Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые механизмы регуляции калиевой проницаемости эритроцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Некоторые механизмы регуляции калиевой проницаемости эритроцитов"

РГ 6 од

1 9 ДПР 1Ш?ститут ж7рши ш.а.л.микшяна мз ра

На правах рукопиои

ГЕОХЧАШ ГАЯНЕ I.1KPTU4EBHA

НЕКОТОРЫЕ ¡ШАШОДЫ РЕШЯЦИИ КАЛИЕВОЙ ПРШИЦАШОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1992

Работа выполнена в лаборатории энергообмена и биологичес активных веществ Института хирургии им. А.Л.Микаеляна МЗ РА.

Научный руководитель: кандидат физикоматематических

наук, ГШЬХАВДАШН A.B.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник ТРЧУНЯН A.A.,

доктор биологических н~ук, старший научный сотрудник ВАДЖИННН С.А.

Ведущее учреждение - Институт Кардиологил .МЗ РА.

Занята диссертации состоимся "/'У " _

н ¿¿^часов на заседании специализированного 'совета К.0э5.01.( по присуждению ученой степени кандидата биологических наук npi Ереванском государственном университете /375049, Ереван,ул.Ал< ка Ианукяна,1,Ереванский государственный университет,биологиче кий факультет,кафедра биохимии/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке универсиз

Автореферат разослан "• //" Qbg.iisCL.iJL 1993г.

Ученый секретарь . специализированного совета, кандидат биологических наук старший научный сотрудник

Л.Г. Ананян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». Основными катионами в цитоплазме клеток являются ионы Са++, 1С1", Na+, Н+. Потоки этих ионов через мембрану в значительной степени определяют концентрацию ионов в цитоплазме и, таким образом, влияют на активность ряда ключевых ферментов в клетке. Известно, что многие патологии сопровождаются нарушением ионного гомеостаза клетки.

Хорошей ¡.-.одельной системой для изучения ионного транспорта являются эритроциты. На мембране эритроцитов присутствует ряд систем сопряженного ионного транспорта и ионные каната. Б по-

Гследнее время интенсивно изучается Са^-зависимый К^-канал".......:

; эритроцитов, впзрЕыэ обнаруженный на^еэнергизован'ных клетках I Гардошем ( Gjrdos G., 1958). Механизм функционирования этого""" канала до сих пор не выяснен. Таким образом, исследование Са44"-зависимого К^-канала на мембране эритроцитов позволит приблизиться к пониманию молекулярных механизмов транспорта ионов через мембрану, a таете получить информацию об устройстве и санкционировании нон-транспортирующих систем.

Са++-зависимкй К+-качал, помимо энергетического истощения клеток (Gardos G., 1958), можно индуцировать ионо^ором двухвалентных ' катионов _А23187, З-блокатором Пропр:нололом (Manninen v., 1970; Pfeiffer D.E. et al., 1978), а такяе элек-трондонорной системой аскорбат+ФМС (Garcia-Sarcho j. et al., 1979).

Наиболее интересно!; оказалась взаимосвязь Са++-зависимого К^-канала с оксадорадуктазной системой мембран эритроцитов.Известно, что в мембранах эритроцитов человека обнаружены НАДН-дегидрогеназная и НЛДН:цитохром с-редуктазная активности и цитохром Bg ( Bruder G. et al., 1980).

В литературе существуют противоречивые мнения относительно связи Са++-зависимого К+-канала эритроцитов с активностью мембранных оксидоредуктазных компонентов. Минер с соавторами отмечено отсутствие корреляции г.;езду Са^-зависимым Х+-ка-налом и НА£Н-дегидрогеназной активностью эритроцитов различных видов млекопитающих (Miner С. et al., 1983). По мнению

друга* исследователей, хотя и Са^-зависимый К^-канал и мембра-несвязанная окоадоредуктаза являются различными белками, активность редокс-компонент может влиять на канал (?оЬ1аи е. et а1». 1989). Таким образом, до сих пор не ясно, каковы регуля-торные механизмы Функционирования активируемой ионами Са"1-1" калиевой проводимости эритроцитов.

Одним из проявлений патологического состояния организма может являться изменение физико-химических свойств мембран эритроцитов и связанного с этим распределения ионов в клетке.Исследование состояния эритроцитов при патологиях может дать ценную информацию о протекании патологичеокого процесса и молекулярных механизмах нарушений мембранного транспорта.

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы является выяснение механизмов регуляции и условий сопряжения Са^-зависимого ^-канала эритроцитов с окислительно-восстановительными компонентами мембран, а также изучение взаимосвязи ионной проницаемости клеток с физико-химическими изменениями мембран в норме и при некоторых сердечно-сосудистых патологиях.

