Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas"

СЮ34 YGSbS На правах рукописи

СУЛЕЙМАНОВА ЛИНА РИНАТОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ МЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS

03.00.07 - микробиология

- 1 О KT 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2009

003478555

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

кандидат биологических наук, доцент Петухова Надежда Ивановна

Ведущая организация -

Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, г. Москва

Защита состоится « 20 » октября 2009 года в /3 часов на

заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», по адресу: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан « 17 » сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Лукманова К. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами симбиотического взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации. В свою очередь, ризосферные бактерии обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений [Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990; Воронин A.M., 1998; Логинов О.Н. и др., 2005; Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J., 2001; Whipps J.M., 2001]. Наиболее распространенными ризосферными бактериями являются представители рода Pseudomonas.

Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитолатогеные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция бактериями различных низкомолекулярных веществ, таких как сидерофоры и антибиотики [Логинов О.Н. и др., 2005; Kim K.K. et а)., 2000; Nielsen Т.Н. et а!., 2000; Paulitz Т. et al., 2000; Fakhouri W. et al., 2001; Sorensen D. et al„ 2001; Quail J.W. et al., 2002; Lee J. et al., 2003]. Эти антигрибные метаболиты имеют различную химическую структуру и некоторые из них обладают способностью к комплексообразованию с экзометаболитами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста при улучшении роста растений. Однако эта способность для метаболитов бактерий рода Pseudomonas практически не изучена. В тоже время, установление механизмов действия метаболитов бактерий рода Pseudomonas на фитопатогены необходимо для разработки эффективных способов защиты растений.

Цель исследования

Оценка комплексообразующей способности метаболитов, продуцируемых бактериями рода Pseudomonas и определение их биологической роли в проявлении фунгицидной активности по отношению к фитопатогенным грибам.

Задачи исследования

] Установление способности к росту и развитию исследуемых штаммов Pseudomonas putida ИБ 17, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6, Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в средах с компонентами экзометаболитов растений в качестве источника углерода.

2 Изучение комплексообразования триглицеридпептидов исследуемых штаммов Pseudomonas с различными углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, входящими в комплекс экссудатных выделений корней растений.

3 Изучение способности к комплексообразованию метаболитов псевдомонад с катионами металлов: меди, цинка, кадмия, свинца.

4 Установление оптимального стехиометрического состава комплексов метаболит : экссудат, метаболит : катион для проявления фунгицидной активности метаболитов Pseudomonas.

5 Оценка комплексообразующей способности триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas как одного из механизмов их ингибирующего воздействия на фитонатогены.

Научная новизна исследования

Впервые охарактеризована способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать межмолекулярные комплексы с экссудатами растений: углеводами, органическими кислотами, аминокислотами, тем самым лимитируя по субстрату фитопатогены. Установлено, что процесс комплексообразования триглицеридпептидов и растительных экссудатов является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.

Впервые показано, что метаболиты псевдомонад способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами металлов: меди,

цинка, кадмия и свинца, что снижает содержание солей металлов в ризосфере растений.

Практическая значимость

Установленная способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать комплекс с экссудатами растений позволяет рекомендовать их применение в качестве средств защиты растений.

Установленная способность исследованных штаммов бактерий Pseudomonas к секреции антигрибных метаболитов в средах с различными субстратами является основой для использования их в производстве биопрепаратов, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Установленная комплексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Бактерии Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 способны к росту и секреции антигрибных метаболитов в средах с источниками углерода, которые могут составлять комплекс экссудатных выделений корней растений, что позволяет им интегрироваться с растением в совместном функционировании системы бактерии - растение - фитопатогены.

2 Триглицеридпептиды псевдомонад способны образовывать межмолекулярные комплексы с компонентами таких фракций экзометаболитов растений, как углеводы, органические кислоты и аминокислоты.

3 Метаболиты бактерий способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца, не обладая сидерофорной активностью по отношению к ионам железа.

4 Оптимальные стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат и метаболит : катион для триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций корневых экссудатных экзометаболитов растений и ионами металлов, находятся в интервале 1:1 - 1:20 и 1:1 — 1:9, соответственно.

5 Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпеп-тидами штаммов Pseudomonas с экзометабол игам и растений ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления их антигрибной активности.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на XIX и XX Международных научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006, 2008), IV Всероссийской научной internet-конференции (Уфа, 2006), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008), 5-м Всероссийском научно-практическом совещании-семинаре, (Анапа, 2008), Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (КНР, Харбин - Санья, 2008).

Публикации

По материалам работы опубликовано 12 научных работ, в том числе четыре статьи в рецензируемых ВАК РФ журналах.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 99 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Работа содержит 7 таблиц, И рисунков. Список литературы включает 26 отечественных и 110 иностранных источников.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в выполнении работы заведующему контрольно-аналитической лабораторией к.б.н. С.П. Четверикову; в.н.с. лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН к.т.н. H.H. Силищеву; сотрудникам лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН -с.н.с., к.б.н. Н.Ф. Галимзяновой и с.н.с., к.б.н. Т.Ф. Бойко.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

Основными объектами изучения являлись штаммы бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (пат. 2203945, РФ), являющийся основой биопрепарата «Елена»; Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 (пат. 2260951, РФ) и Pseudomonas putida ИБ 17 (пат. 2213774, РФ) из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, проявляющие антагонистические свойства в отношении ряда грибов - возбудителей болезней растений.

В качестве тест-объектов для анализа фунгицидной активности метаболитов в работе использовали наиболее чувствительный для исследования антагонизма фитопатогенный гриб Bipolaris sorokinianq (Sacc.) Shoemaker (= Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke). Культуры Pseudomonas поддерживали на агаризованной среде Кинг В [King Е.О. et al., 1954]. Для поддержания и культивирования микроскопических грибов использовали жидкую и агаризованную среды Чапека [Теппер Е.З. и др., 1972].

В качестве корневых экссудатов растений использовали вещества квалификации ч.д.а. (Sigma, США), представленные в таблице 1.

Таблица 1 - Типичные представители корневых экссудатов растений

Углеводы Органические кислоты Аминокислоты

Арабиноза Яблочная кислота Алании

Ксилоза Фумаровая кислота Метионин

Фруктоза Янтарная кислота Валин

Глюкоза Лимонная кислота Аргинин

Галактоза Пировиноградная кислота Тирозин

Сахароза Молочная кислота Цистеин

Лактоза Пропионовая кислота Аспарагин

Рафиноза Кетоглутаровая кислота Лизин

Рамноза Щавелевая кислота Пролин

Маннит Триптофан

Способность штаммов Pseudomonas к росту и наличие антагонизма в отношении фитопатогенных грибов изначально определяли методом совместного выращивания антагонистов и фитопатогенов в чашках Петри на среде Чапека с различными источниками углерода (таблица 1). Суспензию спор тест-гриба высевали на агаризованную среду, а исследуемую культуру вносили, делая посев уколом поверх газона гриба. Чашки инкубировали в термостате в течение трех суток, при температуре 28 °С. Антагонизм выявляли по наличию вокруг колонии бактерии зоны подавления роста тест-гриба.

