Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas - ингибиторы роста фитопатогенных грибов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas - ингибиторы роста фитопатогенных грибов"

На правах рукописи

ЧЕТВЕРИКОВ СЕРГЕЙ ПАВЛОВИЧ.

НОВЫЕ МЕТАБОЛИТЫ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas ИНГИБИТОРЫ РОСТА ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ.

03.00.04-биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2004

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Логинов Олег Николаевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шакирова Фарида Миннихановна

кандидат биологических наук Положенцев Сергей Игоревич

Ведущая организация: Башкирский государственный университет

Защита состоится ¿-¿} 2004 г. в 14:00 часов на заседании

Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01. при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу. 450054, Уфа, проспект Октября, 69

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Авторефератразослан «-у» августа 2004 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии рода Pseudomonas — одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Weller, 1988; Смирнов, Киприанова, 1990; Dowling & O'Gara, 1994; Воронин, 1998; Логинов и др., 2001; Bloemberg & Lugtenberg , 2001; Whipps, 2001) и обладающих совокупностью полезных для растений свойств. В настоящее время такие бактерии принято обозначать PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (ризобактерии, способствующие росту растений).

Следует также отметить, что PGPR Pseudomonas являются потенциальными объектами агробиотехнологий для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов.

Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогеные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция псевдомонадами различных низкомолекулярных (НМ) веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий- рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al., 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al, 1997; Suzumura et al., 1997; Thrane et al., 1999Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001; Quail et al., 2002; Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа (Shanahanetal., 1992,1993).

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение состава и физико-химических свойств метаболитов, продуцируемых бактериями Pseudomonasputida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774), Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945) -основы биопрепарата "Елена", и определение биологической роли данных метаболитов в проявлении фунгнцидной активности исследуемых штаммов по отношению к фитопато генным

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ (испиптт

грибам. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов питательной среды на продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas;

2. отработать схему выделения и очистки метаболитов штаммов Pseudomonas; выделить и охарактеризовать гомогенность очищенных метаболитов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;

3. исследовать основные физико-химические свойства метаболитов;

4. определить состав и предполагаемую структуру метаболитов.

Научная новизна. Выделена и охарактеризована новая группа метаболитов псевдомонад, по химической структуре - представляющих собой трипептиды, глицерина, и обладающих фунгицидной активностью.

Установлена способность, комплексообразования трипептидов глицерина псевдомонад с углеводами.

Практическая значимость. Изучены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена", предназначенного для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и П Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология — 2003» (Нущино, 2003).

Публикации. По материалам работы опубликовано 9 научных работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (три главы),- заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий

136 ссылок. Работа изложена на 95 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 9 таблиц.

Благодарности

Автор выражает огромную признательность всем сотрудникам лаборатории биологически активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН за постоянную поддержку при выполнении данной работы. Автор благодарит заведующего контрольно - аналитической лаборатории Института биологии Уфимского научного центра РАН к.х.н. Гусакова В.Н. за помощь в обсуждении результатов и консультации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами изучения являлись штаммы бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17 из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, проявляющие антагонистические свойства в отношении ряда грибов — возбудителей болезней растений. .

В качестве тест-объектов для анализа фунгицидной активности метаболитов в работе использовали следующие фитопатогенные - грибы: Bipolaris sorokiniana Shoem (Helminthosporiumsativum P., K.), Fusarium culmorum BKM 844, F. gibbosum BKM 848, F. graminearum BKM 1668, F. nivale BKM 3106, F. oxysporum BKM 137, F. semitectum BKM 1938, F. solani BKM 142, F. avenaceum BKM 132, а также Alternaria alternate и Penicillium Juniculoswn из Колекции микроорганизмов Института биологии.

Культуры Pseudomonas поддерживали на агаризованной среде Кинг В (Kinget al. 1954). При изучении влияния физико-химических факторов на продукцию метаболитов с фунгицидной активностью и для их выделения микроорганизмы культивировали в жидкой питательной среде, содержащей (г/л): глицерин- 10,0; пептон ферментативный - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; магний сернокислый

ссмиводный - 1,5; калий фосфорнокислый двузaмeщeнный - 1,5; воду водопроводную - до 1GGG см3.

Для пoддepжaния и культивирования грибов использовали жидкую и агаризованную срсды Чaпeкa (Тсппср и др., 1972).

При исслeдoвaнии физико-химичсских факторов, влияющиx на титр клсток и сскрсцию мстаболитов с фунгицидной активностью, псрсмснными всличинами являлись концснтрации источника углсрода, источника органичсского азота и тсмпсратура культивирования.

Выдслснис мстаболитов с антигрибной активностью Pseudomonas проводили слсдующим образом. Послс удалсния биомассы на цснтрифугс "К23 D" (3GGG мин1, 2G мин) супсрнатант подвсргали ультрафильтрации на модулях волоконного типа "Amicon 3P-1G " (США), отбирая фильтрат, содсржащий фракцию ( 3 кДа) внсклсточных мстаболитов исслсдусмых штаммов. Фильтрат упаривали на вакуумном роторном испаритслс при 35°С, примсси осаждали мстанолом и отдсляли цснтрифугированисм в тсх жс условиях. Послс отгонки мстанола из супсрнатанта, изучасмыс всщсства осаждали ацстоном.

Чистоту и гомогснность выдслснных мстаболитов провсряли при помощи ВЭЖХ в систсмс, состоящсй из насоса высокого давлсния модсли 572Р ("Gasukuro Kogyo, Япония), ультрафиолстового дстсктора ("Du Pont", США). Для раздслсния использовали колонку из нсржавсющсй стали с сорбснтом (размср зсрна S мкм) Zorbax-ODS (2SGx4,6 мм, Shimadzu, Япония). Образцы вводили с помощью дозатора модсли 712S ("Rheodyne", США) с пстлсй объсмом 2G мкл. В качсствс элюснта использовали воду, подвсргнутую дополнитсльной очисткс, при скорости элюции 1,G мл/мин. Рсгистрировали поглощснис при длинс волны 2S4 нм.

Молскулярную массу выдслснных мстаболитов оцснивали при помощи эксклюзионной хроматографии в систсмс, описанной вышс, на колонкс TSK G2GGGSW (3GGx7,8 мм, "Toyo Soda", Япония) при элюировании смссью G,1 M фосфата натрия и G,3 M хлорида натрия (рН 7,G) с расходом 1 мл/мин с УФ -дстсктированисм при 2S4 нм. В качсствс марксров молскулярной массы использовали инсулин (Mr 5,8 кДа, "Lilly", Франция) и витамин Bi2 (Mr 13SS Да, ЗАО "Всрофарм", Россия).

Аминокислотный анализ кислотных гидролизатов (6н. НС1,24 ч, при 105°С) метаболитов был выполнен на анализаторе Т339М (Чехословакия).

Элементный состав метаболитов определяли на С, Н, N - анализаторе HP Model 185 В (США) и по общепринятым методикам (Климова, 1967).

