Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное моделирование взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами на примере формиатдегидрогеназы и поли(ADP-рибозо)-полимеразы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами на примере формиатдегидрогеназы и поли(ADP-рибозо)-полимеразы"

На правах рукописи /7 __

/

Нилов Дмитрий Константинович

Молекулярное моделирование взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами на примере формиатдегидрогеназы и поли(АБР-рибозо)-полимеразы

03.01.04 биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва 2011

4846473

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н, Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Швядас В.К.

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Ямсков И.А. д.ф.-м.н., профессор Шайтан К.В.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «31» мая 2011 г. в 15— часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «29» апреля 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

/

Общая характеристика работы

Термин «молекулярное моделирование» является общим названием для теоретических и вычислительных методов химии, биологии и наук о материалах, направленных на воспроизведение, симуляцию поведения молекул. Молекулярное моделирование упрощает изучение системы, описывая ее на атомном уровне с использованием законов классической физики. Такой подход дает возможность симулировать поведение систем, включающих тысячи атомов, и широко используется для изучения биологических макромолекул. Настоящая работа сфокусирована на применении методов молекулярного моделирования в биокатализе для изучения взаимодействий фермента с низкомолекулярными веществами - субстратами и ингибиторами. Рассматривается стохастический метод молекулярного докинга, обеспечивающий быстрый поиск возможных статичных конформаций субстрата или ингибитора в активном центре, и метод молекулярной динамики, позволяющий проследить эволюцию фермент-субстратного или фермент-ингибиторного комплекса во времени. В качестве объектов исследования были выбраны важные с точки зрения фундаментальной энзимологии ферменты формиатдегидрогеназа (ФДГ) и поли(АОР-рибозо)-полимераза (ПАРП).

Актуальность проблемы. ФДГ представляет собой удобный объект для изучения механизма переноса гидрид-иона в активном центре КАО+-зависимых дегадрогеназ методами вычислительной химии. Фермент используется также на практике для регенерации коферментов в процессах ферментативного синтеза оптически активных соединений. Разработка эффективных катализаторов для восстановления коферментов на основе ФДГ по-прежнему актуальна. Биологическая роль ПАРП человека заключается в репарации ДНК, регуляции концентрации КАО+ и активации генов, ответственных за воспалительную реакцию. Фармакологическое ингибирование ПАРП может повышать эффективность действия противоопухолевых препаратов, препятствовать клеточному некрозу и подавлять различные воспалительные процессы. На данный момент известен ряд ингибиторов ПАРП, однако их фармакокинетические и токсичные свойства недостаточно изучены.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось использование методов молекулярного моделирования, а именно молекулярного докинга, классической молекулярной динамики, управляемой молекулярной динамики и гибридной квантово-механической/молекулярно-механической молекулярной динамики, для решения следующих задач:

1) изучения механизма образования фермент-субстратного комплекса ФДГ;

2) разработки процедуры поиска новых ингибиторов ПАРП.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате моделирования уточнен механизм образовании фермент-субстратного комплекса ФДГ с участием отдельных остатков активного центра. Впервые охарактеризовано связывание субстрата в активном центре открытой конформации ФДГ; описан механизм транспорта субстрата в активный центр ФДГ через субстратный канал. Разработана методика скрининга новых ингибиторов ПАРП с использованием

построенной модели фермента; для экспериментальной проверки активности рекомендован ряд потенциальных ингибиторов из компьютерной библиотеки соединений.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях: «Biocatalysis in Non-Conventional Media» (2008), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (2010), «Ломоносов» (2008,2010, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, 5 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 91 ссылку. Работа изложена на 96 страницах текста, содержит 14 таблиц и 40 рисунков.

Основные результаты работы Связывание субстрата в открытой и закрытой конформации ФДГ

КАО+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ; К.Ф. 1.2.1.2) катализируют окисление формиата до углекислого газа, сопровождающееся восстановлением NAD+. ФДГ существует в двух конформационных состояниях: в открытой конформации происходит связывание кофермента и субстрата, после чего фермент переходит в каталитически активную закрытую конформацию (в результате междоменного поворота на 7,5° происходит закрывание междоменной щели). Для изучения связывания субстрата в активном центре ФДГ были построены молекулярно-динамические модели открытой и закрытой конформации на основе PDB структур 2пас (апоформа) и 2nad (тройной комплекс с коферментом и ингибитором), соответственно. Для расчетов использовали пакеты программ AmberTools и Amber. Моделирование показало, что в открытой конформации ФДГ происходят интенсивные междоменные флуктуации, в то время как закрытая конформация является жесткой. По-видимому, междоменная жесткость является важным условием катализа ФДГ, т.к. в свою очередь определяет жесткость участка связывания NAD+ и активного центра, включающего остатки из различных доменов. В модели закрытой конформации субстрат образовывал стабильные водородные связи с остатками Arg284, Asnl46 и lie 122 (рисунок la), аналогично конкурентному ингибитору (ион азида) в структуре 2nad. В открытой конформации фермента субстрат был изначально смоделирован в позиции, предполагающей взаимодействие с вышеперечисленными остатками, однако при уравновешивании системы водородные связи с Asnl46 и Не 122 были утрачены, и молекула формиата образовала устойчивое вилочковое взаимодействие с гуанидиновой группой Arg284 (рисунок 16). Неблагоприятное связывание субстрата одновременно с Arg284 и кластером Asnl46-Ilel22 можно объяснить тем, что в открытой конформации остатки активного центра отдалены друг от друга (расстояния Arg284:CZ-Asnl46:ND2 и Arg284:CZ--IIel22:N в структуре 2nad составляют 8,43 и 6,56 А, в структуре 2пас - 10,12 и 8,82 А). В ходе

симуляции среднее расстояние между С4м-атомом кофермента и С-атомом формиата составило 3,38 А в модели закрытой конформации и 4,26 А в открытой конформации, т.е. разница составляет около ангстрема. Повышенные флуктуации молекулы формиата, удаление от атакуемого С4м-атома и альтернативная ориентация делают невозможным перенос гидрид-иона, поэтому связывание субстрата в открытой конформации ФДГ является непродуктивным.

