Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы ооплазматической сегрегации и формирования клеточной линии трохобластов в раннем развитии Nereis virens

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костюченко, Роман Петрович, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 591

КОСТЮЧЕНКО Роман Петрович

ПРОЦЕССЫ ООП ЛАЗМАТИ ЧЕСКОЙ СЕГРЕГАЦИИ И ФОРМИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ ТРОХОБЛАСТОВ В РАННЕМ РАЗВИТИИ NEREIS VIRENS

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор, д.б.н. Дондуа А. К.

Санкт-Петербург 1999

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. От яйца к зародышу: спецификация клеток

Эмбриогенез - это процесс, при котором оплодотворенный ооцит развивается в многоклеточный организм, состоящий из множества специализированных клеток, организованных в трехмерном пространстве как единый комплекс (Davidson, 1990, 1991). В ходе этого процесса имеет место размножение клеток, связанное с изменением клеточных потенций: клетки приобретают определенные свойства и одновременно потенции этих клеток экспрессировать иные свойства постепенно редуцируются. Такие изменения потенциальной способности клетки вступать на путь той или иной дифференциации может быть как независимым, так и зависимым от внешних стимулов. В первом случае говорят об автономной спецификации клеток, а во втором - о зависимой спецификации1. У большинства видов Metazoa во время развития имеют место оба типа спецификации. Возможно, у некоторых животных (например, у мыши) все клеточные линии могут быть специфицированы в зависимости от условий, но на сегодняшний день не известно ни одного организма, оперирующего во время развития только механизмами автономной спецификации (обзоры Davidson, 1990, 1991, 1993).

Существенным для постижения феномена развития является понимание, как клетки становятся специфицированными в рамках трехмерной организации зародыша. С этой целью было исследовано развитие самых разных, в том числе и филогенетически далеко стоящих друг от друга организмов. Изучение показало, что царство животных использует очень ограниченное число механизмов для продуцирования неограниченногчгчисла вариантов.

Для объяснения, как возникают различные клеточные типы, были предложены две четкие концепции (см., например, Jeffery, 1988; Davidson, 1990; Gilbert, 1997).

Первая идея заключается в том, что яйцо уже содержит пространственно организованные компоненты, известные как цитоплазматические

1Под термином спецификация здесь, вслед за Дэвидсоном (Davidson, 1990,1991), понимается процесс(ы), за счет которого впервые устанавливаются различные пути развития потомков бластомеров в зародыше, не подвергавшемся экспериментальным воздействиям (стабильность не имеет значения в данном контексте)

детерминанты, влияющие на судьбу клеток вследствие их дифференциальной сегрегации по различным бластомерам во время дробления. Т.е., потенция клетки в этом случае ограничена, а судьба окончательно детерминирована в результате наследования специфических цитоплазматических детерминантов. Такой тип спецификации независим от других клеток и именно в этом смысле понимают автономную спецификацию.

Вторая концепция состоит в том, что определенные эмбриональные клетки, чьи уникальные свойства уже возникли, например, под воздействием локализованных детерминантов, влияют на развитие смежных клеток, индуцируя их к формированию того или иного клеточного клона. Поскольку этот тип спецификации зависит от других клеток, его называют зависимой спецификацией.

Таким образом, принято считать, что диверсификация эмбриональных клеток есть результат дифференциальной экспрессии генов, вызванной совместной активностью цитоплазматических детерминантов и индуктивных процессов.

1.2. Цитоплазматическая локализация

Концепция сегрегации морфологически значимых веществ, имеющихся в цитоплазме яйца, вызвала повышенный интерес к развитию животных, у которых судьба каждой отдельной клетки строго детерминирована. Возможно, это и было одной из причин, почему явление цитоплазматической локализации долгое время считали характерным главным образом для животных с так называемым мозаичным типом развития, прежде всего для аннелид и моллюсков. Зародыши этих животных отличаются ранним появлением различных структур, что позволяет уже с первых этапов развития исследовать судьбу клеточных генераций. Все эти животные имеют сравнительно небольшое число клеток, легко различимых визуально. Более того, благодаря асимметричному характеру развития зародышей сравнительно легко определить те или иные клетки по их форме и взаимному расположению.