УФ — спектры регистрировали на спектрофотометре Specord M40 ("Carl Zeise" Германия) в области 200-330 нм (в воде), ИК - спектры — на спектрофотометре Specord M80 ("Carl Zeise", Германия) в области 400-4000 см-1 (в вазелиновом масле или в тонком слое).

Спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Broker АМХ-Ш-300 (Германия) (рабочая частота 300,13 МГц), внутренний стандарт — тетраметилсилан (ТМС), растворитель - CD3OD.

- Расшифровку спектров проводили при помощи программы ChemNMR Pro.

Способность штаммов псевдомонад к синтезу питокининов определяли с помощью иммуноферментного анализа (Г.Р. Кудоярова и др., 1986,1990)

Антигрибную активность низкомолекулярных (НМ) фракций метаболитов (< 3 кДа) и очищенных образцов метаболитов определяли методом разведений. В пробирки вносили 0,5-3,0 мл препарата фракции метаболитов, добавляли 1 мл суспензии спор тест-гриба, 1 мл шестикратно концентрированной среды Чапека и дистиллированную воду до общего объема 6 мл. Засеянные пробы инкубировали при 28'С 7 суток. Подавление роста гриба оценивали микроскопически относительно контроля, представляющего собой вышеописанную систему, но без внесения метаболитов. В качестве единицы активности принимали такое количество фракции метаболитов, при котором подавляется рост гриба в течение 7 суток.

Образование межмолекулярных комплексов с углеводами и их стехиометрический состав определяли следующими способами:

- методом Бента-Френча (Бек и Надьпал, 1989) по спектрам вычитания . растворов метаболитов с углеводами при помощи спектроскопии в УФ - области при длинах волн 260-265 нм, соответствующих Я—электронным переходам карбонильных групп метаболитов, на спектрофотометре Specord M 40;

- методом поляриметрии по изменению угла вращения в зависимости от мольного соотношения метаболиг.углевод на поляриметре. Отклонение угла

вращения смеси этих растворов от монотонного изменения угла вращения в зависимости от мольного соотношения компонентов в смеси указывает на образование комплекса метаболит углевод и его стехиометрию.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Подбор оптимальных условий культивирования и биосинтез метаболитов штаммами бактерий p. Pseudomonas. Сравнительный анализ полученных данных подбора оптимальных условий культивирования показал, что использование в качестве источника углерода различных органических веществ существенно влияет на образование антибиотических веществ культурами Pseudomonas. Было установлено, что максимальное количество низкомолекулярных антибиотических веществ образуется на среде с глицерином. Вторым существенным фактором для накопления в среде наибольшего количества метаболитов с антигрибной активностью является природа источника органического азота. Как видно из результатов эксперимента (табл. 1), оптимальным оказалось одинаковое соотношение дрожжевого экстракта и пептона по 0,5 %, что может быть связано со сбалансированностью факторов роста, витаминов и микроэлементов, входящих в их состав.

Оптимальными для секреции метаболитов с антигрибной активностью являлись температуры в диапазоне от 22 до 26 °С. Установлено, что в подобранных оптимальных условиях культивирование при температуре 22°С позволяло штаммам интенсивно накапливать НМ метаболиты с антигрибной активностью на завершающей стадии экспоненциального роста к 28-30 ч, в дальнейшем активность практически не изменяется до окончания культивирования (рис.1). Причем следовые количества антибиотических веществ обнаруживались в среде уже через 8 ч культивирования.

Зависимость фунгицидной активности КЖ штаммов Pseudomonas от состава питательной среды

Состав среды, г/л Фунгицидная активность, едУмлЮК

Дрожжевой экстракт Пептон Источник углерода КгНРОч MgS04

5 - Глицерин, 10' 14 1,5 . 3

10 - Глицерин, 10 14 1,5 6

5 5 Глицерин, 10 1,5 1,5 12

- 5 Глицерин, 10 '4 1,5 4,5

- 10 Глицерин, 10 1,5 14 6-

5 5 Сахароза, 10 14 14 6

5 5 Глюкоза, 10 14 14 6

5 5 Ацегамнд, 10 14 1,5 3

5 5 Пируют, 10 1,5 1,5 3

Повышение температуры культивирования до 30°С отрицательно сказывалось на накоплении НМ метаболитов с фунгицидной активностью. Их секреция в среду начиналась через 30 ч антигрибная активность была невысокой и не увеличивалась до окончания культивирования.

Снижение температуры. культивирования до 15°С также приводило к уменьшению образования метаболитов с фунгицидной активностью и задержке их секреции в среду (через 40 ч), что может быть связано с замедлением роста культур.

При этом, максимальный титр клеток оставался высоким вне зависимости от температуры выращивания и составлял (6,5-7,0)-1010 КОЕ/мл КЖ при 22°С и (2,5-3,0)1010 КОЕ/мл КЖ при 15 и 30°С.

В фазе стационарного роста и при переходе в стадию отмирания культуры секретируют во внешнюю среду ростсгимулирующие вещества, что, в принципе,

не является новым свойством для псевдомонад. Данные иммуноферментного анализа по секреции ростстимулирующих веществ представлены в табл. 2.

во

О 16 32 48 64

Время культивирования, ч.

Рис. 1. Динамика периодического роста и накопления антибиотических веществ культурами Pseudomonas: 1-3 - титр клеток, млрд. КОЕ/мл КЖ, при температуре 22°С (1) 30°С (2) и 15°С (3); 4-6 - антигрибная активность, ед/мл КЖ, при температуре 22°С (4), 30°С (5) и 15°С (6).

Таблица 2

Концентрация ростстимулирующих веществ в культуральных жидкостях штаммов Pseudomonas

Штамм Концентрация фитогормона, нг/мл КЖ

Цигокин инподобные вещества ИУК

Р. chlororaphis И Б 51 205 878

P.puiida ИБ 17 255 -

Р. chlororaphis ИБ 6 680 511

Определение состава низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseudomonas. Хроматографические профили НМ фракций метаболитов Pseudomonas представлены на рис. 2, а-в. При помощи препаративной ВЭЖХ из НМ фракций метаболитов были выделены 6 компонентов у штамма P. chlororaphis ИБ 51, 10 компонентов у штамма P. chlororaphis ИБ 6 и И - у P. putida ИБ 17 (табл. 3). Покомпонентный анализ показал, что фунгицидной активностью обладает лишь один компонент из НМ фракции метаболитов каждого изучаемого штамма Pseudomonas. При хроматогафическом разделении эти компонеты первыми выходят с колонки, они также не имеют ярко выраженного максимума поглощения в УФ - области. Остальные компоненты фракций за некоторым исключением имеют максимумы УФ - поглощения в интервале от 265 до 280 нм, характерные для регуляторов роста растений.

Физико-химические свойства НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas. В интервале рН 6-9 уровень фунгицидной активности НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas оставался максимальным и стабильным, критическими точками стабильности являлись значения рН < 4 и рН > 11, после которых активность падала больше, чем в два раза.

Максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов Pseudomonas наблюдался в диапазоне температур 25 - 60°С, при температуре 70°С происходила значительная термоинактивация, но при этом 20-25 % от начальной активности у штаммов P. chlororaphis остается даже после инкубирования при температуре 100°С. Такая картина может быть обусловлена наличием во фракциях двух компонентов, обладающих фунгицидной активностю, один из которых имеет пептидную природу и денатурирует при температуре, выше 60°С, а второй - антибиотик феназиновой природы в следовых количествах, нехарактерный для вида P. putida.

Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности. Разработана оригинальная методика выделения метаболитов, обладающих фунгицидной активностью (рис. 3).

Рис. 2. Хроматографические профили НМ фракций метаболитов КЖ штаммов Pseudomonas (P.putida ИБ 17 (а), Р. chlororaphisHb 51 (б), P. chlororaphis

ИБ 6 (в)) и выделенных метаболитов этих штаммов, обладающих фунгицидной активностью (г); (ВЭЖХ, 254 нм, колонка Zorbax-ODS (250x4,6 мм, "Shimadzu" Япония), элюент - вода). Цифрами обозначены номера компонентов фракции.

Характеристики компонентов НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas.

Штамм Ks компонента ^ямпг В УФ, нм Фунгицидная активность Фитогормональная активность

Р. chlororaphis ИБ 51 1 — + -

2 275 +

3 267 +

4 267 +

5 252; 257,5; 263,5 -

6 267; 2S0 +

Р. chlororaphis ИБб 1 — -

2 274 +

3 267 +

4 — -

5 — -

б 267 +

7 267 +

8 252; 257,5; 263,5 -

9 267 +

10 272 +

Р. pulida ИБ 17 1 — -

2 263 +

3 — -

4 267 +

5 272,5 +

6 270 +

7 268 +

8 279,5 +

9 — -

10 276 +

11 — -

Схема выделения метаболитов с антигрибной активностью включала в себя стадии центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования, осаждение примесей и осаждение метаболитов;

— центрифугирование КЖ Стадия удаления микробных клеток из КЖ — общая стадия для всех методик по выделению экзоцеллюлярных антибиотических веществ;

— ультрафильтрация на модулях волоконного типа Стадия избавления от высокомолекулярных соединений. Ультрафильтрации подвергаются супернатанты со стадии центрифугирования КЖ с отбором фильтратов, заведомо содержащих низкомолекулярные фракции (< 3 кДа) внеклеточных метаболитов. Эти фракции содержат 6-11 компонентов, причем, как было показано выше, антигрибной активностью обладает только один компонент каждой фракции;

— концентрирование ультрафильтрата, Эта стадия проводилась путем упаривания фильтрата на вакуумном роторном испарителе при 35°С. Степень концентрирования 20 раз;

— осаждение примесей. На этой стадии проводили осаждение солей и других остатков питательной среды в концентрате метанолом до 60 % насыщения с дальнейшим их отделением центрифугированием и отгонкой метанола из супернатанта под вакуумом.

— осаждение метаболитов, обладающих фунгицидной активностью. Заключительная стадия выделения, на которой из супернатанта предыдущей стадии, изучаемые вещества осаждали ацетоном.

В результате применения разработанной оригинальной методики выделения в хроматографических профилях элюции выделенных метаболитов присутствовал лишь один пик (рис. 2, г), по времени выхода соответствующий пикам компонентов, обладающих антигрибной активностью, причем время выхода активного компонента для каждого из штаммов Pseudomonas достоверно не отличалось.

Рис. 3. Схема выделения метаболитов штаммов P. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Л putida ИБ 17 обладающих фунгицидной активностью.

Определение молекулярной массы метаболитов штаммов Pseudomonas обладающих фунгицидной активностью. Определение молекулярной массы метаболитов проводили при помощи эксклюзионной жидкостной хроматографии с использованием маркеров молекулярной массы. В результате чего было установлено, что метаболиты штаммов Pseudomonas близки по молекулярной массе, различие составляет ± 200 Да, и их молекулярная масса варьирует в пределах 2,8 - 3,0 кДа (рис. 4).

Рис.4. Хроматограмма метаболитов Pseudomonas с антигрибной активностью (2, время выхода 15Д±0,1 мин.) и маркеров молекулярной массы (1 - инсулин (Мг 5,8 кДа), время выхода 11,5 мин., 2 - витамин В12 (Мг 1355 Да), время выхода 17,2 мин.). (280 нм, колонка TSK G2000SW (300x7,8 мм), элюент - ОД М фосфат натрия, 0,3 М хлорид натрия (рН 7,0), расход 1 мл/мин)

Аминокислотный и элементный составы метаболитов Pseudomonas. обладающих фунгицид ной активностью. Исходя из того, что активность изучаемых метаболитов штаммов псевдомонад проявлялась в диапазоне температур 25 - 60 °С, а при температуре 70 °С происходила их значительная термоинактивация, можно было предположить, что метаболиты имеют пептидную природу. Это предположение было подтверждено данными аминокислотного анализа гидролизатов метаболитов. Данные аминокислотного и элементного анализов (табл. 4 и 5) также показали, что метаболиты изучаемых штаммов неидентичны по своему составу, различие составляет в одну аминокислоту, чем и определяется разница в их молекулярных массах.

В состав кислотного гидролизата метаболита штамма P. chloraphis ИБ 51 входит 19 аминокислот, штаммов ИБ 6 и ИБ 17-18 аминокислот, в основном составы схожие, за некоторым исключением. В составе гидролизата метаболита штамма ИБ 51 не наблюдается лейцина, который присутствует в составе гидролизатов штаммов ИБ 6 и ИБ 17, а аспарагиновая кислота и треонин присутствуют в удвоенном количестве

Эквимолярное содержание аминокислот в структуре метаболитов, продуцируемых псевдомонадами

Аминокислота Штамм- продуцент

Р. putida т 17 Р. chloraphis ИБ 51 Р, chloraphis ИБ 6

Аспараги новая кислота I 2 !

Треонин 1 2 \

Серии 1 1 1

Глутаминовая кислота 2 2 2

Пролии 2 2 2

Глицин 4 4 4

Алании 2 2 2

Валин 1 1 1

Метионин 1 1 1

Лейцин 1 1

Лизин 1 1 1

Гисгидин 1 1 1

Таблица 5

Элементный состав метаболитов бактерий p. Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

Культура Содержание элемента (%)

Углерод Водород Азот Сера

Р. cMororaphis ИБ 51 48,6 6,4 16,0 1,7

P.pufida ИБ 17 50,2 6,5 16,1 1,8

Р. chlororaphis ИБ 6 50,0 6,6 16,1 1,8

НК— и ЯМР 13С- спектроскопия метаболитов Pseudomonas.

обладающих фунгицидной активностью. Анализ данных ИК- и ЯМР С-спектроскопии (рис. 5 и 6) показал, что молекулы изучаемых метаболитов содержат глицериновый остов, что характеризуется наличием химических сдвигов (ХС) 65 и 74 м.д. и характерными полосами поглощения в ИК -спектрах на 2968 и 1408 см-1. К молекуле глицерина через эфирные атомы кислорода посредством

карбонильных групп (1044 см-1, 170 м.д.) присоединены три полипептидные цепочки, на наличие которых указывает увеличение площади пиков аминогрупп (3100-3200 см-1) и изменение пропускания в области 1500 см-1, характерной для аминных и ацетаидных групп.