Выделение метаболитов с антигрибной активностью Pseudomonas проводили по методике С.П.Четверикова (2003). Антигрибную активность метаболитов (в зависимости от экссудатов) оценивали методом разведений, в качестве тест-объекта использовали возбудитель корневой гнили зерновых культур Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (= Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke). Подавление роста гриба оценивали микроскопически относительно контроля, представляющего собой вышеописанную систему, но без внесения метаболита. В качестве единицы активности принимали такое количество метаболита, при котором гриб не развивался в течение 4 суток.

Морфологические изменения, происходящие с микромицетами под воздействием метаболитов псевдомонад, изучали с помощью светового микроскопа "Amplivai" 30 - G048a (Carl Zeiss Jena, Германия) при увеличении в 480 раз.

Комплексообразование исследовали спектрометрически в УФ - области по методу Бента - Френча [Бек М., Надьпал И., 1989], методом изомолярных серий [Булатов М.И., Калинкин И.П., 1976] и поляриметрически [Будников Г.К. и др., 2003].

Для исследования методом Бента-Френча готовили водные растворы, содержащие постоянное количество метаболита (0,001 моль/дм3) и возрастающее количество экссудата, соответствующее мольным соотношениям метаболит : экссудат = 1:1, 1:10, 1:20, 1:50. Спектры поглощения полученных

растворов записывали на спектрофотометре SPECORD М 40 (Carl Zeiss, Германия) при длине волны 265 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см. Измерения осуществляли через 15 минут после смешивания реагентов в условиях равновесной реакции. В канале сравнения находился раствор метаболита. После измерения оптической плотности растворов строили графики логарифмической зависимости оптической плотности от концентрации экссудата. Угловой коэффициент этой прямой tg а соответствовал стехиометрическому соотношению в комплексе метаболит : экссудат.

Для исследования вторым методом готовили изомолярную серию с соотношениями метаболит: экссудат от 1:9 до 9:1 (сохраняя неизменным общий объем) и начальными концентрациями веществ 5-104 моль/дм3. После измерения оптической плотности растворов строили графики зависимости оптической плотности от соотношения концентраций компонентов изомолярной серии:

A = f(CM/(C3 + CM)), где А - оптическая плотность раствора метаболит : экссудат; Сэ - концентрация экссудата в растворе метаболит : экссудат; См - концентрация метаболита в растворе метаболит : экссудат. При выявлении точки излома на полученном графике констатировали наличие межмолекулярного взаимодействия в системе, а по расположению точки излома на графике определяли стехиометрический состав образующегося комплекса метаболит: экссудат.

Методом поляриметрии по изменению угла вращения [а] в зависимости от мольного соотношения метаболит : экссудат с .у с,., на поляриметре Perkin Elmer 341 (США) подтверждали стехиометрию комплексообразования. Углы вращения снимались для водных растворов метаболитов (0,01 моль/дм3) и экссудатов (0,01 моль/дм3) в соотношениях, определенных УФ-спектрометрическими методами, вблизи образования комплекса. Отклонение угла вращения смеси этих растворов от монотонного изменения угла вращения находится в зависимости от мольного соотношения компонентов в смеси и указывает на образование комплекса метаболит : экссудат и его стехиометрию.

Образование межмолекулярных комплексов с катионами металлов и их стехиометрический состав определяли при помощи инверсионной вольтамперометрии на полярографе ABC-1.1 (НТФ «Вольта», Россия) методом изомолярных серий. Изомолярную серию готовили с соотношениями ион металла : метаболит от 1:9 до 9:1 и начальными концентрациями веществ 10" 3моль/дм3.

Вольтамперограммы снимались при температуре 25°С с водных растворов на фоне 0,1 моль/дм3 калия хлорида.

При выявлении точки излома на полученном графике установили наличие межмолекулярного взаимодействия в системе, а по расположению точки излома на графике определяли стехиометрический состав образующегося комплекса метаболит : катион.

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (ш) и уравнения статистической значимости (Р) по Стьюденту для нормального типа распределения признаков. Зависимость одной переменной от другой считалась статистически значимой при р <0,05. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерных программ Microsoft Office Excel, STATISTICA V 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Способность штаммов Pseudomonas к росту и их антигрцбная активность в средах с различными источниками углерода

Исследуемые штаммы бактерий рода Pseudomonas были способны к росту и секреции антигрибных метаболитов в средах с источниками углерода, представленными в таблице 1, что может положительно сказываться на их интеграции с растением и совместном функционировании в системе бактерии -растение - фитопатогены.

При совместном культивировании с микромицетом Bipolaris sorokiniana было выявлено, что изучаемые штаммы псевдомонад проявляют

фунгистатическое действие достаточно специфично, т.е. диаметры зон ингибирования роста фитопатогена сильно варьировали в зависимости от источника углерода (таблица 2).

В условиях непосредственного взаимодействия со штаммами псевдомонад формирование мицелия всех тест-грибов значительно замедлялось по сравнению с контролем (наблюдается задержка прорастания спор), а формирующийся мицелий патогенов отличался ярко выраженными морфологическими изменениями.

Таблица 2 - Размеры зон ингибирования роста фитопатогеиа штаммами

бактерий рода Pseudomonas в зависимости от источника углерода

Источник углерода Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм

Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17

М±гп

' 1 2 ■ 3 4

Арабиноза 21,20±1,16 23,60±1,02 23,20±0,98

Ксилоза.. 13,40±1,02 13,20±0,75 13,60±1,20

Фруктоза 19,20±1,16 14,00±0,89 16,80±1,33

Глюкоза 12,60±0,81 21,40±1,02 16,40±0,80

Галактоза П.80~ 1,16 13,20±1,67 11,20±1,33

Сахароза 13.20l().97 _ 14,40±0,80 10,80±0,98

Рафиноза . 14.60:0.49 11,20±0,75 . 12,20±0,75

Рамноза 13,40±1,01 13,80±1,17 10,80±0,75

Маннит . 13,80±0,74 . - 21,40±1,02 16,60±0,50

Щавелевая кислота .... 19,60±0,81 13,80±1,17 16,40±0,80

Пропионовая кислота 12,60±0,80 21,40±1,02 16,40±0,50

Молочная кислота ' 1 14,20±0,74 13,20±1,17 10,40±0,80

Яблочная кислота •. 14,60±0,48- 13,80±0,98 10,40±0,50

Пировиноградная кислота 13,80±0,74 10,6(Ь1,02 12,40±0,80

Фумаровая кислота 13,40±1,01 11,80±0,75 12,80±1,33

Янтарная кислота 20,00±1,41 ■ 15,20±1,33 16,40±1,20

Кетоглутаровая кислота ■ 13,40±1,02 21,80*1,47 16,60±1,02

Лимонная кислота -19,80±1;17- ~ - 14.81Ы.ЗЗ 16,20±1,17

Алании ■ 14,40±1,20 13,20±1,17: 11,20±1,33"'

Валин 14,80±0,98 13,60±1,02 10,40±0,75

продолжение таблицы 2

1 2 3 4

Пролин 15,20±0,75 10,20±1,16 14,20±0,98

Метионин 19,20±0,98 14,20±1,47 16,60±1,47

Триптофан 13,20±0,98 20,60±1,36 15,80±1,17

Тирозин 14,40±1,20 11,80±0,98 10,20±0,75

Аспарагин 12,20±1,17 12,40±0,49 13,80±0,98

Цистеин 19,40±1,02 14,20±0,98 16,40±1,41

Лизин 13,80±1,47 21,40±1,02 17,20±0,98

Аргинин 19,40±1,02 14,20±1,47 16,40±0,80

Так, под воздействием метаболитов штаммов-антагонистов происходило ограничение развития ростковых трубок с формированием на кончиках растущих гиф сферопластоподобных структур. Нарушения в развитии гиф приводили в свою очередь к формированию излишне разветвленного, часто

септированного мицелия, напоминающего нитку бусин (рисунок!).

