Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ADP-рибозил трансфераза клеток головного мозга крыс: свойства и биологическая роль

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ADP-рибозил трансфераза клеток головного мозга крыс: свойства и биологическая роль"

АКАДЕМИЯ НАУК ГРУЗИИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ НЫ.И.С.БВРИТАШВИЛИ

На правах рукописи

ЗААЛИШВИЛИ Тенгнз Налхаэович

ADP-РИООЗИЛ ТРАНОФЕРАЗА КЛЕТОК ГОЛОВНОГО ЫОЗГА КРЫС: СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

03.00.13 - Физиология человека я животных 03.00.04 - Биологическая химия

А В Т О Р. В Ф ВРАТ диссертации на соискание учено* степени доктора Сяодогкчоски иагк в форме научного доклада

ТБИЛИСИ - 1992

Работа выполнена в Институт© молекулярной биология в биологи-1®ско2 Фшеже АН Грузен

О^дцкадыхио озпопон'хы: доктор биологических наук, профессор Г.В.Абуладзо доктор биологических паук, Д.Г.Инкедадзо доктор и№аЕнскйх наук, срофзссор А. К.Сихарулидзе

Ведущая организация; Тбглвсскпа государственник медпциаскап ' • институт

'?>., л? > () . А'"^ Защвта оостоатся 1932 г. в'"-— час за

заседаиак спецзаянзнрованного совета Л СОТ.09.01 при Институте

фязаологиа вн. й.С.Боритавшдн АН Грузан (380000, Тбилиси, ул.

Л. Гогуа 14).

О диосертациеа можно ознакомиться в библиотеке Института ■ Фжзашогин ин.Й.й. Бараташвили АН Грузик

Автореферат разослав марта 1992 года

Ученш! секретарь спвцаал131рованяого ооаета каядвдат бяодогпесххх ваук

Н.Г.Букия

:с«ртацкй i

—зукафяотпчвскнх клетках Фермент ADP-рнбозил траяоФераза катализирует превращение NAD в <АВР-рабозу)п я осуществляет обратимую ковалеятпую посттрансляционную модификацию белков ADP-рибоЭилированиом. Обратимость процесса ADP-рибозилиро-вания осуществляется поли<А0Р-ри0оза> гликогидролазой а ADP-рибозил протеин лиазоЯ. Гликогидролаза расщепляет риОо-зо-риоозиую гликоэидную связь в полимере (А0Р-риооза>п и образует мономеры ADP-риооэных остатков. Гликогидролаза но может гидролиэовать связь мопо(АБР-риОози) с белком, что осуществляется ADP-риоозил протсии лиапоя (МагкМ 9t а!.. 1982. Gaai, Pearson. Ueda, 1W7>. *

В литературу накоплены данный, угсязыплющио на участие процесса ADP -риоозилиропипия и клоточпой пролиферации. диф-фереицировко. репарации ДНК и т. д, однако падо отметить, что результаты экспериментов, кастой иося роли ADP риОозили-рования часто противоречивы и но дают однозначного отпета. Исходя из вишесказанного, а также учитывая, что ADP риооэи-лирование в клетках мозга практически не исследовано, настоящая работа касающаяся изучепия закономерностей Функционирования ядорной ADP-рябозйл траисферазы мозга крыс и ее биологической Функции является весьма актуальной.' Исследование процесса ADP-рисозилировашя имеет важное значение и для практическоп медицины, так как имеются данные о том, что ингиоитори ADP-риоозил траисферазы заметно усиливают цитотоксичность противоопухолевых препаратов.

Цель.^задачи. исследования. Основной целью настоящей

работы являлось:

1. Изучелпз субклеточного распределения ЛОР-риоозил трансферазпоя активности головного мезга крас.

2. Разработка простого и доступного метода получения ДСР-рнбозил трапофераэк из головного козга я исследование зако-помервостев функцпояврованнл АПР-реоозел трансферази изолированных ядер, а также очищенного Ферментного препарата.

; 3. Выяснение рола АОР-рибозил трансферазы в клетках мозга. •

На23вая_5овнзна_8_5рак1из^ко§_здазенид_раЗоти._ Впервые яэ головного мозга крыс ваделен высокоактивные препарат ядеряоа АОР-рнбоэм трансферазы в изучены закономерности Функционирования Фермента. Установлено, что в ядрах мозга првимущоствэкко АОР-рябозилируотся негветоаовиа оелкя. в 'том числе в Солки ядерного матрикса. Одним яз Оелков, активность которого модулируется АБР-рибозилированием является ДНК топоязомераза II ядерного натрякса. Впервые определена АЕР-рибсзял грансферазная активность ядер неярояов я клеток глни в период постватального развития крыс и показано участие АОР-рибозил трансферазы в эхешгаионвоа репарации ДНК ядер клеток мозга.

Полуденный экспериментальны! материал способствует углублению наших знания о процессе АБР-рибозилирования и его роли в эукариотической клетке. С другой стороны установление участия АОР-рибсзял трансферазы в репарация ДНК клеток мозга может нмэть определенное значение и для улучшения традиционных методов лечения злокачественных перерождений.

Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. Объем раОоти составляет 53 машинописные страницы. Она содержит девять рисунков и двенадцать таблиц. Автор выражает признательность всем сотрудникам лаборатории структурной организации хроматина я репарации за помощь в проведения экспериментов и постоянный интерес к работе.

Апродация_работьг Результаты исследования были доложены на всесоюзных и международны! симпозиюмах и конференциях; на республиканской конференции по энэимологии (Тбилиси, 19й&); 19 ои конференции ФКБО (Рим. Utó'jn а также на втором дпухсторошмм симпозиуме ССХЦ'-ША "Структура эукариотического гатма и регуляция его укспроссии" «Тбили • си, l'.W).

Методы исследования

В опытах использовали о ели о крысы весом 160-160 г. содержащихся в стандартных условиях вивария. Тотальное облучение животных проводили с помощью рентгеновской.установки РУМ-17 при следующих условиях: модность дози около 0,6 Гр/ мин. сила тока 15 мА. напряженно 200 кВ. фильтры 1 мм Al и 0,5 мм Си. кожно-фокусное расстояние 40 см. Применяли однократные облучения. Ндра из цельного головного мозга крыс получали методом Шою и др. (Chauv&au et al..1956) с неко-

-6-

I

торами изменениями. '

Выделение ядер несроков п глин из суммарного прэпарата ядер нрозодгаи в ступенчатой градиенте сахарозы (Toapson, 1973). Критерия определения типа ядер были те же. что я у Ловтр/п-ренна. Лакюена (Lovtnip-Rein, McEven. 1966) и Аусто-кера н др. (AustoKer et al., 1972).Субклеточные фракции мозга получали методом дяФФзрепцкалыюго центрифугирования (Johnson. Sellinger. 1971. Hamberger et al., ^^Фракционирование белков после проведения в ядрах реакцяг ADP-рибо-эшгарованвя осуществляли по стандартной методике ( Busch. 1575; Elgin 1975).

Ядерный натрикс получали двумя разными методшсамг. Од-яа-включает иуклеазвую обработку нзояированвuz ядер, после

I

чего удалят Оелкн а отделившуюся ДНК выоокосолевой зкст-ракцз02(Вег97ПОУ, Buchholtz. 1981). а другая - удаление белков вксокоооловой экстракцная перед нуклеазной обработкой ядер «Buttyan et al., 1983).

Плазмидяую ДНК pBR 32Z выделяли по стандартной методике Шавнатис и др., 1984>, а ДНК ткмуса теленка акти-снровалн по методике Апоииава в Корнберга (Aposhlan. Korn-bsrg.1362).