Рис. 5. ИК-спектр метаболитов с антигрибной активностью, продуцируемых штаммами Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и P. риТШи ИБ17.

Рис. 6. ЯМР 13С спектр метаболитов с антигрибной активностью, продуцируемых штаммами Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ6 и Р. риТШи ИБ17

Сравнение спектров выделенных метаболитов со спектрами полученными при помощи программы ChemNMR Pro, позволило сделать вывод, что выделенные метаболиты по своей химической структуре являются трипептидами глицерина и представляют собой новую группу метаболитов бактерий рода Pseudomonas. Также очевидно, что выделенные метаболиты не являются сидерофорами в классическом понимании, т.к. не имеют в своем составе флюоресцентного хромофора На рис 7 представлена их предполагаемая пространственная конфигурация.

от —атом углерода,

о -атом водорода,

О - атом кислорода,

О -атом азота,

о - атом серы.

Рис. 7. Предполагаемая пространственная конфигурация молекулы триглицеридпеггшда - нового метаболита бактерий р. Pseudomonas

Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas. В связи с тем, что выделенные триглицеридпептиды являются новой группой метаболитов бактерий рода Pseudomonas, было интересно определить величину их фунгицидной

активности и соотнести ее с таковыми известных метаболитов псевдомонад, обладающих антигрибной активностью.

Методом разведений выявлена минимальная ингибирующая концентрация ряда фитопатогенных грибов (табл. 6), которая является сопоставимой с величинами ингибирования фитопаогенов известными псевдомонадными антибиотиками.

Таблица 6

Спектр фунгицидной активности метаболитов, продуцируемых бактериями p. Pseudomonas

Штамм -продуцент Минимальная ингибирующая концентрация подавления следующих видов патогенных грибов, мг/мл

Fusarium culmorum Fusarium gibbosum || S Sr -II 1.1 | Fusarium ; semilectum I Fusarium i avenaceum «1 Ii II £ E Bipolaris sorokiniana Alternaría atiéntala Ii •gl

Р. chlororaphis ИБ 51 0,2 0,50,6 >1 0,50,6 0,50,6 0,50,6 0,81,0 0,10,2 0,30,4 0,30,4

Р. chlororaphis ИБ6 0,1- 0Д 0,50,6 0,50,6 0,10,2- 0,50,6 0,2-. 0,3 0,81,0 0,10,2 0,30,4 0,30,4

Р. pulida ИБ17 0,10,2 0,30,4 >1 0,50,6 0Д-04 0,30,4. 0,30,4 0,1- 0Д >1 0,20,3

Комплексообразующая способность триглицеридпептидов Pseudomonas. Триглицеридпептиды Pseudomonas не обладают сидерофорной активностью по отношению к ионам Fe+3, но, в тоже время, они способны образовывать комплексы с ионами Zn+2 и молекулами мальтозы, причем комплексообразование метаболитов с углеводами у бактерий рода Pseudomonas является новым свойством, которое ранее не было отмечено другими исследователями.

В УФ-спектрах всех трех метаболитов имеется максимум поглощения, лежащий на длинах волн 260-265 нм и соответствующий я—nt* электронным переходам карбонильной группы метаболита Методом Бента-Френча по спектрам

вычитания растворов метаболитов с мальтозой установлено, что стехиометрия молекулярных комплексов соответствует составу метаболит:мальтоза = 1:1. Стехиометрия молекулярных комплексов метаболитов с мальтозой была также подтверждена методом поляриметрии. Установлено, что смесь растворов метаболита и углевода имеет монотонно изменяющийся угол вращения [а] в зависимости от их мольного соотношения. Но при их соотношении 1:1 обнаруживается отклонение от монотонности с ярко выраженным минимумом угла вращения (рис 8).

[а] «о 100

8060 40 ■ 200

0123456789 10 С мльтом IС иггаболит.

Рис 8. Стехиометрия молекулярных комплексов метаболитов Pseudomonas с мальтозой методом поляриметрии.

В природных условиях корневая система растений выделяет в ризосферу различные вещества, в том числе и углеводы. Борьба за источник питания между бактериями рода Pseudomonas и фитопатогенами может характеризоваться продукцией во внешнюю среду метаболитов, которые, связывая субстрат, ограничивают его доступность для других микроорганизмов. Поэтому хелатообразующая способность по отношению к углеводам, по всей вероятности, обуславливает дополнительное ингибирующее действие на прорастание спор фитопатогенных грибов в средах, содержащих, в качестве источника углерода, различные сахара.

V

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные условия культивирования бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, P. chlororaphis ИБ 6 и P. putida ИБ 17 в жидкой среде, позволяющие получить культуры с высоким титром клеток и максимальной продукцией метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.

2. Разработана новая схема выделения метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. С помощью ВЭЖХ охарактеризована гомогенность выделенных метаболитов.

3. Методами жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа ИК- и ЯМР 13С- спектроскопии показано, что выделенные метаболиты Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, представляют новую группу метаболитов бактерий рода Pseudomonas и по своей химической структуре являются триглицеридпептидами с молекулярной массой 2,8-3,0 кДа.

4. Определены минимальные ингибирующие концентрации триглицеридпептидов изучаемых, псевдомонад для ряда фитопатогенных и фитотоксичных грибов, показывающие, что антигрибная активность выделенных метаболитов сопоставима по своей величине активности известных антибиотиков бактерий рода Pseudomonas.

5. Обнаружена способность триглицеридпептидов Pseudomonas образовывать комплексы с ионами Zn+2 и молекулами мальтозы, причем комплексообразование метаболитов с углеводами у бактерий рода Pseudomonas является новым свойством, характерным для этих антибиотиков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Логинов О.Н., Четвериков СП. Разработка методов выделения веществ, обладающих ростстимулирующей и фунгицидной активностью, из культуральной жидкости микроорганизмов рода Pseudomonas // Материалы XV Межд. научно-техн. конф. «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (7-10 октября 2002 г., Уфа). Гос. изд-во научно-техн. литры «Реактив», Уфа, 2002. - Т. 1. - С. 108.

2. Логинов л О.Н., Четвериков СП. Низкомолекулярные метаболиты Pseudomonas sp.y обладающие ростстимулирующей и фунгицидной активностью // Материалы I Межд. Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» (14-18 октября 2002 г., Москва), М., 2002. - С. 496.

3. Логинов О.Н., Четвериков СП. Низкомолекулярные токсины псевдомонад - ингибиторы роста фитопатогенных грибов // Материалы II Российской научно-практ. конф. «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-3 июня 2003 г., Москва), М., РАЕН-МААНОИ. - 2003. - С. 131.

