Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение реакции цистеин-специфического ADP-рибозилирования в эритроцитах человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение реакции цистеин-специфического ADP-рибозилирования в эритроцитах человека"

МОСКОВСКЮ ГОСУДАГСТВЕЖЬИ УИВЕРСИТЕТ пени МВЛомоносоел

Биологический факультет

На правах докошен

КОЦ АЛЕКСАНДР ЯКОВЛЕВИЧ

/ УДК 577. 152. 421

КДОНИЕ РЕАКЦИИ ЦИСТЕШ-ОЕШШ£СК(ГО АОР-Р№ОЭИЛИРОВМ«Я е ЗРМТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА

ОЗ. 00. 04. - бяохтяш

. . и .

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических наук

Москва - 1932

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени и.В.Ломоносова

Научный руководитель! доктор химических наук,

профессор, чл.-корр. РАН Е.С.Северин

Официальные оппонента: доктор биологических наук

В.А.Ткачук доктор биологических наук В.И.Ыуронец

Ведущее учреждение - Институт Эндокринологии РАН

( Защита состоится "_я_1992 г. в "_" часов на

; заседании Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском

' государственной университете икеш Ы.В.Ломоносова по адресу»

• р. Москва 118699, Леышскиа гори, ШологическиЯ факультет.

О дасоартацкей моасно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

1 Автореферат разослан_ 1992 г.

I Ученый секретарь ^дадаштзироввнного Совета,

к.б.н. < Ю.Н.Лейкан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ *

Актуальность проблемы. Регуляция значительного числа внутриклеточных процессов осуществляется путем ковалентной посттрансляционной модификации белков. Одним из такта путей являются* реакции моно-АОР-рибозилирования. ADP-рибозилтрансферазной активностью обладают многие токсины патогенных микроорганизмов, действие которых на клетки-мишени приводит к гибели последних или нарушению процессов регуляции клеточного метаболизма. Молекулярные механизмы таких заболеваний, как холера, дифтерия, коклш, ботулизм и др. связаны о проявлениями АВР-рибозклтрансферазноЙ активности токсинов. Функции ксмтонэнтов аденилатцкклазной системы, GTP-связывающих белков (G-белков), били установлены с использованием методов модификации этих белков под действием коклюшного (КТ) и холерного токсинов.

В то ке время описаны раоквдш эндогенного Айр-рибозилирования; субстратами внутриклеточных лпр-рибозилтрансфераз являются многие функционально важные солки. При помощи обратимого АБР-рибозилирования может осуществляться контроль за функционированием ферментных систем (вденилатциклазы, нитрогеназы) и процессов трансляции, репарации и репликации. Несмотря на то, что роль эндогенного ADP-рибозилирования в регуляции состояния клеток изучена в недостаточно, она представляется чрезвычайно важной.

Зачастую об акцепторах ADP-риоозы не известно ничего, кроме их молекулярной массы. Ке изучены также и механизмы, при помощи которых гормоны и нейромедиаторы могут оказывать влияние на протекание реакций AlP-рйбозилирования. Это вдвойне справедливо для реакций цистеин-специфичвского ADP-риоозялирования, которые ln vivo протекают с высокой интенсивностью (Jaoobson et al, 1990). Кроме того, исследование влияния различных соединений на протекание реакций ADP-рибозилирования может способствовать установлению .механизмов регуляции активности adp-рибозилтрансфераз.

Следовательно, изучение и характеристика субстратов, активаторов к ингибиторов реакций иистеин-стоцифиче ского АВР-риОозилирования представляется своевременным и актуальным.

Ц§ЗЬ„настоящей_рабдты заключалась в исследовании реакции цистеин-специфического АВР-рибозилирования в эритроцитах человека.

В данной работе предусматривалось решение еледующих.задач:

Идент1$йК8Ция субстратов эндогенного АСР-риоозилирования и определение акцепторного аминокислотного остатка.

Исследование возможности цистеин-специфического

АШ>-рибозилярования модельных высокомолекулярных субстратов, в частности о-Селка из нервной ткани (ао-Оелка).

Изучение влияния нитрапруссида (НП) на протекание реакий

А»р-рибозилировшшя и выяснение предполагаемого механизма активации *

АЕР-рибозилярования, а также участие в этой реакции извзстных АВР-риоозилтрансфераз.

Поиск других, возшано бодав активных, стимуляторов АНР-рибозилирования и соединений, способных регулировать эту реакцию.

В хода настоящей работы вперше показано существование мембранной и цитетиазматической фора цистеш-споцш^ческой АВР-рноозилтрансфзразы в »ритроцитах человека, способной использовать в качестве надельного субстрата ао-Селок. Проведена идентификация эндогенных акцепторов АЛР-рибозы, при этом установлено, что белок с молекулярной массой 3? кДа, щр-рибогилирущийся го остатку цистеина, представляет собой глицерапьдегг.д-3-фосфат дзгндрогеаазу (ГАФД). Показано, что НИ активирует авто-АВр-риОозидшювание ГАФД, и 3-фосфоглицериношй альдегид (ФГА) стану тфует АВР-рноозилироваше татрачврной форш 1'АЗД из мшад кролика. Проведено исследованяе еяияния различиях соединений на протекание реакции АГО-рибозилироаакия ГАФЯ.

Практич0скдс_значшшв_Е§адтн. Дашшэ чпо влиянию различных соединений, способных высвобождать оксид азота, позволяют разработать новые способы лечения сердечно-сосудистых заболеваний различными органическими нитратами. Помимо этого предложен оригинальный методический подход к установлению эндогенных субстратов ADP-рибозилирования при помощи выделения и иммунохимической идентификации белков.