Рисунок 1 - Прорастание конидий и формирование мицелия Bipolaris sorokiniana: а - контроль; под воздействием метаболитов: б, в - Pseudomonas; Увеличение в 400 раз (а, б); в 1600 раз (в).

В нашем эксперименте образование сферопластоподобных структур, связанное очевидно с нарушением формирования стенки гифы под воздействием метаболитов псевдомонад, стимулировало преждевременное ветвление. В числе других особенностей воздействия метаболитов псевдомонад на морфогенез грибов следует упомянуть, например, то, что некоторые микромицеты не формировали воздушный мицелий; отсутствовало спорообразование. При этом необходимо подчеркнуть, что степень воздействия на фитопатоген определялась радиальным градиентом концентрации метаболитов бактерий-антагонистов: вне зоны действия веществ формировался обычный мицелий гриба, а чем ближе к колонии бактерии, тем ярче были выражены аномалии в строении мицелия.

Антигрибная активность трнглнцеридпептндов псевдомонад в средах с различными источниками углерода

Изучение влияния природы экссудатов растений (органических кислот, аминокислот и углеводов) на антигрибную активность метаболитов штаммов псевдомонад показало, что она оставалась высокой вне зависимости от вносимого в среду экссудата из выбранного спектра. Наблюдаемые различия в уровне активности были подвержены межвидовой корреляции. Антигрибная активность метаболитов штамма Р. putida ИБ 17 была одинаковой для всех экссудатов, тогда как активность метаболитов штаммов вида Р. chlororaphis была выше в вариантах с экссудатами углеводной природы.

В условиях непосредственного взаимодействия с метаболитами штаммов псевдомонад по истечении четырех суток конидии фитопатогена, высеянные в среду, не проросли, тогда как в контрольных вариантах, уже через 6 часов, можно было видеть массовое прорастание спор, а через сутки наблюдали сплошной рост гриба. Причем характер воздействия метаболитов на патогены был аналогичен антагонизму, который мы наблюдали в условиях совместного культивирования бактерий и грибов.

Таким образом, установлено, что штаммы Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17 способны к росту и антагонистическому воздействию на фитопатогены, вызывая задержку

прорастания спор и вызывая нарушение морфогенеза мицелия за счет секреции антибиотических веществ в средах с различными источниками углерода.

Таблица 3 - Минимальная ингибируюгцая концентрация метаболитов _псевдомонад в зависимости от источника углерода (мг/мл)_

Штамм бактерий

Экссудат Р. chlororaphis Р. chlororaphis Р. putida

ИБ 51 j ИБ 6 ИБ 17

М±ш

Углевод 0Д±0,018 0,1 ±0,017 0,1 ±0,015

Органическая кислота 0,2±0,010 0,2±0,010 0,1 ±0,018

Аминокислота 0,1±0,015 0,2±0,011 0,1 ±0,017

Мы предположили, что такой характер проявления антигрибной активности может быть связан с межмолекулярным взаимодействием в системе метаболит : экссудат, в связи с чем далее была исследована способность комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas с экзометаболитами растений.

Комплексообразующая способность триглицеридпептидов Pseudomonas с экссудатами растений органической природы

Ранее в лаборатории биологических активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН были выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью -триглицеридпептиды, также показана их способность к образованию межмолекулярных комплексов с таким углеводом — представителем экссудатов растений, как мальтоза [Четвериков С.П., 2003].

На рисунке 2 представлены результаты изучения комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов экссудатов растений с использованием метода Бента-Френча. Из рисунка 2 виден линейный характер логарифмических зависимостей, который указывал на образование комплекса в системах метаболит : экссудат, а значения первых членов в аппроксимирующих уравнениях показывали в первом приближении стехиометрическое соотношение в комплексах метаболит : экссудат.

Данные изомолярных серий метаболитов псевдомонад с теми же представителями экссудатов (рисунок 3) подтвердили наличие комплексообразования в системах метаболит : экссудат и уточнили их стехиометрический состав. Например, из рис. За видно, что изомолярная серия метаболита штамма Р. сЫогогарЫя ИБ 51 с фумаровой кислотой имеет четкий излом, расположение которого, определенное по пересечению касательных, отвечает содержанию в комплексе 50 % (мольных) метаболита и 50 % (мольных) фумаровой кислоты. Следовательно, стехиометрический состав комплекса метаболита штамма ИБ 51 и фумаровой кислоты составлял 1:1.

Рисунок 2 - Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сЫогогарЫз ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в) методом Бента- Френча

Рисунок 3 - Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сЫогогарЫ.ч ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в)методом изомолярных серий

Таким образом, метод изомолярных серий позволил уточнить и подтвердить данные по комплексообразованию триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов экзометаболитов растений и установлению их стехиометрического состава. Для окончательного уточнения и подтверждения количественных показателей составов комплексов было проведено исследование комплексообразования при помощи метода поляриметрии, который наглядно демонстрировал характерные изломы на графиках зависимости угла вращения [а] от мольного соотношения в системе метаболит: экссудат (рйсуйок 4). • ' •

Рисунок 4 - Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сЫогогар}т ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в) методом поляриметрии

Результаты исследования стехиометрических соотношений в комплексах метаболит : экссудат, проведенные аналогично вышеописанному, для других корневых экссудатов растений представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Стехиометрические соотношения в комплексе метаболит : экссудат