4. Четвериков СП., Логинов О.Н. Новые антигрибные метаболиты пептидной природы Pseudomonas, способные к комплексообразованию с углеводами // Материалы II Межд. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003 г.; г. Москва). М., 2003.-Ч. 1. - С 338339.

5. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Четвериков СП., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С, Силищев Н.Н. Новые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды // Тез. докл. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (24-25 ноября 2003 г., гЛущино, ИБФМ). Пущино, 2003. - С. 74-75.

6. Логинов О.Н., Четвериков СП. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 // Биотехнология. -2003. - № 5. - С 22-25.

7. Логинов О.Н., Четвериков СП., Гусаков В.Н. Триглицеридпептиды -новая группа антигрибных метаболитов псевдомонад {Pseudomonas) II Доклады Академии Наук. - 2003. - Т. 393, № 5. - С. 715-717.

8. Логинов О.Н., Четвериков СП., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Высокоэффективная жидкостная хроматография низкомолекулярных бактериальных метаболитов белковой природы, обладающих фунгицидной активностью // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т. 59, № 3. - С 310-314.

9. Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков СП., Васильева Н.С, Силищев Н.Н. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 - продуцент цитокининов // Заявка № 2003101144/13 от 15.01.2003.

Отпечатано с готовых диапозитивов ООО "Принт+" Тираж 100 экз. Заказ № 27 450054, г. Уфа, пр.,Октября, 7

»15614

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Четвериков, Сергей Павлович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 1.1. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas — агенты биологического контроля фитопатогенных грибов

1.1.1. Продукция сидерофоров

1.1.1.1. Сидерофоры пиовердинового типа

1.1.1.2. Другие сидерофоры

1.1.2. Синтез антибиотиков 15 ^ 1.2. Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью

1.3. Выделение и свойства метаболитов бактерий рода

Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

1.3.1. Способы выделения метаболитов бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

1.3.2. Количественная оценка антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

2.1. Объекты исследований

2.2. Условия хранения и культивирования псевдомонад

2.3. Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов

2.4. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

2.5. Определение фитогормональной активности метаболитов

Pseudomonas

2.6. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

2.7. Определение pH - стабильности и термостабильности низкомолекулярных фракций метаболитов Pseudomonas

2.8. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

2.9. Определение антигрибной активности метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

2.10. Комплексообразование метаболитов Pseudomonas с углеводами, определение стехиометрии комплексов

2.11. Статистическая обработка результатов 40 ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММАМИ БАКТЕРИЙ Pseudomonas

3.1. Влияние углеродного и азотного питания на фунгицидную активность штаммов Pseudomonas

3.1.1. Природа источника углерода

3.1.2. Природа источника азота

3.2. Влияние температуры культивирования на фунгицидную активность штаммов Pseudomonas

3.3. Динамика процессов периодического роста и образования антибиотических веществ штаммами Pseudomonas

ХАРАКТЕРИСТИКА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ МЕТАБОЛИТОВ Pseudomonas И ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ НИХ МЕТАБОЛИТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

4.1. Определение состава низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseudomonas

4.2. Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseudomonas

4.3. Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности

5. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МЕТАБОЛИТОВ Pseudomonas,

ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

5.1. Определение молекулярной массы метаболитов штаммов

Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

5.2. Аминокислотный и элементный составы метаболитов штаммов

Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

5.3. ИК— и ЯМР 13С— спектроскопия метаболитов штаммов

Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

5.4. Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas

5.5. Комплексообразующая способность триглицеридпептидов

Pseudomonas

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas - ингибиторы роста фитопатогенных грибов"

Актуальность проблемы. Бактерии рода Pseudomonas — одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Weller, 1988; Смирнов, Киприанова, 1990; Dowling & O'Gara, 1994; Воронин, 1998; Логинов и др., 2001; Bloemberg & Lugtenberg , 2001; Whipps, 2001) и обладающих совокупностью полезных для растений свойств. В настоящее время такие бактерии принято обозначать PGPR — Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (ризобактерии, способствующие росту растений).

Следует также отметить, что PGPR Pseudomonas являются потенциальными объектами агробиотехнологий для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов.

Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогеные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция псевдомонадами различных НМ веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al., 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al., 1997; Suzumura et al., 1997; Thrane et al., 1999Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001; Quail et al., 2002; Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа (Shanahan et al., 1992, 1993).

Цель исследования. Целью исследований являлось изучение состава и физико-химических свойств метаболитов, продуцируемых бактериями Pseudomonas putida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774), Pseudomonas chlororaphis

ИБ 6 и Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945) - основы биопрепарата "Елена", и определение биологической роли данных метаболитов в проявлении фунгицидной активности исследуемых штаммов по отношению к фитопатогенным грибам. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов питательной среды на продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas;

2. отработать схему выделения и очистки метаболитов штаммов Pseudomonas; выделить и охарактеризовать гомогенность очищенных метаболитов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;

3. исследовать основные физико-химические свойства метаболитов;

4. определить состав и предполагаемую структуру метаболитов.

Научная новизна. Выделена и охарактеризована новая группа метаболитов псевдомонад, по химической структуре представляющих собой трипептиды глицерина, и обладающих фунгицидной активностью.

Установлена способность комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с углеводами.

Практическая значимость. Изучены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена" для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I и II Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва,

2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003).

Публикации. По материалам работы опубликовано 9 научных работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах.

Благодарности

Автор выражает огромную признательность всем сотрудникам лаборатории биологически активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН за постоянную поддержку при выполнении данной работы. Автор благодарит заведующего контрольно - аналитической лаборатории Института биологии Уфимского научного центра РАН к.х.н. Гусакова В.Н. за помощь в обсуждении результатов и консультации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas — агенты биологического контроля фитопатогенных грибов

К настоящему времени выделено множество штаммов ризосферных псевдомонад, подавляющих или замедляющих рост и развитие фитопатогенных грибов. Механизмы антагонистического взаимодействия псевдомонад и фитопатогенов различны. К основным и наиболее важным с точки зрения практического использования PGPR Pseudomonas относятся продукция сидерофоров и синтез антибиотиков (Homma et al., 1989; Dowling & O'Gara, 1994; Raaijmakers et al., 1997).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Четвериков, Сергей Павлович

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные условия культивирования бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 в жидкой среде, позволяющие получить культуры с высоким титром клеток и максимальной продукцией метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.

2. Разработана новая схема выделения метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. С помощью ВЭЖХ охарактеризована гомогенность выделенных метаболитов.

3. Методами жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа, ИК- и ЯМР ,3С- спектроскопии показано, что выделенные метаболиты Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, представляют новую группу метаболитов бактерий рода Pseudomonas и по своей химической структуре являются трипептидами глицерина с молекулярной массой 2,8-3,0 кДа.

4. Определены минимальные ингибирующие концентрации триглицеридпептидов изучаемых псевдомонад для ряда фитопатогенных и фитотоксичных грибов, показывающие, что антигрибная активность выделенных метаболитов сопоставима по своей величине активности известных антибиотиков бактерий рода Pseudomonas.