. АСР-рибознл трансферазпуп активность определяли вклю-чепяеи ^C-NAD, произвольно меченного в адениловой части, в КЕслотопорастворимый продукт CKlshizuka et al.. 1967). 1 ; Для определения NAD пироФосФорилазной актнвноста ядер йспользовалв реакционную среду обменом 0.8 мл. содержащую 0,26 И гляцнл-глишшовий буфер pH 7.4: 0.75 мМ КММ. 1.25 мИ

АТР. 76 мМ някотивамид. 15 мМ МдС12 и ядра (Atkinson et al., 1961). Пробы инкубировала при 38°С в течение 20 мин, посла чего реакцию останавливали охлаждением и одновременным добавленном 0,8 мл холодно® 1 н НСДО^. Суспензии центрифугировали при 4000 od/мия и в супернатантах После нейтрализации 2 M КаОН концентрацию MAD определяли по его восстановлению дрожжевой алкоголъдегидрогеназой. Аналогичным образом определяла содержание MAD я в хлоратных экстрактах Мозга крис. Алкогольдегидрогеназу из пекарских дрож-• жей получали по методике описанной в книго Кочетова (Кочетов, 1971). ДНК топоизомераэные активности определяли электрофорезом в агарозиом голо thlíshizawa -et al.. 1984; Tsu-tsui, 198G>. ADP риооза пироФосФорилазную активность ядер ' определяли тонкослойной хроматографией на PEI целлюлозе (Tanunia. 1Ж>>.

Эндогенную ДНК полиморазную активность ядер мозга определяли по включению 3Н-ТТР в кислотонорастюримый материал <Iпои© et al., 1976).

ДНК-агпрссный гелъ приготавливали по прописи Бендич и Болтон (Bendich. Bolton. 1968).

Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури и др. ( Markwell et ai., 1978) и по Ередфорду (Bradford. 1976), а ДНК по Дише и по Бартону (Георгиев, 1968). Количество ядер подсчитывали в камер» Горяева. Радиоактивность измеряли в жидкостном сциятнляционном счетчике SL-30 и SL-4000 (Intertectuilqu9, Франция) в растворе толуола содержащем 0.5'/ РРО и 0.03Х РОРОР.

-е- •

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Субклеточное расиредлени? ADP-рибозил трансФеразнов активности головного мозга

Изучение субклеточного распределения ADP-рибозил ' трансферазноЯ активности головного мозга крыс показало, что трансферазная активность ассоциирована со всеми субклеточными Фракциями (Табл. 1). Самой внсокоя АИР-рнОозил транофе-разной активностью характеризуется ядерная Фракция клеток. , Хотя надо отмегить, что и с субцнтоплазматическими Фракциями ассоциирована значительная ADP-рибозил травсферазная ак-, тивность. Из су бдя т опла зм а та ч оскя х фракций самой высокой ДСР-рябозил гранофоразноЕ активностью характеризуется цито-fзольная Фракция, а самой низкой трансферазной активностью мнкросокальная фракция.

В таблицеZ представлены эффекта различных ингибиторов на ADP-рвОозил трансферазные активности цитоплазмы клеток мозга крыс. Видно, что никотинамид и тпмкдин только частично янгибнруют ADP-рибозил трансферазнво активности цитоплазмы клеток, мозга, тогда как ядерная ADP-риоозил транс-феразная активность этими веществами в аналогичных концентрациях полностью подавляется (Niedergang et al.. 1975; Hol-tlund et al.. 1981: Mandel et al.. 1382). Никотинамид в концентрации 10 мМ ингибирует мятоховдриальную, микросомаль-вгю я цвтоэольяую ADP-рибозил трансферазные активности соответственно на 36-422, 44% и 51Х. Сходная картина наблюда-

Таблица 1

Субклеточное распределение ЛЮР-рибозил транс-феразноя активности головного мозга крыс

Клеточные фракции ЛБР-рибозял трансфертная активность

Удельная Суммарная

ед/ мг белка единицы

Неочищенные ядра 425

Митохондриалыюя фракция содержащая обработанные дигитонином митохондрии 1мг дигитонин/Шмг белка 44.3 Митохоидриалыюя фракция обработанная ультразвуком содержащая разрушииние митохондрии 47,&

Микросомальная фракция 30,8

Цитозольная фракция 78,3

140250

4625

4069 1Ь78 7422

За единицу АЕР-рибозил траноферазноя активпости принимали включение 1 пмоля АОР-рибозы в кислотонерастворимыя материал за 1 час. Для проведения трансФеразноЯ .реакции фракции (0,3 -0,4 мг белка) инкубировали при 37°С в течении 1 часа в сроде объемом 0,4 мл содержащей 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, Ю мМ Мдй 1 мМ Р-меркапгоэталол и 0,11 мМ 14С-МГ (400 ООО имп/мин на нмоль).

Таблнца 2

Влияние някотинампда. тпмидипа, 'ADP-рибозы и ДНК тимуса теленка, на удельную ADP-рибознл трапсферазную активность цитоплазмы клеток головного мозга

Реакционная Митохондрии Митохондрии Мнкросомн Цитозоль среда обработанные разрушенные дигитовином ультразвуком

Контроль Никотипамид Б мМ 10 мМ Тямидян 5 мЫ АРР-Рибоза

V-

1 мы

2 МЫ ДНК тимуса теленка

60 ккг/нд 100 мкг/нл

44.3

30.6

25.7

25.1

39.0 19.9

4?. 6

34.2 30/4

29,4

42.3 19.9

30,8

22,1 17.2

17. G 10.8

32.5 34,3

78; 3

47.6 36.4

38.9 21.1

81Д 84,8

• -11- •• ' отся я в случав б мМ тамидява.

Осиовнваясь па тон, что пикотинамид в концентрация 10 мН полностью подавляет HAD гликогядролаэвые активности субцитоплазматзчеясих фракция, можно заключить, чтопефер-ментативпое ADP-рибозилированзs белков через HAD гднкогид-ролазнуп активность в нашем случае можно исключить. .

ДНК тимуса теленка практически не влияет на ADP-рибо-эил трагсферазнне активности мнкросомальной н цитозольноа фракции <та<5л. 2). тогда, как ферментативная активность мнкросомальной Фракции семенников крыс (Concha. Concha. 1965), и клеток HeLa (Roberts et al.. 1975) в присутствии ДНК заметно стимулируются. Известно, что ядерная ADP-рибо-зил трансфераза (полиС/ШР-рнОсза) полямераза) активируется * ДНК. Поэтому обнаруженные активности не являются ядерного происхождения, т.е. по видимому можно исключить высвобождение ADP-риоозил трансферазы из ядер мозга при гомогенизации ткани.

1.2. Взаиморасположение MAD пирсфосфорилазы и ADP-рибозлл трансферазы в ядрах клеток головного мозга крыс

i

Ключевой фермент биосинтеза NAD-HAD пирофосфорвлаэа как и ADP-риоозил трансфераза ассоциирован с хроматином «Cantarow. Stoliar, 1977; Uhr, Saulson. 1902),Для понимания механизмов регуляции метаболизма в клетке HAD a priori важное значение имеет определение локализации этих двух ферментов.

Исходя нэ этого было исследовано взаиморасположение NAD пирофоофорнлвзы я ADP-рнбсзнл траюфвразн в ядрах клеток головного мозга крыс. :

В таблице 3 представлено влияние различных концентрата някотивамидмовонукдеогкда CNMN) и АТР (из которых HAB дярофосфорилаза синтезирует HAD) ка ADP-рибоэилтрансфераз-иую активность. Вадцо, что внесение в инкубационную среду дня определения трааоферазног активпостн предвественняков HAD. O.ImM КММи 0.2мМ АТР. заметно ингабпрует ADP-рнбоззл траксфаразаую активность в ядрах, тогда, как в аналогичное ситуации ADP-рибозил траноферазпая активность в экстрактах ядер ингибируется звачятедьио в'меньвей степей, несмотря • аа то, что при екстракшя на ядер удельная активность NAD пирофос&орилазм заметно, 15 -20 раз увеличивается.