В овязи с этим были приняты к исследованию следующие задачи: I) изучить характеристики Са++-завиоимого К+-каналар индуцированного электрон-донорной системой аскорбат+ФМС и_оксшш^ ток периодатом натрия. 2) Исследовать влияние классических ингибиторов энергетических процессов, ингибитора НАДН-дегидроге-назы плазматических мембран, БН-реагентов, антиоксидантов и фенольных соединений с различным окислительно-восстановительным потенциалом на Катаеву» проницаемость эритроцитарных мембран. 3) Исследовать взаимосвязь калиевой проницаемости с пе-рекисным окислением липидов и зарядам на мембране эритроцитов при сердечных (приобретенные пороки сердца) и сосудистых (об-литерирующий эндартериит и атеросклероз) заболеваниях.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных нами исследований было, показано, что увеличение активности Са^-зависимого ^-канала, индуцированного электрон-донорной системой аскорбат+ОМС, не связано с процесс а1,ж ПОЛ эритроцитов. Установлена функциональная зависимость Са++-завк-симого К+-канала с редокс-компонентами мембран, а также учас-

тие sh- групп в работе зтой системы. Впервые обнаружено модулирующее действие фенолышх соединений с различным окиелитоль-но-восстановителышм потенциалом на Са^-зависимую ^-проводимость. Это позволило выявить регуляторную взаимосвязь между степенью окиолекнссти (восстаноатепности) мембранных редокс-компонентов и работой Са^-завксимого К^-какала.

Впервые показано, что периодат натрия икдуцируэт калиевую и Са^-зависимую К+-проводимость эритроцитов, однако, в данном случае, выход калия но регулируется степенью восстановлен-ности мембранных компонентов.

Выявлено, что при сердечно-сосудистых заболеваниях ^изико-хишческие изменения мембран эритроцитов сопровождаются нарушениями ионного транспорта. Полученные данные, наряду с хирургическим лечением этих заболеваний, дают возможность рекомендовать терапию, направленную на коррекцию состояния эритроцитов у предоперационных больных, что позволит уменьшить возможные послеоперационные осложнения. Результаты исследований внедрены в практику Института хирургии иы.А.Л.Микаеляна МЗ РА.

Апробация работа. Основной материал диссертационной работы обсуждался на научных семинарах лаборатории энергообмена и биологически активных веществ и был апробирован на заседании Ученого совета Института хирургии им.А.Л.Микаоляна МЗ РА.

Результаты исследований были представлены и доложены на У научной сессии "Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии" (Иркутск, 1967), на всесоюзном совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пушино, 1988), на всесоюзной конференции "Ионный транспорт и регуляция функции клетки" (Ленинград, 1990).

Публикации. По результата!.! к с следовали!: опубликовано 6 работ, в том числе 4 статьи.

Объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 18 рисунков. Библиография включает 169 наименований литературных источников.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав; I - обзор литературы, П - материалы и ь-етода исследований, Ш - результаты исследований, 1У - обсуждение результатов; выводов и списка использованной литературы.

- 4 -

МАТЕРИАЛЫ Ii МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Виделение эритштштов. Эритроциты, иапользуемые в опытах, выделяли из гопаризкрованной крови доноров и крови больных о приобретенными пороками сердца, атеросклерозом и облитерирую-щим эндартериитоы.

Измерение концентрации К* и Н"1". Транспорт ионов К* и Н+ через мембрану эритроцитов изучали потенциокетрическим методом с помощью If*" и Н+-селективных электродов, совмещенных в одной ячейке. Измерение концентрации ионов Н+ проводили стеклянным водородным электродом фирмы "Kadioaeter" (Дания). Концентрацию К*" регистрировали с помощью пленочного электрода фирмц "Orytur" (Чехо-Словакия) или стеклянным ¡^-селективным электродом, изготовленным из стекла марки Na.il- 2704.

Определение продуктов перекисного окисления лилидов. Один из конечных продуктов ПОЛ, ыалоновый диальдегид (МДА), определяли ПО методу Стокса и Дорманди (Stocks J., Doraandy T.L., 1973) с небольшими модификациями, спектрофотометрически по поглощению в области 532 нм на спектрофото

Флуориметрическое исследование мембран эритроцитов о помощью 1-анилино-8-наДггалинсульФоната (АНС). Взаимодействие отрицательно заряженного мембранного зонда АНС с эритроцитами определяли согдасно методике Фортео и Гофмана (Fortes T.tu,, noffman j.F.j., 1971). Время инкубации было выбрано на основании исследований Чернщкого и др. (Черницкий Е.А., Воробей A.B., 1981; Черницкий Е.А., Воробей A.B., Конев C.B., 1976). Интенсивность флуоресценции смотрели на спектрофлуориметре "ь:агк-1" фирмы "Farrand" (США) при длине волны возбуждения 370 нм и флуоресценции 470 нм. Сравнивались интенсивности флуоресценции АНС супернатанта эритроцитов в диоксане (I) с контролем (Iq). Величина 1/10 характеризовала относительное связывание АНС эритроцитами.

Определение относительного количества метгемоглобина в кро-£и проводили по методу Эвелина и Меллой (Покровский A.A.,1969). Исследование проводили при длине волны 630 нм на спектрофотометре №-26 (СССР).

циент молярной экстинкции брался равным

Полученные данные обрабатывали статистически по г;- критерию Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАН^ И 0БСШ.ЕШЕ

Изучение Са^-зависимого К^-канала. индуцированного элоктрон-донорной системой аскорбат+ФМС

Нами было проведено детальное изучение взаимосвязи редокс-системы мембраны эритроцитов человека с Са++-зависимым К^-ка-налом.