Штамм бактерий

Экссудат Р. сЫогогарЫь Р. сЫотгарЫя Р. риИс!а

ИБ 51 ИБ 6 ИБ 17

1 2 3 4

Арабиноза 1:5 1:5 1:18

Ксилоза 1:5 1:5 1:10

Фруктоза 1:6 1:6 1:4

продолжение таблицы 4

1 2 3 4

Глюкоза 1:7 1:7 1:2

Галактоза 1:3 1:4 1:17

Сахароза 1:8 1:8 1:15

Рафиноза 1:13 1:10 1:9

Рамноза 1:3 1:3 1:5

Манн ит 1:15 1:14 1:2

Щавелевая кислота 1:2 1:2 1:2

Пропионовая кислота 1:16 1:9 1:21

Молочная кислота 1:17 1:13 1:12

Яблочная кислота 1:20 1:1С 1:5

Пировиноградная кислота 1:3 1:3 1:3

Фумаровая кислота 1:1 1:1 1:2

Янтарная кислота 1:17 1:11 1:20

Кетоглутаровая кислота 1:7 1:8 1:6

Лимонная кислота 1:14 1:5 1:11

Алании 1:10 1:15 1:17

Валин 1:13 1:6 1:16

Пролин 1:14 1:17 1:15

Метионин 1:6 1:3 1:5

Триптофан 1:2 1:2 1:2

Тирозин 1:1 1:1 1:1

Аспарагин 1:11 1:11 1:9

Цистеин 1:9 1:5 1:8

Лизин 1:6 1:4 1:4

Аргинин 1:20 1:9 1:8

Полученные соотношения не коррелировали с величиной антигрибной активности, с молекулярной массой или каким- либо другим физико-химическим свойством экссудата, что, вероятнее всего, можно связать с особенностью строения пептидных компонентов. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали о том, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с различными экссудатами растений: углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, лимитируя по субстрату фитопатогены. Оптимальный

стехиометрический состав комплексов метаболит : экссудат для проявления антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas, находился в интервале от 1:1 до 1:20.

Комплексообразующая способность триглицеридпептидов Pseudomonas с ионами металлов

Триглицеридпептиды, как было показано ранее, способны к комплексообразованию с ионами Zn+2 [Ильина И.Г., 2004]. В данной работе изучена возможность их комплексообразования с ионами других металлов: меди, кадмия, свинца и определена стехиометрия образующихся комплексов.

В результате исследований изомолярных серий комплексов метаболитов псевдомонад с катионами металлов были получены вольтамперограммы, т.е. графики зависимости величины тока в пике от соотношения метаболит : катион в изомолярной серии (рисунок 5). Графически изомолярн ые серии триглицеридпетидов штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17 с ионом кадмия представлены на рисунке 5а, из которого четко видно, что изомолярные серии имеют четкие изломы, расположение которых отвечает соотношению в комплексе метаболит : катион 50 % (мольных) метаболита и 50 % (мольных) ионов кадмия, причем эти соотношения были одинаковы для метаболитов всех трех исследуемых штаммов. Следовательно, стехиометрической состав комплексов с катионом кадмия определялся соотношением 1:1. Данные изомолярных серий метаболитов псевдомонад с ионами меди, цинка и свинца представлены на рис. 5б-г, стехиометрические составы комплексов с ними представлены в таблице 5.

Рисунок 5 - Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад (штаммы ИБ 51 (1) ИБ 6 (2), ИБ 17 (3)) с ионами металлов: а - кадмий; б - медь; в - свинец; г - цинк методом инверсионной вольтамперометрии

Таблица 5 - Стехиометрические соотношения в комплексе метаболит : ион

металла

Ион металла Штамм бактерий

Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17

Цинк- 1:1 1:1 1:1

Кадмий 1:1 1:1 1:1

Медь 1:9 1:9 1:9

Свинец 1:4 1:4 1:4

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установлено, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с неорганическими ионами кадмия, меди, свинца и цинка. Оптимальные стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находились в интервале 1:1-1:9.

Таким образом, нами были проведены исследования способности комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas с различными органическими кислотами, аминокислотами и углеводами. Было установлено, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas обладают выраженной способностью к образованию комплексов с органическими кислотами, аминокислотами и углеводами. Нами были установлены оптимальные для проявления фунгистатического действия метаболитов стехиометрические соотношения комплексов метаболит : экссудат и метаболит : катион. Полученные результаты необходимы для разработки новых эффективных средств защиты растений от фитопатогенов.

ВЫВОДЫ

1 Бактерии рода Pseudomonas (Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17) способны к утилизации основных источников углерода (органических кислот, аминокислот и углеводов) в ризосфере и секреции антигрибных метаболитов, что позволяет им интегрироваться с растением в совместном функционировании в системе бактерии - растения — фитопатогены.

2 Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с компонентами экзометаболитов растений -органическими кислотами, аминокислотами и углеводами, лимитируя по субстрату фитопатогены.

3 Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца, что снижает содержание солей металлов в ризосфере растений.

4 Оптимальные стехиометрические составы комплекса метаболит : экссудат для проявления антигрибной активности триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций корневых экссудатных экзометаболитов растений находятся в интервале 1:1 - 1:20. Оптимальные для снижения

содержания солей металлов стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находятся в интервале 1:1 - 1:9.

5 Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпеп-тидами изученных штаммов бактерий рода Pseudomonas ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления антигрибной активности метаболитов, что является основой для разработки эффективных средств защиты растений.

Практические рекомендации

При производстве биопрепаратов на основе штаммов бактерий Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов, рекомендуется использование субстратов аминокислотной и углеводной природы.

Метаболиты бактерий рода Pseudomonas рекомендуется использовать при применение препаратов для инактивации тяжелых металлов из ризосферы растений.

Методы современной аналитической химии рекомендуются для оценки характера антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas для изучения комплексообразования в биологических системах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование метаболитов бактерий рода Pseudomonas с простыми углеводами // Сборник тезисов IV Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (15-25 декабря 2005 г., Уфа). - Уфа: Реактив, 2006.-С. 131-132.

2 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas с эксудатами растений // Материалы XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (2-4.10.2006 г., Уфа). Уфа: Реактив, 2006. - Т. 1. - С. 109-110.

3 Бойко Т.Ф., Сулейманова Л.Р., Силищев H.H., Логинов О.Н. Биоудобрение «Азолен» при выращивании лука // Материалы XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (2-4.10.2006 г., Уфа). - Уфа: Реактив, 2006. - Т. 1. - С. 35-36.

4 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas с корневыми эксудатами растений // Башкирский химический журнал. - 2007. -Т. 14, №3.-С. 47-51.

5 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas экологичный механизм взаимодействия с растениями // Вестник Оренбургского государственного университета. -2007. - Вып. № 75. - С. 338-340.

6 Сулейманова Л.Р., Асабина Е.А., Дубинина О.Н., Логинов О.Н., Четвериков С.П., Черняева Н.Ю., Хузнарнзанова Р.Ф., Силищев H.H. Микроорганизм Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и биопрепарат «Елена» // Токсикологический вестник. - 2008. - № 3. - С. 39-41.

7 Сулейманова JI.P., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Влияние бактериальных метаболитов на грибные фитопатогены растений // Современная микология в России.Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. - 2008. - С. 331-332.

8 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Изучение механизма влияния БАВ псевдомонад на фитопатогены // Международная научно-техническая конференция «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» - КНР, Харбин - Санья. Т. 1.-С. 68-69.

9 Логинов О.Н., Силищев H.H., Сулейманова Л.Р. Биопрепараты для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и повышения их урожайности // Материалы 5-го Всероссийского научно-практического совещания-семинара «АНАПА-2008» «Современные технологии и перспективы использования средств защиты растений, регуляторов роста, агрохимикатов в агроландшафтном земледелии». - Анапа, 2008. - С. 54-55.

10 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование метаболитов бактерий рода Pseudomonas с ионами металлов И Материалы XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии». - Уфа: Реактив, 2008. - Т. 1. - С. 90-91.