Эти результаты можно объяснить тем, чтоШ)пярсфосФо-рхдаза в АБР-рибозял травофереза в ядрах клеток мозга рас-волоиеан близко друг от друга.а экстракция'этнх Ферментов из ядер нивелирует их близкое взаиморасположение. Поэтому синтезированный из NMN в АТР немэчошшй MAD более еФФектнв-но замещает используемый для проведения реакции ADP-рибози-лировання меченный 14C-NAD в ядрах, чем в экстрактах ядер. , Поскольку NAD является продуктом NAD пирофосфорилазной реакции ми исследовали.влияние той концентрации HAD (O.ImH) на HAD пирсфоофорвлазнув активность, которую использовали Для определения АВР-рнбозил тралсферазноЗ активности. Такая концентрация MAD практически не влияла па HAD пирофоо^орн-лаэную активность как ядер, так в ядеринх экстрактов. Надо заметить, что испольэовавже НМН в более внооких концентра-

Таблаца.З. '

Влияние NMN и ATP иа ADP-рнбозил траноФераэную активность ядер, ядерпыг вкстрактов в очиценпуп АЮР-ргбозвз

трапоферазу

14,

Объект исследования амп/мин' %

Ядра 10330 100

Ядра + ОДмМ НИН 9514 92,1

Ядра + 0,2мМ NMN 7540 73,0.

Ядра + -0.2MM АТР 10110 97,3

Ядра +. ОЛмМ NMN и 0,2кМ АТР Z 872 27,а

Ядра + О.БмМ NMN 5 981 57,9

Ядра + О.БмМ АТР 9 566 92,6

Ядра + 5.0мм АТР 6,405 62,0

Ядерный экстракт 15 756 100 .

Ядерный экстракт + 0,1мМ NMN 14 700 93,3

Ядерный экстракт + 0,2мМ АТР 15 362 97.5

Ядерный экстракт + ОДмМ NMN и

0,2мМ АТР 10 525 66,8

Ядерный экстракт + 0,5мМ KMN 7 830 49,7

Ядерный экстракт' + 0,5мМ АТР 13 393 85,0

Ядерный экстракт + 5,0мМ АТР 9 768 62,0

ADP-рибозил траксфераза 7 200 . 100

ADP-рибозил трансфераза + 0,5мИ NMN 3 788 52.6

ADP-рибозил трапсфераза + б.ОмИ АТР 3 766 52,3

Реакционная среда (О.ймл) для определения ADP-рибозил трансферазпов активпости ядер содержала 50мМ т'рис-HCl pH 8,0, 20 им MgOlg, 1нМ (i -моркаптоэтапод, 0,106 нМ i4C-HAD <9,1мКи/мм) я ядра - 100мкг белка. Для определения трапо}>е-разной активпости ядерного экстракта, полученного по прописи описанной па стр. 15, использовалась реакционная среда применяемая для определения Ферментативной активности очи-шеяноЯ ADP-рибозил трансфоразы <си.табл.4) с той лпшь разницей, что она содержала 0.106 nil HAD и ЮОмкг ядерного бояка.

днях чаи 0,1 кИ охазадось менее удобным, поскольку как вяд-;

по S3 тсбляци 3 высокая конаентраазя ШЯ1 заметно ппгяСпр7ст ADP-рябозил траж&оразную активность. №Ш в концентраций 0,5 мН кнгиОаруот активность очинённой грапсферазы приблизительно с то2 aso интенсивностью что й в ядрах. Это говорит что НМН в ядрах Еепосрэдств»кно влияет на ADP-раОозал трансферазу. Так как реальная концентрация MAD в клейко зависит от снороста сннтеза е распада MAD, в которых решающее значение имеет HAD пирофооЮрглаза к ADP-рибозил трансфера-за «Заа1, Poarson. 1985; DeMurcla. oi al., 1983). то топологическая близость этих Ферментов может являтся значительным контролирующим фактором концентрации NAD в клетке.

60

га

. С

&&

п

z-5 IS if «о

4 У

20

uf

I

Рис. 1. НАГ пирофосфорилазная активность ядер и ядерного матрикса клеток головного мозга крыс: а - ядра, б - ядерннй матрикс. Метрике содзр-яал 6.2 % ядерного белка

■ Полученные нами данные согласуются с изложенным вышо предположением, поскольку указывают на близкое пространственное расположение MAD пирофосфорилазы и ADP-рибозил трансферазы в ядрах.Об этом говорит н ассоциирование части моле кул HAD пнроФосФорилази <рис,1), также как и ADP-рибозил трансферазы (см. рис. 9) с ядерным матриксои клеток головного мозга.

2.Исследование закономерностей Функционирования ядерной ADP-рибозил тч'аноферази кле ток головного мозга крыс

ADP-рибозил траяофераоа выделена из различных органов, однако методика очистки фермента из нервной ткани и доступной нам литературе не встречалась.

Изучение закономерностей Функционирования очищенной ADP-рибозил трансферазы in vitro внесет определении?, вклад в установление ее биологической Функции. Поэтому нами был разработан простой и доступный метод получения ADP-риоооил трансферазы из очищениях ядер головного мозга крис, позволяющий очистить Ферментный препарат за короткий период времени и изучить его свойства.

ADP-рибозил траноферазу экстрагировали добавлением к ядерному препарату буферного раствора, содержащего 50 мЦ тряс-НЙ (рН 7,6), О.ЗЬ М М&С1. 1мМ Р-моркаптоэтанол. 1мМ

НаНз (буфер 4>, в постоявши перемешиванием в течения 40 мня. Суспензию центрифугировали при 15000д в течение 30 мин. Надосадочную жидкость использовали для афинной хроматографии ва колонке ДНК-агарозы <1,2 х б см), которая содержала 8 мг ДНК. Для удаления нуклеиновых кислот экстракт ядер наносили со скоростью 20 ил/ч ва колонку ДЭАЭ-ц <2- X 4 см>, которая была уравновешена буфером А, содержащим 0,3 Н N801. К колонке с ДЭАЭ-ц била .непосредственно присоединена колонка с ДНК-агароэоЯ. куда поступал элюат с первой колонки для дальнейшей афипнов хроматографии. Колонка. ДНК-агарозы была также уравновешена буфером А. содержащим 0,ЗМ Кай. Белки связавшиеся с ДНК-агарозой элшровали буфером А, содержащим 1 К Кай порцяями по 1 мл. Фракции, обладающие АПР-рибозил траноферазной активностью объединяли и диа-ляэовали против буферного раствора А содержащего 0,2 Л N801. Все растворы содержали фенилметилсульфонилфторвд в концентрации 0.1 ми.

Как видно из табл. 4. где представлены результаты, полученные в процессе очистки АСР-рибозил траноферазы после хроматографии па колодке ДНК-агарозы удельная ферментатив- , ная активность возрастает в 10,1 раз, а выход фермента по активности составляет 27,ТА по сравнению с ядерным экстрактом.

Для дальнейшей очистки АОР-рибознл траноферазы диализат наносили со скоростью 10 мл/ч на колонку голубой сефа-розы СЬ-6В <1,2 х 3 см), уравновешенную буферным раствором А, содержащим 0,2 М Май, в элюировали буферным раствором А. содержащим 1 М N801, порциями по 0,5 мл. На этой стадии

уделъная травсфвразная активность возрастает в 123 раза, а выход фермента по активности составляет 11.2%.

ADP-рибозил трансфераза проявляет оптимум действия при рН 8.0-8,5 и температуре 25°С. Хранение при 4°С очищенной ADP-рибозил т'рансферазн в течении недели приводит к понижению ферментативной активности приблизительно на 40%.

На рис. 2. представлено влияние ионов магния (а) я спермина (б) на ADP-рибозил трансфераэную активность. MgClg при концентрации 10 - 20 мМ стимулирует ADP-рибозил транс-Феразную активность приблизительно в 3 раза, тогда как спермин при оптимальных концентрациях 2,5 - 5 мИ активирует

Фермент приблизительно на 502. Как видио из рисунка. ADP-

%

рибозил транофераза проявляет достаточно высокую активность и в отсутствие в реакционной сродо катионов, что говорит о том, что они не являются необходимыми для Функционирования траноферазь.

в

4

t

7

• < ■—1. смрмкм, иМ

Рис.2. Влвявие МдС12 (а) в спермина «$) на активность оч»*еияо» АОР-ршвсоил траяофервэм.

