался 2-3 часа. Оплодотворение икринок происходило во время икрометания, поэтому их сразу же отбирали сифоном в чашки Петри и использовали в опытах.

Четоды исследований

В опытах по изучению нормального развития , для уточнения значений tQ партии икринок от отдельных самок инкубировали при температурах от + 0,1 °С до + 14,0 °С, отбирая с высокой дробностью (0,10,25 to ) пробы численностью 25 - 50 икринок с последующей их фиксацией в уксуснокислом этаноле для просмотра ex témpora или с фиксацией в смеси Бродского (формалин + этанол + ледяная уксусная кислота в пропорции 10:3:1 объемных частей). Для определения динамики волны развития из смеси икры 10 самок, инкубировавшейся при

постоянной температуре, б равноинтервальком режиме отбирали пробы по 100 - 200 штук икринок, фиксировали в смеси Бродского, а затем тщательно просматривали с помощью бинокулярного микроскопа, предварительно удалив оболочку- При определении поздних стадий эмбриогенеза оболочку :даляли до фиксации. В каждой пробе подсчитывали число нормально развивающихся зародышей, определяли стадию развития по таблицам Бернье-Игнатьевой (1975), отделяли эмбрионов с нарушениями развития и систематизировали их в следующем порядке:

1. Нарушения в формировании бластодиска;

2. Нарушения равномерности дробления;

3. Аномалии процесса гаструляции;

4. Отклонения от норны в период закладки осевых структур и ор-ганогенезов;

5. Дефекты морфо-функциональной организации;

6. Пролиферативные уродства;

7. Сочетанные и неидентифицированные аномалии развития.

Для количественной оценки равномерности дробления бластодиск отделяли от желтка в уксусно-глицёриновой смеси (Доронин Ю.К. ,1983) и после диссоциации бластомеров выполняли седиментометрический анализ (Доронин 1й К. 1983). Поскольку бластомеры в первые пять стадий развития имеют достаточно сложную форму, примененный метод дал нам лишь приближенные значения дисперсии бластомеров по размерам, но учитывая постоянный характер вносимых ошибок, его оказалось возможным применить для сравнения аналогичных серий развивающихся зародышей, имеющих одинаковый биологический возраст.

Полученные количественные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием ЭВМ. \

В экспериментах по- генетической трансформации применяли два метода введения генсодержащих рекомбинантных конструкций (векторов интеграции). Первый из них - микроинъекции в бластодиск оплодотворенного яйца - ранее уже был успешно использован другими авторами для генетической трансформации лососевых рыб (Ыас1еапп,Та1 »тег, 1986, СЬоиггоиЬ еЬ а1. ,1986). Однако, в нашей модификации этот метод не требовал предварительного вырезания в плотной внешней яйцевой оболочке специального отверстия для введения микропипетки, или применения двух коаксиальных пипеток, одна из которых - внешняя - служит' своеобразным, бором, а другая - внутренняя - применяется для микроинъекций. В первых экспериментах, выполненных нами, микропипетку

вводили в блаетодиск через микропиле. Впоследствии i далось подобрать режимы изготовления пипеток с очень прочным и ост >ым кончиком, что позволяло прокалывать оболочки и выполнять микроииъекции одной и той же микропипеткой и использовать ее до 100 и более раз.

Второй метод был разработан в лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В. А. Энгель-гардта АН СССР ( зав. лаб. проф. A. R Зеленин) на основе .так называемого генетического пистолета, впервые примененного Стаффордом (Stafford, 1987)для генетической трансформации растений: введение генетического материала внутрь клеток осуществляется с поморю пучка, разогнанных до высокой скорости выстрелом, мельчайших частиц инертн.металлов (вольфрама, золота, платины), покрытых преципитатом ДНК, В наших экспериментах этим методом вводили рекомбинантиые конструкции. содержащие ген гормона роста человека в яйцеклетки радужной форели, и содержащие ген неомицинфосфотрансфзразы ("neo") в яйцеклетки данио обыкновенного (Brachydanio rerio).