11 Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразующая способность метаболитов псевдомонад с ионами металлов // Аграрная Россия. — 2009. - Специальный выпуск. - С. 130— 131.

12 Четвериков С.П., Сулейманова Л.Р., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов псевдомонад с корневыми экссудатами растений как механизм воздействия на фитопатогены // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - Т. 45. - № 5. - С. 1-6.

Отпечатано с готового орнгинал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г.Уфа, ул.Комсомольская, 2 Заказ №67, т. 100,2009, Формат 60x90 1/16. Уч. п.л. 1,75, усл. печ. л. 1,6 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сулейманова, Лина Ринатовна

ВВЕДЕНИЕ.

Обзор литературы.

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА

PSEUDOMONAS.

1.1. Ризобактерии рода Pseudomonas. Функционирование в системе растения — фитопатогены.

1.2. Механизмы комплексообразования метаболитов бактерий с органическими соединениями и ионами металлов.

Собственные исследования.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Определение динамики роста бактерий в средах с различными источниками углерода.

2.3. Выявление антигрибной активности бактерий Pseudomonas.

2.4. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.5. Определение антигрибной активности метаболитов псевдомонад на различных источниках углерода.

2.6. Исследование комплексообразования метаболитов Pseudomonas с экссудатами растений.

2.7. Исследование комплексообразования метаболитов Pseudomonas с ионами металлов.

2.8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ КОРНЕВЫХ ЭКССУДАТОВ РАСТЕНИЙ НА АНТИГРИБНУЮ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS И ИХ МЕТАБОЛИТОВ.

3.1. Оценка способности штаммов Pseudomonas к росту в средах с различными источниками углерода.

3.2. Исследование антигрибной активности штаммов Pseudomonas при культивировании в средах с различными источниками углерода.

3.3. Характеристика антигрибной активности триглицеридпептидов псевдомонад в средах с различными источниками углерода.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОМПЛЕКСООБРА-ЗОВАНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДПЕПТИДОВ PSEUDOMONAS С ЭКССУДАТАМИ РАСТЕНИЙ.

4.1. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов

Pseudomonas спектрофотометрическими методами.

4.1.1. Определение комплексных соединений методом Бента-Френча.

4.1.2.Определение комплексных соединений методом изомолярных серий.

4.2. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов

Pseudomonas поляриметрическим методом.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ТРИГЛИЦЕРИДПЕПТИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА

PSEUDOMONAS С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas"

Актуальность проблемы

Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами симбиотического взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации.

В свою очередь, ризосферные бактерии обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений [Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990; Воронин A.M., 1998; Логинов О.Н. и др., 2005; Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J., 2001; Whipps J.M., 2001]. Наиболее распространенными ризосферными бактериями являются представители рода Pseudomonas.

Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогеные микроорганизмы,. заселяющие ризосферу растений, является продукция бактериями различных низкомолекулярных веществ, таких как сидерофоры и антибиотики [Логинов О.Н. и др., 2005; Kim K.K. et al., 2000; Nielsen Т.Н. et al., 2000; Paulitz T. et al., 2000; Fakhouri W. et al., 2001; Sorensen D. et al., 2001; Quail J.W. et al., 2002; Lee J. et al., 2003]. Эти антигрибные метаболиты имеют различную химическую структуру и некоторые из них обладают способностью к комплексообразованию с экзометаболитами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста при улучшении роста растений. Однако эта способность для метаболитов бактерий рода Pseudomonas практически не изучена. В тоже время, установление механизмов действия метаболитов бактерий рода Pseudomonas на фитопатогены необходимо для разработки эффективных способов защиты растений.

Цель исследования V

Оценка комплексообразующей способности метаболитов, продуцируемых бактериями рода Pseudomonas и определение их биологической роли в проявлении фунгицидной активности по отношению к фитопатогенным грибам.

Задачи исследования

1 Установление способности к росту и развитию исследуемых штаммов Pseudomonas putida ИБ 17, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6, Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в средах с компонентами экзометаболитов растений в качестве источника углерода.

2 Изучение комплексообразования триглицеридпептидов исследуемых штаммов Pseudomonas с различными углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, входящими в комплекс экссудатных выделений корней растений.

3 Изучение способности к комплексообразованию метаболитов псевдомонад с катионами металлов: меди, цинка, кадмия, свинца.

4 Установление оптимального стехиометрического состава комплексов метаболит : экссудат, метаболит : катион для проявления фунгицидной активности метаболитов Pseudomonas.

5 Оценка комплексообразующей способности триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas как одного из механизмов их ингибирующего воздействия на фитопатогены.

Научная новизна исследования

Впервые охарактеризована способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать межмолекулярные комплексы с экссудатами растений: углеводами, органическими кислотами, аминокислотами, тем самым лимитируя по субстрату фитопатогены. Установлено, что процесс комплексообразования триглицеридпептидов и растительных экссудатов является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.

Впервые показано, что метаболиты псевдомонад способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами металлов: меди, цинка, кадмия и свинца, что снижает содержание солей металлов в ризосфере растений.

Практическая значимость

Установленная способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать комплекс с экссудатами растений позволяет рекомендовать их применение в качестве средств защиты растений.

Установленная способность исследованных штаммов бактерий Pseudomonas к секреции антигрибных метаболитов в средах с различными субстратами является основой для использования их в производстве биопрепаратов, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Установленная комплексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Бактерии Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 способны к росту и секреции антигрибных метаболитов в средах с источниками углерода, которые могут составлять комплекс экссудатных выделений корней растений, что позволяет им интегрироваться с растением в совместном функционировании системы бактерии - растение -фитопатогены.

2 Триглицеридпептиды псевдомонад способны образовывать межмолекулярные комплексы с компонентами таких фракций экзометаболитов растений, как углеводы, органические кислоты и аминокислоты.

3 Метаболиты бактерий способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца, не обладая сидерофорной активностью по отношению к ионам железа.

4 Оптимальные стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат и метаболит : катион для триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций корневых экссудатных экзометаболитов растений и ионами металлов, находятся в интервале 1:1 — 1:20 и 1:1 - 1:9, соответственно.

5 Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпеп-тидами штаммов Pseudomonas с экзометаболитами растений ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления их антигрибной активности.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на XIX и XX Международных научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006, 2008), IV Всероссийской научной internet-конференции (Уфа, 2006), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008), 5-м Всероссийском научно-практическом совещании-семинаре, (Анапа, 2008), Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (КНР, Харбин - Санья, 2008).

Публикации

По материалам работы опубликовано 12 научных работ, в том числе четыре статьи в рецензируемых ВАК РФ журналах.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 99 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Работа содержит 7 таблиц, 11

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сулейманова, Лина Ринатовна

Выводы

1 Бактерии рода Pseudomonas {Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17) способны к утилизации основных источников углерода (органических кислот, аминокислот и углеводов) в ризосфере и секреции аптигрибных метаболитов, что позволяет им интегрироваться с растением в совместном функционировании в системе бактерии - растения - фитопатогены.