Таблица 4.

Очистка ADP-ркбозил трансферазы головного мозга крыс

Активность

Стадия очистки Количество общая удельная Степень

белка ,мг ед. ед/мг белка очистки

0,35 М №01 экстракт очищении! ядер 35 665 19 1 •

Хроматография на ДНК-агарозе 0,96 184 192 10,1

Хроматография на голубой сеФарозе fil-fiR 0,032 74.6 2330 12.3

За единицу Ферментативной активности принимали включение 1

пмоль MAD в кяслотонерастворкмый материал за 1 мин. Среда содержала 50 мМ грис-HGl. рН 8.0, 20 Ш МдС12.60мМ NaCl,5 мМ Р-меркадтоэтавол, 2,25 мкМ C14-NAD(280 мКи/мм>, по 40 мкг ДНК и тотального гнстона (0,4 мл). Инкубация Ю мин при 25°С.

Поскольку ADP-рибозил трансфераза ассоциирована в ядре с хроматином, представляло определенный интерес.исследовать

v.-

влияние различных форм ДНК и гистонов в а ADP-рибозил транс-феразную активность. Как видно из табл. 5, баз внесения в реакционную среду ДНК тимуса теленка, трансфераза не проявляет активности, тогда, как суммарная Фракция гистонов тимуса теленка частично стимулирует фермент. Денатурированная и метилированная ДНК стимулируют ADP-рибозил трансФеразную активность значительно слабее по:сравнению с нативной. В . присутствии апуриковой ДНК ADP-ркСозил трансфераза. также как и в случае отсутствия нативной ДНК, в реакционной среде но проявляет каталитическую активность.

Интересным представляется и значительная стимуляция ADP-риСозил трансФеразноа агаивностй чфЯ'Фрагментации ДНК

Си2*

Таблица 6

Подавление дитиотреитолом воздействия катионов и на активность очищенной ЛЙР-рибозил траноферазы мозга крыс

Добавки Активность, И

Без добавок 100

5 мкИ Си2"1, 145

5 мкН Си2+ + 10 мМ дитиотреитол 96

50 мкМ Си2+ О

50 мкМ Сц2+ + 10 мМ дитиотреитол 99

125 мкМ О

125 мкМ + ю мМ дитиотреитол ч 98

Исходя из сказанного выше, можно предположить, что АВР -риОозид трансфераза содержит участки, имеющие различное сродство к катионам С\?л. Связывание при низких концентрациях этого катиона с участками /ШР-рибоэил траисфера-зы. имеющими высокое сродство к катиону, увеличивает транс-

Феразную активность, тогда как при высоких концентрациях 2+

катионы Си , по-видимому, связываются и с участками, имеющими более низкое сродство к металлу, что подавляет Ферментативную активность.

Полиамины - спермип и спермидин - увеличивают АБР-ри-бозил траноферазную активность (рис.4), стимулируют ее в ядрах, выделенных из головного мозга как новорожденных так а взрослых крыс. Однако влияние полиаминов на АЮР-рибозил траисферазную активность ядер новорожденных крыс более сильное, чем взрослых.

Рнс. 4. Влияние снермидина (а) а спермина <б> на ADP-рабозил травсферазаую активность ядер мозга новорожденных (1 - 2-дневных) <1> и взрослых <2> крыс

Для определения ADP-риОозил трансферазноя активности в изолированных ядрах мозга крыс использовали1 реакционную среду объемом 0,2 мл, содержащую 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 106.4 икМ 14C-HAD (9.1 мКи/мм), 1 мМ Р -меркаптоэтанол и суспензию ядер <200 мкг белка). Реакцию проводили при 25°С в течение 10 мин.

На рис. 4 виден двухступенчатый характер стимулирования ADP-рибозил трансферазноя активности полиаминами. Исходя из этого, можно предположить два возможных механизма влияния спермина на ядерную ADP-рибозил трансферазную активность. Первое - аллостер?1Ческое активирование трансфе-разы после связывания полиамина с хроматином (с фосфатными

остатками ДНК), а второе - непосредственное влияние полиа-кина на ÄDP-рибозил трансферазу. Надо заметить, что на изолированных ядрах клеток Heia ранее было показано, что спермин, спермндин и путресцин не влияют на интенсивность синтеза (ADP-pnöo3a)n (Byrne et al., 1978). Полученные нами результаты сходни с данными о стимулировании полиаминами ADP-рибозил трансферазной активности в ядрах печени крыс (Tanigawa et al., 1977. Perrella, Lea. 1987).

Для выявления влияния спермина на интенсивность ADP-рибозилирования различных ядерных белков ядра мозга как новорожденных, так и взрослыi крис инкубировали с *4C-NAD в

ч

присутствии катионов Mg" или спермина для проведения реакции ADP-pиöoзилиpoвaния. после чего из ядер выделяли раз-, личные белковие Фракции.

Результаты экспериментов представлены в табл. 7 и 8. Видно, что в присутствии катионов Mg2*, гак же как и в присутствии спермина, в ядрах новорожденных и взрослых крыс преимущественно ADP-рибозилируются негистоновые (остаточные) белки. Тем не менее надо заметить, что спермин в от-2+

личие от Mg обеспечивает более интенсивное ADP-рибозили-рование негистоновых (остаточных) фракций белков и в меньшей степени негистоновых белков, экстрагируемых из ядер 0,3 М NaCl. и глобулиновой фракции белков. Аналогичная картина наблюдалась и в случав проведения реакции ADP-рибозилирова-ния в ядрах при одновременном присутствии в инкубационной среде катионов и спермина.

Таким образом, эти результаты показывают, что катионы и Zn2+ и полиамины являются веществами, имеющими по-

тснцкальнув возможность модулировать ядерную АОР-ряОозял траноФеразную активность в нервной ткани.

Таблица 7

I Распределение радиоактивности в белковых фракция? ядер мозга новорожденных крыс, полученных из преинкубированных с ядер в присутствии Мд2+ и спермина

Фракция ядерных белков

10 мМ МдС1 2 Ю мН спермин Радиоактвность

ими/мин

%

ими/мин

X

Глобулины 84 496 22.65

< Негистоновые белки 43 536 11.67

Гистон Н1 1 828 0,49

Нуклеосомные гистояы 6 828 1,83 Негистоновые

: (остаточнне) Оелкк 236 336 63,35 289 §72 80,52

36 936 10.26

24 984 6,94

- 1 872 0,52 6 336 1.76

Для проведения реакции АЕР-рибозилирования ядра (2мг белка/мл) инкубировали в 5 мл буферного раствора, содержащего 50 мМ трнс-НЙ. рн 8,0. 10 мМ МдС12, 1 мМ Р-меркапто-зтанол и 106.4 мкИ 14С-Ш (9,1 мКи/мм) при 25°С в течение 20 мип. После проведения реакции АБР-рибозилирования ядра быстро охлаждали добавлением пятикратного объема 0,25 М сахарозы к помещением проб в ледяную баню. Суспензию ядер центрифугировали при 16003 10 мин.' и ядерный осадок использовали для выделения различных белковых фракций.

Та блица 8

Распределение радиоактивности в белковых Фракциях ядер мозга взрослых крас полученных из проинкубированных с ИАО ядер в присутствии и спермина

Фракции ядерных белков

10 мм МдС12 10 мМ спермин

радиоактивность

имп/мин

X

имп/мин X

Глобулины

Негистоновые белки Гистон HI

Нуклеосонные гистоны Негистоновые (остаточные) белки

74 934

43 296 i 350 11 325

18.26 10.55 1,06 2,76

11 668 3.34

11 176 3,20

2 096 0,60

6 220 1,78

276 460 67,37 318 140 91.08

3. Биологическая роль ядерной ADP-рибозил транс{>еразы головного мозга крыс

Как уже отмечалось, одним из кардинальных процессов, протекающих в клетке, в котором лредпологается участие ADP-рибозил траноферазы, является репарация ДНК (Shall. Collins, 19Eff). В этом аспекте нервная ткань почти не изучена .