Апробация работы. Результаты работы доложены на коллоквиуме кефедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 10 симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР (Ташкент, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,

/

обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литература. Работа содержит 176 страниц машинописного текста, Э таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 333 источника.

. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Препараты ГАФД из мышц кролика, из дрокжей и из E.coli были любезно предоставлены Э.А.Сергиенко, Е.В.Кузьминской и К.А.Хорошиловой (НИИ им. А.Н.Белозерского, МГУ).' Синтез [32P]NAD осуществляли энзиматически из [а-32Р]АТР. Мышиные моноклональные антитела (ЖАТ) клонов СБ и G7 были получены к очищенной ГАФД из мышц кролика и предоставлены А.Г.Катрухой (МГУ, лаборатория "Химии ферментов").

Получение мембран.и цитоплазмы.эритроцитов человека. Для получения иэмбран и цитоплазмы использовали эритромассу различных групп крови. Мембраны выделяли в Яа^-буфере, рН 8,0 (Dodge et al, 1963). Выделение Co-белка из мозга крысы проводили по методу Стернвейза и Робйшоу (Stemweis, Robiehaw, 1984).

Выделение ГАФД из мембран эритроцитов___человека___и определенно

активвоста ГАФД. Мемораш эритроцитов человека выделяли по описанному выше методу в течение двух часов и использовали для опыта в тот же день. Для выделения ГАФД мембраны экстрагировали 20 Мл! Ыа-нкреб-буфером, рН 7,8, содержащим 0,2 и Ыаох, центрифугировали, супернатант концентрировали на мембране Апйооп РМ-10 до 0,7 мл а наносили на колонку с Сефакрилом в-200 или Сефадексом 0-100(1,6x26 см), уравновешенную 20 мМ Ыа-НЕМБ-буфвром, рН 7,8, содержащим 50 мМ КаС1. Элюцию вели тем же буфером при 4°. Белок 37 кДа елгаровался острым симметричным пиком с кажущейся мол. массой 72 кДа,

Дегидрогеназную активность ГАФД измеряли при 25° в I м срода инкубации, содержащей 60 мМ КР.,, 60 Ш глицин (рН 9,0), 0,6 Ш ФГЛ и 0,5 мМ наь . Реакцию начинали добавлением фермента, фиксируя прирост оптической плотности при 340 ни в точений 20 с.

Инкубационная смось

для АЮР-рибозилкрования Оо-Оелка (3-10 ккг/пробу) содержала 50 кМ трис-Н01, рН 7,в , 10 кУ датаотреитал (Д?Т), 1 Ш ЭДТА, 2 кй «¿СХ2, ю км текидяк, 1 ку каор, 1 .ч! агр, 0,1 к."4 ост, 0,15?; луброл рх к 1-5 мхМ [-2Р1 (1-5 иска). КТ пород внесением в проб/

активировали в теченка зо мш£ при 37°с в присутствии 20 кй! ДМ, I кй! АТР, ОЛ^-ього луброла РЖ. Конечная концзнтрздня токсина составляла ю миг/мл.' Инкубацию проводила в течение 1 ч при 37°с а реаицщз сстанав^али добавлением денатурирующей смаса. Перед электрофорезом пробы кипятили в течение з »®н. Расщепление связи меченых белков с АЕР-рибозой проводили по известному методу (Моуег et а1,, 1983).

Шахуоа&отая смесь для Бвдогекиого АСР-рябоашшрования мембран вритроцатов человека содераела БО ш трио-нс1, рК 7,8, 10 Ш ДИ, 1 Ш ЭД1А, 2 Ш Ыв012, т0 ММ тийшдин, X »¡И НАВР, 1-2 мкки (32р»Ш)Ц-г> ккЫ), 1кй1 НП и 60 «кг белка мембран. Инкубационная смесь да ¿ПР-рибоаштрования очшцетаа оелкоэ не содержала твмядияа в навр,

концентрация НИ составляла 0,1 Ш, а концентрация белка была 0,1-0,2 мг/мл. Для определения ФГА-зависимого ADP-рибозилирования вместо 0,1 ММ НП в пробы добавляли ФГА до концентрации 0,5 мМ. Инкубацию проводили в течение I ч при 37°, реакцию останавливали добавлением денатурирующей смеси. Пробы кипятили в течение 3 мин. Расщепление связи меченых белков с ADP-рибозой проводили по окончании инкубации. Электрофорез_в jrojna^^ .

Электрофорез вели в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по методу Лэммли (Laemmli, 1970). По окончании электрофореза гель фиксировали, окрашивали Кумасси, отмывали в кипящей воде, высушивали и подвергали авторадаографии. Полосы белков, содержащих метку, просчитывали в толуольном сцинтилляторе КС-106, либо нужные полосы вырезали, ПААГ солюбилизировали я радиоактивность просчитывали. Чаще всего гели сканировали на лазерном денситометре (Шговоап XL. Шмуноблоттинг. Нктроцеллвдсзнне фильтры инкубировали в буферо, содержащем 10 Ш трис-HCl, рН 7,5, 1л- DCA, 0,1% твин-20 и ю мкг шит/мл и окрашивали полосы белков при помощи антимышиных антител, коныогированшх с пероксвдазой (Towbin et al, 1979). ШШЙЙЁЦЩНШШЭЭ' Для проведения тамунопрзцишташш реакцию ADP-рибозилирования останавливали добавлением немеченого NAD до концентрации I' Ш, прибавляли 0,5 мл буфера для иммунопреципитации, содержащего 1% тритона Х-100, 0.156 ДС-Na, 0,4 M Naci, ю мМ ЭДТА, 0,1 M КР^, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5. Затем пробы кипятили в течение I мин, -добавляли 40 мкг очищенных МКАТ, и инкубировали в течение 12 ч при 4°. По окончании инкубации в пробу с антителами 05 вносили белок А-Сэфарозу, инкубировали в течение I ч при 30°, центрифугировали, осадок дваады промывали буфером для икмунопреципитации, к осадку добавляли денатурирующую смесь, пробы кипятили и подвергали электрофорезу. В пробы с ЫКАТ 07 добавляли белок А-Сефарозу, прэдинкубироввнную с избытком кроличьих антимяшкинх антител.