а

б Asn146

•У

Ile122

Рисунок 1. Связывание субстрата в активном центре закрытой (а) и открытой (б) конформации ФДГ. Данные получены в результате молекулярно-динамических симуляций.

Для геометрической характеристики комплекса Михаэлиса в закрытой конформации ФДГ при молекулярном моделировании использовали следующие параметры: средние межатомные расстояния в активном центре, а также заселенность реакционноспособной конформации субстрата.

Реакционноспособным считали расположение субстрата, подходящее для каталитического превращения, когда реагирующие атомы находятся в Ван-дер-Ваальсовом контакте, и при этом не требуется каких-либо дополнительных конформационных подстроек. В случае ФДГ реакционноспособная конформация характеризовалась расстоянием C4N—H < 3,0 А и углом атаки C4N—H—C02 в пределах от 132° до 180°. Для более точного моделирования взаимодействия реагирующих атомов использовали гибридный подход: атомы субстрата и

Asn146

Ие122

Arg284

Arg284

кофермента описывали квантово-механически, белок и растворитель -молекулярно-механически. В таблице 1 представлены результаты моделирования активного центра ФДГ при использовании различных полуэмпирических гамильтонианов - AMI, РМЗ и RM1 - для описания квантово-механической области. Все выбранные методы моделирования дают схожие значения длин водородных связей с остатками активного центра Arg284, Asnl46 и 11е122, а также возникающей время от времени водородной связи с His332. Заселенность реакционноспособной конформации составляет 52% с гамильтонианом AMI, 75% - с РМЗ и 70% - с RM1, т.е. молекулы субстрата и кофермента находятся во взаимном расположении, подходящем для переноса гидрид-иона, большую часть времени.

Таблица 1. Дистанционные (А) и угловые (градусы) характеристики комплекса Михаэлиса ФДГ, полученные гибридным методом моделирования при использовании различных гамильтонианов (AMI, РМЗ и RM1). Средние значения приведены вместе со стандартным отклонением.

AMI/MM РМЗ/ММ RM1/MM

01- •НН12 Arg284 1,85 ± 0,13 1,92 ±0,13 1,84 ±0,12

01" •НН22 Arg284 2,12 ±0,28 2,22 ± 0,29 2,30 ± 0,34

02- ■HD21 Asnl46 2,03 ±0,21 2,10 ±0,22 2,02 ±0,21

02- •Н lie 122 1,90 ±0,13 1,95 ±0,14 1,95 ±0,15

01 •• •НЕ2 His332 2,90 ± 0,33 2,86 ± 0,33 2,74 ± 0,33

C4N' -Н 2,66 ±0,37 2,58 ± 0,30 2,59 ± 0,32

С4К •Н"С02" 131,88 ± 23,19 144,09 ±20,24 140,36 ±21,76

Механизм транспорта через субстратный канал ФДГ

Субстрат может проникать из раствора в активный центр ФДГ двумя путями: либо через участок связывания КАБ+, либо через субстратный канал. Благодаря наличию субстратного канала, связывание субстрата и кофермента у прокариотических ФДГ происходит неупорядоченным образом. В то время как участок связывания КАБ+ представляет собой широкий карман на поверхности белка, субстратный канал весьма узок, что может в определенной степени препятствовать свободной диффузии формиата. Для выяснения механизма функционирования канала было проведено моделирование транспорта формиата в активный центр ФДГ в открытом и закрытом конформационных состояниях фермента. Моделирование транспорта начинали с точки, когда молекула формиата находилась у входа в субстратный канал в области остатка 1^286. Затем, методом управляемой молекулярной динамики формиат втягивали в активный центр фермента. Исследование показало, что в открытой конформации ФДГ доставка

формиата происходит без заметных затруднений (работа, затрачиваемая на транспорт, составляет 5 ккал/моль), однако в закрытой конформации транспорт практически невозможен (работа составляет 58 ккал/моль).

Последовательные стадии доставки субстрата в открытой конформации ФДГ, выявленные в результате моделирования изображены на рисунке 2. При приближении формиата ко входу в субстратный канал в результате диффузии и электростатического притяжения к Ьуэ286, остаток А^284 разворачивается в сторону формиата (при этом плоскость гуанидиновой группы совершает поворот на 180°) и в дальнейшем захватывает его из раствора (рисунок 26). Затем А^284 изменяет конформацию и передвигает формиат к аминогруппе бокового радикала С1п313, взаимодействие с которым обеспечивает связывание субстрата внутри канала (рисунок 2в). После этого А^284 возвращается в исходное положение и переносит формиат в глубину активного центра, что приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, способного к последующим каталитическим превращениям (рисунок 2г). Таким образом, конформационная подвижность остатка А^284 обеспечивает захватывание формиата из раствора, последующий его транспорт в активный центр через субстратный канал и образование комплекса Михаэлиса в катализе ФДГ. Электростатическое взаимодействие А^284 с формиатом сохраняется на всей траектории движения, что освобождает транспорт полярной молекулы от необходимости образования и разрыва дополнительных связей. Важность А^284 в функционировании ФДГ подтверждается абсолютной консервативностью этого остатка в семействе ЫАО+-зависимых ФДГ и полной потерей активности фермента при точечной мутации остатка.