Изучение влияния различных доз рентгеновского облучения на активность ключевого фермента биосинтеза NAD-NAD лирофос форилазы изолированных ядер мозга показало, что рентгеновское облучение крыс не влияет на NAD пирсфосфорилазную активность, тогда как ADP-рибозял траноферазная активность ядер после рентгеновского облучения заметно увеличивается.

Как видно из рис. 5, облучение животных в дозах 1.7; 4,2; 6,7 Гр увеличивает ЛБР-рибозил трансферазную активность ядер в 1.6; 2,1 и 2,3 раза соответственно.

Рис.Б. Влияние рентгеновского облучения на ядерную ADP -рибозил траноферазную активность головного мозга крыс и на содержание NAD'в нервной ткави.

По оси абсцисс - доза облучения, Гр; по оси ординат -включение 14C-NAD, ймп/минх1СГ3на 5.106 ядер (1), выделенных через 1 ч после облучения крыс и на содержание 1СГ8 М NAD (2). в пересчете на 1 г влажного веса нервной ткани через 1 ч после облучения животных. Для определения ADP-рибо-звл трансферазноя активности использовали реакционную среду

объемом 0.2 мл. содержащую 50 мМ трисНС!, рН 8.0, 20 мМ MgCl^, 1 мМ Р-меркаптоэтанол. 106,4 мкМ 14C-NAD (9.1 мКи/ мм). Пробы инкубировали при 25°С в течение 10 мии.

Так как образование разрывов в молокуле ДНК стимулару-'' ет активность ядерной ADP-рибозил трансферазы, то образование разрывов ДНК ядер мозга рентгеновским облучением, по-

видимому, является причиной увеличения ADP-рибозил тразсфэ-разноя активности ядер.

На ряс. 5 представлено также содержание NAD в нервной ' ткани в норме и после рентгеновского облучения крыс. Уже через 1 ч после облучения животных, в период усиления ADP-рябоэял трансферазясп активности ядер иоэга, наблюдается уменьшение содержания NAD в нервной ткани. Видно, что рентгеновское облучение животных в дозе 1,7 Гр вызывает уменьшение содержания NAD в мозговоа ткани в 1,5 раза. Последующее увеличение дозы облучения поникает содержание NAD в мозге. При облучения животных в дозе 6,7 Гр содержание NAD в нервной ткана падает в 2,1 раза.

Из рисунка ясно видно, что между ядерноЯ ADP-рибозил трансферазноя активностью и содержанием HAD в нервной ткани' существует негативная корреляция. Увеличение ADP-рябоэял трансферазнол активности с повышением дозы облучения животных сопровождается понижением содержания NAD в ткани. Увеличение ядерной АСР-рябозял траисферазнов активности и понижение содержания HAD в нервной ткани наблюдается и через 24 ч после облучения крыс.

• Из литературы известно, что даже высокие дозы рентгеновского облучения не влияют на флуоресценцию внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов. \JaniQSon, 1956). Поэтому кажется маловероятном, что реакция присоединения свободных радикалов с HAD и изменения в окислительно-восстановительном состоянии клетки играют роль в понижении содержания NAD з нервной ткани после облучения животных. По-видимому, сти-

мудяцяя ADP-риОозил трансфэразной активности ядер является причиной, или по крайней мэре одной из причин, понижения содержания HAD в нервной ткани.

Для того чтобы выявить, какие ядервые Оелки ADP-рибо-залврустся при облучении крыс, ядра инкубировали в реакционной смеси для проведения реакции ADP-рибозилирования с радиоактивным 14C-NAD, после чего проводили выделение белков различной природы. Как видно из таблицы 9 в ядрах облученных крьЬ усиливается АОР-р^боэилирование различных белковых фракций. Нужно заметить, что интенсивность ADP-рибо-зилироваиия негистоновых белков ядер мозга как облученных, так и вормальных крыс гораздо вше, чем гистонов.

Увеличение ядерной ADP-рибозил трансферазной активности ДНК-повреждающими агентами является одним из признаков, указывающих на участие процесса ADP-рисозилирования в репарации ДНК (Shall,1984, Collins, 1987). Поэтому полученные нами данные дают возможность предположить, что ADP-риСози-лирование вовлечено в репарацию поврежденных участков ядерной ДНК нервной ткани, вызванных рентгеновским облучением.

Обработка ядерного хроматина нуклеазами широко применяется для изучения структуры хроматина. В данной работе для изучения влияния процесса ADP-риоозилирования на структурную организацию хроматина использовали панкреатическую ДНКазу 1 <2000ед/мгбелка "Serva",ФРГ). Как известно ДНКаза 1 в отличие от микрококковой нуклеазы, которая преимущественно расщепляет хроматин в межнуклеосомных участках, также

хороио расщепляет ДНК :сак в межнуклеосомных участках, так я внутри нуклерсом (МсСЬее, Felsenfeld, 1380)"

Для нуклеазноя обработки ядра (300 мкг ДНК/мл > суспендировали в буферном растворе, содержащей 15 мЯ трис-HGl рН 7,4 . 0,25 И сахарозу, 15 мМ NaCI, 60 мМ КС1, 0,15 мМ саер-ман, 0,5 мМ спермядин, 15 мМр-меркаптоэтавол, 10 мМ MgClg. 1 мн СаС12 (Hewish. Burgoune, 1973), и инкубировали при 25°С в течение 3 мин, после чего добавляли панкреатическую ДНКазу 1. растворенную в буфере (150.ед/мг ДНК).

Для изучения кинетики расщепления ДНК аликвоты забирали в различных интерзалах времени и реакцию останавливали . добавлением ЗДГА (10 кМ. конечная концентрация) и одновременным охлаждением. Материал, растворимый в 0.5 Н НС10».

•Й

удаляли центрифугированием и в осадке не разрупенпую нукле-азоЯ долю ДНК определяли после еэ гидролиза в 0/5 Н НСЮ^ при 70°С в течение 15 мин по методу Лиге.

На рис. 6а представлена кинетика расщепленяя ДНК.ядер мозга ДНКазой 1, выделенных из облученных рентгеновскими лучами крыс в дозе 6,7 Гр. Видно, что кинетика расщепления

ДНК ядер нормальных крыс ДНКазой 1 изменяется после провэ-■

деяяя в ядрах реакции АБР-рибозилирокаяия . Преянкубапия ядер с 1 мМ NAD заметно усиливает расцепление ДНК ядер нуклеазой во времени, хотя стимулирование расщепления ДНК ядер нуклеазой отмечается и после прешткубации ядер с 0,1 мМ NAD.

Аналогичная картина наблюдается в случае растепления

?ic. 6 Кинетика расщепления ДНК ядер мозга крыс, неполученных (а) и облученных (0) в дозе 6,7 Гр панкреатической ДНКазой 1.

1 - ядра, не преинкуоировааные с HAD,

2 - ядра, преинкубированные с 0,1 мМ М>. 3 - ядра, преинкубарованныа с 1 мМ

m

ДНК ядер, изолированных из головного мозга крыс, подвергавшихся рентгеновскому облучению (рас. 6б>. ADP-дабозклхрова-

ние усиливает расщепление ДНК ядер облученных животных. ' 0

Однако в отличив от ядер необлучецанх крыс заметное усиленна расщепления ДНК отмечается уже при преинкубацви ядер с 0.1 мМ HAD. Это явление можно объяснить стимулированием ADP-рибозил траноферазной активности ядер в соответственно усилением ADP-рабозилирования белков рентгеновским облучением .

