Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенетические эффекты проявления мутаций Notch у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Морфогенетические эффекты проявления мутаций Notch у Drosophila melanogaster"

Г Б од

г. ^ИГ 'г-,.,, АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УЖ 575.164:595.77

ФРОЛОВА Ирина Павловна

МОРФОГЕНЕТИЧЕОКЙЕ ЭМ5ЕШ ПРОЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ ЫоЬсп У ОгаБорМ1а т1алoeasteг

03.00.15, - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

шОскза 1995

Работа выполнена в лаборатории генетики Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (Директор - академик РАН Н. Г. Хруща?.;

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук А.И.Иванов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОШОНЕНТВ:

доктор биологических наук М.М.Асланян кандидат биологических наук Е.В.Полякова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт эволюционной экологии и морфологии км А.Н.Северцова

Защита состоится 1995 г, б Н час, на .

сэдании специализированного совета Д002.85.01 при Институте биа г;::: развития им. Н. К. Кольцова РАН (117334 Москва, ул. Вавило: 25, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института 5: логик развития им. Н.К.Кольцова РАН

Автореферат разослан "^3" <х\А/(ур^ис1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.М.Протопопова

~ о -

ВВЕДЕНИЕ

' Актуальность проблемы. Экспериментальная и классическая эмбриология сформулировали фундаментальное положение, согласно которому онтогенетическое становление зачатка происходит в результате автономней и зависимой дифференциации его клеток. В эмбриогенезе позвоночных дифференциация клеток дорзальной эктодермы (инвагинация клеток нервной пластинки) происходит вследствие индуктивного влияния меток хордо-мезодермального зачатка (Spemann, 1938). У насекомых нервная система формируется з результате диффузной сегрегации клеток эктодермы (ней-робластов), потомки которых образуют головной мозг и брюшную нервную цепочку. При этом дифференциация клеток покровной эктодермы опережает дифференциацию меток мезодермы (Paulson, 1951). Такие различия в морфогенезе позвоночных и насекомых свидетельствуют о принципиальной разнице их "механики развития" и не позволяют переносить выводы эмбриологии позвоночных на онтогенез насекомых.

Незначительные размеры зародышей насекомых затрудняют экспериментальное манипулирование с отдельными зачатками. Поэтому изучение характера их дифференцировки в раннем развитии требует иных подходов, поиск которых составил одну из основных задач данной работы. В качестве основной модели были выбраны мутации локуса Hatch дрозофилы. Ген Hatch известен как ключевая ген, контролирующий дивергенцию эктодермалькых клеток на нейрогенный и дерматогенный пути развития (Wright, 1970; Artavanis-Tsakonas, 1983). Уже первые цито-эмбриологические описания Df(l)Notch-8 (Poulson, 1940) установили, что у мутантов отсутствует воя вентральная и передняя дорзальная гиподерма, а брюшной нервный тяж разрастается на латеральные стороны (рис. 1). Эти изменения морфогенеза дрозофилы приводят к тому, что клетки различных зародышевых листков формируют новый эмбриональный паттерн, что делает возможным анализ взаимодействий мезодермы и эктодермы в змбирогенезе D. mela-nogasterL,В__рабо?е были использованы: 1) аллеломорфы гена Notch: tf*4^ и ffivn. у) разные дозы локуса Notch; 3) мозаики по мутантному локусу Notch.

Топографическое изменение эмбрионального паттерна позволяет также вычленить автономную и зависимую диффеиенцировку мезодермальных клеток и приблизиться к пониманию того, что является ведущим в определении направления их^миграции^ В свою очередь, использование двух аллей Notch: и^г-оо к iP3n, имеющих разное фенотипическое проявление, делает возможным описание взаимодействий висцеральной мезодермы и внутренней эктодермы, а анализ эбриогенеза зародышей, мозаичных по доку-

су Notch-84k35, проясняет характер взаимоотношений клеток, несущих нормальный и мутантный аллель Notch.

Другая часть исследования была посвящена анализу нейро-генеза. У дрозофилы формировании нервной системы зависит от межклеточных взаимодействии.(Campos-Ortega, 1988), в которых одну из ключевых ролей играет белок гена Notch (Artava-nis-Tsakonas, 1988;. Для решения поставленной задачи были использованы мутанты Notch~84k35 и Notch-88n, отличающиеся по степени нейраливции, к эмбрионы, несущие разные дозы локуса Notch.

Проявление гена Notch носит плейотропньш характер. Доминантный эффект мутации Natch связан с изменением паттерна крыловой пластики:. Это дает основание предполагать участие данного локуса з морфогенезе имаго и его влияние на дифференциацию проспективно имагинапьных клеток. Экспериментальной основой решения данного вопроса являлись трансплантация му-тантных эмбриональных клеток в брюшко имаго (культура in vivo) я последующая ретрансплантация их в метаморфозирующих личинок. В случае интактного характера проспективно имагиналь-ных клеток они должны быть способны формировать кутикулярные структуры имагинального паттерна.

Конкретные задачи этого исследования были следующие:

1) Дитс-эмбриологическое исследование на разных стадиях развития дифференциации производных трех зародышевых листков у мутантов с гемизиготной, гомозиготной, гетерозиготной по Notch~84k35 и Notck-88n структурой, их компаундов, а такте генотипических мозаикоЕ по локусу Notch

2) Изучение влияния дозы гена Notch на эмбриогенез дрозофилы;

3) Анализ характера межклеточных взаимодействий у мозаичных по Notch эмбрионов;

4) Выяснение влияния гена Notch на дифференциацию клеток кма-гинзльных тканей.