2 Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с компонентами экзометаболитов растений - органическими кислотами, аминокислотами и углеводами, лимитируя по субстрату фитопатогены.

3 Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца, что снижает содержание солей металлов в ризосфере растений.

4 Оптимальные стехиометрические составы комплекса метаболит : экссудат для проявления антигрибной активности триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций корневых экссудатных экзометаболитов растений находятся в интервале 1:1 - 1:20. Оптимальные для снижения содержания солей металлов стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находятся в интервале 1:1 - 1:9.

5 Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпеп-тидами изученных штаммов бактерий рода Pseudomonas ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления антигрибной активности метаболитов, что является основой для разработки эффективных средств защиты растений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При производстве биопрепаратов на основе штаммов бактерий Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов, рекомендуется использование субстратов аминокислотной и углеводной природы.

Метаболиты бактерий рода Pseudomonas рекомендуется использовать при применение препаратов для инактивации тяжелых металлов из ризосферы растений.

Методы современной аналитической химии рекомендуются для оценки характера антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas для изучения комплексообразования в биологических системах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сулейманова, Лина Ринатовна, Уфа

1. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. М. : Мир, 1989. - 413 с.

2. Белякова Л.А., Ляшенко Д.Ю. Комплексообразование бензолкарбо-новых кислот с ß-циклодекстрином // Журнал прикладной спектроскопии. -2008. Т. 75. - № 3. - С. 299-303.

3. Блажевич О.В., Максимова Н.П. Биосинтез флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм у ризосферных бактерий Pseudomonas putida М // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. - № 2. - С. 205-209.

4. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал. 1998,-№ 10.-С. 25-31.

5. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. Основы современного электрохимического анализа. — М.: Мир: Бином ЛЗ. 2003. -592 с.

6. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотоколориметриметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. Изд. 4-е. Л. : Химия. 1976. - 376 с.

7. Вебер Э., Фегтле Ф., Хингельфельд Р., Зэнгер В., Крам д. Дж. и др. Химия комплексов «гость хозяин». Синтез, структуры и применения. - М.: Мир. - 1988.-512С.

8. Коршунова Т.Ю., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф. Биофунгицид Елена для протравливания семян ячменя ярового и его влияние на урожайность и устойчивость к болезням // Башкирский химический журнал.- 2007. Т. 14. - № 4. - С. 92-94.

9. Кравченко JI.B., Азарова Т.С., Леонова-Ерко Е.И. и др. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 1. - С. 48-53.

10. Кузьмина Л.Ю., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф., Свешникова Е.В., Мелентьев А.И. Эффективность бактериальных препаратов при защите растений яровой пшеницы от твердой головни // Сельскохозяйственная биология. 2003. - № 5. - С. 69-73.

11. Ленгелер И., Дрейвс Г., Шлегель Г. // Современная микробиология Прокариоты в 2-х томах. Т. 1.: Мир: 2005. — 656 с.

12. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии. М. : Наука. — 2005. - С. 94-97.

13. Логинов О.Н., Четвериков С.П., Гусаков В.Н. Триглицеридпептиды- новая группа антигрибных метаболитов псевдомонад (Pseudomonas) // Доклады Академии Наук. 2003. - Т. 393. - № 5. - С. 715-717.

14. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия». - 2005. - 608 с.

15. Попова Ж.П., Эськин С.Б., Матисова А.Н. О составе антифунгина -сырца//Бюл. ВНИИ с.-х. микробиологии. 1971. - Т. 15. -№ 1. - С. 79-80.

16. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Валидов Ш.З. и др. Продукция фенозиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas aureofaciens, содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 6. - С. 778-785.

17. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наук, думка, 1990. 264 с.

18. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. и др. Антибиотическая активность и сидерофоры Pseudomonas cepacia // Прикл. биохимия и микробиол. — 1990. -Т. 26. -№ 1.-С. 75-80.

19. Теппер Е.З., Шильшикова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос. - 1972. - 200 с.

20. Худяков Я. П., Шкляр М.С., Савадеров Е.П. Антибиотик антифунгин, образуемый бактериями рода Pseudomonas // Прикл. биохимия и микробиология.- 1965.-Т. 1.-№2.-С. 186-190.

21. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Триглицеридпептиды псевдомонад новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - Т. 41. - № 1. - С. 90-93.

22. Ahmadzadeh M, Afsharmanesh H., Javan-Nikkhah M., Sharifi-Tehrani A. Identification of some molecular traits in fluorescent pseudomonads with antifungal activity // Iranian Journal of Biotechnology. 2006. - V. 4. - P. 245253.

23. Arima K., Imanaka H., Konsara M. et al. Pyrrolnitrin, a new antibiotic substans, produced by Pseudomonas // Agr. and Biol. Chem. 1964. - V. 28, - № 8.-P. 575-582.

24. Balta D.K., Arsu N. Host/guest complex of P-cyclodextrin/5-thia pentacene-14-one for photoinitiated polymerization of acrylamide in water // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2008. - V. 200. - P. 377-380.

25. Batchelor E., Klinowski Ja., Jones W .Crystal engineering using co.-crystallisation of phenazine with dicarboxylic acids // Journal of Materials Chemistry. 2004. - V. 10. - № 4. - P. 839-848.

26. Baysse C., De Vos D., Naudet Y., Vandermonde A., Ochsner U., Meyer J.M. et al. Vanadium interferes with siderophore-mediated iron uptake in Pseudomonas aeruginosa II Microbiology. — 2000. V. 146. — P. 2425—2434.

27. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria // Curr. Opin. Plant. Biol. 2001. - V. 4.-P. 343-350.

28. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. 2003. — V. 157.-P. 503-523.

29. Choudhury S.D., Basu S. Caging of phenazine by 4,4-bis(dimethylamino)diphenylmethane: A comparative study with phenazine-N,N-dimethylaniline // Chemical Physics Letters. 2004. - V. 383. - P. 533-536.

30. Compant S., Duffy B., Nowalc J., Clement C., Barkal E.A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl Environ Microbiol. — 2005. — V. 71. P. 4951^4959.

31. Cornelis P., Matthiis S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines // Environ. Microbiol. 2002. - V. 12. - P. 787-798.

32. Dakora F.D. & Phillips D.A. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments // Plant and Soil. 2002. - V. 245. - P. 35^47.

33. Danhom T., Fuqua C. Biofilm formation by plantassociated bacteria // Annu Rev. Microbiol. 2007.-V.61.-P.401 -422.

34. Dao K.H.T., Hamer K.E., Clark C.L., Harshman L.G. Pyoverdine production by Pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress // Ecol. Appl. 2001. - V. 9. - P. 441-448.

35. Dharumaduari D., Thajuddin N., Panneerselvam A. An antifungal compound: 4 'phenyl- 1-napthyl-phenyl acetamide from Streptomyces sp. DPTB16 //Medicine and Biology. 2008. - Vol.15, № l.-P. 7-12.

36. Dreja M., Kim In.T., Yin Ya., Xia Y. Multilayered supermolecular structures self-assembled from polyelectrolytes and cyclodextrin host-guest complexes // Journal of Materials Chemistry. 2000. - V. 10, № 3. - P. 603-605.