На рисунке I показана типичная запись выхода К+ и кинетика изменения рН среда суспензии эритроцитов под действием элек-трон-донорнок системы аскорбат+ФМС. Й1С добавляли после нескольких минут инкубации эритроцитов с аскорбатом натрия. Из рисунка видно, что в среде без Са++ выходящий поток К4" весьма незначителен. В присутствии жо Са"*"1" скорость выхода К* составляет около 2 ммоль/мин-л эритроцитов (скорость выхода К4" вычислялась как средний поток за 15 минут). Очевидно, при переносе электронов Са++ входит внутрь и активирует Са^-зависимый К+-канап. Изменение рН двухфазное: после внесения ФМС происходит сильное подщелачпвание среда, сменяющееся через I минуту закислением. При изменении очередности добавок двухфазность изменения рН появляется после аскорбата, это значит, что очередность добавок на изменении рН не отражается. Только аскор-бат или ФИО не индуцируют выхода К4" (по крайней мере в течение 15-20 минут наблюдения).

к'аг1йсппеаи I. et а1. (1983) было показано, что добавление к эритроцитам ФЖ монет вызывать образование свободных радикалов кислорода. Нами были проделаны эксперименты по изучению влияния электрондонорноп системы на окислительные процессы в эритроцитах. Опыты выявили, что относительное количество мет-гемоглобина (относительно присутствующего гемоглобина) при действии аск+ФМС составляло 84%, в необработанных же эритроцитах метгемоглобин практически не выявлялся. Интенсифицировалось также ПОЛ мембран. При добавлении аскорбата-^',1С количество образовавшегося МДА, конечного продукта ПОЛ, равнялось 52,88^3,85 ыкмоль МДА/л эритроцитов (п=5). В контрольных же пробах уровень МДА составлял 6,15±0,53 (п=13) мкмоль МДА/л.

Т < .

д^К^ОД

к- ,

I *

7.4L ^

I - - - \, |

\

7,8 8,2

мин

Рис.1. Выход К1" и кинетика изменения рН, индуцированная элек-трондонорной системой аскорбат-^.'С. 0,1 мл клеток внесено в 3 мл среды, содержащей 150 мМ NaCl и 0,1 Ш КС1.

---- В среде присутствует также I мМ СаС12.

В среде присутствует I мМ 0аС12 и ббмкМ Д1ЩД. Добавлено 10 мМ аскорбат и 0,1 мМ ФЫС; t = 26±1°С.

Предварительная инкубация клеток в течение 5 минут с анти-оксидантами ионолом (0,1 мМ) и J.-токоферолом (0,1 мМ) уменьшала величину ПОЛ практически одинаково, до 42,62^3,84 (п=4) и 41,65^4,0 (п=4) мкмолъ ЦДА/л эритроцитов соответственно. В то же время ионол приблизительно на 50% шгибирует ^-проводимость эритроцитов, а (/-токоферол практически не оказывает влияния на выход К+ (табл.1).

В эритроцитах факт блокирования Са^-зависимого выхода К+, индуцированного аскорбатом +SMC некоторыми ингибиторами энергетических процессов, выпервые был отмечен Garcia-Sancho J. et al. (1980).

Нами было проведено исследование влияния ряда ингибиторов олигомицина, ДЦКД, антш/лцина и атебрина, на кинетику выхода К* из эритроцитов.

На рис.1 представлено влияние ДЦКД на Са^-зависимую К*"-

S L

Таблица I

Влияние различных соединений на Са++-зависимую ^-проводимость эритроцитов, индуцированную аскорбатом+>ЙЛС и перио-

датом

Исследуемые соединения, мкМ Аск+ФМС Е0 мВ Периодат натрия с Са++ без Са4"4"

Олигомицин (13) +42±8 +39,5±Ю +1±1

ДЩ (66) +67,5-6,5 -8,5±1,5 -35±2

Антимицин (18) +52±4 +45±Ю,6 +24±7

Атебрин (250) +90±Ю -1&±е -75±1

ТНФД (133) -1,5±0,5 +260

ДХФИФ (100) -21,5±5,5 +217 +65,5±5 +40^4

ДШФ (400) -48,5±3,5 +60±5

Мет^леновый синий

. +60±1,5* +11 +33,5±17

Менадаон (ICü) +20±3 +S -16,5±2,5 -33±9

Сафранин Т (100) +37-6 -290 -16,5±5

/-нафтол (100) +38,5±9,5 +57±Ю +52Í2

Ионол (100) +47-13 +12,5-2 +40±4

с/-токо$ерол (100) -5±5 +10±4,5 +33Ü¿I0

N -этилмалеимид (300) +54±4 +53,5±13 +35±12

ПХМБ (100) +56-12 +48,5±3,5

Дитиотреитол (350) +10±6 +59±6,5 +28±14

SITS (60) +41,5±Ю

Показан процент ингибировашя (+) или активации (-) по отношению к контролю. Даны средние результаты 3-5 измерений.