Научная новизна работы. Использование двух аллелей Notch íNotch-84k35; Notch-88a) дрозофилы, имеющих равный паттерн нарушения эмбриогенеза дрозофилы, позволило установить дифференциальную регуляцию этим геном морфогенеза брюшного и головного отделов нервной системы: нормальная сегрегация ней-робластов и дерматооластов брюшной области происходит при наличии одного нормального аллеля Notch, а головной области -только при наличии двух. Для дифференцировки энтодермального и мезодермалькогс листков также оказывается достаточно наличие одного аллеля Notch дикого типа.

У мутантов, несущих разную дозу гена Notch, возможна 2 типа нарушения нейрогенеза. У эмбрионов первого типа утрата

- D -

гиподермы сопровождалась пшернейрадизацией брюшного отдела нервной системы, во втором - гиперяейрализацией головного отдела. Таким образом, было показано, что дифференциация всех клеток переднедорзальной и вентральной эктодермы по нейроген-ному пути развития, вызывающая утрату в этой области гиподер-мальвой ткани, делает возможным процесс гипернейралиэации, но не является его щпкксй.

Анализ эмбриогенеза гемизиготных Notch мутантов позволил описать характер взаимоотношений клеток мезодермы и эктодермы. Установлено, что вектор миграции мезодермальных клеток определен запрограммированностью их движения в направлении латеральной гиподермы, а также их сродством к клетам покровной эктодермы. Также было показано, что в морфогенезе предже-лудка ведущая роль принадлежит висцеральной мускулатуре передней кишки.

С помощью описания эмбрионального паттерна детельных Notch-84k35-MQ8SiszcB было показало отсутствие у них мозаичного нарушения развития нервной системы и гиподермы. Это свидетельствует о том, что диффузный тип сегрегации нейробластов из слоя эктодермы приводит к тому, что маркированные участки нервной системы и покровной эктодермы имеют малый размер. Кроме того, Е яйцах, несущих кольцевую нестабильную Х-хромосому, было отмечено появление разного количества погибших ядер. При этом эмбрион формировался даже в тех яйцах, где погибало 501 ядер дробления. Зтс свидетельствует о достаточно высоких регулятсрных способностях яиц дрозофилы.

Нарушение развития мозаичных по Hatch эмбрионов, несущих нестабильную юльцегую Х-хромооа/у, была аналогично нарушению дифференцировки гемизиготных самцов с гетерозиготной структурой по локусу Match, возникающей з результате транслокации на Y-хромосому участка Х-хромосомы, содержащего нормальный аллель Match. Эта говорит о возникновении position effect variegation у гетерозиготных по Hatch самцов и позволяет считать их новой моделью мозаицизма.

Трансплантация и культивщюваше в брюшке имаго гемизиготных по Notch-84k35 мутантов с последующей кк ретрансплан-тацией в метаморфпзирущих личинок показала наличие у мутант-ных эмбрионов нормального процесса сегрегации проспективно кмагинальных клеток, но нарушение их дифференцировки.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на Конференции Молодых Ученых (Москва, 1993), на I съезде Вавиловс-кого Общества Генетиков и Селекционеров (Саратов, 1994), а также на объединенном семинаре отдела генетики Института биологии развития им. Н. К. Кольцова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, экспериментальные данные представлены 21 рисунком и 3 таблицами. Список литературы состоит из 162 работ.

Рис. 1. Схема разрастания вентрального нервного тяжа на поперечном срезе зародыша у мутантов Notch: эк - эктодерма; эк - энтодерма; и - мезодерма; внт - вентральный нервный тяж.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Линго! Drosophila melanogaster: В работе были использованы лабораторные линии D. melanogaster, маркированные следующими генами.

1) дикая линия Oregon Ш.

2) линия Notch-34k35 1-2.0).

3) линия yellow.

4) линия yellow white-apricot/white+Y.

5) линия Natch 88ti/Fir£.

6) линия у Natch-84k35 / Base.

7) линия у Notch-84k35/Frrß.

8) линия 1п(1) dl-49 у 1(1) v/ lz+/R(l)2,Гс, In(l) w'c/y+: Более подробную характеристику мутаций можно найти в

справочнике Линдсли и Грелл (Lindsley and Grell, 1968).

Анализ нервной системы на тотальных препаратах эмбрионов дрозофилы. Анализ развития нервной системы проводили следующими методами:

1) гистохимической реакцией с пероксидазой хрена (Zalo-каг aid Erk, 1977);

2) окраской основным фуксином (Lillie, 1954);

3) реакцией на ацетижолшзстеразу (Корочкнн, 1992).

ЭК

f

Приготовление тотальных препаратов кутикулярного паттерна. Яйца просветляли в жидкости Хойера (Ноуег): 30 г гуммиарабика, 200 г хлорал гидрата, 20 г глицерин; НоО - 50 мл (Wi-eschaus and Nusslein-Volhard, 1986).

Гистологическое исследование эмбрионов дрозоФшш. Гистологический анализ эмбрионов проводили на стадиях 12, 15, 16 стадиях развития (Canpos-Ortega, Hartenstein, 1985) и через 28 ч после откладки яйца (невылупившиеся эмбшоны) при температуре 17°, 25°, 29°С.

1) Фиксация по Zalokar, Erk (1977).

2) Препараты дегидратировали, заключали в парафиновые блоки, которые разлагали на серии, толщиной 7 мкм.

3) Окраску срезов проводили азур I¡-эозином по методу Лилии (Lillie. 1954).