Надо отметить, что прэинкубация ядер с NAD для проведения реакции АСР-ргОозилирования в присутствия ингибитора * *

ADP-рибозил траноферазной актавностп никотипамкда (20 мН> или тимидииа (5 кН) нивелировала эффект усиления расцепления ДНК ядер как нормальных, так в облученных крыс. Этот ' аффект является доказательством того, что a priopl ADP-ря-бозилирование белков является причиной изменения кинетики расщепления ДНК ядер после их преинкубашш с HAD. t

Из табл. 9 видно, что в ядрах как нормальных, так ж облученных крыс в основном ADP-рибозилируются вегистоновые белка. Однако ладо заметить. чтоАОР-Рябозилнроваюепгсто-иовых фракция заметно усиливается в ядрах облученных крыс, что может указывать на вовлечение и ADP-рибозиларования гистонов в структурные перестройки хроматина. Усиление ADP-рибозилирования гистонов может нейтрализовать положительный заряд последних и ослабить взаимодействие белков с ДНК. что в свою очередь, может повлиять и на суперструктурную орга-

низанию хроматина.

'Итак, кинетика расщепления ДНК ядер панкреатической ДНКазой 1 указывает, что АйР-рибозилирование белков модулирует структуру хроматина как нормальных, так и облученных рентгеновскими лучами крыс.

Таблица 9

Включение 14С-А0Р-рибозы в различных белковых фракциях

ядер головного мозга крыс (нмоль в пересчете на Ю9 ядер) _•_«__

Фракция ядерных белков 12 3

Ядра 96.92 201,55 226,66

Глобулины - - -Негистоновые белки.

экстрагируемые 0,3 М Had Б.59 11.93 10.45

Гнетов HI . 0,76 1,57 1,68 •

Нуклеосомные гистоны 1.58 7.Об 10.72

Негистоновые (остат.) белки 58.04 121.41 131,49

--f—.—■———-—■—.-■--

I

Ядра необлучонных крыс, инкубированные 0,1 мМ NAD, 9.7 нКи/мм, (1) и 1 mMMAD, 1 мКи/мм, (2). Ядра облученных крыс в дозе 6,7 Гр, инкубированные с 0,1 мМ NAD (3). Интенсивность ADP-рибозилировання белков различной природы определяли. инкубируя ядра (108/мл) с радиоактивным 14C-NAD в среде объемом 5 мл. в течение 20 мин. После этого фракционировали различные ядерные белки по стандартной методике.

Поскольку усиление ADP-рибозил траноферазной активности ядер головного мозга в зависимости от дозы облучения крыс, которая коррелирует с понижением содержания NAD в" нервной ткани, указывает на участие ADP-рибозилирования в

репарацая ядерной ДНК, поэтому нами была предпринятя попытка

изучить влияние процесса ЛОР-рибозилированил на эндогенную ДНК полимеразную активность ядер после рентгеновского облучения крыс.

На рис. 7 представлено влияние NAD-зависимого ADP-ри-зилирования белков на эндогенную ДНК полимеразную активность ядер. Видно, что преинкубация ядер, выделенных из облученных в дозо 1,7 Гр крыс с'НАБ, активирует эндогенную ДНК полимеразную активность в 1,5 раза, тогда как преинкуСация ядер из животных, облученных в дозе 6,7 Гр с HAD. активирует ДНК полимеразную активность в 4,7 раз.

Из рис 7 видно, что ингибитор ADP-рибозил трансферазы ' яияотинамид (20 мМ) снимает эффект NAD на ДНК полимеразную активность, что исключает непосредственное влияние NAD на ДНК полимеразную активность и говорит об участии процесса ADP-рибозилирования в усилении ДНК полимеразной активности.

Как уже отмечали, ADP-рибозил траноферазная активность ядер мозга усаливается в зависимости от дозы облучения крыс. В ядрах облученных в дозе 1,7 и 6,7 Гр крыс ADP-рибозил трансферазная активность увеличивается в 1,6 и 2,3 раза iro сравнению с трансферазной активностью ядер необлученных животных соответственно. Итак, отмечается положительная корреляция между интенсивностью ADP-рибозилирования белков и усилением эндогенной ДНК полимеразной активности ядер мозга.

Известно, что в ядрах головного мозга крыс содержится

в основном ДНК полимераза 0 являющаяся репарирующим Ферментом '(Kimzla, 1985). Исходя из того, что в экспериментах in vitro показано ингиоировавие активности ДНК полимеразы р

ADP-рибознлированием (Yoshiharaeial. .1984.Ohashi et al..

/

1986) можно исключить роль непосредственного ADP-рибозили-рования ДНК полимеразы Р в усилении эндогенного синтеза ДНК в ядрах мозга.

Рис. 7. Эндогенная ДНК полимеразвая активность ядер мозга облученных рентгеновскими лучами крыс в дозах 1.7 Гр (а) и 6,7 Гр (0). 1 - ядра, ве преинкубироваииые с HAD. 2 -ядра, преиякубированние с 1 мЫ HAD, 3 - ядра, проинкубированные с 1 мМ HAD и 20 мЫ никотивамида.

Эндогенную ДНК полимеразную активность ядер мозга определяли при 37°С в течение 30 мин, в среде объемом 0.3 мл. содержащее 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 5 мМ MgClg, 5 мМ Э-мер-каптсотанол. 0.1 мМ dATP. dGTP, dCTP. 3H-dTTP<3 Ки/мм) l.bx'-107 ядра.

Посколъку структурные язмевемя хромата в участках ДНК, подвергавшихся эксцязионноЯ репарация, .однозначно установлены (Hunting et al.. 1985, Dresler, 1965). можно предположить, что ADi^-рибозилирование белков хроматина, ослабляя взаимосвязь белков с ДНК я модулируя структуру хроматина, мояет облегчить проникновение ДНК полимеразн к ДНК-матрице и усилить репарационный синтез ДНК клеток нервной тканн. Об участив ADP-рибозил травсферазы в репарации говорят я эксперименты проведенные с использованием ацет-альдегида я днметилсульФата.

Общеизвестно, что ацетальдегид является продуктом метаболизма спирта. Это вещество содержится в различных пние-вых продуктах, а также в большом количестве в сигаретном дыме загрязняющем воздух (Clerici et al., 1589). При злоу--потреблении алкоголем ацетальдегид увеличивает вероятность образования рака различных органов пиаеварательного и дыхательного дутея, особенно в асоыиацви с курением (Hecht. Hoffman. 1988). Высокую реактивность ацетальдегида обусловливает карбоннлная группа. Ацетальдегид реагирует с аминокислотами. с короткими полилсптидами и макромолекулами. Это вещество образует ДНК-белковые сшивки, индуцирует хромосомные аберрации и обмен между участками сестринских хроматид , (derlei et al.. 193Э). С другрЗ стороны, как уже отмечено.в литературе накоплены данные указывающие об участии ядерной ADP-рибозил травсферазы в различных генетических процессах, поэтому исследование влияния ацетальдегида на процесс ADP-рибозилирования представляет определенный интерес.

АцеталвДегяд разбавляли 150 мМ Натрий фосфатным буфером <рН 7,2), содержащим 120 мМ NaCl и иньекцировали крысам весом 100 г шутрибрюшинно. Ядра из цельного головного мозга получали по стандартной методике и определяли их ADP-ри-бозил грансферазную активность. Из табл.10 видно, что в изолированных ядрах через 18 ч после иньекции красам 20 мкм ацетальдегида ADP-рибозид траноферазная активность заметно увеличивается .

Таблица 10

ADP-риоозил трансфераз^ая активность ядер головного мозга через 18 ч после иньекции крысам ацетальдегида и диметилсульфата

Обработка Включ. 140-HAD в {ADP-риоозу )п

с ^

мкмоль/крыса нмоль/5.10°ядра

Контроль 0 0.90-0,06 100

Ацетальдегид 10 1,25 138.9

Ацетальдегид 20 ' 1.41 1 0.11 156.7

Ацетальдегид 3D ■ 1,33 147.8

Диметилсульфат O.t) 1,23 136.7 •

ДиметилсульФат 5 1.84 - 0.21 204.4

Диметилсульфат 10 1,74 133.3

АСР-рибозил траноферазную реакцию ядер проводили по стандартной прописи <см. рис. 5).