5. Обнаружена способность триглицеридпептидов Pseudomonas образовывать комплексы с ионами Zn+2 и молекулами мальтозы, причем комплексообразование метаболитов с углеводами у бактерий рода Pseudomonas является новым свойством, характерным для этих антибиотиков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Четвериков, Сергей Павлович, Уфа

1. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. М.: Мир, 1989. - 413 с.

2. Блажевич О.В., Максимова Н.П. Биосинтез флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм у ризосферных бактерий Pseudomonas putida М // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. - №2. - С. 205-209.

3. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал.- 1998. № 10. - С. 25-31.

4. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. — М.: Мир, 1991.-544 с.

5. Есипов С.Е., Аданин В.М., Баскунов Б.П. Новый антибиотически активный флороглюцид из Pseudomonas aurantiaca II Антибиотики. 1975. -Т. 20, № 12.-С. 1077-1081.

6. Квасников Е. И., Айзенман Б.Е., Соломко Э.Ф. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на средах с низкомолекулярными н-алканами // Микробиология. — 1975. Т. 44, № 1. - С. 55-60.

7. Киприанова Е.А., Рабинович A.C., Бойко О.И., Каминская Л.Ю. Высокоактивное антибиотическое вещество, выделенное из бактерий рода Pseudomonas II Антибиотики. 1969. - Т. 14, №3. - С. 228-231.

8. Киприанова Е.А., Рабинович A.C., Каминская Л.Ю. Химическая и биологическая характеристика антибиотических веществ, образуемых Pseudomonas aurantiaca II Физиологически активные вещества. 1971. - № 3-С. 283-290.

9. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каровайко Н.И. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. - Т. 37, вып. 1. - С. 193-199.

10. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. - Т. 33, вып. 6.-С. 1221-1227.

11. Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Силищев H.H. и др. Роль бактерий -антагонистов фитопатогенов в защите сельскохозяйственных растений от болезней. Уфа: Гил ем, 2001. - 66 с.

12. Климова В. А. Основные микрометоды онализа органических соединений. М.: Химия, 1967. - 208 с.

13. Пат. 2213774 Российская Федерация, 7 С 12 N 1/20// (С 12 N 1/20, С 12 R 1:40). Штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами /

14. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев H.H., Мелентьев А.И., ^ Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф.; Заявлено 25.03.2002; Опубл.1010.2003. Бюл. 28.

15. Петренко М.Б., Боровков A.B. Производные феназина из Pseudomonas sp. штамм 2/3 // Химия природ, соединений. 1970. - №6. - С. 779.

16. Поморцева Н.В. Образование пиоцианина на средах с углеводородами // Микробиология. 1965. - Т. 34, № 3. - С. 473-476.

17. Попова Ж.П., Эськин С.Б., Матисова А.Н. О составе антифунгина — сырца// Бюл. ВНИИ с.-х. микробиологии. 1971. - Т. 15, № 1. - С. 79-80. ^ Редди Т.К., Боровков A.B. Моно-, ди- и триацетилфлороглюцины из

18. Pseudomonasßuorescens II Химия природ, соединений. 1969. - № 2. - С. 133.

19. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука, 1986.-200 с.

20. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 464 с.

21. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев:Р1. Наук, думка, 1990. 264 с.

22. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Додатко Т.А., Клюев H.A. Антибиотики ароматической природы из Pseudomonas cepacia II Микробиол. журн. 1991. - Т. 53, № 5. - С. 41-45.

23. Теппер Е.З., Шилыиикова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1972. - 200 с.

24. Хеншен А., Хупе К.-П., Лотшпайх Ф., Вельтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988. - 688 с.

25. Худяков Я.П., Шкляр М.С., Савадеров Е.П. Антибиотик антифунгин, образуемый бактериями рода Pseudomonas II Прикл. биохимия и микробиология. 1965.-Т. 1,№2.-С. 186-190.

26. Широков A.B., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 ингибиторы роста фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. -Т. 38,№2.-С. 161-165.

27. Anthony U., Christophersen С., Nielse Р.Н., Gram L., Petersen В.О. Pseudomonine, an isoxazolidone with siderophoric activity from Pseudomonas fluorescens AH2 isolated from lake Victoria Nile perch // J. Nat. Prod. 1995. - V. 58. -P. 1786-1789.

28. Arima K., Imanaka H., Konsara M. et al. Pyrrolnitrin, a new antibiotic substans, produced by Pseudomonas I I Agr. and Biol. Chem. 1964. - V. 28, № 8. -P. 575-582.

29. Bawden K., Broadbent J., Ross W. Some simple anthelmintics // Brit. J. Pharmacol, and Chemother. 1965. - V. 24. - P. 714-724.

30. Baysse C., De Vos D., Naudet Y., Vandermonde A., Ochsner U., Meyer J.M. et al. Vanadium interferes with siderophore-mediated iron uptake in Pseudomonas aeruginosa II Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 2425-2434.

31. Becker J.O., Cook R.J. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased growth response of wheat by fluorescent Pseudomonas // Phytopathology 1988. - V. 78. - P. 778-782.

32. Bisacchi G.S., Hockstein D.R., Koster W.H., Parker W., Rathnum M.L, Unger S.E. Xylocandin: a new complex of antifungal peptides. II. Structural studies and chemical modifications // J. Antibiot. 1987. - V. 40. - P. 1520-1529.

33. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria // Curr. Opin. Plant. Biol.- 2001. V. 4. - P. 343-350.

34. Bonsall R.F., Weller D.M., Thomashow L. S. Quantification of 2,4 diacetylphloroglucinol produced by fluorescent Pseudomonas spp. in vitro and in the rhizosphere of wheat // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 951-955.

35. Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 104. - P. 209-228.

36. Budzikiewicz H. Siderophores of fluorescent pseudomonads // Z. Naturforsch. 1997. - V. 52. - P. 713-720.

37. Burkhead K.D., Schisler D.A., Slininger P.J. Pyrrolnitrin production by biological control agent Pseudomonas cepacia B37w in culture and in colonized wounds of potatoes // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2031-2039.

38. Buyer J., Wright J., Leong J. Structure of pseudobactin A 214, a siderophore from a bean-deleterious Pseudomonas II Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 54925499.

39. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. 2003. - V. 157.-P. 503-523.

40. Corbell N., Loper J. E. A global regulator of secondary metabolite production in Pseudomonas fluorescens Pf-5 // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6230-6236.

41. Cornelis P., Matthiis S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines // Environ. Microbiol. -2002.-V. 12.-P. 787-798.

42. Cox C.D., Rinehart K.L., Moore M.L., Cook J.C. Pyochelin: novel structure of an iron chelating growth promoter for Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. 1981. -V. 78. - P. 4256-4260.

43. Dao K.H.T., Hamer K.E., Clark C.L., Harshman L.G. Pyoverdine production by Pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress // Ecol. Appl. -2001.-V. 9.-P. 441-448.