Гистологическая обработка материала имела своей цчлью сопоставить внешние признаки (закладка и прохождение борозд) ра.:чих стадий эмбриогенеза и конкретные фазы митотического цикла. После оплодотворения и активации яйцеклетки радужной форели фиксировали в смеси Бродского через 0,1 to до появления первой борозды дробления, и далее через 0,2 to до стадии 6 (морула). Фиксированный материал переводили в 70% этанол, и после проводки по спиртам (смесь этанола, и бутанола,- затем чистый бутанол) заключали в парафин. Серийные срезы толщиной 5-7 мкм после размещения на предметных стеклах депа-рафинировали в ксилоле и подвергали окрашиванию по методу Фельгена. Тонирование препаратов выполняли 0,5 Z -спиртовым раствором светлого зеленого. Фазы митотического цикла идентифицировали по характерному расположению хромосом и элементов веретена дробления. Молекулярно-биолсгический анализ выполняли путем щелочного лизиса гомогенатов ткани сеголетков радужной форели' и мальков данио. Выделенную ДНК (I) обрабатывали рестриктазой PSt-I и гибридизовали с меченным путем ник-трансляции зондом (исходная конструкция) или (II) использовали для амплификационного анализа (PCR) с последующим электропереносом соответствующей фракции ДНК на фильтр и гибридизацией по Southern. Радиоавтографы получали путем экспонирования бло-тов i лолной темноте в течение 2 недель.

- 7 -РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Безразмерная единица измерения биологического возраста зародышей -Ьо, определяемая как продолжительность одного митотическо-го цикла в период синхронных делений дробления при данной температуре,- может, в известной степени, быть прекрасным основанием для шкалы стадирования эмбриогенеза вне зависимости от того, подразделяют авторы эмбриогенез на этапы, периоды или стадии. Однако, применение этой единицы сильно ограничивается ее конкретной привязанностью к одному или нескольким зародышам - передовым или продвинутым - тогда как в большинстве реальных случаев необходимо определять возраст всей группы в целом. Особенно это важно в тех случаях, когда необходимо сравнить между собой две группы, например, контроль и опыт. С этой целью Со было определено для независимых выборок как статистический параметр. При макроскопическом обследовании фиксированных эмбрионов определяли визуально начало закладки борозд дробления, при микроскопическом - определяли промежуток времени между двумя соседними метафазами. Основываясь на наблюдениях, выполненных на 2000 зародышах, можно отметить следующее: синхронность закладки борозд дробления наблюдается до стадии 8 бластомеров, когда между отдельными бластомерами ещё существуют обширные цитоплаз-матические связи. Она всегда выше внутри группы зародышей - потомков одной самки, чём в смешанных группах. Нарушение синхронности митозов наблюдается уже на стадии - 4 бластомеров. Расхождение _ во времени начала одноименных фаз (метафаза) в однородной группе достигает 20%, в разных бластомерах одного и того жэ зародыша- 10%. При переходе от 8 к 16 клеточному зародышу расхождение одноименных фаз достигает 25 и 20 7.7. от 1о, соответственно. Показатель синхрон-ности-асикхронкости митозов вариабелен: у потомства одних самок он близок к ошибке определения (< 0,1 Ьо), у других - достигает упомянутых выше величин. Уточнение данного показателя в нашей работе преследовало следующую главную цель: связать внешние проявления дробления (прохождение борозд) с состоянием ядер для того, чтобы, выполняя генноинженерные процедуры, точно анать, находится ли заро-4 дыш в фазе компетентности, или нет. Под компетентностью здесь мы понимаем период (включающий Б-фазу), захватывающий позднюю телофазу и короткую интерфазу (в суше 0,2 - 0,4 1о). Именно в этот период деконденсация хроматина делает доступной ДНК хромосом и именно в этот период происходит ее редупликация. Нэ исключено, поэтому, что вероятность интеграции чужеродных молекул будет в это время наи-

высшей. Прямые прижизненные наблюдения за состоянием бластодиска затрудненье zona radiata на большей части поверхности имеет ограниченную прозрачность, а сам бластодиск высокую. Подготовка оплодотворенных яйцеклеток к генноикженерным манипуляциям сопряжена с переводом их из одного температурного режима в другой. Отсюда и вторая цель, достигаемая уточнением значений to: зная, какое время и при какой температуре яйцеклетки находились до данного момента, можно вычислить суммарное число набранных долей to и тем самым определить дальнейший ход эксперимента Итоговые результаты по определению значений to для разных температур были сведены в таблицу .