Так, у пиявок Не1оЬс1е11а и Пеготугоп источники мезодермы и эктодермы, протелобласты РМ и РМОРО соответственно, формируются очень рано в развитии, в ходе пятого деления дробления, а их материнская клетка -

бластомер D' - наследует особый, морфологически выраженный участок цитоплазмы зиготы, называемый телоплазмой (Fernández, 1980; Weisblat, Shankland, 1985; Sandig, Dohle, 1988; Holton et al., 1989; Nelson, Weisblat, 1991, 1992; Shankland, 1994; Bissen, Smith, 1996).

Сегрегация определенных участков яйца в отдельные бластомеры, дающие в последствие клоны специализированных клеток, известна и для многих других животных: наследование так называемых Р гранул клетками зародышевого пути у нематоды Caenorhabditís elegans (Strome, Wood, 1983; Hill, Strome, 1990; Schlicht, Schierenberg, 1991; Skiba, Schierenberg, 1992; Boyd et al., 1996; Hird et al., 1996); сегрегация полярной плазмы у олигохеты Tubifex в бластомер 4d, дающий мезодермальные структуры (Penners, 1922; Lehmann, 1948); переход материала полярной лопасти в клетки линии D (некоторые моллюски и полихеты: Verdonk, 1979; van Dam, Verdonk, 1982; Speksnijder, Dohmen, 1983; Render, 1983, 1991; Henry, 1986); сегрегация миоплазмы яйца асцидий в презумптивные мышечные клетки хвоста личинки (Zalokar, Sardet, 1984; Nishikata et al., 1987a; Swalla et al., 1991; Nishida, 1994) и так далее.

Разумеется, данные о формировании особых, морфологически очевидных, цитоплазматических доменов и распределении их в определенные бластомеры предлагают лишь пищу для размышления, но сами по себе не являются доказательством принципиальной значимости этих доменов для развития тех или иных клеточных клонов. Поэтому были предприняты попытки экспериментальным путем получить доказательства морфогенетической важности процессов сегрегации цитоплазмы.

1.3. Экспериментальные доказательства цитоплазматической

локализации

1.3.1. Эксперименты по изоляции бластомеров

Результаты исследования развития изолированных бластомеров позволили установить, что цитоплазматическая локализация представляет собой важнейшую черту эмбриогенеза.

Вилсон (Wilson, 19046, 1925) разделял презумптивные зачатки моллюска Patella coerulea в искусственной морской воде с низким содержанием кальция. Помещая изолированные таким образом бластомеры в обычную морскую воду,

он сравнивал характер развития изолированных клеток с нормальным развитием этих же бластомеров в составе целого зародыша. В ходе экспериментов выяснилось, что потомки изолированных бластомеров образовывали такие же структуры как и при нормальном развитии. Наиболее отчетливо это было продемонстрировано для изолированных трохобластов, ресничных клеток, образующих локомоторный орган личинки - прототрох.

Согласно данным Вилсона, четыре микромера второго порядка первого

2

квартета 1т , дочерние клетки которых во втором поколении формируют в норме трохобласты, будучи изолированными претерпевают обычное число делений (два) и затем в соответствующее время покрываются ресничками, как это происходит и в норме. Такие результаты Вилсон оценил как доказательства того, что эти клетки, без сомнения, обладают всеми факторами, определяющими характер и ритм дробления, а также характер дифференцировки, которую претерпевают эти клетки, причем все эти процессы не зависят от взаимоотношений клеток линии трохобластов с другими клетками зародыша. Результаты, хорошо согласующиеся с этими утверждениями, были получены Вилсоном и на других типах изолированных клеток, а также на изолированных многоклеточных частях зародышей. Например, изолированные апикальные клетки дифференцировались in vitro в апикальные сенсорные и эктодермальные клетки.

Способность дочерних клеток изолированных на 16-клеточной стадии клеток-основательниц первичных трохобластов к цилиогенезу была показана позже и для другого вида - Patella vulgata (Serras, Speksnijder, 1991; P. Damen, 1994; Damen, Dictus, 1996).