44. Dowling D.N., O'Gara F. Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - P. 133-141.

45. Duffy B.K., Defago G. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - V. 65. - P. 2429-2438.

46. Dybas M.J., Tatara G.M., Criddle C.S. Localization and characterization of the carbon tetrachloride transformation activity of Pseudomonas sp. strain KC // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 758-762.

47. Fakhouri W., Walker F., Vogler B., Armbruster W., Buchenauer H. Isolation and identification of N-mercapto-4-formylcarbostyril, an antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens II Phytochemistry. 2001. V. 58. - P. 1297-1303.

48. Gamard P., Belrhlid R., Labbe C., Belanger R., Paulitz T. Production of multiple antifungal compounds by PGPR strains of Pseudomonas fluorescens and Serratiaplymuthica II Can. J. Plant Pathol. 1996. V. 18. - P. 89.

49. Gamard P., Sauriol F., Benhamou N., Belanger R.R., Paulitz T.C. Novel butyrolactones with antifungal activity produced by Pseudomonas aureofaciens strain 63-28 // J. Antibiot. 1997. V. 50. - P. 742-749.

50. Gould W.D., Hagedorn C., Bardinelli T.R., Zablotowicz R.M. New selective media for enumeration and recovery of fluorescent pseudomonads from various habitats // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. - P. 28-32.

51. Higashihara T., Sato A. Microbial formation of 1-phenazine-carboxylic acid from hydrocarbons // Agr. and Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 1802-1804.

52. Higashihara T., Sato A. Production of 1-phenazine-carboxylic acid from ethanol by a hydrocarbon assimilating bacterium Pseudomonas aeruginosa II Rep. Ferment. Res. Inst. - 1985. - № 63. - P. 80-92.

53. Höfte M., Buysens S., Koedam N., Cornelis P. Zinc affects siderophore-mediated high affinity iron uptake systems in the rhizosphere Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 // Bio/Metals. 1993. - V. 6. - P. 85-91.

54. Homma Y., Sato Z., Hirayama F., Konno K., Shirahama H., Suzui T. Production of antibiotics by Pseudomonas cepacia as an agent for biological control of soilborne plant pathogens I I Soil Biot. and Biochem. 1989. - V. 21, № 5. - P. 723- 728.

55. James D.W., Gutterson N. I. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens HV37a and their differential regulation by glucose // Appl. Environ. Microbiol. 1986.-V. 52.-P. 1183-1189.

56. Janisiewicz W.J., Roitman J. Biological control of blue mold and gray mold on apple and pear with Pseudomonas cepacia II Phytopathology. 1988. V. 78. - P. 1697-1700.

57. Janisiewicz W.J., Yourman L., Redman J., Mahone L. Postharvest control of blue mold and gray mold of apples and pears by dip treatment with pyrrolnitrin, a metabolite of Pseudomonas cepacia I I Plant Dis. 1991. V. 75. - P. 490-494.

58. Jiao Y., Yoshihara T., Ishikuri S., Uchino H., Ichihara A. Structural identification of cepaciamide A, a novel fungitoxic compound from Pseudomonas cepacia D-202 // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. - P. 1039-1042.

59. Kanner D., Gerber N., Bartha R. Pattern of phenazine pigment production by strain of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1978. - V. 134, №2. - P. 690.

60. Katoh K., Itoh K. New selective media for Pseudomonas strains producing fluorescent pigment // Soil Science and Plant Nutrition. 1983. - V. 29. - P. 525532.

61. Kim K.K., Kang J.G., Moon S.S., Kang K.Y. Isolation and identification of antifungal N -butylbenzenesulphonamide produced by Pseudomonas sp AB2 // J. Antibiotics. 2000. - V. 53. - P. 131-136.

62. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration ofpyocyanin and fluorescin //J. Lab. Clin. Med. 1954. - V. 44. - P. 301-307.

63. Kintaka K., Kitano K., Nosari Y. et al. Sulfazecin, a novel ß- lactam antibiotic of bacterial origin. Discovery, fermentation and biological characterization // J. Fernent. Technol. 1981. - V. 59, № 4. - P. 263-268.

64. MacDonald J.C. Pyocyanine. Antibiotics. V. 2. Biosynthesis. London; New York: Springer Verl., 1967. - P. 52-65.

65. MacDonald E.M.S., Powell G.K., Regier D.A., Glass N.L., Roberto F., Kosuge Т., Morris R.O. Secretion of zeatin, ribosylzeatin, and ribosyl-l-methylzeatin by Pseudomonas savastanoi II Plant Physiology. 1986. - V 82. P. 742-747.

66. Martin J. Control of antibiotic synthesis by phosphate // Adv. Biochem. Eng.- 1977.-V. 6, № 1. P. 105-127.

67. Mauerhofer M., Keel C., Haas D., Defago G. Pyoluteorin production by Pseudomonas ßuorescens strain CHAO is involved in the suppression of Pythium damping-off of cress but not of cucumber // European Journal of Plant Pathology.-1994.-V. 100.-P. 221-232.

68. Meyer J.M., Abdallah M.A. The siderochromes of non-fluorescent pseudomonads: production of nocardamine by Pseudomonas stutzeri I I J. Gen. Microbiol. 1980.-V. 118.-P. 125-129.

69. Meyer J.-M., Hohnadel D., Halle F. Cepabactin from Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, № 6. - P. 14791487.

70. Meyer J.M. Py o verdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species II Arch. Microbiol. 2000. - V. 174. -P. 135-142.

71. Meyers E., Bisacchi G.S., Dean L., Liu W.C., Minassian B., Slusarchyk D. S., Sykes R.B., Tanaka S.K., Trejo W. Xylocandin: a new complex of antifungal peptides. I. Taxonomy, isolation, and biological activity // J. Antibiot. 1987. - V. 40.-P. 1515-1529.

72. Moon S.-S., Kang P.M., Park K.S., Kim C.H. Plant growt promoting and fungicidal 4-quinolines from Pseudomonas cepacia II Phytochemistry. 1996.-V. 42. - P. 365-368.

73. Neilands J.B., Leong S.A. Siderophores in relation to plant growth and disease // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V 37. - P. 187-208.

74. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 26723-26726.

75. Neu T.R., Hartner T., Poralla K. Surface active properties of viscosin: a peptidolipid antibiotic // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 32. - P. 518— 520.

76. Neuenhaus W., Budzikiewicz H., Korth H., Pulverer G. 8-hydroxy-4-methoxy-monothiochinaldinsäure -eine weitere Thiosäure aus Pseudomonas II Z. Naturforsch. 1980. - V. 35. - P. 1569-1571.

77. Nielsen T.H., Christophersen C., Anthoni U., Sorensen J. Viscosinamide, a new cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas fluorescens DR54 // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87. - P. 80-90.

78. Nowak-Thompson B., Gould S.J., Kraus J., Loper J.E. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol by the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens Pf-5 // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 1064-1066.

79. Nyfeler R., Ackermann P. Phenylpyrroles, a new class of agricultural fungicides related to the natural antibiotic pyrrolnitrin. In D. R. Baker, J. G.