Применение данных из этой таблицы позволило оценить влияние введения чужеродного генетического материала на продолжительность клеточных циклов. Во время микроинъекций внутрь бластсдиска вводится от 20 до 60 нл раствора, содержащего до 100-150 пг ДНК, что на порядок превышает массу ДНК генома радужной Горели (3 - 14 пг). Визуализация пронуклеусов у рыб весьма затруднена, поэтому инъекции выполняются в геометрический центр бластодиска, где по гистологическим данным находится место формирования ядра зиготы. Отсюда следует, что сам факт микроинъекции и попадание в область расположения ядра большого количества ДНК могут нарушить нормальные циклы зародыша. Действительно, в экспериментах по определению предельно допустимых количеств рекомбинантной ДНК в расчете на 1 инъекцию было обнаружено временное удлинение клеточных циклов при введении 200 пг материала в 40 нл раствора. В этих ле экспериментах было обнаружено, что значительная часть зародышей погибает в период гаструляции, а сохранившие жизнеспособность завершают эмбриогенез в те же сроки, что и контрольные.

II. Значительная дисперсия: ранних эмбрионов по продолжительности митотических циклов естественным образом влечет эа собой размывание временных границ более поздних стадий. Поэтому определять время начала какой-то из них по моменту обнаружения первого продвинутого зародыша становится достаточно рискованно. Если же необходимо указать среднее время наступления некоторой стадии, то выполнить это корректно можно только тогда, когда известна форма распределения. Для вычислений этого параметра проводили фиксации проб икры из смешанных и индивидуальных кладок, соблюдая равноинтервальность и репрезентативность. Первичная фиксация материала выполнялась в смеси Бродского с последующей перезаливкой в 70% спирт. Из собранной коллекции отбирали по 100 икринок из каждой пробы, и после уда-

ления внешних яйцевых оболочек просматривали под бинокулярным микроскопом, определяя стадии развития по таблицам Вернье-Игнатьевой.

Для большей детализации структуры стадии вводили дополнительные индексы 'Ч" и "-" , с помощью которых обозначали стадию, включающую 1-2 признака старшей, или млади-й, соответственно. В пределах каждой пробы устанавливали весовое соотношение стадий по числу зародышей, а затем строили график движения волны развития в виде кривых, аппроксимирующих эмпирические данные по методу наименьших квадратов. ГЬлученные в результате этих процедур данные показали, что уже начиная с дарулы (стадии 7, 8) происходит перекрытие времен существования стадий, а распределение зародышей по времени прохождения стадии начинает отличаться от нормального (по критерию Колмогорова-Смирнова). К моменту завершения эпиболии (стадия 17) могут уже перекрываться 3 , а в период, предшествующий выклеву (стадии 27 - 29) 4 стадии. Перекрытие стадий возникает вследствие возникновения своеобразного "хвоста" из отстающих в развитии зародышей. часть из которых погибает еще до выклева. Передний фронт волны развития достаточно крутой: он образован эмбрионами, составляющими, как правило, треть группы. Задний фронт более пологий. При ограничении его по уровню 0,95 (т.е. по уровню, предполагающему рассмотрение только 95Х зародышей - для отсечения аномально отстающих эмбрионов) медианное сечение проходит левее точки среднего времени существования стадии, но правее точки максимума развития стадии. Таким образом, характеристика движения волны развития включает в'себя следующие понятия: 1. Начало стадии,- определяется традиционным способом - по обнаружению передовых зародышей, совокупность морфологических признаков которых соответствует табличным. 2. Окончание стадии,- прохождение через данную стадию 95Х эмбрионов данной группы (уровень 95Z был выбран на основе многочисленных наблюдений, показавших, что у радужной форели, содержащейся в условиях индустриального выращивания около 57. эмбрионов даже в наиболее благоприятных условиях имеют серьезные аномалии развития). 3. Время существования стадии,- задается интервалом между началом и окончанием стадии. 4. Среднее время стадии,- задается моментом, к которому 50Х зародышей данной группы вступают в конкретную стадию развития. 5. Максимум развития стадии,- определяется максимальной представленностью (числом эмбрионов, XX) данной стадии в пробе.