Если предположить, что после иньекции крысам ацетальдегид равномерно распределяется в различных тканях, то можно допустить, что активацию тракоФеразноя активности вызывает Физиологическая концентрация ацетальдегида (ОД-О.ЗмМ) Приблизительно такая жо концентрация ацетальдегида обнару-

Ядерный матрикс, вероятно, представляет собой регуляторную структуру. В литературе накоплены данные, указывающие на участие ядерного матрикса в репликации, транскрипции и в других процессах (Jaikson. 1986, Збарский, 1988. Глазков, 1988. Nakayasu, ßerezney, 1989. Patrioiis. 1990). По-видимому, в клетке, в ядерном матриксе, происходят конформацн-онные изменения, о которых мы пока очень мало знаем. Поэтому дальнейшее изучение матрикса, являющегося скелетом ядра, вероятно, окажется важным для выяснения ряда важнейших процессов происходящих в эукариотической клетке.

Изучение ADP-рибозил трансферазной активности изолированных ядерных матриксов нейронов н глиальных клеток показало. что с матриксами ассоциирована достаточно высокая траноферазная активность (рис. 9).

Об ассоциации ADP-рибозил трансферазы с ядерным мат-риксом говорят и данные представленные в табл. 11. которая наглядно показывает ADP-рибозилирование белков матрикса после преинкубацин изолированных ядер клеток козга с NAD.

Характер изменения ADP-рибозил трансферазной активности ядерных матриксов нейронов и клеток глин, в период пост-нйтального развития крыс аналогичен характеру изменения активности ядер этих клеток. Поэтому можно предположить, что ADP-рибозил трансфераза вовлечена в пролиферацию глиальнш клеток и в биосинтезе РНК клеток головного мозга.

Имеются данные, хотя весьма скудные, говорящие о вовлечении ядерного матрикса и в репарации ДНК (McCready, Cook, 1984. Mull enders et а1., 1984). Об этом указнвают и наши данные. Как видно из табл.12 в ядрах как ингактных, гак и

Рис.9. ЛОР-рибозил траноферазная активность ядерных матриксов нейронов и глиальных клеток в период постнаталь-пого развития крыс: 1 - нейроны, 2 -олигодендроглия.

Для получения ядерных матриксов ядра суспензировали в Бмл буферного раствор^, содержащего 50 мМ трис-НС1. РН 7,4. 0,15 М сахарозу. 50мМ МаС1. 5мМ МдС^, 1мМ р-меркаптоэтанол и обрабатывали панкреатической ДНКазой 1 (10 ед/мгДИК) при 20°С 15 мин. После этого суспензии ядер быстро охлаждали и центрифугировали при ЗОООд 10 мин. Ядерные осадки экстрагировали.буферным раствором, содержащим 10 мМ трис-НС1, рН 7, 4, 2М Май, 0.2 мМ МдС12, 1мМ Р-меркаптоэтанол в течении 10 мин. Процедуру повторяли три раза. Материал, оставшийся после экстракции, промывали 10 мМ трис-НС1, рН 7,4. 0,2 мМ МдС12.1мМ(3-меркаптоэтанолом,0.&Х--ным тритоном Х-100 и трижды этим же буфером но содержащим детергент. Изолированные ядерные матрикси сюдефжали 2-3% ядерной ДНК и 4,6-5* ядерного белка.

Клеточные Радиоак- Клеточные фракции яость X фракции имп/мин

Радиоак-иость Z имп/мия

Ядра

Ядра+5нИ ти-мндин

Ядерный мат-рикс"

172 Б00 100 Ядра 4

Ядра+5мИ ти-0 0 мидия

Ядерный мат-22 420 13 риксч» 7

425 200 100

70 9Q0 16,7

О

О

- Для проведения ADP-ркбозил траво^еразной реакции ядра <2,Змг белка/мл) инкубировали при25° в течение 10 мин' в 5мл буферного раствора содержащего 25 мМ трис-HCl. рН 7.6, 0,25 U сахарозу, 5мМ МдС12. 1мМ б-мерхаптоэтааол. 10S.7 мкМ 14C-NAD (9;08мКи/мм) . После этого ядерный материал центрифугировали и суспендировали в 5мл буфера (50мМ трис-HCl. рН 7,4, 50 мМ КаС1. 0.15 М сахароза) и обрабатывали при 25°С 10 мин панкреатической ДНКазой 1 <10 ед/мг ДНК).ядра охлаждали и центрифугировали при ЗОООд 10 мия и для получения ядерного матрикса экстрагировали (см.рис. 9).

*» Для проведения реакции ADP-рибозилзровання ядра (2,3 мг белка/мл > инкубировали при 25° 20 мип в 5мл буферного раствора (50 мМ трнс-Нй.рН 8,0. 20 мМ МдС12, 1мМ Р-мер-каптоэтанол и 106,4 мкМ NAD <9,1мКи/мм)). Для получения ядерного матрикса ядра центрифугировали и экстрагировали пысокосолевым буферным раствором и только после этого обрабатывали ДНКазой 1.

Изолированные ядерные матриксы клеток головного мозга содержали 1.5-3% ядерного ДНК.

облученных крыс ДНК полимеразная активность гораздо выше по сравнению с полимеразной активностью ядерных матриксов. Однако после облучения животных в дозе 4,2 Гр ДНК полимераз-

ная активность, асоциированвая с ядерным матриксон, заметно увеличивается.

Таблица 12

Влияние рентгеновского облучения крыс на ДНК полиме-разную активпость ядер и ядерного матрикса клеток головного мозга крыс

Клеточная Включение 3Н-с1ТМР. пмоль/мг белка

структура веоблучевные облученные <4.2Гр)

Ядра 4.2 6,0

Ядерные

матриксы 5,1 10.7

Крысы весом 140-150 гр декапи тировали через 12 ч после облучения. При выделении матриксов использовали предварительную обработку ядер ДНКазой 1. Матриксы содержали 5,15,32 ядерного белка и 2.6-32 ядерлоЯ ДНК. ДИК полимораоную активность определяли по стандартиой методике <с.м. рис.7).

Аналогичная картина наблюдалась и при внесении е реакционную среду для определения ДНК полимеразной активности активированной ДНК. Классический ингибитор активности ДНК полимеразы в афндиколин. в нашем случае никакого влияния не оказывал как на ядерную, так и на магриксную ДНК полимераз-ную активность, что согласуется с литературными данными, поскольку, как отмечали, в ядрах головного мозга крыс содержится в основном ДНК полимераза р являющаяся репариру-ющим ферментом.

Итак мы имеем дело с перераспределением ДНК полимеразы"'' Р из внематриксной области ядра в иатриксную область индуцированной рентгеновским облучением крыс. Это говорит об

участаа ядерного матрикса в неплановом синтезе ДНК клеток

первяоЯ ткйнл и еще раз указывавт яя участпо ядерной ADP-рибознл тразсФеразн в репарация ДНК.

О функциональной активности ядерного матрикса клеток нейронов а глии указывает s ассоциирование с матриксом ДНК топонзомеразн 11. которая осуществляя топологические переходы в молекуле ДНК, по видимому играет ваашую роль в различных генетических процессах (North. 1985, Глазков, 1988. Wang. Liu. 1990. Marlnl, Benbcw, 1991).

Данные полученные нами говорят- о той, что преннку-бация натрнксов с NAD ингибирует ДНК топоизомеразу 11 ядерного матрикса нейронов. Ингибитор реакции ADP-рибози-ляровакпл тямндян снимает ингиСирование ДКК топожзонера-за II что говорит о модулирующей роли ADP-рибозял траноФе-разы катрнкса для ДНК топоизомеразной активности клеток головного мозга. Наивысиая активность ДИК топоязомераза II в ядерном матриксе глзальных клеток яовсроадеяяых крас мо-ает указывать на участие ДНК топоязомераза И матракса в пролиферация этих клеток. Полученные нами данные о том. что ДНК топоззомеразная активность ядераого матрикса гли-альных клеток заметно понижается, но всегда выие активнос-ности матрикса нейронов в период постватального развития крыс, дают возможность предположить. что фермент имеет мульглФункцЕональное значение в нервной ткани.

Итак ADP-рибозал транофераза может осуществлять свою биологическую функцию и с помощи рогуляцял активности ДНК тололзомеразы II ядерного натрякса мозга.