^^матдгра$яя_ГАФД_на_разда1шх_носител С целью изучения возможности авто~А1Р-ри0озилирования ГАФД из мышц кролика и эритроцитов человека подвергали хроматографии на различных носителях. Эксклюзионную хроматографию фермента из эритроцитов человека проводили на Сефадексе с-IOO, Сефакриле S-200 и TSK-G2000SW. В последнем случае очищенный белок инжектировали на колонку TSK-G2000SW, уравновешенную 10 мМ MES-NaOH, рн 6,0. Элюцию вели тем же буфером. Симметричный пик ГАФД имел объем элюции 13 мл, что соответствует мол.массе 72«Да. Перед проведением адсорбционной хроматографии ГАФД из эритроцитов человека наносили иа колонку с гидроксиапатитом, уравновешенную 10 мМ МЕЗ-ИаОН-буфером, рН 6,0. элюицию ГАФД проводили линейным градиентом К^ (0-0,4 И). Белок сходил с носителя одним ликом при конценрации КР, от 0,20 до 0,25 М. Белок также наносили на колонку с КМ-целлвлозой, уравновешенную тем же буфером. Элшцию ГАФД проводили линейным градиентом Nací (0-500ММ). При ионообменной хроматографии белок сходил с носителя одним асскметричным пиком при концентрации HaCl около 340 Ш. ГАФД из мышц кролика подвергала оф$ишюй хроматографии на колонке с иыинодиацетат(т)-аг8розоа, связанной с ?е3+. 1ва-8гарозу (2 мл) набивали в колонку, промывали, пропускали 60 км раотвора *е013, и снова промывали. После нанесения раствора холофермента проводили последовательную элкцию следувдими буферами: 50 мМ трио-HCi, рН 7,8, БО мМ трис-нс1, рН 8,6, БО мМ трис-HOl, рН 9,2, 30 мм NaPlf рН 6,8, в 30 МЫ NaP^, рн Ю.5. Собирали фракции, соответствующие пикам белка, немедленно доводили рН во воех фракцию; до 7,8 и определяли юр-рибозилгрансфоразную вктюшость.

495® з jr$ueoTij лов. Блоттинг осуществляли на приборе для полусухого переноса. Нитроне ллкпзные фильтры промывали буфером, содержащим I мМ трис--Н01, рН 7,5, вырезали полосу белка с мол. массой 36 кДа и иякубирорщда в присутствии фосфодивотерази яда гюрзы (ФДЭ) (50

мкг/мл) при 30° I ч. Раствор кипятили ю мин, лиофилизироввли,. повторно растворяли в 25 мМ KPj-буфере, рН 3,5, и инжектировали на колонку Ultrasphere-ODS, уравновешенную тем хе буфером. Анализ нуклеотидов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках с PEI-целлюлозой и целлюлозой (Pirón, MoMahon, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. АИР-РИБОЗЛЛИРОВАНИЕ СТР-СВЯЗЫВАОДИ БЕЛКОВ

После инкубации мембран эритроцитов с ['2P]NAD и КТ с последующим электрофорезом в ПААГ ' происходило преобладающее включение изотопа в белок с мол.массой 41 кДа, наблюдаемое на азторадиограмме (Рис.,1). В отсутствие коклюшного токсина, т.е. в условиях эндогенного АБР-рибозилирования, изотоп включался в два белка с молекулярными массами 41 и 37 кДа (Рис.1). Идентичность молекулярной массы основного субстрата КТ, а-субъедишцы oi-белка, и белка 41кДа позволяет предположить, что белок 41кДа может относиться к G-Оелкам. С целью идентификации с-белков проводили обработку под действием 2'-3'даальдегвда ía-32P]GTP экстрактов, полученных при солюбилизации мембран различными детергентами. При этом из оОТР-связыващих белков экстрагировался только полилептид с мол.массой 41 кДа. Go-Оелок из мозга быка также был способен связывать оогр. При этом включение изотопа. происходило в а-субъединицу ао-Оелка (данные не приведены).

Инкубация цитоплазмы эритроцитов с Go-белком в присутствии t32p]NAD приводила к интенсивному включению изотопа в белок с мол.массой 39 кДа (Рис.2), что указывало на модификацию а-субъединицы Go-белка эндогенной ADP-рибозилтрансферазой. Аналогичный эффект наблюдался в присутствии мембран эритроцитов. С целью определения локализации эндогенной дцр-рибозилтрансферазы в эритроцитах проводили полное освобождение мембранной фракции от гемоглобина, з также от других цитоплазматических белков, с помощью

т

й

оЦз

1

Рис. 1. Авторадиограмма АВР-рибозклировашшх белков мембран эритроцитов человека. Мембрана инкубировали с [32рзнав в отсутствии (I) или в присутствии КТ (2) , проводили электрофорез в градиенте (8-15%) ШАГ и авторадаографию. На рисунке указаны мол.массы белков в кДа.