Движение волн развития в смешанных кладках и в потомстве отдельных самок отличается большей шириной интервала времени сушэст-

- ю -

вования стадии в первом случае по сравнению со вторым. Форма распределения остается неизменной. Регистрация ранних стадий развития в подопытных группах эмбрионов затруднена, однако после начала эпибо-лии стадию развития легко определить и без фиксации. Поэтому сравнение движение волн развития в группах трансгенных и нормальных эмбрионов можно было выполнить для периода от 11 стадии (гаструляция) до 26 стадии (закладка элементов скелета плавников).- Результат такого сравнения показывает, что при исключении из рассмотрения эмбрионов с тяжелыми формами уродств (микроофтальмия, микроцефалия, ги-поморфизм), ни структура самой волны, ни ее характерные точки достоверно не различаются. Применение понятия волны развития оказалось очень удобным для практических целей: выбор температурного режима инкубации, определение моментов времени, благоприятных для выполнения различных биотехнических процедур стали легко прогнозируемыми и уменьшили риск потери инкубируемых зародишей, что особенно важно с точки зрения сохранения подопытного материала.

III. В ряде предварительных наблюдений было отмечено, что нарушение синхронности митозов в раннем цитотипическом периоде развития часто связано с нарушением равномерности дробления. Т.е., если в результате цитотомии возникает крупный и мелкий бластомеры, то, соответственно, повышается вероятность того, что очередной митоз и цитотомия пройдут быстрее в меньшем из них. Чтобы количественно оценить степень равномерности первых делений дробления, практически задающих размерные паттерны последующих делений, был использован седиментометрический анализ (Доронин Ю.К., 1983). Результаты измерений и последующе вычисления показали, что у всех исследованных зародышей в диапазоне стадий 2-5 (2-16 бластомеров) наборы клеток представлены статистически различающимися по объему бластомерами. Иными словами, два одинаковых бластомера в одном дробящемся зародыше - событие маловероятное (р > 0,65 - 0,999). Степень дисперсии бластомеров по размерам меняется. У двухклеточных зародышей в одном из типичных экспериментов она может быть охарактеризована следующими цифрами: больший бластомер (от«, ед.) - 57,64 ( 8 - 5,7), мень-ший42,36 (8 = 5,7), отношение - 1,36. Для четырехклеточного эмбриона эти цифры таковы: 30,71 (S - 3,8) , 18,85 (<? - 3,44) и отношение - 1,63. Для восьмиклеточного: 20,45 (8 - 4,0) , 7,1 (5-1,87) и 2,88. И, наконец, для 16-клеточного: 14,84 (<> - 1,42), 1,93 (£ -0,61) и 7,69.

Иными словами, степень разнообразия, оцененная по крайним ва-

риантам растет. В первую очередь она отражает тот факт, что базаль-ные бластомеры, сцепленные с желтком, сохраняют большие размеры, нежели бластомеры полностью отшнуровавшиеся. Во вторую, она показывает, что в норме столь значительная неравномерность дробления не препятствует развитию.

Шестьдесят зародышей, инъецированных на стадии 1 (формирование бластодиска) раствором (40 нл), содержащим конструкцию pKGHG9 в количестве 5 пг/нл (т. е. всего 200 пг - доза, заведомо превышающая оптимальную) были последовательно фиксированы в уксусноглицериновой смеси по достижению стадий дробления 2-5, а бластомеры после дезагрегации исследованы тем же методом. Несмотря на то, что цифры, :арактеризующие предельные отклонения размеров бластомеров были несколько выше, чем в контроле, только в одном случае (стадия 4) это превышение носило достоверный характер на уровне р > 0.95. Следовательно, в целом можно говорить лишь о тенденции к увеличению дисперсии размеров бластомеров в ранний период развития трансгенных зародышей.