80. Fenyes, and J. J. Steffens (ed.). Synthesis and chemistry of agrochemicals. Ill ACS symposium series 504. American Chemical Society. Washington, D.C. 1992. P. 395-404.

81. Ogata K., Minami K., Tani Y. Образование 1-феназинкарбоновой кислоты и оксихлорорафина из углеводородов под влиянием микроорганизмов // J. Ferment. Technol. 1971. - V. 49. -P. 925-934.

82. Ohmori T., Hagiwara S., Ueda A. et al. Production of pyoluteorin and its derivatives from n- paraffin by Pseudomonas aeruginosa S 10B2 // Agr. and Biol. Chem. 1978. - V. 42. - P. 767-771.

83. Parker W.L., Rathnum M.L., Seiner V., Trejo W.H., Principe P.A., Sykes R.B. Cepacin A and cepacin B, two new antibiotics produced by Pseudomonas cepacia И J Antibiot. 1984. - V. 37. - P. 431-440.

84. Philson S.B., Llinas M. Siderochromes from Pseudomonas fluorescens. II. Structural homology as revealed by NMR spectroscopy // J. Biol. Chem. 1982. -V. 257. - P. 8086-8090.

85. Paulitz T., Nowak-Thompson В., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens // J. Chem. Ecol. 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.

86. Pierson III L.S.P., Pierson E.A. Phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens: role in rhizosphere ecology and pathogen suppression // FEMS Microbiology Letters. 1996. - V. 136. - P. 101-108.

87. Quail J.W., Ismail N., Pedras M.S.C., Boyetchko S.M. Pseudophomins A and B, a class of cyclic lipodepsipeptides isolated from a Pseudomonas species I/ Acta Crystallographica. Section C: Crystal Structure Communications. 2002. - V. 58.-P. 268-271.

88. Raaijmakers J.M., Weller D. M., Thomashow L. S. Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. 1997.-V. 63.-P. 881-887.

89. Risse D., Beiderbeck H., Taraz K., Budzikiewicz H., Gustine D. Corrugatin, a lipopeptide siderophore from Pseudomonas corrugate II Z. Naturforsch. — 1998. -V. 53.-P. 295-304.

90. Roitman J.N., Mahoney N.E., Janisiewicz W.J., Benson M. A new chlorinated phenylpyrrole antibiotic produced by the antifungal bacterium Pseudomonas cepacia II J. Agr. Food Chem. 1990. - V. 38, № 2. - P. 538-541.

91. Rosales A.M., Thomashow L., Cook R.J., Mew T.W. Isolation and identification of antifungal metabolites produced by riceassociated antagonistic Pseudomonas spp. II Phytopathology. 1995. - V. 85. - P 1028-1032.

92. Rossbach S., Wilson T.L., Kukuk M.L., Carty H.A. Elevated zinc induces siderophore biosynthesis genes and a zntA-like gene in Pseudomonas fluorescens II FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 191. - P. 61-70.

93. Serino L., Reimmann C., Visca P., Beyeler M., Chiesa V.D., Haas D. Biosynthesis of pyochelin and dihydroaeruginoic acid requires the iron-regulated pchDCBA operon in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 248-257.

94. Shoji J., Hinoo H., Kato T., Hattori T., Hirooka K., Tawara K., Shiratori O., Yoshihiro T. Isolation of cepafungins I, II and III from Pseudomonas species II J. Antibiot. 1990. - V. 43. - P. 783-787.

95. Shoji J., Hinoo H., Terui Y., Kikuchi J., Hattori T., Ishii K., Matsumoto K., Yoshida T. Isolation of azomycin from Pseudomonas fluorescens II J. Antibiot. -1989.-V. 42.-P. 1513-1514.

96. Slininger P.J., Jackson M.A. Nutritional factors regulating growth and accumulation of phenazine 1-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 2-79 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - V. 37. - P. 388-392.

97. Slininger P., Shea-Wilbur M.A. Liquid-culture pH, temperature, and carbon (not nitrogen) source regulate phenazine productivity of the take-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2-79 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 43. - P. 794-800.

98. Sokol P.A., Lewis C.J., Dennis J.J. Isolation of a novel siderophore from Pseudomonas cepacia II J. Med. Microbiol. 1992. - V. 36. - P. 184-189.

99. Sorensen D., Nielsen T.H., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 // Acta Crystallographica. 2001. - Section C: Crystal Structure Communications C57. -P. 1123-1124.

100. Stolworthy J.C., Paszczynsk A., Korus R., Crawford R.L. Metal binding by pyridine-2,6-bis (monothiocarboxylicacid), a biochelator produced by Pseudomonas stutzeri and Pseudomonas putida II Biodegradation. 2001. - V. 12.- P. 411-418.

101. Suzumura K., Takahashi I. et al. Structural elucidation of YM-75518, a novel antifungal antibiotic isolated from Pseudomonas sp. Q38009 // Tetragedron Lett. 1997. - V. 38, № 43. - P. 7573-7576.

102. Takeda R. Pseudomonads pigments (II). Two pigments, phenazine-carboxylic acid and oxy chlororaphine, produced by P. aeruginosa T 359 // J. Ferment. Technol. 1958. - V. 36, №2. - P. 286-290.

103. Takeda R. Pseudomonads pigments. IV. The structure of pyoluteorin //Bull. Agr. and Chem. Soc. Jap. 1959. - V. 23, № 3. - P. 165-171.

104. Taraz K., Seinsche D., Budzikiewicz H. Pseudobactin und Pseudobactin A

105. Varianten: Neue Peptidsiderophore vom Pyoverdin — Typ aus Pseudomonas fluoresces E2 // Z. Naturforsch. 1991. - V. 46, № 7-8. - P. 522-526.

106. Teintze M., Leong J. Structure of pseudobactin A, a second siderophore from plant growth promoting Pseudomonas BIO // Biochemistry. 1981. - V. 20. -P. 6457-6462.

107. Thomashow L.S., Weller D.M. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici II J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3499-3508.

108. Thomashow L.S., Weller D.M., Bonsall R.F., Pierson L.S. Production of the antibiotic phenazine-l-carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas species in the rhizosphere of wheat // Appl. and Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, № 4. - P. 908-912.

109. Thrane C, Nielsen T.H., Nielsen M.N., S0rensen J. Viscosinamide-producing Pseudomonas fluorescens DR54 exerts a biocontrol effect on Pythium ultimum in sugar beet rhizosphere // FEMS Microbiol Ecol. 1999. - V. 33. - P. 139-146.

110. Tooney J.I., Nelson C.D., Krotrov G. Isolation and identification of two phenazines from a strain of Pseudomonas aureofasiens II Can. J. Bot. 1965. - V. 43, №9.-P. 1055-1062.

111. Weller D.M. Biological control of soil-borne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - V. 26. - P. 379-407.

112. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. - P. 487-511.

113. Wright J. Viscosin, a potent peptidolipid biosurfactant and phytopathogenic mediator produced by a pectolytic strain of Pseudomonas fluorescens II J. Agric. Food Chem. 1991. - V. 39. - P. 483-489.