Аналогичные результаты были получены Костелло (Costello, 1945) в опытах по изоляции бластомеров на всех стадиях дробления со второго по пятый цикл деления включительно у полихеты Nereis limbata. Оказалось, что все изолированные бластомеры четырехклеточного зародыша (А, В, С и D), каждый в отдельности или в любом сочетании друг с другом, способны через некоторое число делений давать клеточные агломераты, частично покрытые ресничками. Потенции к цилиогенезу демонстрируют также и потомки всех микромеров первого квартета 1т (1а, 1Ь, 1с, 1d), в то время как макромеры 1М этим качеством более не обладают. Далее, на стадии 16-кпеточного зародыша,

потенция к формированию ресничек ограничивается главным образом

2 1

клеточной линиеи 1т и частично 1т ; микромеры второго порядка 2т и макромеры 2М и их потомки, напротив, не образуют никаких ресничек.

Способность самостоятельно, без влияния со стороны других клеток, дифференцироваться таким же образом, что и при нормальном развитии, была показана для изолированных бластомеров гребневиков Вегое и Mnemiopsis. В частности, определенные бластомеры и их потомки автономно образуют так называемые гребные пластинки (Fischöl, 1903; Freeman, 1976, 1977; Houliston et al., 1993).

Методами изоляции бластомеров ранняя самодифференцировка была продемонстрирована и на примерах моллюсков llyanassa (Clement, 1956, 1967, 1986а,б; Sweet, 1998), Dentalium (Wilson, 1904а,б, 1925; Cather, Verdonk, 1979), Bithynia (Verdonk, Cather, 1973), полихет Chaetopterus (Henry, 1986), Sabellaria (Render 1983), пиявки Helobdella triseriaiis (Symes, Weisblat 1992), асцидий (Crowther, Whittaker, 1986; Meedel etal., 1987; Nishida, 1990).

Таким образом, еще задолго до проявления цитодифференцировки яйцо во время дробления делится на клетки, потомки которых обладают различными морфогенетическими потенциями. Описанные выше результаты опытов указывают на то, что в бластомерах должен содержатся какой-то фактор (несколько факторов), который в конечном итоге влияет на функционирование геномов в клонах клеток, происходящих из этих отдельных бластомеров.

1.3.2. Факторы, содержащиеся в цитоплазме яйца, могут определять

спецификацию бластомеров

Убедительные доказательства существования цитоплазматических факторов, распределенных особым образом в ооплазме и влияющих на судьбу бластомеров и их потомков, в которые эта цитоплазма будет распределена, т.е. доказательства явления цитоплазматической локализации, были получены в ходе опытов по инъекции цитоплазмы в различные бластомеры, взятой из различных участков яйца. Так, эпидермальные клетки хвостовой личинки асцидии Halocynthia roretzi берут свое начало исключительно из бластомеров анимального полушария раннего зародыша. Чтобы получить доказательства существования цитоплазматических детерминантов эпидермиса Нишида и

Ямада (МэШа, 1994а,б; Yamada, МэШа, 1996) провели эксперименты по пересадке цитоплазмы путем слияния бластомеров и безъядерных клеточных фрагментов различных участков яйца и зародышей. В одном из вариантов опыта презумптивные неэпидермальные бластомеры вегетативного полушария были слиты с цитоплазматическими фрагментами бластомеров из различных регионов восьмиклеточного зародыша. В качестве критериев типа дифференцировки были использованы экспрессия специфичного для эпидермиса антигена Ерн2 и секреция материала личиночной туники. Формирование эпидермиса наблюдалось, если в вегетативные бластомеры была инъецирована цитоплазма из презумптивных эпидермальных бластомеров. Эти эксперименты подтверждают то, что цитоплазматические факторы, способствующие эпидермальной дифференцировке (детерминанты эпидермиса) присутствуют в бластомерах-предшественниках эпидермиса. Вегетативные бластомеры демонстрировали такое изменение своей судьбы лишь тогда, когда вливаемый участок цитоплазмы был равным или большим по размеру. Далее, для исследования присутствия и локализации эпидермальных детерминантов недробившегося яйца цитоплазматические фрагменты различных зон неоплодотворенного и оплодотворенного яиц были слиты с вегетативными бластомерами. В результате опытов выяснилось, что детерминанты эпидермиса присутствовали уже в неоплодотворенном яйце и были сегрегированы при перемещениях ооплазмы после оплодотворения. После первой фазы ооплазматической сегрегации эти детерминанты были локализованы в наибольшей концентрации в экваториальном регионе. Различий в активности инъецированной цитоплазмы из участков в пределах экваториальной области на этой стадии обнаружено не было. После второй фазы ооплазматической сегрегации, непосредственно перед первым делением дробления, активность смещается в анимальную сторону, т.е. в анимальное полушарие, из которого в норме формируются бластомеры клеточной линии эпидермиса.