IY. Среди рассмотренных характеристик эмбриогенеза ни одина так значительно не отличала нормальных эмбрионов от трансгенных, как частота и разнообразие аномалий развития. Уже говорилось о том, что (многолетнее) среднее значение частоты аномалий развития в норме у радужной форели (очевидно, и прежде всего, для форелевого хозяйства "Аравузе") не превышает 5%. В это число входит значительная, но трудно выделяемая доля эмбрионов с приобретенными уродствами, возникшими вследствие нарушений условий инкубации, а также эмбрионы с врожденными аномалиями. Отметим их в том порядке, в каком они встречаются в процессе инкубации. Формирование бластодиска: полное отсутствие бластодиска, островки цитоплазмы на анимальном полюсе, мелкоразмерный (1 мм или менее в диаметре) бластодиск иногда амебоидной формы. Два бластодиска (и два микропиле). Дробление: формирование микро- и макромеров, нечетное число бластомеров, изменение направления прохождения борозд, образование чонослойной мору-лы, ложное дробление. Гаструляция: формирование более чем одного колец обрастания, отсутствие зародышевого узелка или его удвоение, инволюция подзародышевой полости, остановка в развитии. Нейрулячия и органогенезы: микроцефалия, микроофтальмия, нарушения билатеральной симметрии, изменение числа сомитов, гипокардия. Мэрфофуикиио-нальные аномалии: дисгенез сердечно-сосудистой системы, отсутствие одной из жаберных дуг, недоразвитие жаберных крышек, сколиоз. В»-

лиферативные уродства- унилатеральная или билатеральная дисплазия каудальных отделов туловища, незавершенные дифференцировки плавниковой каймы, отсутствие или гипоморфия плавников.

Генетическая трансформация с помощью микроинъекций в целой сопровождается схожими по проявлению уродствами, но частота их много выше, а разнообразие аномалий шире и причудливей. Среди специфических форм уродств можно отметить следующие: грубая, асимметрия мо-рулы и бластулы, элипсоидальное кольцо обрастания, акрания, ундули-рующий сколиоз, унилатеральный тотальный типоморфизм, дисплазия и гиперплазия плавниковой каймы. Значительное число аномалий развития, приводящих к летальному исходу, к сожалению, не может быть классифицировано, поскольку гибель зародыша часто удается заметить уже после начала его некротизации и истечения желтка в перивителли-новое пространство. Общее число летальных й нелетальных уродств возрастает до 16 - 20%. Причем гибель зародышей в период гаструля-ции особенно резко повышается при использовании конструкций с промотором RSV и при повышении количества ДНК, вводимой в бластодиск, сверх 150 пг.

ОБСУЦЦЕНИЕ

Рассматривая в целом полученные результаты, следует в первую очередь подчеркнуть, что во многих отношениях они носят характер первых шагов на пути подробного количественного биологического анализа трансгенных рыб как новых биологических объектов. Очевидно, такой анализ должен начинаться с наиболее ранних периодов развития и с наиболее общих его показателей. Этим объясняется то, что уточнениям и привязке к групповым параметрам были подвергнуты именно временные характеристики эмбриогенева и патоморфогенез.

Определение статистических параметров to позволило охарактеризовать биологический возраст группы зародышей и сравнить этот показатель у подопытных и контрольных эмбрионов. Зависимость продолжительности клеточных циклов у эмбрионов лососевых от температуры хорошо изучена (Игнатьева Т. М., 1975, • Павлов Д. А. 1989), данных о влиянии чужеродной ДНК на него мы не обнаружили. Оказалось, что в тех количествах, в которых ее вводили в бластодиски оплодотворенных яйцеклеток (до-200 пг), ДНК способна удлинить цикл. Механизм такого влияния не ясен. Однако, исходя из того, что оно носит транзиентный характер, и на стадиях развития, следующих за гаструляцией, уже не

достоверно, можно предположить, что пул рекомбинантных молекул, персистирующих в зародыше до поздней бластулы (Яоккопез е1 а1. 1985), обладающих способностью к амплификации и ограниченной экспрессии, представляет собой заметную нагрузку на синтетический аппарат зародыша Тогда становится понятным, почему продолжительность стадий в средней и поздней фазе эмбриогенеза возвращается к норме: большая часть чужеродных молекул ДНК элиминируется в период гаструляции (Масеуоу е1 а1.,1988)