Трансплантация и культивирование эмбрионов в брюшке имаго. Эмбрионов на стадии 16-20 час. развития трансплантировали в брюшко самок дрозофилы Oregon R0 (Кузин, 1977). Через 10-14 дней часть эмбрионов фиксировали 8 сут. в смеси Бузна, другую часть эмбрионов ретрансплантироваяи в метаморфизирующих личинок. Мух, вылупившихся из этих личинок, обследовали на наличие у них в брюшке имагинальных тканей мутантов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Установление общего характера нарушения нейрогенной и дермагогенной закладок у мутантных эмбрионов Hotch-94k35 и Hotch-83n

1.1. Строение нервной системы на тотальных эмбрионах Uotch-84k35 и üatch-SSn. Для анализа нервной системы на тотальных эмбрионах дрозофилы была использованы реакция на аце-тиллолпнэстеразу, иммуногистохимичеокая реакция с пероксида-зой хрена и окраска основным фуксином, с помощью которых был .описан общий характер нарушения нервной системы мутантов llatch-84k35 и Notch~88n, а также показано распределение пучков нервных волокон и распределение ядер перикарионоз.

Использование трех различных методов позволило идентифицировать разный характер аномалий нервной системы, которые соответствовали двум видам нарушений. К первому виду относились эмбрионы, у которых отсутствовала конденсация брюшной нервной цепочки, а ее задний отдел сильно разрастался. В вентральной области брюшной нервной цепочки расстояние между продольными и поперечными пучками нервных волокон было непостоянным и отличалось от нормы. Их толщина и протяженность также была переменной.

¥ эмбрионов, проявляющих второй вид нарушений, отмеча-

- я -

лась не только гипертрофия брюшной нервной цепочки, но и сильное разрастание ее на латеральные стороны. Причем у части эмбрионов нервная система в результате этого разрастания окружала эмбрион полностью. Клетки и нервные волокна у таких эмбрионов распределялись хаотично, без видимых признаков формообразования .

Эти два вида нарушения морфогенеза нервной системы были характерны для обеих мутаций, однако для эмбрионов Hatch-84к35 по сравнен™ с Notch~88n в большей степени была характерна гипернейрализация (II вид), тогда как у мутантов Uatch-88n иногда отмечалась даже редукция участков брюшной нервной системы.

2. Исследование хетотаксического паттерна у эмбрионов Notch-84k35

2.1. Влияние дозы гена Hatch-84k35 на диЦеренцирозку эктодермы. Дифференцировку покровной эктодермы у эмбрионов дрозофилы с одной дозой гена }Mch-84k35 изучали у мутантов, погибающих з разных скрещиваниях. Гемизиготные самцы (Notch-84k35/+) были получены в Ft следующего скрещивания: 9 Natch-84k35/+ х сГ Oregon RC

Все гемизиготные эмбрионы полностью утрачивали нейроген-ную эктодерму, в результате чего хетотаксические единицы не формировались.

S Fi выпге указанного скрещивания были также зафиксированы эмбрионы, у которых отсутствовала передняя дорзальнзя покровная эктодерма, но была сформирована вентральная гиподерма. Такие зародыши имели все абдоминальные ряды черных щетинок, которые иногда раздваивались ближе к латеральным сторонам или соединялись в области средневентральной линии мелкими хетами. Эти эмбрионы были гетерозиготными самками, что подтвердили результаты ниже описанного скрещивания:

2 у tiotch-84k35/Basc х (fBasc/Y yNotch-84k35/Basc особи, погабащке в результате доминантного эффекта локуса Hatch, имели пигментированные (темные) хеты на вентральной стороне эмбриона. Гибель гетерозиготных самок оказалась незначительной. У трех описанных мутантов отсутствовала передне-дорзальная гиподерма, но были сформированы все восемь брюшных сегментов. Рисунок хетотаксического паттерна был аналогичен вышеописанному.

Влияние дезы гена Hatch на характер дерматогенной диффе-ренцировки был изучен также у гемизиготных самцов с гетерозиготной структурой по Match (ИоЬсЬ-84к35/ш+У), возникающей в результате транслокации на Y-хромосому участке Х-хромосомы,

- У -

несущего нормальные аллели Notch и white. Такие самцы были получены в Fi следующего скрещивания:

Ç Natch-Q4k35/+ х d'y vP/^Y

Смертность гетерозиготных самцов Notch-84k35/wrY была вше, чем гетерозиготных самок. Было идентифицировано два типа нарушения морфогенеза их покровной эктодермы. Эмбрионы первого типа утрачивали всю нейрогенную эктодерму (как и гетерозиготные самцы), а второго типа - только передне-дорзаль-ную эктодерму (как гетерозиготные сажи). У эмбрионов П-го типа были сформированы все абдоминальные ряды кет и лить у отдельные: эмбрионов отсутствовала половина сегментарного ряда, либо его внутренние части.

Исследование характера нарушений дифференцировки покровной эктодермы у эмбрионов женского пола, гомозиготных по Notch, было проведено у особей F± следующего скрещивания:

Ç у Motch-84k35/+ х сГ+ i!atch-8-ik35/w~Y Так как гетерозиготные самки (+Natch-B4k35/+), погибают достаточно редко, всех погибающих эмбрионов квалифицировали как гомозиготных самск.

Хетотаксический паттерн 601 всех эмбрионов соответствовал паттерну гешзиготных самцов (нейрогенная эктодерма полностью утрачивалась). F 25% погибших эмбрионов сохранялась вентральная гиподерма и отсутствовала головная покровная эктодерма, а у 10% - сохранялась вся гиподерма. В обоих случаях конденсации зародышевой полоски не происходило. У таких гомозигот были представлены 8 брюшных рядов щетинок и лишь иногда встречались мутанты с нарушениями хетотакоичеокого паттерна, характерными для гемизиготкых самцов.