Как показало моделирование, субстратный канал заблокирован для транспорта формиата в закрытой конформации ФДГ. Этот факт согласуется с рентгеноструктурными данными: если обратиться к структурам 2пас и 2пас1, можно отметить, что в закрытой конформации фермента канал значительно сужен, что должно затруднять транспорт молекул. Однако наиболее значимым фактором блокировки канала представляется ограничение подвижности остатка А^284, вызванное сужением междоменной щели и образованием водородных связей между гуанидиновой группой и остовами остатков Ие122 и 01у 123. Об этом свидетельствуют значения среднего температурного фактора, являющегося мерой подвижности атомов: в структуре 2пас температурный фактор для боковой цепи Aтg2%A составляет 44,04 А , в структуре 2пас1 - 8,04 А2. Функциональное значение блокировки субстратного канала по-видимому заключается в изоляции активного центра от растворителя и предотвращении диссоциации субстрата, поскольку молекула формиата слабо связывается в активном центре (Кт == 15 мМ). Логично предположить, что для перехода ФДГ в закрытую конформацию необходимо связать как кофермент, так и субстрат. В противном случае могла бы существовать закрытая конформация комплекса фермент-кофермент, не способная связать субстрат из-за блокировки субстратного канала. Такая тупиковая конформация приводила бы к уменьшению эффективности работы фермента. Действительно, эксперименты по малому угловому рассеянию показали, что апоформа двойного комплекса ФДГ-МАО+ существует в открытой конформации, в отличие от тройного комплекса ФДГ-КАЕ)+-азид, который имеет более компактную форму.

сайт кофермента

Агд284

Рисунок 2. Кадры молекулярного моделирования механизма транспорта формиата через субстратный канал ФДГ. (а) Связывание с остатком 1^286 у входа в субстратный канал, (б) Захват субстрата остатком Аг§284 на входе в субстратный канал, (в) Связывание с остатками Ащ2М и ЯпЗВ внутри субстратного канала, (г) Доставка субстрата в активный центр.

Механизм образования фермент-субстратного комплекса ФДГ

Результаты работы, в совокупности с существующими экспериментальными данными, позволяют получить наиболее полное представление об образовании фермент-субстратного комплекса ФДГ. Фермент существует в двух конформациях: в гибкой открытой конформации происходит связывание кофермента и субстрата, в жесткой закрытой конформации обеспечивается их реакционноспособное расположение. Молекула субстрата проникает в активный центр открытой конформации ФДГ либо диффундируя через участок связывания NADf (если кофермент еще не связался), либо проникая через субстратный канал при помощи остатка А^284. После связывания кофермента и субстрата происходит переход в закрытую конформацию путем изменения взаимного расположения доменов. При этом блокируется субстратный канал, структура активного центра компактизуется и становится более жесткой, молекула формиата в активном центре необходимым образом ориентируется по отношению к коферменту и образуется реакционноспособный комплекс Михаэлиса. Ориентация субстрата, необходимая для переноса гидрид-иона, обеспечивается водородными связями с остатками

активного центра Arg284, Asnl46 и lie 122; большую часть времени субстрат и кофермент находятся в реакционноспособной конформации. Остаток Arg284 играет первостепенную роль в функционировании ФДГ, т.к. вносит наибольший вклад в энергию связывания субстрата, образуя солевой мостик с формиатом, а также обеспечивает пропускную способность субстратного канала.

Поиск ингибиторов ПАРП

Поли(АОР-рибозо)полимераза (ПАРП; К.Ф. 2.4.2.30) является эукариотическим белком репарации ДНК. После активации ПАРП в результате связывания с разрывом цепи ДНК, происходит автомодификация и модификация других ядерных белков посредством присоединения ADP-рибозы с дальнейшим наращиванием полимера. ПАРП является перспективной терапевтической мишенью в онкологии, поскольку функционирование системы репарации может обуславливать устойчивость раковых клеток к химио- и радиотерапии. В настоящей работе методы молекулярного моделирования были использованы для поиска новых высокоспецифичных ингибиторов ПАРП. Модели фермента были построены на основе PDB структуры lefy с использованием программного обеспечения AmberTools, Amber и Lead-Finder.

Рисунок 3. Модель комплекса ПАРП с NAD+ и фрагментом поли(ADP-рибозы). Молекула NAD' в глубине связывающего кармана раскрашена по атомам, фрагмент полимера, состоящий из двух звеньев, показан черным цветом.

поли(А1

Прежде всего, для идентификации участков связывания был сконструирован фермент-субстратный комплекс ПАРП с NAD+ и фрагментом синтезируемого полимера (рисунок 3). Моделирование показало, что цепь поли(АБР-рибозы) располагается на белковой поверхности ПАРП, в то время как молекула NAD+ связывается в глубоком кармане на стыке доменов. При поиске ингибиторов ПАРП целесообразно включить упомянутый карман в область проведения молекулярного докинга. Затем тестирование используемой нами методологии поиска было проведено на 10 ингибиторах с установленной кристаллографической структурой комплекса с ПАРП. При моделировании фермент-ингибиторных комплексов эффективность молекулярного докинга характеризовали двумя составляющими: корректностью найденной позиции лиганда (т.е. визуальным сходством с позицией в кристаллографическом комплексе) и точностью предсказания энергии связывания. Все описанные в литературе ингибиторы были корректно локированы, рассчитанные константы ингибирования хорошо согласовались экспериментальными (рисунок 4).