Уточнение периода компетенции ядра зиготы к интеграции трансгена дало ценную информацию относительно определения промежутка времени (в долях Ьо), в течение которого наиболее высоки шансы на успех, если цель состоит в получении тотально трансформированных животных: от 0,6 до 1,2 Ьо происходит слияние пронуклеусов и завершается первая Б-фаза , между 2,2 и 2,6 Ьо заключена первая телофаза (её поздняя часть и очень короткая интерфаза). На гистологических препаратах хорошо видно, что оболочка ядра в период первых делений дробления практически отсутствует, а цитотомия не носит завершенного характера - бластомеры объединены обширными цитоплазматическими мостами. Не исключено, что благодаря именно этим обстоятельствам рыбы (особенно лососевые) заслужили репутацию объектов, обладающих высокой способностью к генетической трансформации (по данным СЬоиггиоЬ с соавторами -1986 г. - до 75% вылупившихся зародышей радужной форели могут быть трансгенны). Если интеграция трансгена не произошла в первый же цикл редупликации хромосомной ДНК, то благодаря возможности распределиться относительно равномерно между двумя бластомерами (как, впрочем, и четьгрмя), на фоне низкой активности цитоплазматических эндонуклеаз, его копии смогут использовать дополнительные "попытки" для встраивания в хозяйский геном. Следовательно, микроинъекции и иные генноинженерные приемы могут выполняться и тогда, когда первое деление дробления уже завершено.

Волна развития - групповая характеристика, позволяют количественно оценить однородность некоторой группы эмбрионов по признаку синхронности прохождения через морфологически идентифицируемые стадии. Маловероятно, чтобы выявленные в нашем исследовании закономерности ее изменения в период эмбриогенеза оказались абсолютными: пусть и на вполне репрезентативных выборках, но исследовано лишь одно стадо радужной форели (хозяйство "Аразузе"). С другой стороны, никак нельзя считать эти результаты случайными: большая фактология практического рыбоводства показывает, что сходные элементы

дисперсии темпов развития наблюдаются у эмбрионов других лососевых и не трлько лососевых рыб. С точки зрения биологической целесообразности это легко объяснить: разновременность прохождения эмбрионами одних и тех же стадий развития, в том числе и вылупления, способствует сохранению вида, снижая риск гибели потомства при прохождении пиков неблагоприятных ситуаций, улучшает возмохность утилизации кислорода в кладках, использования кормовой базы после перехода к активному внешнему питанию. Понятно, что в условиях естественного воспроизводства эволюция "не работала" над тем, чтобы подавить такую дисперсию. Иначе обстоят дела в рыбоводстве, где высокая синхронность развития эмбрионов не только внутри одной кладки, но и в смеси икры, полученной от десятков и сотен самок, представляет собой очень важный параметр, облегчающий или усложняющий проведение многих биотехнических приемов инкубации (сортировка, санитарная обработка, изменение температурных режимов, проточности перевозка и т. д.). Следовательно, характерные особенности волны развития могут выполнять роль количественного параметра для селекционной работы. И в этом ее практическая значимость. Для целей конкретного научного исследования этот параметр - мера силы влияния экспериментальных воздействий на механизмы, контролирующие темпы развития. Обработка данных наших опытов, как уже говорилось выше, в частности показала, что после завершения собственно гаструляции, волна развития в группах контрольных и подопытных зародышей - потомков одной самки - достоверно не различается, в то время как до гаструляции в опыте увеличено время существования стадии, а максимум ее развития эксцессивно смещен к ее началу.

Преформированность клеточных размеров, регуляционность клеточного состава зародышей рыб и роль в этой связи исходных размеров бластомеров, составляющих весь клеточный пул эмбриона перед началом гаструляции (формирования презумптивных зачатков) составляет отдельную интереснейшую тему в биологии развития. Но поскольку она выходит далеко аа рамки рассматриваемого здесь материала, мы не будем подробно касаться наблюдений, сделанных на нормально развивающихся интактных зародьшах. Отметим лишь, что исходно высокая дисперсия бластомеров по размеру затрудняет оценку влияния процедуры генетической трансформации на этот параметр, даже в тех случаях, когда микроинъекции выполнялись на стадии развития II в один из двух бластомеров. В тех же достаточно редких случаях, когда указанная дисперсия в опыте была выше, чем в контроле,обнаружить истинную