2.2. Дифференцировка покровной эктодермы у мозаичшдг эмбрионов. Эмбрионы-мозаики (ХХ/ХО) были получены в следующем скрещивании:

ç Uotch-S4k35/+ к cf R(l)21w,c/yrY

ДифференциссЕку покровной эктодермы анализировали у погибающих в Fi эмбрионов-мозаикюв, развивающихся из зигот генотипи-ческой структуры }ЫсЬ-84к35/Я(1)2/,г'°, несущих коль деву® нестабильную Х-хромоссму. Контрольные эмбрионы были получены в скрещивании:

Ç Oregon R0 х cfR(l)2)rc/y+Y

Ввиду невозможности идентифицировать XX и ХО клетки проводили другое скрещивание, в котором КО клетки имели маркер yellow:

Ç +/у Notch-84k35 х <f R(î)2, w"'c/y+Y В качестве дополнительного контроля использовали y/R(l)2tw4^ эмбрионов, полученных в Fi скрещивания:

- 10 -

9 */у х О" R(l)2,wvc/y+Y

В проведенных контрольных скрещиваниях не были обнаружены эмбрионы с мозаичным распределением темных и желтых кет. Все эмбрионы имели либо темные, либо желтые щетинки, но при этом у одних мозаикоЕ утрачивались целые ряды щетинок или их участки; у других происходило соединение отдельных сегментов мелкими хеташ или их расширение. У 1/4 всех мозаиков вентральная зародышевая полоска не была сконденсирована и три последних брюшных сегмента оказывались на дорзальной стороне эмбриона. Часть эмбрионов при этом утрачивала головную дор-залькую гиподерму.

Для мозаичных по гену Notch-84k35 эмбрионов была характерна утрата или всей нейрогеннои эктодермы или только ее пе-редне-дорзальной области. В последнем случае формировался" однородный кутикуллярный паттерн с пигментированными (темными) или непигментированными (делтши) хетами. Других аномалий хе-тотаксичеокого паттерна, кроме тех, которые были описаны в контроле, не было отмечена.

3. Цито-змбриолагический анализ мутантов Natch-84k35 и Uotrti-Шп

3.1. Эмбриогенез гемизиготкых самцов Notch/Y. Для установления морфогенетической специфики проявления мутантов по локусу Hatch были использованы мутации с разной степенью фе-яотишгаеского проявления (аллели Notch-84k35 и Notch-88ri). Были проанализированы все эмбрионы на 8, 12, 16 и 28-м часу после откладки яиц, погибающие в Ft скрещиваний: о у Notch-84k3B/Basc х сfBasc/Y § Notch-88n/FrrS к <f FoB/Y Общей задачей на первом этапе работы являлось детальное описание характера дифференциации производных трех зародышевых листков у мутантов по каждому из аллелей. Предполагалась, что иополь зование генетических и экспериментальных подходов к анализу развития выбранных мутантов позволит разобраться в сложной системе межклеточных и межзачаткозых взаимодействий.

Паулсон (Paulson, 1940), анализируя эмбриогенез гемизи-готных самцов дрозофилы Df(l)Notch-8, высказал предположение, что первичное шрфогенетическое действие данного локуса состоит в переключении развития всех клеток вентральной и перед-не-дсрзальнсй эктодермы (нейрогенная эктодерма) на нейроген-кый путь развития, что приводит к утрате гиподермы в этой области. Формирование нервной системы у таких эмбрионов тоже нарушается: ее передний отдел представляет собой слившуюся массу надглоточного и подглоточного ганглия, а задний - ги-

пернейрализованный брюшной нервный тяж. Вентральная часть нервной системы при атом конденсируется лишь частично.

Эмбриональный паттерн исследованной нами мутации Notch-84k35 сходен с таковым Df(l)Notch-8, но при этом тлеет ряд характерных особенностей. Деформация головного мозга у гемизигот Hotch-84k35 по сравнению с Df(l)Uotch~8 была менее выражена, а степень нарушения конденсации вентрального нервного тяжа не однородна (рис. 2, тип 1а,б,в). У большинства эмбрионов он был не сконденсирован и его каудальный конец заходил на дорзальную сторону зародыша (16 тип). Незначительное .количество мутантов имело частично сконденсированный брюшной нервный тяж, так что его конец совпадал с задним полюсом яйца (1а тип). Также встречались эмбрионы, у которых вентральный нервный тяж не только не конденсировался, но его задний отдел нарастал на дорзальные складки гиподермы и смыкался с надглоточным ганглием головного мозга (¡в тип). Экспрессивность проявления Natch-88n аллеля отличалась от Notch-84k35: среди эмбрионов преобладала 1а группа нарушений 1-го типа, у которых была наибольшая степень конденсации брюшной части нервной системы, как и у мутантов Df(i)Hotch-8.

Существенным отличием мутаций Notch-84k35 и Notch-88n от Df(l)Uotch-8 является характер нарушения морфогенеза передней и средней кишки. У Hotch-8 мутантов передний и задний рудименты средней кишки инзагинирозалп нормально, но терминальная дифференцировка их нарушалась. Передний и задний рудименты средней кишки у эмбрионов Df(l)Notch-8 не соединялись и не формировался ни знтодермальный, ни мезодермальный слой средней кишки. Для liatch~84k35 и Hotch-B8n эмбрионов отмечалась большая степень дифференцированное?!! клеток средней кишки: были сформированы мышечный и эпителиальный слои. Однако из-за аномального увеличения мптоткческой активности энтодермальньк клеток средней кишки размер больших базофильных меток (одного из трех типов клеток, которые формируют среднюю кишку) уменьшался, а их число возрастало. Это приводило к удлинении средней кишки и мальпигиевых сосудов, что подтверждает предположение Pculson (1950) об их знтодермальком, а не зктодер-мальном (Campos-Ortega and Hartenstein, 1985) происхождении!-!.