Скрининг коммерческой библиотеки

Поиск потенциальных ингибиторов ПАРП был предпринят в коммерческой библиотеке «случайных» химических соединений (более 300 ООО). По результатам компьютерного скрининга, 22 соединения с наиболее высокой расчетной энергией связывания с ПАРП были рекомендованы для экспериментальной проверки in vitro. Влияние отобранных соединений на ферментативную активность ПАРП было охарактеризовано сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, в таблице 2 представлены результаты анализа. В тех случаях, когда по причине ограниченной растворимости соединения значение 1С50 измерить не удавалось, оценивалась остаточная активность ПАРП при концентрации соединения 500 мкМ.

Рисунок 4. Пример моделирования

позиции ингибитора методом докинга. Серым цветом показана референсная позиция, взятая из кристаллографической структуры 1ик0. Также изображены остатки активного центра 01у863 и Бег904. Рассчитанное при моделировании значение К, для данного ингибитора составляет 0,026 мкМ, экспериментальное значение ГС50 составляет 0,014 мкМ.

Таблица 2. Ингибирующая активность соединений, отобранных путем компьютерного скрининга в качестве ингибиторов ПАРП. Серым цветом отмечены соединения, удовлетворяющие структурному критерию.

ID ^dock IC5ocalc, мкМ 1С50СХР, мкМ Остат. акт-ть

STK056130 1,0 3,91 1,0

STK031481 0,95 114,68 2,0

STK265022 1,0 62,09 2,6

STK059438 1,0 0,18 10,0

STK041437 1,0 0,08 380

STK032245 0,9 476,51 500

STK217773 1,0 21,61 500

STK217808 1,0 35,76 500

STK165584 0,95 3,74 1300

STK177681 - 0,44 77%

STK201275 - 0,53 79%

STK279722 - 1,94 81%

STK201554 0,25 133,1 85%

STK071083 - 513,07 87%

STK202130 - 0,18 94%

STK215634 - 1,77 95%

STK216443 1,0 0,35 95%

STK022727 0,1 0,61 98%

STK161324 1,0 0,16 99%

STK073085 - 0,72 113%

STK112669 0,95 0,91 125%

STK201163 1,0 0,64 129%

Экспериментальная проверка ингибиторных свойств 22 соединений, отобранных при компьютерном скрининге, показала, что 9 из них ингибируют реакцию поли(АОР-рибозил)ирования. Наилучшее совпадение расчетных и экспериментальных характеристик получено для двух соединений: STK056130 и STK032245 (отношение экспериментально полученного 1С50 к расчетному соответственно 3,9 и 0,95). Лучшими ингибиторами оказались соединения STK056130, STK031481 и STK265022 (1С50 = 1,0, 2,0 и 2,6 мкМ, соответственно), молекулы которых содержат бициклический фталазиновый фрагмент. Этот фрагмент входит в состав соединений-кандидатов в лекарственные препараты, которые либо проходят испытания in vitro и in vivo, либо уже включены в клинические испытания.

и

Следует заметить, что предсказание 13 соединений как потенциальных ингибиторов ПАРП оказалось ошибочным: программа докинга дала завышенное значение энергии связывания. С целью повысить эффективность прогнозирования т бШсо мы ввели дополнительную стадию скрининга - структурную фильтрацию результатов молекулярного докинга. Данная методика позволяет отсеивать ложноположительные результаты моделирования. Анализ доступных кристаллографических структур ПАРП показывает, что для эффективных ингибиторов характерно образование водородных связей между лактамной группой фармакофора и остатком С1у863 ПАРП (рисунок 5). Поэтому при структурной фильтрации наличие консервативных водородных связей с 01у863 использовалось в качестве критерия корректности моделирования комплексов фермент-ингибитор. Для каждого из 22 лигандов провели 20 запусков докинга, при этом вероятность успешного локирования Рйоск определяли как отношение числа запусков с успешным результатом (удовлетворяющим структурному критерию) к общему числу запусков, т.е. Р,_\Жк — Луи/20. При использовании структурного фильтра исключали соединения с Рбоск < 0,25, что позволило отсеять 9 из 13 ложно предсказанных ингибиторов, и таким образом увеличить точность предсказания.

Рисунок 5. Схематическое изображение консервативных водородных связей между фармакофором высокоспецифичных ингибиторов ПАРП и остатком С1у863 активного центра ПАРП.

Скрининг специализированной библиотеки

Скрининг коммерческой библиотеки «случайных» соединений не выявил принципиально новых ингибиторов ПАРП, однако позволил разработать методологию более эффективного поиска ингибиторов фермента. Для дальнейшего исследования была создана специализированная т яШсо библиотека оригинальных производных амидов, включающая 162 соединения с учетом возможности их препаративного синтеза. Все соединения содержали амидную или лактамную группу - важнейший структурный фрагмент высокоспецифичных ингибиторов ПАРП, установленный на предыдущем этапе исследований. Компьютерный скрининг специализированной библиотеки включал докинг каждого соединения в активный центр созданной модели ПАРП по разработанной методике. Структурная фильтрация позволила сразу отсеять более половины (а именно 92 из 162) соединений. Среди оставшихся соединений после оценки энергии связывания и

ориентации ингибитора в активном центре фермента был отобран ряд потенциальных ингибиторов ПАРП, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки активности (таблица 3, рисунок 6). Расчетное значение констант ингибирования отобранных соединений достигает 0,07 мкМ.

Таблица 3. Соединения, отобранные в результате компьютерного скрининга специализированной библиотеки производных амидов.