разведения мембран и последующего цзнтрафугирования. Мембраны с удаленным гемоглобином в контрольна© набраны в равной степени АБР-рибозилируют а-суоъадйницу бо-белка. Обработка бо-белка, АВР-рибс зкжро в айне га под действием КТ, датоплазш или мембран эритроцитов, с помогав гндрсксилаккна на приводила к изменения включения 15гРЗАЕР-риСозы в белок с мол.кассой 39 кДа. С другой сгорош, значительное уменьшение включения изотопа после инкубации Кб.",оран . с НёС12 не зависело от источника АВ?-рибозилтраиферази, модифгцируюцей ао-белок (Рис.3). Подучвншэ данные указывают не модификацию остатка цистеина Оо-белка, осуществляемую эндогенной Аир-рибозилгрансфвразой эритроцитов человека и, как известно, КТ. Оакт модификации белка с мол.массой 41 кДа в присутствии нав лодтвервдается данными о существовании в цитоплазме эритроцитов человека цкстеин-специфической АСР-рибознлтрансферазы, субстратой которой является б1-белок (Тагшта еЪ а1, 1989).'

а

•12 3

Рис. 2. Авторадиограмма АБР-рибозилированного бо-белка. 5 мкг Оо-белка инкубировали с {згр]ИАИ в присутствия мембран (I), цитоплазмы эритроцитов (2) и КТ(3), проводили электрофорез в градиенте (8-15;«) ПАЛГ' и авгорадиографгао. На рисунке указаны мол.массы белков в кДа.

2. Л)Р-РИБ03ШШР0ВАНИЕ БЕЖА 37кДа (ГАФД)

Инкубация мембран эритроцитов человека в присутствии [^гР№Ай приводила' к преимущественному включении изотопа' в белок с мол. массой 37 кЦа. Нами был изучено воздействие НП на эту реакцию. В присутствии НП многократно (приблизительно в 10 раз) увеличивалось включение изотопа в белок 37кДа- (рис.4).

Обработка мембран эритроцитов с помощью 0,2 М N301 вызывала солюбилизацию белка с мол. массой 37 кДа. Посладувдие стадии концентрирования и гель-фильтрации позволили очистить его до состояния кажущейся гомогенности. Полученный полипептид сохранял способность к включению изотопа при добавлении [апенилат-^РЦШ). В ходе солюбилизацда и виделения сохранялся также стимулирующий эффект

9Ц бб

А

—

г- 66

1 I

-—- 30

> *-4 2 3

Рис. 3. Расщепление связи между Оо-селком и ADP-рибозой под действием Hgci2 и гидроксилашнв. Авторадаоградиограмма ADP-рибозилирсванного Go-белка. 3 мкг Go-белка инкубировали с t32P]NAD в присутствии лпр-рибозилтрансфераз, белки осаждали трихлоруксусной кислотой СШ) , осадок растворяли в 0,5 М Na-HKPES, рН 7,в, инкубировали в течение 30 ыин в присутствии I мы HgCi2 (IA, ЗВ, 6В), ив течение 3 ч в присутствии 0,6 Id гвдроксйламина<2А, 2В, 5В). Контрольные пробы (ЗА, IB, 4В) инкубировали в течение 30 мин. На p¡icyiска указана шл.массц балков в кДа. В качестве источника АЕР-рибозклтрансферазы использовали: А-КГ, 1В-ЗВ-мвмбранн эритроцитов, 4В-6В- цитоплазму эритроцитов.

Щ (рис.4).

Для выяснения характера реакции шдификащв? полипептида с мол. массой 37 кДа его обработку проводили под действием аденин (U-1*C]nad и (карбонил-1 ]Ni» в концентрации 5 мм при удельной активности 40 мКи/ммоль в присутствии или в отсутствие Ш. Включение изотопа происходило только upa использовании аденин (и-1 4cJííad. Таким образом,- никотинамидаая часть iíad не содержится £ иодифцированном поли^ептиде. Включение АЕР-рмбозы, составляющее 8 ммоль/моль белка, максимально для данного препарата.

Получении« после мочения под действием (32P]HAD полипептид с

В

' у*

'. "'Í

—

4 2 3 И 6

9467 43—

36—в та 37-

Рис.4. АБР-риоозилирование оелка с мол.массой 37 кДа эритроцитов человека.Мембраны ; (Г, 4-6)и очищенный полипеп-■' тид с мол.массой 37 кДа (2 мкг; 2, 7-9 и 20 мкг; 3) » • : обрабатывали [32Р]ют в при-

, . : сутствии 10 мм дат (4, 7), в .

. ■ присутствии 10 мМ ДТТ и Ш

ДП I - ✓

; 1 (5, 8), в отсутствие ДТТ, но

1в—V в присутствии НП (6,9). Гели

1 2 ^ 436 7 8 9 окрашивали Кумасси (1-3) и

• подвергали авторадиографии

(4-9). Слева указаны мол. массы белков в кДа.

Рис. 5. Расщепление связи между белком с мол.массой 37 кДа и иэр-рибозой. Авторадиограмма АЕР-рибозилированных белков. Белок с пол.массой 37 кДа (20 мкг/пробу) обрабатывали [ э2р]мах) в присутствии И. Белки осаждали ТХУ, осадок растворяли в 0,1 М Иа-НЕРБЕ, рН 7,8, I инкубировали без добавок 3 ч (I), в присутствии 0,5 М гидроксиламша, рК 7,5, 30 мин (2) и 3 ч (3), в присутствии I мМ ТеС12 30 мин (4), и ФДЭ яда гюрзы (50 мкг/мл) и I мМ ыв012 (5). Затем добавляли разрушающую смесь, пробы кипятили, проведали электрофорез и авторадиографию.