Передняя кишка мутантов Df(l)Matchr8 вмела нормально дифферекцировнные зктодермальный и мезодермальный слои клеток, но сохраняла рудиментарный характер строения и представляла собой изогнутую трубку, которая соединялась с передним рудиментом средней кишки и формировала нормально дифференцированный преджелудок (провевтрикулш), внутренняя стенка которого образуется передней кишкой эктодермального происхожде-

I тип

II тип

III тип

ния, а наружная - средней кишкой энтодермального происхождения. У мутантов Notch-84к35 нарушение дифференцировки мышечного слоя передней кишки сопровождалось нарушением формирования преджелудка. У Notch-SSn гемизигот преджелудка тоже не было, однако в редких случаях можно было идентифицировать утоншенный, по сравнению с нормой, ■ слой мышечных волокон. Сопряженность нарушения дифференциации мезодермальных клеток и формирования преджелудка позволила предположить, что а образовании провентрикулюса, ведущую роль играет висцеральная мускулатура передней кишки. Анализ эмбриогенеза компаундов Notch-84k35/Notch-88n подтвердил это предположение, о чем будет сказано ниже.

Нарушение развития соматшесюй^муск^лагуры было сходно у всех трех типов мутантов (lfi, Мезодермальные

клетки приобретали веретенозидную форму, но не сливались и были не способны формировать мкогоядерные мышечные волокна. Однако у эмбрионов Notch-84k35 и Notch-88n мезодермаяьные клетки сохраняли способность к миграции. Первоначально, как и у нормальны;: эмбрионов, они двигались в направлении латеральной гиподермы. Мезодермальные плетки проникали в верхний слой ганглиозных меток разросшегося вентрального нервного тяжа, который отделял их от сегментарных складок покровной эктодермы, но оказывались не способны преодолеть этот барьер и изменяли направление своего движения; они возвращались в просвет между витками кишечника и слоем нервных клеток, а затем поднимались к дорззльным складкам гиподермы - единственному ее участку, свободному от ганглиозных клеток (рис. 3).

Таким образом, анализ развития мутантов Notc/г позволил установить два фактора, определяющих направление миграции ме-зодермальных клеток дрозофилы. Ими являются: в первую очередь - запрограммированное движение клеток мезодермы в направлении латеральных участков зародыша. Однако преграда из ганглиозных клеток делает невозможным их контакт с латеральной покровной эктодермой и приводит к тому, что ведущим в определении направления мезодермадьвых клеток становится их сродства к зкто-дермальным клеткам. В результате вектор их окончательной миграции направлен в сторону дорзальных складок гиподермы.

Сравнительный анализ разных аллелей Wofccft (табл. 1) показал, что наиболее значительные нарушения морфогенеза эктодермы, мезодермы и энтодермы обуславливает Df(l)Notch-8. Для Hotch-84№5 сказалось характерным меньшая степень нарушения нервной системы, что выражалось в появлении трех классов разрастания брюшной нервой цепочки (рис. 2, тип 1а,б,в), из 'которых даже экстремальный тип уступал Dt(l)Nobch-8. На диффе-

Рис. 3. Схема миграции мееодермальных клеток мутантных эмбрионов Notch. А - 12-й ч эмбриогенеза; Б - 16-й ч эмбриогенеза; В - 28-й ч эмбриогенеза; внт - вентральный нервный тяж; м - клетки соматической мезодермы; ск - средняя кишка; эк - эктодерма.

ренциацию энгодермальных производных также в большей степени влияла мутация If, чем м54*35 я Формирование мускулатуры передней кишки наоборот меньше всего нарушалась у мутантов Notch-8, сильнее - у f!otch~88n и вообще не образовывалась у эмбрионов l!otch-34k35,

Табл. 1. Отличия в нарушении развития мутантных эмбрионов Notch

Notch-8 Mtch-84k35 Notch-88n

ГОЛОЕНОЙ МОЗГ ± -

Вентральный нервный тяж + + +

Средняя кишка + - -

Передняя кишка - + +

Мускулатура средней и

задней кишки + - -

Мускулатура передней

кишки - + ±

Преджелудок - + +

Скелетная мускулатура + + +

** + помечены те органы, формирование которых нарушено.

Первые исследования морфогенетических эффектов развития мутации Мо1сй-84к35. было проведено в 1986 году. Оно обнаружило, что наиболее выраженные изменения развития касались покровной эктодермы, клетки которой становились вакуолизирован-кыми к отмирали (Иванов, Сахарова, 1989). Часть зародышей утрачивала способность дифференциально окрашиваться азур-эози-ном, что свидетельствовало о его глубоком некрозе, который был характерен для большей части эмбрионов. Исследование паттерна морфогенетических нарушений данной мутации, возобновленное б 1992 году, позволило оценить изменение ее фенотипа через 6 лет. Полученные нами результаты свидетельствуют об изменении характера ее фенотипкческого проявления. Ни один из описанных нами мутантных зародышей не обнаружил признаки некроза. вентральной эктодермы. Следовательно, некротические аффекты мутации МоЬсЬ-ВЙЗ5 в течение нескольких лет оказались вытесненными явлениями гипернейрализации. Наиболее вероятная причина этого явления состоит в изменении генетической среды, кшораа мсдафщирует проявление мутации, обуславливающее смерть гиподермалъньк клеток. Поскольку отбор среди мутантных гемизиготных эмбрионов вследствие их гибели невозможен, следовательно, он происходит у имагинальных гетерозиготных ооо-

бей. Действие отбора на имаго Notch, сфокусированное на доминантный признак этой мутации, распространяется и на рецессивный эффект ее проявления у летальных особей, по которому отбор происходить не может. Частичная нормализация развития покровной эктодермы у эмбрионов приводит к тому, что стадия их преимущественной гибели сдвигается с 12-ти ч развития к 24-ыу ч. Общий характер данного явления подтверждается наблюдениями, сделанными при изучении температурочувствительных мутаций у D.melanogaster и D. virilis, у которых стадия преимущественной гибели в течение 5 лет сместилась на более поздние сроки развития (Митрофанов и др., 1985).