причину произошедших изменений трудно. Действительно, при выполнении микроинъекций кончик микропипетки проникает в бластодиск на глубину 20 - 50 мкм и, очевидно, на своем пути он встречает не только цитоплазму. Еще более травматично для тонких цитоплазмати-ческих структур, надо полагать, и для цитоплазматического скелета, прохождение через зародыш пучка высокоскоростных частиц металла (вольфрама), использовавшихся нами в экспериментах' с применением "генетического пистолета". Таким образом, только дальнейшие наблюдения и статистический анализ изменений дисперсии размеров бласто-меров при различных способах интродукции генетического материала в яйцеклетку дадут ответ на вопрос приводит ли генетическая трансформация как такозая к увеличению дисперсии, а тем самым к повышению частоты возникновения мнкромерных клеточных клонов, обреченных на исключение из процессов морфогенеза.

Нежно с уверенностью говорить о том, что и материалы и методы генетической трансформации нуждаются в значительном усовершенствовании, поскольку увеличение частоты и разнообразия различных нарушений нормального эмбрионального развития в опыте в три - пять раз превышают наблюдаемые в контроле. С не нуждающейся в пояснениях очевидностью индуцированные нарушения в развитии эмбрионов (пато-могут быть подразделены по признаку происхождения на, условно говоря, методические и генетические. Под первыми подразумевается те, появление которых связано с применением конкретного метода введения гексодержацих рекомбинантных ДКК, условий проведения эксперимента, применяемых инструментов и оборудования. Под вторыми-те, чьё появление может быть отнесено на счет самой ДНК: её концентрации, Формы (линеаризованная, кольцевая), структуры (наличие различных промоторно-энхансерных блоков, трейлерных последовательностей др. сигналов, управляющих транскрипцией) и, наконец, конкретных генов (к-ДНК или хромосомные копии). Из использованных в данной работе двух методов введения ДНК в яйцеклетки микроинъекционный,безусловно,- Солее щадящий. В многочисленных контрольных экспериментах, когда микроинъекция ■подменялась просто проколом бластодиска или инъекцией в него буферного раствора, было локаэа:га, что при введении в бластодиск 20 - 60 нл раствора, равно как и в отсутствие инъекции гибель эмбрионов и уродства встречаются приблизительно с одинаковой частотой в группах такого - активного - и интактного контроля. Механические повреждения яйцеклеток в процессе микроинъекций в наших экспериментах приводили к гибели 1 - 3 7. зародышей.

обычно, из-за нарушения целостности желточной области плазматической мембраны. Введение ДНК с помощью генетического пистолета сопровождается значительным повреждением клеток, расположенных по оси выстрела. Принятие специальных мер для увеличения степени рассеивания частиц вольфрама позволило уменьшить гибель яйцеклеток до 20 - 30 7.7.. Однако среди выживших аномалии развития встречались много чаще, чем после микроинъекций. Наиболее экзотические формы уродств возникали при обстреле эмбрионов на У - У1 стадии развития, что может быть объяснено гибелью отдельных бластомеров.

С теоретической точки зрения инсерция трансгена может сопровождаться целым набором летальных и нелетальных индуцированных мутаций. Уже само встраивание трансгена в хозяйский геном может рассматриваться как крупная геномная мутация. ; Перестройки же во фланкирующих трансген областях могут включать в' себя делеции, изменение рамки считывания, возникновение новых эффектов положения и т. д. По всей вероятности, летальные последствия трансформации связаны с множественной инсерцией и куммулятивным характером нарушений в нативной структуре ДНК, не репарируемых в период активации ядер (X стадия развития радужной форели по Вернье-Игнатьевой). В пользу такого предположения свидетельствует значительно.более высокая гибель эмбрионов в период гаструляции или сразу после нее в опыте по сравнению с контролем. Аналогичный "всплеск" эмбриональной гибели наблюдается у рыб после обработки гамет физическими (облучение) или химическими мутагенами (Черфас, Цой, 1987).