проводимость эритроцитов. Как видно из рис.1 и таблицы I, ДЩ приблизительно на 70^ ингибирует Са++-зависимый выход К+, сти-мулированньпЗ аскорбатом+ФЫС. Олигомицин, антимицин и атзбрин оказывают аналогичное воздействие, подавляя процесс утечки К+ из клеток на 40-90;1 (табл.1).

Известно, что в мембранах эритроцитов обнаружены НАДН-де-

гидрогеназная и НАДН:цитохром с-редуктазная активности и цито-хром В^ ( Brudor G., 1980). Антимицин ингибирует перзнос электронов в митохондриальной цепи на участке от цитохрома С к ци-тохрому В (Ленинджер А., 1974; Slater Е.С., 1967). Олкгомицин и ДЦВД, помимо ингибирования Н+-АТФазы митохондрий, moi^t также связываться с НАДН-дегидрогеназой (Мецлер Д., I98C; Solioz М., 1984), и ДЦВД может взаимодействовать с так называемым BCj комплексом штохондрий. Атебрин же является ингибитором НАДН-дегидрогеназы плазматических MeM6paH(Sanchez a. et ai.,1930).

Таким образом, можно думать, что эффекты ингибирования этими соединениями Са++-зависимого выхода К+, индуцированного ас-корбатом+ЛМС, обусловлены их взаимодействием с мембранны.ул редоко-компонентами.

Alvarez et al. (1984) выявлено, что мембранные компоненты способны акцептировать 2 электрона, причем их кажущийся стандартный редокс-потенциал (Е^) при рН 7,5 около -+47 мВ.

С целью выяснения роли окислительно-восстановительных ког.ь понентов в механизме регуляции Са++-зависимого К+-качала в ин-тактных эритроцитах нами было изучено действие фенольных соединений с различными окислительно-воостановительными потенциалами (Eg) (табл.1) на Са^-зависимую К+-проводимость, индуцированную электрондонорной системой аскорбат+ФМС.

Таким образом, у одних фенольных соединений стандартный окислительно-восстановительный потенциал превышал потенциал мембранных компонентов, у других редокс-потенциал был ниже.

На рис.2 показано действие ДХФИФ (Е^> Е^ мембр.комп.) и менадиона (Е^< Е^ мембр.комп.) на Са++-зависиыый выход ^.индуцированный аскорбатом+ФЫС. Из рисунка видно, что и менадион, ингибирующий выход К+, и ДХФИФ, увеличивающий калиевую проводимость, добавленные после аскорбата, сами вызывают двухфазное изменение рН, при этом менадион угнетает опосредованный ФМС всплеск рН, а ДХФИФ, наоборот, даже несколько увеличивает его, при этом и менадион, и ДХФИй, добавленные до аскорбата, сами по себе всплесков рН не вызывают, хотя и их э£фек-ты сохраняются.

Из табл.1 видно, что соединения, обладающие меньшим окислительно-восстановительным потенциалом по сравнению с мембран-

5с

Рис.2. Влияние фенольных соединений на выход К*" и изменение рН. Условия как под рис.1. 3 ореде присутствует I гМ Сз012.

Добавлено: - 10 мМ аскорбат и 0,1 мМ ФМС;

---аскорбат, ОД мМ менадион и ФМС;

-.-.- аскорбат, 0,4 Ш ДХФИФ и 4МС. • Стрелка без обозначения между аск' и ФМС - добавление менадаона или ДХФИФ.

ними компонентами (менадион, метиленовнй синий, сафранин Т) ингибируют выход К+, а соединения о большим Е' (Т1.1ФД, ДХФИФ) -увеличивают (ДХФИФ) или не влияют (Т!.ЙД) на К -проводимость. Фенолъные соединения «¿-нафтол и конол ингибируют выход К*1»'

Противоположные эффекты фенольных соединений' южно объяснить исходя из следующих соображений. Вещества с отрицательным или относительно небольшим положительным (метиленовнй синий, менадион, сафранин Т) будут находиться в кекбране клеток в окисленном состоянии, увеличивая тем самым степень окис-ленности системы (само соединение + мембранные компоненты). ДХФИФ же, имея большой положительный потенциал, будет находиться в восстановленной форме (например, он может восстанавливаться НАДН) и, следовательно, будет повышать степень восста-

новленности сиотемы. Отсутствие влияния ТМФД может, объясняться тем, что это ооединоние не взаимодействует с оксидоредук-тазными компонентами мембран.

Аналогично этому можно объяснить ингибирующее действие антиоксид антов ионола и Х-нафтола, Антиоксиданты могут легко отдавать электроны свободным радикалам и уже в окисленной форме взаимодействовать с редоко-компонентами.

В литературе существуют противоречивые мнения относительно того, влияют ли бн- реагенты непосредственао на К+-канал или на систему транспорта Са*"1" в эритроциты (Бгавг I. еъ а1., 1977; Уагеска Ь. еЪ в1., 1986; Больханданян А.В.-, 1989). В связи с этим наш было исследовано действие блокаторов бн-• групп белков н -этилмалеимида, ПХМБ, а также дитиотреитола, предотвращающего окисление бн -групп, на Са++-зависимый выход К*.