3.2. Эмбриогенез гемизигогньж самцов о гетерозиготной по локусу Notch структурой. Для анализа морфогенетического характера проявления мутации Notch кроме множественных аллелей были использованы особи, имеющие разнр дозу этого гена. Нам удалось получить гетерозиготных самцов, которыми являлись особи Hotch/wrY. Гемизиготные самцы с гетерозиготной по локусу Notch структурой были получены в Fi следующих скрещиваний: о у No tch-84k35/Basc х <fy w-YwrY 9 Notch-88n/FnB x сfy rWY Поскольку тршслощюваншш на У-хромосому участок Х-хромосо-мы, маркированный геном whiteнесет нормальный аллель тена itofccft ожидалось, что все самцы Notch/wrY будут жизнеспособными. Однако, оказалось, что большая часть их погибает. Гистологическое исследование летальных самцов выявило у них два типа нарушения развития; один из них соответствовал 1-му типу описанного выше нарушения эмбриогенеза гемизиготных особей (рис. 2), а второй - обнаружил принципиальные отличия: проявления мутации в них ограничивалось только головной областью (П-й тип, рис. 2). Развитие вентральной гиподермы и брюшной нервной цепочки у них было интактным, а отсутствие покровной эктодермы в головной области у гетерозиготных самцов Notch-84k35 к Notch-BSn сопровождалось разрастанием поверх дорзальной гиподермы надглоточного ганглия, который достигал последнего сегмента брюшка. У части эмбрионов морфогенез брюшной области отличался от нормы отсутствием конденсации зародышевой полоски. Появление мутантного фенотипа у самцов с гетерозиготной структурой по локусу Wo£c/i (Notch/w+Y), а также взриабильность проявления у них мутации Notch свидетельствует о возникновении эффекта положения (position effect variegation) этого гена, что приводит к мозаичному проявлению гена Notch у гетерозиготных самцов Notch/w+Y. Б результате нарушение развития этих особей вдет аналогично нарушению развития мозаичных зародышей, несущих кольцевую Х-хромосому

(flatch/R(l)2,vivc) (см. 6.2) Это позволяет квалифицировать гетерозиготных сшцое Notch/wrY как новую мозаичную систему.

Появление у самцов Notch/w^Y position effect variegation приводит к "подтеканию" нормального продукта гена Notch и делает возможным изучение особенности генетического контроля эти!,: локусом морфогенеза нервной системы. Появление нормального генопродукта у гетерозиготных самцов по сравнению с ге-мизиготнымп особями обусловливает нормальный морфогенез брюшной области эмбриона. Гипернейрализация, которая у гемизигот имела место только в области брюшной нервной цепочки, у гетерозиготных' самцов смешается з область надглоточного ганглия. Подтверждением того, что увеличение нормального продукта гена Notch приводит к интактному развитию брюшной нервной цепочки, а область нарушения нейрогенеза концентрируется только в головной части эмбриона, служит следующий факт. Нарушение развития двух лётаяьньк гетерозиготных самок Hatch-ввп/РпВ соответствовало 11-му типу (см. также гл.2, где описано нарушение хетотаксического паттерна у гетерозиготных по Notch сток). Два эмбриона, конечно, -не дают полного представления о проявлении этого гена в гетерозиготной структуре, однако свидетельствуют об ослаблении мутантного Фенотипа Notch у гетерозиготных самок по сравнению с гетерозиготными самцами (Notch/w^Y), среди которых были описаны и особи с 1-м типом нарушения эмбриогенеза. Появление среди гетерозиготных самцов и самок эмбрионов со П-м типом нарушения развития указывает на разную ферму генетического контроля локусом Notch нейрогенеза в головной'и в брюшной области зародыша: для нормального формирования брюшной нервной цепочки достаточно одного нормального аллеля Notch, а для головной области - необходимо два. Анализ гетерозиготных по Notch эмбрионов показал, что между гиперкейралиэацией и утратой покровной эктодермы е результате нарушения процессов сегрегации нейроблзстов существует непрямая зависимость, так у гемизи-готных особей, в отличии от гетерозиготных самцов, отсутствие покровной эктодермы головной области не сопровождается гипер-нейрализацией головного мозга.

3.3. Эмбриональное развитие самок, гомозиготных по Notch и компаундов /Я4К'-"0//Г'::'п. Гомозиготные эмбрионы были получены в Fi скрещивания:

о У Notch-84k35/Basc к cf+ Notch-84k35/^Y 9 Notch-88n/Fm6 к о* Notch-88n/w+Y

Компаунды:

9 у Notch-84k35/+ к сГ+ Notch-88n/wrY

("в Fi этих скрещиваний погибала также часть самцов Notch/w+Y).