ГО Т^оск ДСТ1', т^Ыс ГО ^ёоск дс*", 1^ са1с

лиганда ккал/моль мкМ лиганда ккал/моль мкМ

1002 ".л 11,97 Ь015 ■|.и 0,50

ьооз 0.7 -6,4 23,31 Ь016 0.95 -8.8 0,43

1Л04 0.95 -7.2 6,14 1X117 1.0 -9.4 0,07

Ь005 0.95 -6.7 14,14 Ю18 1.0 -N.4 0,83

Ш6 0,9 -7.1 7,26 1.020 0.95 -9.3 0,19

Ь007 1,0 -6,6 16,7 Ю21 1.0 -9.6 0,11

Ь008 1,0 -6.2 32,5 Ь023 1.0 -8.4 0,83

Ь009 0.85 -8,2 1,16 Ь024 (1.95 -N.6 0,60

ШО 1,0 -8,7 0,50 Ь025 1.0 -8.3 0,98

Ш1 0.7 -8,7 0,50 Ь027 0.95 -8.2 1,16

Ш2 0,7 -9Д 0,26 1X133 1.0 -9.1 0,26

Ь013 0.85 -6.7 14,14 1.034 1.0 -9.1 0,26

Ш 4 1.0 0,19

Рисунок 6. Схематическое изображение структуры

потенциальных ингибиторов ПАРП (КГс до 0,07 мкМ), отобранных в результате компьютерного скрининга специализированной библиотеки производных амидов.

IV

м'

,н

N

(СН2)П

Рекомендованные соединения содержат амидный фрагмент, соединенный посредством линкера с бензольным кольцом. Согласно результатам докинга, амидный фрагмент связывается в активном центре ПАРП, образуя водородные связи с остатком 01у863, а бензольное кольцо располагается в дополнительном участке связывания, образованном боковыми радикалами остатков А1а880, Туг889 и Туг896. Важной и уникальной особенностью предложенных соединений является наличие аминогруппы по соседству с амидной группой. Данная аминогруппа не образует непосредственного контакта с белком, однако создает полевой эффект, который должен улучшать связывание соединения в активном центре ПАРП. В результате проведенных квантово-механических расчетов было показано значительное увеличение положительного значения электростатического потенциала вокруг водорода амидной группы,

обуславливающее стабилизацию водородной связи с карбонильным кислородом остатка С1у863 (рисунок 7).

Рисунок 7. Влияние аминогруппы на электростатический потенциал вокруг водорода амидной группы ингибитора ПАРП. Белым цветом отмечена область, находясь в которой карбонильный кислород остатка активного центра С1у863 образует водородную связь с амидной группой. Эквипотенциальные линии проведены с шагом 0,025 хартри (1 хартри = 627,51 ккал/моль).

Основные результаты и выводы

1. Показано, что в активном центре открытой конформации ФДГ возможно лишь непродуктивное связывание субстрата. Напротив, закрытая конформация обеспечивает необходимую жесткость участка связывания и образование комплекса Михаэлиса с остатками А^284, АвпНб и Не 122.

2. Описан механизм транспорта формиата в активный центр ФДГ через субстратный канал, принципиальную роль в котором играет остаток А^284. Обнаружено, что субстратный канал блокируется в закрытой конформации фермента, что обеспечивает изоляцию активного центра в процессе катализа.

3. Разработана методика компьютерного скрининга новых ингибиторов ПАРП, включающая стадию молекулярного докинга в активный центр модели фермента и стадию структурной фильтрации результатов докинга. Высокая эффективность методики подтверждена экспериментальными данными.

4. В результате скрининга специализированной библиотеки производных амидов отобран ряд новых потенциальных ингибиторов ПАРП, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки ингибирующей активности.

Список публикаций

1. Нилов Д.К., Шабалин И.Г., Попов В.О. Швядас В.К. Изучение транспорта формиата через субстратный канал формиатдегидрогеназы при помощи управляемой молекулярной динамики. (2011) Биохимия, 76 (2), с. 211-213.

2. Захаренко A.JL, Суханова М.В., Ходырева С.Н., Новиков Ф.Н., Стройлов B.C., Нилов Д.К., Чилов Г.Г., Швядас В.К., Лаврик О.И. Усовершенствованная процедура поиска потенциальных ингибиторов поли(АДФ-рибозо)-полимеразы-1 с использованием молекулярного докинга. (2011) Молекулярная биология, 45 (3), с. 565-569.

3. Nilov, D.K., and Shabalin, I.G. Transport of formate through formate dehydrogenase substrate channel studied by molecular dynamics simulations.

(2008) Materials of the 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media ", Moscow, p. 24.

4. Нилов Д.К., Михайлов C.H., Тараров В.И., Захаренко А.Л., Лаврик О.И., Швядас В.К. Дизайн высокоселективного ингибитора поли(АБР-рибозо)-полимеразы in silico. (2010) Материалы 1-ой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, МГУ, Изд-во Парк-медиа, Москва, с. 108.

5. Захаренко А.Л., Суханова М.В., Ильина Е.С., Кутузов М.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И., Нилов Д.К., Новиков Ф.Н., Чилов Г.Г., Швядас В.К., Куликова И.В.. Ефимцева И.В., Дреничев М.С., Тарасов В.И., Михайлов С.Н., Ефремова A.C., Глебова (Мартынова) К.В., Данынина М.И., Мясоедов Н.Ф., Шрам С.И., Поиск селективных ингибиторов поли(АОР-рибоза)-полимеразы 1 человека и определение их биологических и фармакологических свойств,

(2009), Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы», Москва.

6. Нилов Д.К., Шабалин И.Г. Изучение транспорта формиата через субстратный канал формиатдегидрогеназы с помощью метода молекулярной динамики. (2008), Материалы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, МГУ, секция «Биоинженерия и Биоинформатика», подсекция «Молекулярное моделирование», Изд-во Московского университета, Москва.