Как видно из табл.1, n -этилмалеимид более чем на 50$ ин-гибирует выход К*" из эритроцитов. Аналогичный эффект оказывает также и ПХМБ. Дитиотреитол почти не оказывает влияния на активность К^-канала.

Таким образом, можно придти к выводу, что ¿н -группы участвуют в регуляции Са^-зависимой К+-проводимости, индуцированной электрондонорной сиотемой. Дитиотреитол же, обладающий восстановительной способностью, оказывает незначительный эффект, очевидно, вследствие того, что мембранные компоненты, а следовательно и сульфгидрильные группы этих компонентов, могут уже быть восстановлены аскорбатом+ФМС. В работе уагес^а еЪ а1. (1986) на основании изучения влияния бн -соединений на вход Са++ в эритроциты было постулировано существование белков-переносчиков, . катализирующих транспорт Са"н". На основании литературных и наших собственных данных можно утверждать, что в данном случае подавление бн -реагентами Са^-за-висиыого выхода К*" связано о ингибированием транспорта Са++ в клетки из-за блокировки БН-групп предполагаемого белка-переносчика или мембранных компонентов, регулирующих функции переносчика, а не о влиянием реагентов на калиевый канал.

На основании наших результатов можно утверждать о присутствии в мембране эритроцитов функционального мультиферментно-

Рис.3. Схема функционального сопряжения Са++-зависимого К*"-канала с мембранными редокс-компонентами.

го комплекса, состоящего из мембранной оксидоредуктазы и Са++-зависимого ^-канала. Активность Са^-зависимого К^-канала, индуцированного аскорбатом-нШС, регулируется степенью окислен-ности (восстановленности) этих мембранных редокс-компонентов. Рио.З иллюстрирует предложенное нами заключение.

Изучение калиевой и Са^-зависимой К*"-проводимости эритроцитов. индуцированной периодатом натшя

Нами была изучена кинетика выхода ионов К1" из эритроцитов, индуцированная I мМ периодатом в присутствии к отсутствии Са++. Как видно из рис.4, выход К4" происходит не сразу, а через 3-4 минуты после внесения периодата. Возможно, это связано с процессом формирования пор. При этом добавление периодата приводит к быстрому подкислению суспензии эритроцитов,сменяющемуся подщелачиванием. Из рис.4 видно также, что Са4""1" су£ щественно усиливает скорость выхода К4" из клеток (0,592 ммоль/ мин»л и 1,16 шоль/мин-л эритроцитов соответственно).

Если концентрацию периодата увеличить до 3 мМ, то ионы Са"1-1" перестают влиять на калиевую проводимость. Таким образом, эф-

Рис.4. Выход К* и кинетика изменения рН под действием периодата натрия. 0,1 мл клеток внесено в 3 мл среды, содер-кащей 150 мМ холинхлорид и 0,1 мМ KCI. Добавлен I r.i.' периодат.

--- в среде присутствует I мМ СаС^

в среде присутствует CaCI^ и эритроциты предварительно инкубировали о 13,3 мнМ олигошщина.

фект увеличения выхода К1" проявляется только при сравнительно невысоких количествах периодата в среде.

Интересно било выяснить, с чем связано увеличение ионами Са"*-1" калиевой проводимости клеток: с активацией Са++-зависимо-го выхода К* или с увеличением размера пор под действием Са**, тем более, что как мы отметили, при увеличении концентрации периодата в среде Са++ перестает влиять на утечку К4. С этой целью мы предварительно инкубировали эритроциты с олигомици-ном, который блокирует Са^-зависимый К^-канал, каким бы способом он ни образовывался (Sanchez A. et al., 1980; Кшьханда-нян А.В., 1989). На рис.4 показано действие одигшицина на выход К* из клеток. Олигомщин практически полностью ингибирует Са^-зависимый выход К4", доводя скорость выхода до таковой в среде без Са++. В бескальциевой же среде олигомицин не влияет на калиевую проводимость (табл.1). Эти данные в принципе служат подтверждением индуцирования канала, а не действия-Са*4"

на поры. Можно предположить, что Са++ входит в клетки вследствие ингибирования Са++-АТФазы эритроцитов окисленными продуктами действия периодата или непосредственно через поры и "открывает" канал.

Heller к.в. et al. (1984) отмечено, что периодат индуцирует образование мембранных белковых агрегатов, а дитиотректол и N-этилмалеимид предотвращают ?тот эффект. Мы проверили действие этих соединении, а также другого блокатора sh -групп ПХЫБ на потерю К* клетками. 3 каких опытах все эти соединения ингибировали выток К+ (табл.1). Эти данные доказывают ¿акт участия SH -групп в механизме выхода К4" из эритроцитов, т.е. для инициирования К+-прошщаекости периодатом ванное значение имеет окисление sh -групп мембранных белков и их дальнеГ.шат сшивка. Большая степень ингибирования сн -реагентами общего выхода К1" по сравнению с выходом КГ1" в ореде без Са4^ говорит о том, что эти соединения действуют на Са++-зависимый выход К*". Скорее всего, подавляя образование пор, оти блокаторы уменьшают вход Са++ в клетки и, вследствие этого, активность Са++-зависимого К+-канала.