Анализ эмбриогенеза гомозиготных по Notch особей позволил выявить у них те же фенотипические группы 1-го типа, которые описании у гемизиготных самцов (рис. 2). Среди них преобладали особи с экстремальны},! типом нервной системы, при котором каудальный конец вентральной части нервной системы разрастался на дорзальные складки гиподермы и смыкался с надглоточным ганглием головного мезга. Офано у них были описаны еще 2 типа нарушений: один из них (П-й тип) был подобен нарушению развития гетерозигот и включал эмбрионов с гипертрофией надглоточного ганглия и утратой только головной эктодермы, а другой (II 1-й тип) встречался исключительно среди гомозиготных по Match особей. Они отличались от нормы только нарушением конденсации зародышевой полоски. 'Увеличение частоты экстремального типа (тип 1в, рис. 2) нарушения в гомозиготной структуре локуса Notch свидетельствует об усилении мутационных эффектов, а появление 11-го и 111-го типа - о многообразии его проявления. Ослабление эффекта мутации Notch в последнем случае, по-видимому, отражает более сложную' регуляцию активности данного локуса у самок, чем у самцов, вследствие эффектов компенсации дозы и межзллельных взаимодействий. В пользу последнего предположения говорит анализ компаундов Notch-84k35/Natch-88n, у которых имеет место ослабление эффектов каждого из .аллелей. Для них был характерено умеренное проявление нарушения нейрогенеза 1-го типа, наличие мускулатуры передней кишки и ее скакание со средней кишкой и образование преджелудка. Формирование последнего подтверждает высказанное нами предположение о ведущей роли висцеральной мезодермы в морфогенезе прозентрикулюса. Поскольку мезодерма выполняет роль каркаса в формировании средней кишки (знтодер-малькая производная) (Tepass and Hartenstein, 1994), можно распространить это заключение также на характер взаимоотношений между мезодермой и эктодермой.

Сравнение дифференциации эктодермы, мезодермы и энтодермы у генотигогеески различных структур локуса Notch позволил выявить положительную корреляцию между развитием производных энтодермы, мезодермы и вентральной эктодермы. То есть формирование кишечника и соматической мускулатуры нарушалось только у тех эмбрионов, у которых была нарушена сегрегация ней-роблаотов в области вентральной зародышевой полоски (то есть только у эмбрионов 1-го типа, рис. 2).

3.4. Влияние температуры на фекотипическое проявление мутанткых зллелвй Hotch-S4k35 и Natch-88n. Анализ развития гемизиготных по Notch аллелю самцов при 17°С и 29°С показал, что изменение температуры не влияет на эмбриогенез мутантов.

- 19 -

Табл. 2. __

Родители Генотип летальных эмбрионов (Рх) Количество особей о данным типом нарушения Общее кол-во особей

I II III

9 уН-84/Ва$с сГВаяс/У Н-84/У 131 131

9 уЫ-84/Ва$с сг к 50% 5 50% - 10

9 уН-84/Ваяс сГ +Ц-34/к+У УИ-84/+Ы-84 уП-Ш^У 70 781 13 14% Г» 90

9 уИ-М/Ваяс сГ+Н-ВЗ/я^У уН-84/+И-88 уН-в&^У яя т 4 101 — 37

9 и-88/Ргг£ б1 РГ(б/У Ы-88/У 117 99,2% 1 0,8% - ■118

9 и-88/Рт6 сРуэР/^У -¡О"' - 0

9 Н-88/Рт6 & Н-88/'ГУ Ы-88/Ы-88 я-ва/^у 26 0 О"/ <С П7/ 1 /л ?Я

Все ЫаЬс11-84к35 эмбрионы при обеих температурах имели только 1-й тип нарушения. Мутанты по ШЬск-ВВп при 17°С и 29°С также развивались по 1-му типу. Кроме того, при 29°0, таете как и при 25°С, была зафиксирована одна гетерозиготная по НоЪсЬ-88а самка, проявлявшая П-й тип нарушения развития.

4. Эмбриональное развитие мозаичных (ХХ/ХО) эмбрионов

4.1. Мозаичный паттерн эмбрионов контрольной группы. У

отдельных эмбрионов в Р<! контрольного скрещивания:

9 Огеёоп НС к (ГН(1)2,г'сЛ не формировалась покровная эктодерма головной области, а в передней части яйца наблюдаюсь скопление погибших, по-видимому, нуллисомных ядер и желтка. Единственным механизмом появления нуллисомной массы и нарушения формирования гиподермы нам представляется хромосомные аберации, возникающие в результате митотического спаривания гомологов и их последующей гибели, возможность которой показана в работах Э. А. Абелевой и Е. Н. Мяснянкиной (1976).

Все яйца, в которых были обнаружены погибшие ядра, можно разделить на 3 группы. Первую группу составили те, в которых погибало менее 30% ядер дробления. Е процессе эмбриогенеза они перемещались с переднего полюса яйца на дорзальную сторону и погружались вместе о желтком внутрь эмбриона. В результате формировался нормальный эмбрион, занимавший весь объем

яйца.

В яйцах второй группы погибало около 30-40% ядер дробления. Они также перемещались на дорзалъную сторону, но при этом лишь небольшая их часть была способна погрузиться в желток, остальные ядра располагались между развивающимся эмбрионом и вителлиновой оболочкой. Эти ядра представляли собой инертную массу, не способную участвовать в дальнейшем развитии. В таких яйцах формировался зародыш с нормальным паттерном органной дифференцировки, но деформированный в местах локализации погибших ядер или с утратой головной покровной эктодермы.

В третью группу вошли яйца, в которых гибло половина ядер дробления. Эти ядра были, не способны к миграции и перемещению в желток и были сосредоточены в передней половине яйца. В задней половине яйца формировался эмбрион, который имел нормально дифференцированные производные трех зародышевых листков, исключая головную гиподерму, которая не формировалась. Эти данные свидетельствуют о высокой регуляционной способности яиц дрозофилы и позволяет отнести закономерности генетического контроля метамерии, выявленные на личиночном паттерне (Lewis, 1978), исключительно к производным эктодермы.