юл. массой 37 кДа обрабатывали ФДЗ ядв гюрзы, что приводило к >свобожденшо радиоактивной метки. С помощью жидкостной хроматогрэфии шеокого давления и тонкослойной хроматографии отщепляемый под действием фдэ продукт был идентифицирован как 5'-амр (табл.1). Шучдтшв данные показывают, что иматао АПР-рибозный остаток пап гереносится на белок.

Таблица I. Хроматографический анализ нуклеотадов, освобоздаемых под действием ФДЭ из радиоактивно меченого белка ЗбкДа.

метод разделения

Относительное количество (■'р]-содержащих нуклеотидов, % от общей радиоактивности

32-

АИР

ADP ADP-рибоза

KAD

жхвд

ГСХ на РЕ1-целлшозв TGX на целлюлозе

93 99 95

3

г 1 5

2

. К реагентам, расщепляющим связь между ADP-рибозой и цистеином белка, относится Hgcig. Обработка adp-рибозшшровашюго полипептида с мол. массой 37 кДа с помощью Hgci2, но не гидрсксиламина вызывает удаление радиоактивности (рис.5). Об абсолютной необходимости тиоловых реагентов для стимуляции Ш реакции ADP-рибозилирования свидетельствует активирующий а®ект датиотоеитола (рис.4).

Вещества, способные освобождать оксид азота, такие как гринитроглицервн. и КЕ натрия, используются в качестве вазодаятаторов, ьызыепщкх релаксацию гладкой мышцы. Обнаружен фермент, «штезирувщий окезд азота из аргинина при участии кислорода в NADPH, что подтверждает существование естественного механизма вазодалэтацни с помощью НО (lionoada, Higgs, 1991). Хорошо известно

свойство ыо активировать растворимую гувнилатциклазу (Boulanger et

/

al. 1S90). В то se время существуют данные о оанр-независимой регуляции клеточных процессов под действием Но (Qarg, Hasaid, 1991), что может быть обусловлено стимулирующим действием оксида азота на эндогенное ADP-рибозилировавзэ балков (Oror.eln et ai, 1991). Подученные результаты свидетельствуют об аналогичном аффекте для белка 37 кДа эритроцихов человека (рис.4).

Значение мол.массы, относительное количество и способность абстрагироваться нз эритроцетарной мембраны с увеличением ионной

5<9-47—

'ЯР

w

м

i; t ■

г1»

12 3 4 3

Ь 7 0 9 10 И 42 13

14 13

Г*"

Рис. 6. йшунобяотгинг ГАФД, Электрофорез проводили в ПЖ-ном ПААГ, белка окрашивали Кумасси (1-5) или переносили на нитроцеллюлозу, которую обрабатывали МКАТ С5 (6-10) или G7 (11-15J. Слева указаны мол.массы белков в кДз. I, 6, II - I мкг ГАФД из шлц кролика. 2, 7, 12 - 10 мкг Оелка мембран эритроцитов. 3, 8, 13 - I мкг очищенного белка 37 кДа. 4, 9, 14 - 2 мкг ГАФД из дрожжей. Б, 10, 15 - I мкг ГАФД кз E.coli.

Рис.7. Иммунопреципитация ГАФД. IIi-ный ПААГ окрашивали Кумасси (1-3) и подвергали авторадаографии (4-8). 1,4 -контрольная проба, не подвергавшаяся иммунопреципитации-2,5 - иммунопреципитат ADP-рибозшшрованного белка, полученный с использованием МКАТ С5. 3,6 - иммунопреципитат ADP-рибозилированного белка, полученный с использованием МКАТ G7. 7,8 -вммунопрецюштацкю проводили в присутствии 50 мкг ГАФД из мышц кролика при помояда МКАТ 05 (7) и G7. (8).

сэ

36-

37—

12 3

4 3 6 7 8

силы позволило предположить, что АДР-рибозилируемый белок является ГАФД. Для проверки этого предположения были использованы МКАТ С5 и 07. По данным шмуноблоттинга из всех мембранных белков антитела обоих клонов 05 и .G7, относящихся к подклассам lgQ2b и ' Igii, соответственно,реагируют только с полипептидом с мол. массой 37 кЦа. Взаимодействует с антителами также очищенный полипептид(рис.6). Оба МКАТ реагируют также с ГАФД из мышц кролика, но лишь МКАТ Gl реагируют с ГАФД из дрожжей. В то же время ни те, ни другие МКАТ не взаимодействуют с ГАФД из £. colt(рис.6), то есть эти МКАТ взаимодействуют с различными участками молекулы ГАФД. Оба ИКАТ способны ишунопреципитироввть ADP-рибозилированный белок" из препарата. очищенной ГАФД (рис.7), что ингибировалось ГАФД из мышц кролика.

Таким образом, нами было показано, что Ш активирует цистеин-специфическое ADP-рибозилированив ГАФД. Этот вывод подтверждается тем, что НП способен в присутствии ДТТ активировать ADP-риоозилирование ГАФД не только из .эритроцитов человека, но также и препаратов фермента из мышц кролика, дрожжей и E.coU (рис.8).

В работах по NO-зависимому ADP-рибозилированию белка ЗЭкДа авторами было постул-тровано • существование ADP-рибозилтрансферазы, стимулируемой оксидом азота (Brune, Lapetina, 1989). Наш были предприняты безуспешные попытки разделения ГАФД и ADP-рибозилтрансферазы (табл.6 и 7). ГАФД и ADP-рибозилтрансфервза соочшцались при хроматографии на различных носителях, что свидетельствует . в пользу существования NO-активируемого авто-АИР-рибозшшрования ГкФД. Вероятно,, описанный Брюне и Лапетина белок ЗЭкДа, представляет собой ГАФД, так как свойства реакции ADP-рибозшшрования этого белка идентичны полученным нами данным для препаратов ГАФД из эритроцитов человека и мышц кролика..