Из табл.1 видно, что ингибирование ионолом и .¿-токоферолом калиевой проводимости существеннее без Са++, чем в его присутствии. Это говорит о том, что антиоксиданты незначительно влияют на Са++-зависимую компоненту вытока К+. Ингибирование же может происходить вследствие подавления процессов окисления мембранных тиоловых групп, участвующих в образовании пор.

При проверке, действия фенольных соеданеня;": на калиевую проводимость были получены данные, отличающиеся от результатов, полученных при индуцировании выхода К+ электрондонорной системой (табл.1). Представляется возможным, что ингибирование калиевой проводимости метыенсвым синим, ^-нафтолом и ДХЖ? есть результат их действия на тколовые группы. Не исключено также предотвращение окисления этих групп некоторыми указанными фенольными соединениями.

Ингибитор транспорта анионов sits может уменьшать выход К+, вызванный периодатом (табл.1), очевидно, как из-за предотвращения проникновения периодата в эритроциты через анион-

- 14 -

ную транспортную систему полосы 3 мембраны, так и вследствие подавления выхода СГ", который может служить сопутствующим анионом для К4".

Таким образом, механизм выхода К4" из клеток, индуцированный периодатом, отличается от такового, активированного электрон-донорной системой аскорбат+ФМС. Хотя и в этом случае ингибиторы энергетических процессов митохондрий и НАДН-дегидрогеназы плазматических мембран подавляют Са++-зависимый выход К+, однако регуляция активности канала степенью восстановленности мембранных редокс-компонентов не обнаружена.

Транспорт ионов и Физико-химические изменения мембран эритроцитов пш некоторых сердечно-сосудистых патологиях

В ряде работ было показано, что при различных патологиях часто нарушаются процессы перекисного окисления липидов (Ме-ерсонф.3., 1984; Giardini 0., 1984; Taccone-Gallucci 11., 1986) и транспорта ионов (Брайант С.А., 1980; Uendonca М», 1980; Diez J., 1986; Garay R.P., 1983).

Нами было предпринято исследование ПОЛ и количества К4" в эритроцитах больных приобретенными пороками сердца по сравнению с нормой. Были исследованы 26 больных, из них со стенозом митрального отверстия 15 и 8 с недостаточностью.митрального клапана, у остальных был сочетанный митральный порок. Был изучен не только эндогенный уровень ПОЛ, но и изменение его величины под действием добавленной перекиси водорода. Последняя процедура дает возможность судить о состоянии антиокислительных систем эритроцитов. Результаты исследований приведены в табл.2.Рь'ЯРлено досторерное уменьшпнир уровней К+ и ПОЛ.

Между показателями количества К4" в эритроцитах больных с приобретенными пороками сердца и соответствующими значениями ПОП была выявлена отрицательная корреляционная связь. Коэффициент корреляции был равен -0,6.

Поскольку в эритроцитах нормальный уровень ПОЛ поддерживается в основном ¿-токоферолом, присутствующим в мембране, а также ферментами-антиоксидантами супероксидвдсмутазой, ката-лазой и пероксидазой, то увеличение у больных количества ВДА как в исходе, так и под действием HgOg говорит о том, что может нарушаться соотношение этих антиокислительных систем

Таблица 2

Количество 1С* и величина ПОЛ эритроцитов в норме и у больных приобретенными пороками сердца (М - средняя величина, ш - среднеквадратичное отклонение, п - число пациентов)

Концентрация К* в ммоль на л эр. (М±п)

ПОЛ мкмоль 1ЛДА/л эр. (М±т)

без добавок

добавлено_

сд гдл so;i Н2°2

Норма Больные

91,11^2,18 п=24

76,52^2,53

п=26 Р< 0,001

6,15-0,53 п=13

8,24±0,32 п=25 Р<0,01

28,7b±I,II П=13

34±2,25 п=25 Р<0,С5

или их активность.

Таким образом, можно утверждать, что уменьшение количества К"*" в эритроцитах при врожденных пороках сердца связано с повреждением липидного бислоя мембран.

В связи о этим нами было проведено изучение влияния некоторых применяющихся в клинике соединений-антиоксидантов, таких как «¿-токоферол (витамин Е) и ионол (в клинике применяется масляный раствор этого вещества под названием дибунол) на ПОЛ мембран эритроцитов, вызываемых перекисью водорода в присутствии азида или электрондонорной системой аскорбат+Ф!;!С (табл.3). Из таблицы видно, что и .¿-токоферол, и ионол значительно снижают величину ПОЛ. Учитывая, что ионы К+ являются одними из важнейших катионов в клетке, результаты исследования, приведенные в таблицах 2 и 3, дают нагл основание наряду с хирургическим лечением больных приобретенными пороками сердца рекомендовать антиоксидантную терапию, направленную на улучшение состояния эритроцитов.