4.2. Развитие эмбрионов, мозаичных по Natch-84k35. Мова-иков по Notch получали в следующем скрещиванииг

9 у Natch-84k35/Basc к сfR(l)2,wvc/y+Y Анализировали всех эмбрионов Fi, невылупившихся из яиц. Часть эмбрионов развивались идентично описанному ранее развитию ге-мизигот по Notch (I тип). Вторая группа включала зародышей, у которых отсутствовала вся передняя гиподерма или ее дорзаль-ный участок (II тип, рис. 2). Надглоточный ганглий при этом разрастался вдоль дорзальной стороны до каудального конца. Утрата головной гиподермы отмечалась и в контроле (см. гл. 6.1), поэтому могла быть связана с клеточкой гибелью. Поскольку мутации локуса Notch вызывает увеличение времени пролиферации клеток (Hartley et ai, 1987; Markopoulou et ai, 1989; Johanseri et al, 1989; Kidd et al, 1989; Fehon et ai, 1991), то разрастание надглоточного ганглия головного мозга у эмбрионов-мозаиков по Notch-84k35 происходит в результате действия мутации.

В опыте среди генотиптескп мозаичных особей не было обнаружена эмбрионов, проявляющих явный мозаицизм хетотаксичес-кого паттерна или нервной системы. Это можно объяснить тем, что формирование нервной системы дрозофилы происходит в результате сегрегации отдельных нейробластов из единого пласта клеток эктодермы. Это приводит, по-видимому, к возникновению

мозаиков с небольшими участками маркированных тканей, которых нашими метода® визуализировать не удается.

Появление в опыте эмбрионов со П-м типом нарушения, то есть с утратой головной гиподермы и гипертрофией надглоточного ганглия, могло быть объяснено только потерей в части клеток кольцевой Х-хрсмооомы. Невидимому, ХО-ядра стали родоно-чальниками ядер клеток передней половины эмбриона, из которых развился аномальный головной мозг. Возникновение таких зародышей оказывается возможным благодаря тому, что ядра КО мигрируют преимущественно в направлении переднего полиса яйца, а XX - заднего (Иванов, 1991).. Формирование такого фенотипа, обнаруженного у гемизиготных самцов с гетерозиготной структурой по Notch, подтверждает наличие position effect variegation у последних.

5. Культивирование мутактьта эмбрионов in vivo

Ka 10-14-е сутки после трансплантации у контрольных и мутантных эмбрионов происходил значительный некроз нервной и мышечной ткани. Кнтактные ганглиозные клетки сохранялись в головном мозге как у нормальных, так и у мутантных эмбрионов. Причем у мутантов такие области встречались чаще и они имели больший размер. Клетки кишечника подвергались некрозу в меньшей степени, а обшая длина пищеварительного тракта личинки превышала размер пищевого тракта нормальной личинки. Размер мальпигиевых сосудов также был увеличен.

Цитология извлеченных из мух нормальных гмбрпенов показала интактный характер дифференцировки имагинальных- клеток, тогда как в мутантных эмбрионах имагинальные клетки формировали микроскопически легко визуализируемые конгломераты, способные к росту, но не способные к дифференциревке. Это свидетельствует о нормальной сегрегации у мутантов Natch-84k35 имагинальных и личиночных клеток на ранних стадиях развития и нарушении их дифференцировки на более поздних этапах, то есть з гемизиготном состоянии ген Natch нарушает дифференциацию всего пула имагинальных клеток.

ВЫВОДЫ

1) Выявлено три типа эмбрионального паттерна у летальных мутантов Notch: у зародышей первого типа нарушалась конденсация зародышевой полоски, второго типа - дифференциация головной эктодермы, третьего типа - дифференциация производных всех зародышевых листков.

2) Анализ развития гемизиготных и гетерозиготных эмбрионов Notch мужского пола, а также гомозиготных зародышей женского пола позволило установить дифференциальную регуляцию геном Notch нейрогенеза головной и брюшной области: нормальный морфогенез головного отдела возможен только при наличии двух доз гена, тогда как онтогенез брюшной нервной цепочки возможен при наличии едкого нормального аллеля.

3) Выявлена положительная корреляция между дифференци-ровкой вентральной эктодермы и дифференцировкой мезодермы и энтодермы.

4) Иссследование развития Notch мутантов позволило установить, что вектор миграции мезодермальных клеток определен запрограммированностью их движения в направлении латеральной гиподермы, а также их сродством к кяетам покровной эктодермы.

5) Показано, что в формировании преджелудка ведущую роль играет висцеральная мускулатура передней кишки.

6) Выявлен position effect variation у самцов Uatch/%TY, который позволяет использовать их как новую мозаичную систему.

7) Исследование дифференциации проспективно имагинальных клеток у мутантов Notch-84k35 установило, что нарушение их развития происходит на постэмбриональных стадиях, что свидетельствует об интактном характере их сегрегации от личиночных г-леток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Иванов А.И., Фролова И,П., Захаров И.К., Корочкин Л.И. Анализ нарушений развития мозга у нового Notch мутанта Иго-sophila mlmaeasterZ/JSpvuism Академии Наук. 1993. Т. 331. N 6. С. 775-780.

2. Фролова И.П. Исследование межклеточных взаимодействий в онтогенезе мутантных особей Notch-84k35 Drosophila melano-gaster//Онтогенез. 1994. Т. 25. К 3. С. 5-11.

3. Фролова И.П. Исследование характера морфогенетических нарушений у мутантов по новому аллелю гена Noteh-84k35//Тезисы докл. I съезда ВОГИО. Генетика. 1994. Т. 30, прил. С. 168.