Танака и соавг. (Tanaka et ai, 19Q9) показали "незнзиматическое"

94— 67—

36— t» «»«ss 37 30—_

О цр

18—

к . dfatfillHi illitl'iliHl'htm Цtnlt 4 5 6 ? 8 9 10 11 12

123

Рис. 8. Стимуляция АРР-риОозилирования ГАФД из различных источников под действием НП. Ферменты из E.coli (I, 5, 8, И), дрожжей (2, 6, 9, 12) и мышц кролика (3, 4, 7, 10) инкубировали в присутствии I мМ had и обессоливали при 4° на колонке с Сефадексом G-50, уравновешенной 50 мМ трис-HCi, pH 7,а, содержащим 50 мМ Касч. В пробу вносили по 5 мкг белка. Инкубационная смесь для ADP-рибозилирования очищенных белков не содержала НП (4-6). концентрация НП составляла 0,1 мМ (7-9) и 1 ММ (Ю-lü). По окончании инкубации пробы подвергали электрофорезу в 12$-ном IIAAT, голь окрашивали Кумасси (1-3) и подвергали авторадиографзи (4-12). Слева указаны мол.массы белков в кДа.

ADP-рибозилирование. ГАФД, добавленного к фракционированному сульфатом аммония гомогенату мышц крысы, однако, прямая идентификация белка ЗбкДа (предположительно 1'АФД) не проводилась.

При инкубации ГАФД в присутствии НП и Nad происходило включение ADP-рибозы в белок, однако степень ADP-рибозилирования составляла всего лишь 8 ммоль/моль мономера ГАФД. Подобная сравнительно низкая стехиометрия ADP-рибозилирования может яеляться следствием "неэнзиматического" ADP-рибозилирования, артефактом неоптимальных условий инкубации или же в ходе выделения мембран эритроцитов гэловека или получения препаратов очищенных белков, могут теряться какие -либо факторы, способные либо потенциировать эффект НП, либо самостоятельно активировать ADP-рибозшшрование.

Зависимость включения ADP-рибози в белок от времени инкубации тела трехфазный характер. Сравнительно быстрый линейный рост

Таблица 2. Хромогография ГАФД из .эритроцитов человека на различных носителях. Хроматографию проводили как описано в разделе "Материалы и метода". Начальную скорость определяли при инкубации в присутствии 0,1 мУ НП в течение 5 мин, а степень АОР-рибозилирования в течение 2 ч. В скобках указано, сколько раз проводили эксперимент. Для кзкдого эксперимента использовали 10 различных фракций, начальная скорость и степень Аор-рибозилирования в которых были одинаковы по всему профилю элюции.

носитель для хроматографии начальная скорость степень нитропру-

витропруссид-активи-. ссид-активируемо-руемого АОР-рибозили- го АБР-рибозили-рованил, ¡8 от рования, % от

исходного исходного

Сефадекс (3-100 98+4 <п=5) 95+1 б (п=6)

Сефакрил 3-200 Ю2+8(п=7) 97±18(п=7)

ТБК-ОгОООЗИ 9Э+12(п=3) 82+16(11=3)

гидроксиапатит 89+12(п=3) 95+24(п=4)

КМ-целлюлоза 86+19(п=4) 82+18(п=3)

Таблица 3. Хроматография ГАФД из мышц кролика на МА-агарозе со связанным Ге3+. Степень АОР-рибозилирования определяли при инкубации в течение 2 ч в присутствии 0,1 мМ НП.

условия элюции пика лка содержание бежа в степень АБР-рибо-пике, % от исходного зилирования, ¡6 от исходного

трио-ЯС1, рН 7,8 31 98

ТРИС-НС1, рН 8,6 38 95

трис-нс1, рН 9,2 I 27 98

НаР^, рН 6,8 0,7 102

НаР1, рН 10,5 ч 4 83

АБР-рибозилирования наблюдается до 2-2,5 ч инкубации, а затем уровень АИР-риОозилирования оставался постоянным вплоть до 10 ч.

Скорость модификации ГАФД как в мембранах, так и на препаратах очищенного Сэлка,. зависела от концентрации НП. При этом и б том, и в

другой случае характер зависимости был двухфазный - при низких концентрациях наблюдался рост Аор-рибозилирования вплоть до максимальных значений (0,1 мМ для ГАФД и I мМ для мембранного препарата), а при повшаенни концентрации HJI происходило ингиоированив включения изотопа. Константа активации составляла для мембранного препарата 300 мкМ, а для очшценного ГАФД 10 мкМ. Такая разница констант объясняется тем, что мембрашад фракция загрязнена остатками гемоглобина, который выступает в качестве "ловушки" для N0, стехиометрически связывая оксид азота (Feelisoh, Noak, 1987).

Степень АБР-рлбозилирсвания зависела от концентрации ДГТ, максимальная активация наблюдалась в присутствии 10 мМ ДГТ, при дальнейшем увеличении концентрации ДТТ степень ADP-риоозшшрования уменьшалась.

На основании этих результатов мошо заключить, что условия проведения реакции, использованные нами для определения стехиометрии ADP-р.чСазгшгрсвеяия (10 Ш ДТТ, 0,1 ш нитропруссвда, инкубация в течение 2 ч), являются оптимальными.