Нами исследовано изменение количества К+ в эритроцитах, Катаевой проницаемости мембран, связанной с транспортам Са++ внутрь и структурного состояния мембран по данным флуоресценции АНС при некоторых сосудистых патологиях по сравнению с нормой. Эритроциты выделялись из венозной крови больных обли-

Таблица 3

Влияние антиоксидантоБ на индуцируемое окислительными процессами ПОЛ эритроцитов (М - средняя величина, т -среднеквадратичное отклонение, п - количество пациентов)

ПОЛ, мкмоль ГДДА/л эритроцитов М-и

контроль .¿-токоферол ; ионол (ICC мк1/1) ; (IGO ш<М)

азид (4 mî.'I) + н2о2 (5 MÎ.1) аскорбат (1С м!;0 + SÎÎ.1C (0,1 мМ) 54,2-12,8 п=4 52,88^3,84 п=4 32,05^1,20 п=4 42,625^3,84 п=4 13,56-2,24 п=4 41,65±4,8 п=4

терирующим атеросклерозов и эндартериитом.

В табл.4 представлены результаты расчета концентрации К+ в эритроцитах (функцпоначыше свойства) и отношение интенсивно-стей флуоресценции, отражающей структурные аспекта, в норме и при сосудистых патологиях.

Как видно из табл.4, количество К+ в норме и при атеросклерозе отличается на 1С,3^. В случае же эндартериита концентрация К+ уменьшается по сравнению с нормой почти на 18,8$ (в обоих случаях С,05). Зти функциональные изменения коррелируют с показателями флуоресценции АНС.

Механизм "выбирания" АНС эритроцитами включает 2 процесса: адсорбцию АНС на поверхности у.ембраны и перенос красителя внутрь клеток (Fortes G.Р.А., 1974). Поскольку меньшая величина I/IQ означает уменьшение количества АНС в супернатанте, то, судя по нашим данным, и при атеросклерозе, и при эндарте-риите увеличивается связывание и проникновение АНС в эритроциты. Так как АНС отрицательно заряжен, то с уменьшением отрицательного заряда на мембране АНС будет больше связываться с мембраной и его концентрация в супернатанте будет уменьшаться, т.е. величина I ниже при патологии, чем в контроле. При обеих патологиях по сравнению с нормой есть достоверное различие: Pj^-0,01, Р30^0,01, при атеросклерозе и Pj-^0,01

Таблица 4

Количество К4" и отношение интоноивностей флуоресценции в норме и при сосудистых патологиях (М - средняя величина, т - средневадратичное отклонение, п - число пациентов)

К+, ммоль/л эритроцитов М^ш 1/1.,1 млн. М+ш 1/1о,30 мин М±т

Норма 91, П±2,18 0,947^0,009 0,807^0,008

п =24 п=5 п=5

Атеросклероз 81, 7±2,9 0,871-^0,011 0,754-0,012

п =17 п=8 п=8

Р^.0,01 Р^ 0,01

Облитерирую- 74± 4,4 0,879±0,009 0,746^0,006

щий эндарте-риит п =12 п=11 п=П

Р^ 0,01 Р^. 0,001

и Р30< 0,001 при эндартериите (индексы I и 30 указывают вредя инкубации АНС с эритроцитами). Это может бить связано как с уменьшением фиксированного отрицательного заряда на мембране, так и с ухудшением состояния мембраны, что приводит к увеличению проницаемости и к большему вхождению АНС внутрь эритроцитов.

На.® был исследован выход, К+ из эритроцитов при ингибирова-нии гликолиза метаболическим ингибитором - фторидом натрия.

На рис.5 представлены типичные кривые выхода К1" из эритроцитов в условиях ингибирования гликолиза фторидом в присутствии Са"^ в норме и при эндартериите, поскольку Наибольшее отличие от нормы было получено именно в этом случае. Если в норме только второе внесение Са++ приводит к быстрому выходу 1С1" и резкому "всплеску" концентрации Н то при эндартериите быстрый выход К4" получается уже после первой порции Са++, "всплеск" иногда бывает менее выраженным (рис.5). В некоторых случаях уже после фторида калиевая проницаемость существенно увеличивается и последующие добавки Са++ уже не влияют на скорость выделения К+. "Всплеска" Н+ не отмечается.

- IS -

Рис.5, Кинетика выхода К"*" и "всплеск" Н+ в суспензии эритроцитов под действием Са++ в условиях шгибирования гликолиза в норме'(А) и при эндартериите (Б,В). 0,1 мл эритроцитов инкубировали 10-15 мин в 3 мл среды, содержащей 150 мМ NaCl, I tM Са++ и 0,1 мМ К+. Затем-добавляли 10 мМ NaP и I мМ Са++. Т=22°С.

- 19 -

Кажэтоя вероятным, что "всплеок" вызван каким-то структур-, ным изменением формы эритроцитов, связанным с транспортом Са4-1' внутрь. Очевидно, при эндартериите мембраны эритроцитов в значительной мере нарушены. Не исключено и "ослабление" метаболических процессов, в частности гликолиза, из-за чего в эритроцитах мокет быть меньше АТФ. Б связи с этим нами были проведены специальные опыты, в которых с целью увеличения внутриклеточного АТ*> эритроциты инкубировались с глюкозой. Результаты показали, что при этом происходило уменьшение выхода К1" и всплеск Н+ становился более замедленным. Вышесказанное может объяснить инициирование катаевого канача при меньшем числе добавок Са++ по сравнению с нормой.