В других опытах с использованием подобной схемы экспериментов было убедительно показано, что в яйце асцидии На!осупШа гоге1п имеются детерминанты мышечных и энтодермальных клеток (№э1"ис1а, 1992, 1993; Уатаба, №зЫс!а, 1996). Факторы мышечной дифференциации сегрегируются во

время перераспределения участков ооплазмы после оплодотворения яйца. Они перемещаются сначала на вегетативный полюс яйца, а перед первым делением дробления - в заднюю область вегетативного полушария, откуда берут начало бластомеры, дающие основной клон мышечных клеток хвоста личинки. Детерминанты энтодермы во время ооплазматической сегрегации концентрируются на вегетативном полюсе яйца, а затем распределяются по всему вегетативному полушарию (вплоть до экваториальной зоны яйца), откуда и происходит клеточная линия энтодермы.

При исследовании явления цитоплазматической локализации у асцидий Styela (Bates, Jeffery, 1987) и Halocynthia roretzi (Nishida, 19946, 1996) выяснилось, что, если 5-15% цитоплазмы вегетативного полюса яйца удалить ме>еду первой и второй фазами ооплазматической сегрегации (т.е. тогда, когда предполагаемые мышечные и энтодермальные детерминанты находятся именно в районе вегетативного полюса), то образуются вечные бластулы, не имеющие передне-задней оси, состоящие из эпидермальных клеток и лишенные основной массы клеток энтодермы, мышц и хорды. Удаление такого же объема цитоплазмы вегетативного полюса на стадии неоплодотворенного яйца или после завершения второй фазы ооплазматической сегрегации, а также удаление части цитоплазмы анимального полюса или экваториальной зоны яйца между первой и второй фазами перемещения ооплазмы не препятствует развитию осей и формированию нормальной личинки. Авторы приходят к закономерному выводу о том, что факторы, детерминирующие предне-заднюю эмбриональную ось и процессы гаструляции локализованы на вегетативном полюсе оплодотворенного яйца, находящегося на стадии между первой и второй фазами ооплазматической сегрегации. Такую точку зрения поддерживают и другие ученые (Venuti, Jeffery, 1989; Swalla, 1992).

По мнению Холовач и Элинсон (Holowacz, Elinson, 1993, 1995), локализованные материнские детерминанты контролируют формирование материнских осевых структур в зародыше Xenopus. С целью тестирования пространственного распределения дорсальных детерминантов исследователи инъецировали цитоплазму из различных участков яйца и 16-клеточного зародыша в вентральные вегетативные клетки зародыша-реципиента, находящегося на стадии 16-ти бластомеров. Выяснилось, что кортикальная

цитоплазма вегетативного полушария яйца индуцировала образование вторичной дорсальной оси у реципиентов в 53% случаев. Анимальная кортикальная, экваториальная кортикальная и вегетативная глубокая цитоплазмы, напротив, никогда не индуцировали формирования вторичной оси.

Изучая роль цитоплазматических доменов в детерминации судьбы эктодермальных и мезодермальных клеток у зародыша пиявки Helobdella, Нельсон и Вайсблат (Nelson, Weisblat, 1991, 1992) удаляли не содержащую желток цитоплазму анимального полюса зиготы. В результате выполненного эксперимента бластомеры-предшественники эпидермальных клеток давали мезодермальные образования. В норме анимальная и вегетативная часть телоплазмы попадают в бластомер D', потомки которого образуют мезодермальные и эктодермальные производные, уже как единый цитоплазматический домен. И действительно, инъекция анимальной телоплазмы в область телоплазмы вегетативного полюса предотвращала изменение судьбы клеток с энтодермальной на мезодермальную.

В одной из своих наиболее интересных работ Вилсон (Wilson, 19046) описывает серию экспериментов с ранними зародышами моллюска Dentalium. С целью доказать, что цитоплазма яйца может осуществлять эффективный строгий контроль за процессами морфогенеза, Вилсон использовал в своих опытах интересное и удобное для экспериментатора явление, наблюдаемое во время ранне