-48В целом все вынеизлокенные давние указывают на вовлечение АГР-рнбозпл трансферазы в различные генетические про-. цессы клеток мозга. О мулътифункциояалыюм значение ADP-рибозил трансферазы говорит и обнаружение нами, аналогично клеткам HsLa S3 в ядрах мозга ADP-рдСоза пирофосфорилазв, которая катализирует образование АТР из ADP-рибозн и неорганического пирофосфата:

Мд2+

П ADP-рибоза + П PPi ~ П АТР * П рибоза 5-Р • в

Можно допустить, что (ADP-рибоза >п является своеобразным источником АТР в клетках мозга.

ВЫВОДЫ

1. Ядра клеток головного мозга крыс характеризуются само» высокое ADP-рибозал траноферазной активностью, хотя значительная траноферазная активность ассоциирована и с субцитоплазматически^и (митохондриальная. микросомальная и цитозольная) фракциями.

2. разработана простая и доступная методика получения высокоактивной ADP-рибозил трансферазы из ядер ' головного мозга крыс. Изучены свойства ADP-рибозил трансферазы. Показано, что активность Фермента, являющаяся ДНК зависимой модулируется различными повреждениями ДНК. Катионы

Zn2+, аналогично катионам Ид2*, а также поликатионы <спер-мян, спврмидин), модулируют ADP-риОозил траноферазную активность. Полиамин регулирует дифференциальное ADP-рисоэи-'' лярование белков различной природы.

3. Данные указывают на участие ядерной ADP-рибозил траиоферазы в различных генетических процессах и в первую

очередь в репарация поврежденных участков ДНК. Предполога-ется следующая механизм /частая ДБР-рзбсзил трансфзразы з зг.сц-з-спг.са ргларацгл ДКК ялето;: нервной ткана; фрагментация ДНК ДНК-посрреждавдими агентами активирует АОР-рабозил тргпсфорэзу з стимулирует антеяствность ДГР-раоозилироваяпя хроматина, гем еамям ослабляя взаимосвязь белков с ДНК и модулируя структуру хроматика, что монет облегчить доступность ДНК долакераза к ДНК-матрпцэ а усилить репарационный синтез ДНК.

4. В ядрах клеток головного мозга крыс преимувественно А1)Р-рибозилируются яегястоновые белка, в том числе я белки ядерного матрикса. Одним из ферментов активность которого -

модулируется А1)Р-рибоэялировавиеи является ДНК топонэоме-раза II ядерного матрикса.

5. В ядрах нервное ткани обнаруаен Фермент АСР-рибоза пирофоо^орилаза. которая из АЮР-рибоои я неорганического пирсфоофата синтезирует ДТР. Обнаружение этого Фермента указывает, что <А№-рибоза)п может служить своеобразным источником АТР, что в свою очередь еде раз указавает; о мультнФункшгональном значении /ШР-рибознл трансферазы в щетках нервной ткана.

Спноок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Т.М.Заалипвяли, М.Л.Курдованндзе, К.М.Колхидашвнли. Влияние ионов на ядерную полЖАРР-рибоза) полимеразную активность головного мозга крыс. Сообщения АН ГССР, 1984, Т.113, N3, 637-640.

2. Д.Ш.Сабелашвили. Г.Н.Заалишвили. Ядерная поли(АРР-ри-боза) иолимераза головного мозга крыс. Тезисы докладов.

Рвспублюсанская конференция молоди ученых по еадимгз йжо-полнмеров в биотехнология. Тбилиси, 1986, 28.

3. Т.Ы.Заалишвили, К.М.Колхвдашвиди, А..С. Тамазян. Некоторые аспекты изучения процесса ADP-рибозилирсвания в его возможной биологической роли в ядрах клеток головного мозга крыс. Сообщения АН ГССР. 1986, т.123. N1. 161-164.

4. Т.К. Заалишвяли. ADP-риОознлировавие ядерных белков в аукариотическоа клетке. Изв. АН ГССР, Серия биолог., 1986, Т.12, N2, 77-88. ,

5. Т.Ы.Заалишвили. К.И.Колхидашвили, Д.О.Маргиани, Р.Д. Мвчилашвили. АЮР-рнСозЕЛирование ядерных белков головного мозга крыс. Биохимия, 1988, т.53. N6. 931-935.

6. Т.М.Заалншвили, Н.Ш. Джапаридзе. Р. Д. Мичилашвили. В. Л. Анчабадзе. Изучение поли(АСР-рибоза) полимеразы и ДНК топо-иэомеразы !1 ядер клеток головного мозга в период постна-тального развития крыс. Биохимия. 1989. т.64, N4, 537-541.

7. Т.Ц.3аалкввилк|. Д.Ш.СаСедаивили. Поли<АБР-рибоза) по-лимераза головного мозга крыс: выделение и свойства. Кейро-2ИМИЯ. 1969. т.8. N3 , 385-389.

8. Т.М.Заалиивили, Н.Ш.Джапаридзе, Р.Д.Мичилашвили, М.М, Заалвшвили. Изучение роли поли (ADP- риОоза ) полимеразы в нервной ткаии. Доклады АН СССР, 1989, т.309, N3, 737-740.

9. T\M.Zaalishvili. N.Sh.Dzaparidza. R.D.Michilashvili. Study of ADP-ribosylatLon in rat brain nuclei in vitro. 19th FEBS Meeting. Rome, 1989. July 2-7. Abstract book.

10. T.M.Zaalishvili. Study of ADP-ribosylation in rat'' brain nuclei. Second Bilateral Symposium USSR-USA. Structure of Eukarvotic (Зегюш and Regulation of its Expression.

Tbllisl. 1S69. October 1S-20, Abstract book. pp44.

11. Т.И.Зааливвали. Н.Ш.Дкапарадзе, Д.И.Саболапвпля, P. Д. Ничнлашзили. Влияние катионов биогепина: полиаминов на ядервую*полн(АСР-рнбоза> полиморазпу» активность головного мозга itpac. Е::о:гш-шя. 19СС, т.55,N4,659-634.

12. Т.М.Заалишшдн, Н.Ш.Джапаридзе, Р.Д.Ничилашзнли. Д. 0. Иаргиаян. Влияние рентгеновского облучения крас на MAD пярсфосфорилагную и полМАЕР-рибоза) полимеразную активность ядер головного мозга и на содержание HAD в нервной ткани. Радио биология, 1990, т.30, N1; 38-39.

13. Т.М.Заалязвали, К. И. Колхядапвялз. Взаиморасположение HAD пярофосфсрялази п полЖАБР-рпбозз) полямераэи з ядрах • платок головного мозга крыс. Сообиения АН СССР, 1990, т. 140. КЗ. 605-600.

14. Т.М.Заалаивиля. Н.Ш.Джапаридзе, В.Л.Анчабадза. Изучение роли ядеркого матрикса в репарации ДНК нервной ткани. Изв. АН ГССР. Серия бяолог., 1991, т. 17. Кб, 394-396.

15. Т.М.Заалншвяли.В.Л.Анчабадза, Н.Ш. Джапаридзе; Л.Г.Ка-ландаришвили, К.М.Колхидашвили. Активация ADP-рибозил^траа-сфэразног активности ядер головного мозга крыс ацетальдеги-ДОМ. Сообаеняя АН ГССР. 1991. Т. 141, N2, 381-384.

16. Т. И. Заалиивили, К. Ц. Ко лхи дапвнлн, Д. О. Маргиани. Д. Ш, Са-белашвилн. Субклеточное распределение АВР-рибознл трансфе-разной и ДНК топопзомеразной активностей головного мозга крыс. Известия АН ГССР, Серия Сиологич.1992. т.18. №3. 188.

17. Т.М.Заалишвили. Л.Г.Каландариивили. К.М.Колхидаивили Д.О. Маргиани. ADP-рибоза пирофосфорилазная активность ядер головного мозга крыс. Сообщения АН ГОСР, 1991. т. 143. КЗ. 609-612.