7. Нилов Д.К. Поиск ингибиторов поли(АДФ-рибоза)-полимеразы с использованием молекулярного докинга. (2010), Материалы Международного научного форума «Ломоносов-2010», секция «Биоинженерия и Биоинформатика», подсекция «Биоинформатика», Москва, МГУ, Изд-во МАКС Пресс, Москва.

8. Нилов Д.К. Расчет каталитических констант методом управляемой молекулярной динамики с использованием гибридного ОМ/ММ потенциала. (2011) Материалы Международного научного форума «Ломоносов-2011», секция «Биоинженерия и Биоинформатика», подсекция «Биоинформатика», Москва, МГУ, Изд-во МАКС Пресс, Москва.

9. Нилов Д.К., Шабапин И.Г., Попов В.О., Швядас В.К. Задачи в иллюстрациях, молекулярная динамика. (2009) Суперкомпыотерные технологии в науке, образовании и промышленности, Изд-во Московского университета, Москва.

Список сокращений

ПАРП поли(АОР-рибозо)-полимераза

ФДГ формиатдегидрогеназа

ADP аденозиндифосфат

AG свободная энергия связывания

1С5о концентрация ингибитора, уменьшающая активность фермента на 50%

Ki константа ингибирования

Кт константа Михаэлиса

NAD+ никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма

Pdock вероятность успешного локирования

PDB Protein Data Bank, база данных белковых структур

Заказ № 204-А/04/2011 Подписано в печать 28.04.2011 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail.info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Нилов, Дмитрий Константинович

Список сокращений.

Введение.

Литературный обзор.

1.1 Строение и механизм изучаемых ферментов.

1.1.1 Строение и механизм формиатдегидрогеназы.

1.1.2 Строение и механизм поли(АВР-рибозо)-полимеразы.

1.2 Методы молекулярного моделирования.

1.2.1 Метод молекулярного докинга.

1.2.2 Метод молекулярной динамики.

1.2.3 Гибридные QM/MM расчеты.

1.2.4 Минимизация энергии.

1.2.5 Силовое поле и пакет программ Amber.

1.2.6 Параметризация молекул.

Экспериментальная часть.

2.1 Пакеты программ, использованные в работе.

2.2 Параметризация лигандов.

2.3 Молекулярно-динамические симуляции.

2.3.1 Подготовка стартовых моделей ферментов.

2.3.2 Протокол молекулярно-динамических симуляций.

2.3.3 Управляемая молекулярная динамика.

2.3.4 QM/MM симуляция.

2.4 Молекулярный докинг.

2.5 Измерение ферментативной активности.

Результаты и обсуждение.

3.1 Моделирование формиатдегидрогеназы.

3.1.1 Особенности открытой и закрытой конформации.

3.1.2 Комплекс Михаэлиса.

3.1.3 Транспорт через субстратный канал.

3.1.4. Расчет каталитической константы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Нилов, Дмитрий Константинович

Основные результаты и выводы

1. Показано, что в активном центре открытой конформации ФДГ возможно лишь непродуктивное связывание субстрата. Напротив, закрытая конформация обеспечивает необходимую жесткость участка связывания и образование комплекса Михаэлиса с остатками А^284, АэпМб и Не 122.

2. Описан механизм транспорта формиата в активный центр ФДГ через субстратный канал, принципиальную роль в котором играет остаток А^284. Обнаружено, что субстратный канал блокируется в закрытой конформации фермента, что обеспечивает изоляцию активного центра в процессе катализа.

3. Разработана методика компьютерного скрининга новых ингибиторов ПАРП, включающая стадию молекулярного докинга в активный центр модели фермента и стадию структурной фильтрации результатов докинга. Высокая эффективность методики подтверждена экспериментальными данными.

4. В результате скрининга специализированной библиотеки производных амидов отобран ряд новых потенциальных ингибиторов ПАРП, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки ингибирующей активности.

Благодарности

Автор выражает признательность:

• В.К. Швядасу за руководство

• С.Н. Михайлову на научное консультирование

• A.JI. Захаренко и О.И. Лаврик за экспериментальную проверку активности ингибиторов ПАРП

• И.Г. Шебалину за ценные научные советы

• В.О. Попову за предоставленный пакет программ Amber 10

• Д.А. Суплатову, B.C. Стройлову и И.Г. Халиуллину за технические советы

Работа явилась частью исследований по темам государственного контракта №02.512.11.2247 «Поиск селективных ингибиторов поли(АГ)Р-рибоза)-полимеразы 1 человека и определение их биологических и фармакологических свойств» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» и гранта РФФИ 09-04-92744-ННИОМа.

3.2.5. Заключение

Проведен поиск новых ингибиторов ПАРП путем виртуального скрининга библиотек химических соединений. Показано, что наиболее эффективным методом предсказания ингибиторных свойств соединений т яШсо является комбинаторный подход, соединяющий технологию молекулярного докинга с последующей структурной фильтрацией результатов. После успешного тестирования методологии поиска на известных ингибиторах ПАРП провели скрининг коммерческой библиотеки «случайных» соединений (более 300 ООО) с последующей экспериментальной проверкой ингибирующей активности отобранных веществ. В результате было выявлено несколько ингибиторов ПАРП, однако наиболее активные из них имели описанный ранее элемент скаффолда, т.е. не являлись принципиально новыми ингибиторами. Дальнейший поиск ингибиторов проводили в библиотеке производных амидов, сконструированной т яШсо с учетом структурных особенностей известных ингибиторов ПАРП. В результате был отобран ряд потенциальных ингибиторов ПАРП с оригинальной структурой, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки ингибирующей активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Нилов, Дмитрий Константинович, Москва

1. Popov, V.O., and Lamzin, V.S. NAD+-dependent formate dehydrogenase. (1994). Biochem. J., 301, 625-643.

2. Seelbach, K., Riebel, В., Hummel, W., Kula M.R., Tishkov, V.I., Egorov, A.M., Wandrey, C., and Kragl, U. A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase. (1996) Tetrahedron Lett., 37, (9), 1377-1380.