Извэстныэ свойства "неэнзш,этического" АСР-рибозилирования, описании в работах Гилла с соавт. и Хильца с coaBT.(Giii, wcolkalle, 1991 i Hiiz et al, 1984): реакция равновесная (протекает в течете 12-14 ч), акцепторным аминокислотным остатком является лизин, реакция ингибируется избытком немеченой ADP-рибозы и никотинамидом. Для проверки этой возможности нами был предпринят ряд экспериментов.

I. На одном и том же препарате ГАФД включение ADP-рибозы составляло 8-ГО ммоль/моль белка при использовании аденин[и-14сдеАВ (Б Uii), [33Р)1Ш) (100 мкМ) И (32P]HAD (10 МКМ).

?.. Апофермвнт из мшпц кролика, любезно предоставленный Э.;., Со огненно, и холофермект подвергались . азр-рябозилированию с одинаковой скоростью.

3. Вклвчекие [32р]ADP-рибозы в белок незначительно

ингиоировалось под действием I мМ немеченой ADP-рибозы и 10 мМ никотинамида, но радиоактивность практически на обнаруживалась уже в присутствии 0,1 Ш немеченого NAD.

Суммируя вышеизложенное следует исключить возможность "неэнзиматического" ADP-рибозилирования в случав

нитропруссид-зависиыой реакции для, по крайней мере, димерной формы ГАФД на препаратах очищенного белка по следующим причинам: реакция протекает необратимо; отсутствует равновесие между свободной и связанной с белком ADP-рибозы; NAD подвергается расщеплению с последующим переносом ADP-риОозы в активном центре ГАФД; при использовании NAD, содержащего 'различные радиоактивные изотопы,, степень ADP-рибозилирования не меняется, то есть изотопным эффектом можно пренебречь; акцепторным аминокислотным остатком является цистеин.

Как видно из рис.9 ADP-рибозилирование тетрамерной формы фермента из мышц кролика активируется под действием ФГА. Удельное включение ADP-рибозы в этом случае составляет 17 ммоль/моль мономера ГАФД или 0,068 моль/моль тетрамера. Эта величина почти в 2 раза превышает степень ADP-рибозилирования димерной формы под действием НП. В то же время активирующее действие НИ более ярко выражено при использовании в качестве субстрата (фермента) димерной формы ГАФД. Стимулирующий эффект ФГА проявлялся только в присутствии ДГТ.

Подобно продукту реакции НП-зависимого ADP-рибозилирования, в случае ADP-рибозилирования в присутствии ФГА связь между белком и ADP-рибозой расщеплялась под действием Hgci2 и была устойчива к гидроксиламину, однако, оптимальная концентрация Hg012 составляла 10 мМ, а не I мМ, как' при НИ-активируемой реакции.

Разумно было бы предположить, что активация ADP-рибозилирования ГАФД под действием ФГА влияет на протекание дегидрогеназной реакции. Арсенат и фосфат не оказывал существенного влияния на

т

тшшв /В>Р-нвозшшмшщ»я, % к

а

ЕЯ- з-м

-Ш

-Ш

_ESS

-•л

t»uTpa»urn лиме»

долш( А***'

«мми

rtrtant*

Рис. 9. Активация adp-рибозилирозания ГАФД под действием Ш и ФГА. Димеры ферментов из эритроцитов человека и мышц кролика получали путем гель-фильтрации на колонке с Сефакрилом S-200 при 4°. Тетрамерную форму фермента получали обессоливанием холофермента, предынкубированного в присутствии i мМ nad, на колонке с Сефадексом G-БО, уравновешенной буфером, содержащим 60 мМ трис-нс!, рН 7,8, при 20°. Контрольная прооа не содержала Ш и ФГА.

¿БР-рибозилироввкне (данные не приведены). Помимо этого, включение изотопа не зависело от концнграции nad от 5 мкМ до 100 мкМ (обычная гиперболическая зависимость в случае двгидрогеназной реакции). Полученные результаты свидетельствуют о том, что реакция ADP-рибозилирования не имеет отношения к протеканию двгидрогеназной реакции или, по крайней мире, не является следствием окисления ФГА.

Данные, приведенные на рис.10, свидетельствуют о том, "что пояяжпость протекания АПР-рибозилтрансферазной реакции определяется скорее всего конформационным состоянием ГАФД. При одновременном измерении догидрогеназной активности и ADP-ркбозллирования нами были зыявлонн следующие особенности!

-ADP-рабозилирование характеризовалось начальным лаг-периодом

Рис. Ю. Влияние ФРА на АОР-рибозилирование и дегидрогеназную активность ГАФД. Тетрачерную форму ГАФД из мышц кролика инкубировали в присутствии ФГА в течение указанного времени. Через определенные промежутки отбирали аликвоты для анализа содержания АВР-рибозы методом электрофореза с последующей авторадаографией (левый график, 100» соответствует I" ммоль АОР-рибозы/моль мономера ГАФД) и для определения дегидрогеназной' активности (правый график, 100» соответствует удельной активности 140 мкмоль/мин/мг бежа).

(около 20 мин), переходящим в стадию быстрого роста включения

АБР-рибозы, аналогично нитропруссид-активируемой реакции; через 2ч

достигалось плато.

-дегадрогеназная активность ГАФД в тех же условиях

ингиОировалась на 70% с лаг-периодом, составлявшим 20 мин.

Такое сходство протяженности лаг-периодов позволяет

предположить, что АйР-рибозилироваше связано .со сравнительно

медленным переходом всех (или части) молекул фермента в какое-либо

иное, отличное от исходного, состояние. .'