37. Fakhouri W., Walker F., Vogler B., Armbruster W., Buchenauer H. Isolation and identification of N-mercapto-4-formylcarbostyril, an antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens // Phytochemistry. 2001. V. 58. - P. 1297-1303.

38. Fermeglia M., Ferrone M., Lodi A., Priel S. Host-guest inclusion complexes between anticancer drugs and ß-cyclodextrin: Computational studies // Carbohydrate Polymers. 2003. - V. 53, № 1. - P. 15—44.

39. Gao FI., Wang Y.N., Fan Y.G., Ma J.B. Interactions of some modified mono- and bis-ß-cyclodextrins with bovine serum albumin // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2006. - V. 14, №. l.-P. 131-137.

40. Gaur R., Shani N., Kawaljeet Johri B.N., Rossi P., Aragno, M. Diacetyl phloroglucinol-producing Pseudomonas do not influence AM fungi in wheat rhizosphere // Curr. Sei. 2004. - V. 86. - P. 453-457.'

41. Ghysels B., Dieu B. T., Beatson S. A., Pirnay J. P., Ochsner U. A., Vasil M. L., Comelis P. FpvB, an alternative type I ferripyoverdine receptor of Pseudomonas aeruginosa//Microbiology. -2004. -V. 150. P. 1671-1680.

42. Grgurina I., Mariotti F., Fogliano V., Gallo M., Scaloni A., Iacobellis N.S., Cantore P.L. et al. A new syringopeptin produced by bean strains of Pseudomonas syringae pv. Syringae // Biochim. Biophys. Acta. — 2002. V. 1597. -P. 81-89.

43. Haas D., Keel C. Regulation of antibiotic production in root-colonizing Pseudomonas spp. and relevance for biological control of plant disease. // Annu Rev Phytopathol. -2003. V. 41. - P. 117-153.

44. Haas D., De'fago G. Biological control of soilbome pathogens by fluorescent Pseudomonads // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - V. 4. - P. 307-319.

45. Henriksen A., Anthoni U., Nielsen T. H., Sorensen J., Christophersen C., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide tensin from Pseudomonas fluorescens strain 96.578.//Acta Crystal.-2000.-V. 56.-P. 113-115.

46. Hosseiny Davarani S.S., Fakhari A.R., Shaabani A., Ahmar H., Maleki A., Sheijooni Fumani N. A facile electrochemical method for the synthesis of phenazine derivatives via an ECECC pathway // Tetrahedron Letters. 2008. - V. 49, №39.-P. 5622-5624

47. Housley L., Anderson T., Sontag N., Song-Hee Han, David W. Britt, Anderson A.J. Pluronics' influence on pseudomonad biofilm and phenazine production // Federation of European Microbiological Societies. 2009. - V. 293. -P. 148-153.

48. Howel C.R., Stipanovic R.D. Suppression of Pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin // Phytopathology. 1980. - V. 70, № 8. - P. 712-715.

49. Jeschke P., Harder A., Etzel W., Schindler M., Thielking G. Synthesis and anthelmintic activity of cyclohexadepsipeptides with cyclohexylmethyl side chains // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2007. - V. 17, № 13. - P. 3690-3695.

50. Jones G., Zhou X., Lu L.N. Inclusion by (3-cyclodextrin of a pyrene-labeled dipeptide photoprobe // Tetrahedron Letters. 2002. - V. 43, № 34. - P. 6079-6082.

51. Kim K.K., Kang J.G., Moon S.S., Kang K.Y. Isolation and identification of antifungal N -butylbenzenesulphonamide produced by Pseudomonas sp AB2 // J. Antibiotics. 2000. - V. 53.-P. 131-136.

52. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. 1954. - V. 44. -P. 301-307.

53. Knight M., Hartman Ph., Hartman Z., Young V. A new method of preparation of piocyanin and demonstration of an unusual bacterial sensivity // An. Biochem. 1979. - V. 95, № 1. - P. 19-23.

54. Kuiper I., Lagendijk E.L., Pickford R. et al. Characterization of two Pseudomonas putida lipopeptide biosurfactants, putisolvin I and II, which inhibit biofilm formation and break down existing biofilms. // Mol. Microbiol. 2004. V. 51.-P. 97-113.

55. Lee C., Kim S., Hyun B., Suh J, Yon C., Kim C., Lim Y., Kim C. Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic produced by Pseudomonas cepacia // J. Antibiot. 1994. - V. 47. - P. 1402-1418.

56. Lee J., Moon S., Hwang B. Isolation and antifungal and antioomycete activities of aerugine produced by Pseudomonas fluorescens strain MM-B16 // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, № 4. - P. 2023-2031.

57. Leoni L., Ambrosi C., Petrucca A., Visca P Transcriptional regulation of pseudobactin synthesis in the plant growth-promoting Pseudomonas BIO// FEMS Microbiology Letters. 2002. - V. 208, № 2. - P. 219-225.

58. Ligon J.M., Hill D.S., Hammer P.E., Torkewitz N.R., Hofmann D., Kempf H.J., van Pee K.H. .Natural products with antifungal activity from Pseudomonas biocontrol bacteria // Pest Management Science. 2000. - V. 56. -P. 688-695.

59. Lively D., Gorman M., Mabe M. Metabolism of tryptophans by Pseudomonas aureofaciens. I. Biosinthesis of pyrrolnitrin // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Philadelphia. - 1966. - P.462-469.

60. Manzini B., Hodge P. Polymer-supported syntheses of oxo-crown ethers and derivatives containing a-amino-acid residues // Reactive and Functional Polymers. 2008. - V. 68, № 9. - P. 1297-1306.

61. Masuoka Y., Nagai A., Shin-ya K., Furihata K., Nagai K., Suzuki K.I., Hayakawa Y., Seto H. Spiruchostatins A and B, novel gene expression-enhancing substances produced by Pseudomonas sp. // Tetrahedron Letters. 2001. - V. 42. — N l.-P. 41-44.

62. Matthijs S., Tehrani K.A., Laus G., Jackson R.W., Cooper R.M., Cornelis P. Thioquinolobactin, a Pseudomonas siderophore with antifungal and anti-Pythium activity // Environmental Microbiology. 2007. - V. 9, № 2. - P. 425-434.

63. Meyer J.-M., Hohnadel D., Halle F. Cepabactin from Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, № 6. -P. 1479-1487.

64. Mislin G.L.A., Hoegy F., Cobessi D., Poole K., Rognan D., Schalk I.J. Binding properties of pyochelin and structurally related molecules to FptA of pseudomonas aeruginosa // Journal of Molecular Biology. 2006. - V. 357, № 5. -P. 1437-1448.

65. Mossialos D., Meyer J.M., Budzikiewicz H. et al. Quinolobactin, a new siderophore of Pseudomonas fluorescens ATCC 17400 whose production is repressed by the cognate pyoverdine // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 487-492.