3. Тишков В.И., Попов, В.О. Механизм действия формиатдегидрогеназы и ее практическое применение. (2004) Биохимия, 69, 1537-1554.

4. Lamzin, V.S., Dauter, Z., Popov, V.O., Harutyunyan, E.H., and Wilson, K.S. High resolution structures oh holo and apo formate dehydrogenase. (1994) J. Mol. Biol., 236, 759785.

5. Шабалин И.Г., Поляков K.M., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная структура НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C-l. (2009) Acta Naturae, 3, 98-102.

6. Popov, V.O., Tishkov, V.I. NAD+-dependent formate dehydrogenase. From a model enzyme to a versatile biocatalyst. (2003) Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions, Research Signpost, Kerala, India, 441-473.

7. Попов B.O., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин И.В. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. (1978) Биоорган, химия, 4, 117129.

8. Schiott, В., Zheng, Y.-J., and Bruice, Т.С. Theoretical investigation of the hydride transfer from formate to NAD and the implications for the catalytic mechanism of formate dehydrogenase. (1998) J. Am. Chem. Soc., 120, 7192-7200.

9. Torres, R.A., Schiott, В., and Bruice, T.C. Molecular dynamics simulations of ground and transition states for the hydride transfer from formate to NAD+ in the active site of formate dehydrogenase. (1999) J.Am.Chem.Soc., 121, 8164-8173.

10. Castillo, R., Oliva, M., Marti, S., and Moliner V. A theoretical study of the catalytic mechanism of formate dehydrogenase. (2008) J. Phys. Chem. В, 112, 10012-10022.

11. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров A.M. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена. (1991) Докл. Акад. Наук СССР, 317, 345-348.

12. Jagtap, P., and Szabo, С. PoIy(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4, 421-440.

13. Ame, J.C., Spenlehauer, C., and de Murcia, G. The PARP superfamily. (2004) Bioessays, 26, 882-893.

14. Ruf, A., Mennissier de Murcia, J., de Murcia, G., and Schulz, G.E. Structure of the catalytic fragment of poly(AD-ribose) polymerase from chicken. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7481-7485.

15. Bell, C.E., and Eisenberg, D. Crystal structure of diphtheria toxin bound to nicotinamide adenine dinucleotide. (1996) Biochemistry, 35, 1137-1149.

16. Marsischky, G.T., Wilson, B.A., and Collier, R.J. Role of glutamic acid of human poly-ADP-ribose polymerase in polymer formation. (1995) J. Biol. Chem., 270, 3247-3254.

17. Ruf, A., de Murcia, G., and Schulz, G.E. Inhibitor and NAD+ binding to poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal structures and homology modeling. (1998) Biochemistry, 37, 3893-3900.

18. Ruf, A., Rolli, V., de Murcia, G., and Schulz, G.E. The mechanism of the elongation and branching reaction of poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal structures and mutagenesis. (1998) J. Mol. Biol, 278, 57-65.

19. Keith, G., Desgres, J., and de Murcia, G. Use of two-dimensional thin-layer chromatography for components study of poly(adenosine diphosphate ribose) (1990) Anal. Biochem., 191, 309-313.

20. Banasik, M., and Ueda, K. Inhibitors and activators of ADP-ribosylation reactions. (1994) Mol. Cell. Biochem., 138, 185-197.

21. Milam, K.M., and Cleaver, J.E. Inhibitors of poly(adenosine diphosphate-ribose) synthesis: effect on other metabolic processes. (1984) Science, 223, 589-591.

22. Durkacz, B.W., Omidiji, O., Gray, D.A., and Shall, S. (ADP-ribose)n participates in DNA excision repair. (1980) Nature (London), 283, 593-596.

23. Purnell, M.R., and Whish, W.J.D. Novel inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase. (1980) Biochem. J., 185, 775-777.

24. Borek, C., Morgan, W.F., Ong, A., and Cleaver, J.E. Inhibition of malignant transformation in vitro by inhibitors of poIy(ADP-ribose) synthesis. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 243-247.

25. Purnell, M.R., Kidwell, W.R., Minshall, L., and Wish, W.J.D. Specificity of poly-(ADP-ribose) synthetase inhibitors. (1985) ADP-ribosylation of proteins, Springer-Verlag, Berlin, 98-105.

26. Farzaneh, F., Shall, S., Michels, P., and Borst, P. ADP-ribosyltransferase activity in Trypanosoma brucei. (1985) ADP-ribosylation of proteins, Springer-Verlag, Berlin, 367371.

27. Bauer, P.I., Hakam, A., and Kun, E. Mechanisms of poly(ADP-ribose) polymerase catalysis; mono-ADP-ribosylation of poly(ADP-ribose) polymerase at nanomolar concentrations of NAD. (1986) FEBS Lett., 195, 331-338.

28. Rankin, P.W., Jacobson, E.L., Benjamin, R.C., Moss, J., and Jacobson, M.K. Quantitative studies of inhibitors of ADP-ribosylation in vitro and in vivo. (1989) J. Biol. Chem., 264, 4312-4317.

29. Banasik, M., Komura, H., Shimoyama, M., and Ueda, K. Specific inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase. (1992) J. Biol. Chem., 267, 15691575.