При "удачном" встраивании в хозяйскую ДНК трансген начинает экспрессироваться в зависимости от собственных сигналов регуляции транскрипции, а также в зависимости от окружения (нельзя полностью исключить возможность того, что трансген окажется под влиянием акцепторной промоторно-энхансерной зоны, т. е. попадет в чужую единицу считывания). Тканенеспецифический промотор ЯЗУ, использованный нами в ряде конструкций, как раз обеспечивает транскрипцию "автоматического" типа, а промотор МГ-1 металлотионеинового гена мыши в конструкциях с теми же генами - "регулируемого" (под влиянием ионов некоторых тяжелых металл, в). Ранняя и не контролируемая экспрессия трансгена может приводить к накоплению конечного продукта который, как в нашем случае - СТГ,может быть ответственен за проли-феративные уродства. Подобное суждение подкрепляется недавно опубликованными данными об обнаружении секреции продукта экспрессии трансгена (СТГ человека) в инкубационную среду зародышами радужной

форели (Роккопез еЬ а1. ,1989), а также нашими наблюдениями согласно которым частота аномалий при использовании МТ-промотора ниже, чем при использовании ИЗУ.

Только специальный анализ потомства трансгенных рыб позволит в будущем оценить отдаленные последствия генетической трансформации, в том числе и наследуемость самого трансгена, хотя, судя по литературным данным, есть все основания считать, что у тех особей, у которых произошла трансформация клеток зародышевого пути, потомстео также оказывается трансгенным.

ВЫВОДЫ

1. Применение понятия Ьо - безразмерной единицы измерения биологического возраста зародышей - для групп эмбрионов, потомков одной или более самок, без поправочных коэффициентов допустимо только в пределах первых трех стадий эмбрионального развития форели, г. е. до формирования 8 бластомеров.

2. Начиная со стадии 8 бластомеров для оценки биологического возраста группы зародышей необходимо вводить поправочный коэффициент, который позволяет указать время вступления в данную стадию 50% или 95% всех эмбрионов.

3. Отклонения от среднего времени вступления группы зародышей в данную стадию увеличиваются к концу эмбриогенеза, а распределение зародышей данной стадии развития во времени имеет форму, близкую к лог-нормальной.

4. Дисперсия по размерам бластомеров в цитотипическом периоде эмбрионального развития нормальных зародышей не превышает 5,7 для 2 и 1,4 для 5 стадии развития и не отличается от таковой у траксген-ных.

5. Соотношение между клеточным и ядерным циклом в период достижения 5 стадии развития таковы, что закладка борозды дробления отстает от телофаэы на 0,2 Ьо, а период максимальной компетенции ядра к интеграции трансгена распространяется от 0,3 до 0,6 и от 1,3 до 1,6 Ьо.

6. Микроинъекции растворов ДНК в оплодотворенные яйцеклетки не вызывают летальных эффектов, если количество вводх.мзй Щл к а превышает 150 пг, а объем раствора не превышает 60 нл.

7. Существование в яйцеклетке значительного пула чу/серод.>?гЯ ДНК не изменяет достоверно продолжительности Ьо в цптотипи'-ксгам периоде развития и не изменяет продолжительности всего экбри.^Генс-

га.

8. Эмбриональная ' смертность достоверно увеличивается при использовании рекомбинантных конструкций, включающих промотор КЗУ, а количество аномалий развития и нелетальных уродств у подопытных эмбрионов увеличивается на 202 относительно контроля.

9. Характер нарушений нормального развития указывает на существование разных механизмов влияния трансгена на жизнеспособность подопытных эмбрионов: на уровне интеграции и на уровне экспрессии.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Барминцев В. А., Бенюмов А. 0., Зеленина И. А., Голиченков В. А., Джаббур Р. Н., Зеленин А. Е Создание и изучение трансгенных рыб: 1. Генетическая трансформация радужной форели Salmo gairdneri Rich. //Онтогенез. - 1991.- N 4 в печати.

2. Колесников В. А., Алимов А. А., Барминцев В. А.. Зеленина И. А., Краснов А. Ы., Джаббур Р., Зеленин А. Е Высокоскоростная механическая инъекция чужеродной ДНК в яйцеклетки рыбы // Генетика.-1990.- Т. 26, N 12 - С. 2122-2126.