Таким образом, можно придти к выводу, что при указанных сосудистых патологиях функцконатыше изменения эритроцитов сопряжены со структурными нарушениями мембран. В свою очередь, эти нарушения могут быть связаны с ухудшением процессов гликолиза. Поэтому наряду с хирургическим лечением этих заболеваний можно рекомендовать терапию, направленную на коррекцию состояния эритроцитов. Это может усилить их эластичность и способность к деформации и, таким образом, улучшить проходимость через сосуды.

ВйВода

1. Электрондонорная система аскорбат+феназинметасульфат (Ф.МС), восстанавливающая мембранные компоненты эритроцитов, активирует Са++-завксимый К+-канал. Действие аскорбата+ЗМС сопровождается двухфазным изменением рН, интенсификацией пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) мембраны и переходом гемоглобина в метгемоглобин, причем Са++-зависимый выход К+

не зависит от этих процессов. Антиоксиданты ¿-то-

коферол и ионол. в одинаковой степени подавляют ПОП, в то же время «¿-токоферол не влияет на активность канала, а ионол на 50$ ингибирует его.

2. Ингибиторы энергетических процессов, взаимодействующие ■ с редокс-компонентами мембран (олигомицин, антимипин к ДЦВД), и ингибитор НАДН-дегидрогеназы плазматических мембран (ате-

брин) на 40-90$ подавляют Са^-зависимый выход К+, индуцированный аскороатом+ФМС.

Блокаторы сульфгидрильных групп N -этилмалеимид и ПШБ подавляют активность Са^-зависимого ^-канала, а восстановитель БН -групп дитиотреитол не влияет на выход К+.

3. Выявлено модулирующее действие фенольных соедашний с различным стандартным окислительно-восстановительным потенциалом (Ер па Са++-зависимый выход К1", индуцированный аскорба-том+4МС: соединения с отрицательным или небольшим положительным' Е^ относительно мембранных окислитсльно-восстановитель-ных компонентов кнгпбпруют, а соединения с большим положительным Ед не влияют или активируют выход К+.

4. Предложена схема сопряжения между индуцированным аскор-батом+ОМС Са++-зависимым К+-каналом и редокс-компонентами мембран, основанная на существовании функциональной связи между этими системами и на регуляции функционирования канала степенью восстановленное™ оксидоредуктазных кошонентов.

5. Оксидант периодат натрия, образующий поры в мембране, индуцирует калиевую и Са^-зависимую калиевую проводимость эритроцитов. Для активации калиевой проводимости имеет значение сшивка мембранных белков и состояние окисленности сульф-гидрильных групп этих белков. Ингибиторы энергетических процессов и НАДН-дегидрогеназы плазматических мембран подавляют Са++-зависимый выход К+, в то же время избирательно действуют на калиевую проводимость в бескальциевой среде. Не обнаружена связь между Е^ фенольных соединений и Са^-зависишм ¡^-каналом.

6. У больных приобретенными пороками сердца выявлено уменьшение количества К+ в эритроцитах, связанное с повреждением липидпого бислоя мембран вследствие интенсификации процессов ПОЛ.

7. При некоторых сосудистых патологиях (атеросклероз, об-литерирующий эндартериит) происходит уменьшение количества К+ в эритроцитах, сопровождающееся большим связыванием и проникновением отрицательно заряженного флуоресцентного зонда 1,8-АНС в эритроциты.

Сведения о публикапии научных результатов

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Калиевая проницаемость и физико-химические характеристики мембран эритроцитов при сосудистых патологиях. Тез.докл. итоговой научной сессии, ч.П, Иркутск, 1987, с.214 (соавт. А.В.Вольханданян, А.З.Карапетян).

2. Изучение некоторых функциональных и структурных свойств эритроцитов при сосудистых патологиях. I."Кровообращение", т.

20, 4, 1987, с.39-46 (соавт. А.В.ГЬльханданян, А.З.Карапетян) .

3. Перекисное окисление липидов и количество К+ в эритроцитах больных приобретенными-пороками сердца. Ж. "Кровообращение", т.23, № 6, 1990, с.52-55 (соавт. А.В.Гюльханданян, В.Г. Азатян).

4. Механизмы регуляции индуцированной окисляющими агентами Са++-зависимой калиевой проводимости эритроцитов. Биолог.ж. Армении, т.43, Je 6, 1920, с.477-483 (соавт.А.В.1Ъльханданян}.

5. Функциональное сопряжение оксидоредуктазной системы с Са++-зависишм калиевым каналом эритроцитов. Ж. "Цитология", т.32, 9, 1990, с.927-928 (соавт.А.В.Больханданян).

6. Са^-зависимый выход К+ из эритроцитов, индуцированный окислительным! процессами. Ж."Биофизика", т.36, M I, 1991, с.169-171 (соавт. А.В.Гюльханданян).