30. Tavassoli, M., and Shall, S. Covalent modification of poly(ADP-ribose) polymerase by reactive benzamides. (1992) ADP-ribosylation reactions, Springer-Verlag, New York, 290296.

31. Cepeda, V., Fuertes, M.A., Castilla, J., Alonso, C., Quevedo, C., Soto, M., and Perez, J.M. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitors in cancer chemotherapy. (2006) Recent Pat. Anticancer Drug Discov., 1, 39-53.

32. Virag, L., and Szabo, C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. (2002) Pharmacol. Rev., 54, 375-429.

33. Solis, F.J. and Wets, R.J.-B. Minimization by random search techniques. (1981) Math. Operations Res., 6, 19-30.

34. Hockney, R.W., Goel, S.P., and Eastwood, J. Quiet highresolution computer models of a plasma. (1974) J. Comp. Phys., 14, 148-158.

35. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., and Schulten, K. Molecular dynamics study of unbinding of the Avidin-Biotin complex. (1997) Biophysical J., 72, 1568-1581.

36. Isralewitz, B., Gao, M., and Shulten, K. Steered molecular dynamics and mechanical functions of proteins. (2001) Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 224-230.

37. Crespo, A., Marti, M.A., Estrin, D.A., and Roitberg, A.E. Multiple-steering QM-MM calculation of the free energy profile in chorismate mutase. (2005) J. Am. Chem. Soc., 127, 6940-6941.

38. Jensen, M.O., Park, S., Tajkhorshi, E., and Schulten, K. Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6731-6736.

39. Jarzynsky, C. Nonequilibrium equality for free energy differences. (1997) Phys. Rev. Lett., 78, 2690-2693.

40. Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., and van Drunen, R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. (1995) Com. Phys. Comm., 91, 43-56.

41. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module. (2008) J. Computat. Chem., 29, 1019-1031.

42. Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, and A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved. (2006) Proteins, 65, 712-725.

43. Wang, J., Wolf, R.M., Caldwell, J.W., Kollman, P.A., and Case, D.A. Development and testing of a general Amber force field. (2004) J. Comput. Chem., 25, 1157-1174.

44. Schaftenaar, G., Noordik, J.H. Molden: a pre- and post-processing program for molecular and electronic structures. (2000)/. Comput.-AidedMol. Design, 14, 123-134.

45. Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten K. VMD Visual Molecular Dynamics. (1996) J. Molec. Graphics, 14.1, 33-38.67 http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/68 http://parallel.ru/cluster/

46. Walker, R.C., de Souza, M.M., Mercer, I.P., Gould, I.R., and Klug, D.R. Large and fast relaxations inside a protein: calculation and measurement of reorganization energies in alcohol dehydrogenase. (2002) J. Phys. Chem. B., 106, 11658-11665.

47. Pavelites, J.J., Gao, J.L., Bash, P.A., and Mackerell, A.D. Molecular mechanics force field for NAD+, NADH, and the pyrophosphate groups of nucleotides. (1997) J. Comput. Chem., 18, 221-239.71 http://www.pharmacy.manchester.ac.uk/bryce/amber

48. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module (2008) J. Computat. Chem., 29, 1019-1031.

49. Dewar, M.J.S., Zoebisch, E.G., Healy, E.F., and Stewart, J.J.P. AMI: A new general purpose quantum mechanical molecular model. (1985) J. Am. Chem. Soc., 107, 3902-3909.

50. Stewart, J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods I. Method. (1989)./. Comput. Chem., 10, 209-220.

51. Rocha, G.B., Freire, R.O., Simas, A.M., and Stewart, J.J.P. RM1: A reparametrization of AMI for H, C, N, О, P, S, F, CI, Br and I. (2006) J. Сотр. Chem., 27, 1101-1111.

52. STK library (2007) Vitas-M Laboratory, http://www.vitasmlab.corn/

53. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Поли(АДФ-рибоза) полимераза 1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК полимеразой р. (2004) Биохимия, 69, 686-698.

54. Seabra, G. de М., Walker, R.C., and Roitberg, A.E. Are current semiempirical methods better than force fields? A study from the thermodynamics perspective. (2009) J. Phys. Chem. A, 113, 11938-11948.

55. Ламзин B.C., Асадчиков B.E., Попов B.O., Егоров A.M., Березин И.В. Конформационные изменения бактериальной формиатдегидрогеназы при комплексообразовании с кофактором и его аналогами (1986) Докл. Акад. Наук СССР, 291,1011-1014.

56. Tishkov, V.I., Galkin, A.G., and Yegorov, A.M. Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalysed by the bacterial formate dehydrogenase. (1989) Biochimie, 71, 551-557.

57. Kinoshita, Т., Nakanishi, I., Warizaya, M., Iwashita, A., Kido, Y., Hattori, K., and Fujii, T. Inhibitor-induced structural change of the active site of human poly(ADP-ribose) polymerase. (2004) FEBSLett., 556, 43-46.

58. Novikov, F.N., Stroylov, V.S., Stroganov, O.V., and Chilov, G.G. Improving performance of docking-based virtual screening by structural filtration. (2010) J. Mol. Model., 16, 12231230.

59. Geraets, L., Moonen, H.J., Wouters, E.F., Bast, A., and Hageman, G.J. Caffeine metabolites are inhibitors of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose)polymerase-l at physiological concentrations. (2006) Biochem. Pharmacol., 72, 902-910.

60. Steinhagen, H., Gerisch, M., Mittendorf, J., Schlemmer, K.H., and Albrecht, B. Substituted uracil derivatives as potent inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase-l (PARP-1). (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 3187-3190.