66. Nazarov V.B., Avakyan V.G., Vershinnikova T.G., Alfimov M.V. Excimer fluorescence and structures of the inclusion complexes of P-cyclodextrin with naphthalene and its derivatives // Russian Chemical Bulletin. 2008. - V. 49, № 10.-P. 1699-1706.

67. Neupert-Laves IC., Dobler M. Helv. Chim. Acta. 1975. - V. 58. - P. 432-437.

68. Nybroe O., Sorensen J. Production of cyclic lipopeptides by fluorescent pseudomonads // Biosynthesis of Macromolecules and Molecular Metabolism. J.-L. Ramos, ed., Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, U.S.A. 2004. -P. 147-172.

69. Parker W.L., Rathnum M.L., Seiner V. et al. Cepacin A and cepacin B, two new antibiotics produced by Pseudomonas cepacia // J Antibiot. 1984. - V. 37.-P. 431-440.

70. Paulitz T., Nowak-Thompson B., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens // J. Chem. Ecol. 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.

71. Paulsen I. T., Press C. M., Ravel J., Kobayashi D. Y., Myers.G. S. A. et al. Corrigendum: Biocontrol genome deciphered, // Nat. Bioltechnol. 2006. -Published online.

72. Paulsen I.T. et al. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5 // Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 873-878.

73. Paulsen I.T., Press C.M., Ravel J., Kobayashi D.Y., Myers G.S.A. et al. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5.//Nat. Biotechnol.-2005.-V. 23.-P. 873-878.

74. Pfeifer P. Organische Molekularferbindungen. Stutgart: Ferdinand Euge, 1927.-288 p.

75. Pinkerton M., Steinrauf L.K., Dawkins P. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1969. V. - 35. - 512 p.

76. Quail J.W., Ismail N., Pedras M.S.C., Boyetchko S.M. Pseudophomins A and B, a class of cyclic lipodepsipeptides isolated from a Pseudomonas species II Acta Crystallographica. Section C: Crystal Structure Communications. 2002. -V. 58.-P. 268-271.

77. Raaijmakers J. M., Vlami M., de Souza J. T. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. // Antonie Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. -2002.-V. 81.-P. 537-547.

78. Rossbach S., Wilson T.L., ICukuk M.L., Carty H.A. Elevated zinc induces siderophore biosynthesis genes and a zntA-like gene in Pseudomonas fluorescens IIFEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 191. - P. 61-70.

79. Rudrappa T., Biedrzycki M.L., Bais H.P. Causes and consequences of plant-associated biofilms // FEMS Microbiol. Ecol. 2008. - V. 64. - P. 153-166.

80. Sakai T, Asai N, Okuda A, Kawamura N, Mizui, Y. Pladienolides, new substances from culture of Streptomyces platensis Mer- 11107.11. Physico-chemical properties and structure elucidation // J. Antibiot. 2004. - V. 57, № 3. -P. 180-187.

81. Sbrana C., Bagnoli G., Bedini S., Filippi C., Giovannetti M., Nuti M. P. Adhesion to hyphal matrix and antifungal activity of Pseudomonas strains isolatedfrom Tuber borchii ascocarps // Can. J. Microbiol. 2000. - V. 46, № 3. - P. 259268.

82. Schellenberg B., Bigler L., Dudler R. Identification of genes involved in the biosynthesis of the cytotoxic compound glidobactin from a soil bacterium // Environ. Microbiol. -2007. -V. 9. P. 1640-1650.

83. Semenova I., Burakov A., Berardone N., Zaliapin I., Slepchenko B., Svitkina T., Kashina A., Rodionov V. Actin Dynamics Is Essential for Myosin-Based Transport of Membrane Organelles // Current Biology. 2008. - V. 18, № 20.-P. 1581-1586.

84. Smith G.D., Duax W.L. Crystallographic studies of valinomycin and A23187. In: Metal-ligand // Interactions in Organic Chemistry and Biochemistry. -1977.-Parti.-P.291-315.

85. Sorensen D., Nielsen T.H., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 // Acta Crystallographica. 2001. - Section C: Crystal Structure Communications C 57. -P. 1123-1124.

86. Srivastava R., Srivastava S., Bridge V. Antifungal activity of Pseudomonas fluorescens against different plant pathogenic fungi // Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry. 2008. - V. 7, № 4. - P. 2789-2796.

87. Stolworthy J.C., Paszczynsk A., Korus R., Crawford R.L. Metal binding by pyridine-2,6-bis (monothiocarboxylicacid), a biochelator produced by Pseudomonas stutzeri and Pseudomonas putida II Biodegradation. — 2001. — V. 12. -P. 411-418.

88. Szejtli J. Past, present, and future of cyclodextrin research // Pure Appl. Chem. -2004. V. 76, № 10.-P. 1825-1845.

89. Takemoto J. Y., Brand J. G., Kaulin Y. A., Malev V. V., Schagina L. V., Blasko K. The syringomycins: lipodepsipeptide pore formers from plant bacterium, Pseudomonas syringae II Taylor and Francis. London. England. 2003. -P. 260-271.

90. Tambong Ja.T., Hofte M. Phenazines are Involved in Biocontrol of Pythium myriotylum on Cocoyam by Pseudomonas aeruginosa PNA1 // European Journal of Plant Pathology. 2001. - V. 107, № 5. - P. 511-521.

91. Tjeerd van Rij E., Genevie' ve Girard, Lugtenberg B. J.J., Bloemberg G.V. Influence of fusaric acid on phenazine-l-carboxamide synthesis and gene expression of Pseudomonas chlororaphis strain PCL1391 // Microbiology. 2005. -V. 151.-P. 2805-2814.

92. Uhlig S., Ivanova L. Determination of beauvericin and four other enniatins in grain by liquid chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 2004. - V. 1050, № 2. - P. 173-178.

93. Upadhyay A., Srivastava S. Characterization of a new isolate of Pseudomonas fluorescens strain Psd as a potential biocontrol agent // The Societyfor Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology. 2008. - V. 47. - P. 98-105.

94. Wang J.H., Cai Z. Investigation of inclusion complex of miconazole nitrate with ß-cyclodextrin // Carbohydrate Polymers. 2008. - V. 72, № 2. - P. 255-260.

95. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. - P. 487-511.

96. Willis D. K., Kinscherf T. G. Global regulation in Pseudomonas syringae. II Virulence and Gene Regulation. J.-L. Ramos, ed. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, U.S.A. 2004. -V. 2. - P. 223-238.

97. Yan A., Huang X., Liu H., Dong D., Zhang D., Zhang X., Xu Y. An rhl-like quorum-sensing system negatively regulates pyoluteorin production in Pseudomonas sp. Ml8 // Microbiology. 2007. - V. 153. - P. 16-28.

98. Yokokawa F., Inaizumi A., Shioiri T. Synthetic studies of the cyclic depsipeptides bearing the 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp) unit. Total synthesis of the proposed structure of micropeptin T-20 // Tetrahedron. 2005. -V. 61, №6.-P. 1459-1480.

99. Zehnder G., J.F. Murphy, E.J. Sikora and Kloepper. Application of rhizobacteria for induced resistance // European Journal of Plant Pathology. -2001.-V. 107.-P. 39-50.1<УЪ