Зависимость скорости АЛР-рибозилирования от концентрации ФГА позволяет определить константу активации, равную 2 мкМ, 'что значительно отличается от константы Михаэлиса дегидрогеназной реакции (50 мкМ). Эти данше позволяют сделать вывод о том, что для протекания АБР-рибозилирования необходимы очень низкие концентрации ФГА (около I мкМ). При соотношении ГАФД и ФГА 1:2 (моль/моль) протекает ацилирование фермента. Ацил-фермент подвергался АВР-рибозилированию в отсутствие ФГА в среде инкубации. Реакция характеризовалась теми жэ особенностями, что и АЮР-рибозилированш деактированного белка в присутствии 0,5 к!1 ФГА:- отсутствала зависимость от концентрации N40, 20 мМ кр^ на влиял на протекание Аяр-рибозилироваяия (данные не приведены).

Данные по деаотвию различных соединений на АЮР-рибозилирование ГА©Д суммирована в табл.4.

Несмотря на то, что реакция АЕР-рибозилирования каждого препарата ГАФД обладала определенными особенностями, можно сразу же отметить ряд обягих свойств»

- АСР-пибозопэрозаниэ всех форм фермента ективируется в той или няой степени в присутствии 2 к!.! НйС12, I мЫ ЭДХА.

- ионы Са2+ и никотинамид не оказывают существенного влияния на АВР-ркбозилзгрование.

- КР4 и зрсенат оказывают сходное между собой действие на все форм фермента, при этом нитропруссид-завиоимоэ АЮР-рибозилирование растворимых белков ингкбируется, а АВР-рибозилирование тетрамерной форка ГАСД а связанного с мембраной ферж;та Ективируется.

- не Е-таяет на нгропруссяд-завнсйлоо АБР-рибозилирование, но ягач'-излысо активирует АВР-рибозилкровеикэ .з отсутствие 1Кггропрусседа.

- ЗГА иятиЗкрует штропруссид-активируемое АПР-рибозилирование,

так как нитропруссид реагирует с альдегидами таким образом, что высвобождения N0 не происходит (Leeuwenkamp et al, 1984).

- ADP-рибоза и атр значительно ингибируют ADP-риОозилирование всех форм фермента (однако, не настолько, чтобы можно было говорить о реакции " неэнзиматического" ADP-рибозилирования), вероятно, на конкурентной по отношению к MAD основе.

На основании приведенных в табл.4 данных нельзя сделать более детального сравнительного анализа. Во-первых, на

ADP-рибозилирование ГАФД, связанного с мембраной, оказывают влияние другие белки, фосфолипиды и эндогенные нуклеотида. Во-вторых, связанный с мембраной фермант, а также димерыые формы ГАФД практически не обладают дегидрогеназной активностью, в отличие от тетрамера из мышц кролика. В третьих, за 100% в каждом случав принимали разные величины ADP-риоозилирования, при этом различными были и площади пиков на авторадаограмме (выражены в относительных единицах).

ADP-рибозилирование в отсутствие и в присутствии нитропруссида различных форм ГАФД имеет ряд особенностей, свидетельствующих о. возможных путях регуляции ADP-риоозилирования под действием ионов и нуклеотидов. ' .

Данные литературы свидетельствуют в пользу того, что изучаемая нами реакция ADP-рибозилирования ГАФД, может протекать, по крайней мере, In vitro. Блох и соавт. (Blooh et al, 1971) обнарукили, что выделенная из мышц кролика ГАФД вместо предполагаемого кофермента NAD содержит в активном центре ADP-риОозу. На способность ГАФД гидролизовать ы-гликозидную связь между никотин амидом и ADF-рибозой. указывает то, что мономерная форма фермента обладает урацил-ДНК гликозидазной активностью (Meyer-Siegler et al, 1991). Существование ADP-рибозилирования ГАФД ставит ряд вопросов о его функциональном значении. Низкая степень включения, составляющая 8-15 ммоль

2Z

Таблица 4. Влияние различных соединений на аор-рибозилирование ГАФД. 1-мембраны эритроцитов человека инкубировали в присутствии I мМ нитропруссида, 100Я-230 отн.ед.; 2-очшценный ГАФД из эритроцитов человека инкубировали в присутствии 0,1 мМ нитропруссида, 100^-460 отн.ед.; З-димерную форму ГАФД из мышц кролика инкубировали в присутствии 0,1 мМ нитропруссида в тех же условиях, что и димврную форму ГАФД из эритроцитов человека, 1СШ-430 отн.ед.;4-тетрамерную форму ГАФД из мышц кролика инкубировали в отсутствие НП, 100$-48 отн.ед.; 5-тетрамерную форму ГАФД из мышц кролика инкубировали в присутствии 0,1 мМ нитропруссида в тех же услоеия, что и диморную форму ГАФД из эритроцитов человека, 10055-30 отн.ед..

эффекторноо соединенна

ADP-рибозилтрансферазная активность, & от контроля

I ' 2 3 4 5

контроль 100 100 100 100 100

2 KM MgOlg, I ММ ЭДТД 110 196 205 141 313

0,1 т CaOlp, 112 96 102 95 90

го мм хр1 138 49 52 165 40

го мМ арсвната натрия 140 49 51 271 42

ю щ kmn 90 S2 105 453 95

ЮШ никоткнамида 82 ' 88 71 . 76 94

I мМ ФГА 6 2 8 2470 2

[ мМ ADP-рибОЗЫ 64 25 29 24 23

с т AT? ' 46 94 40 12 40

цегидрогенвзная активность, <1 <0,5 <0,5 140 140

жшль NADH/МИН/МГ белка

iDP-рибозы на моль мономера ГАФД, может означать, что эта. реакция зуществэнно не сказывается на участии фермента в гликолизе. С другой зторонн, возмоено, ADP-рибозилирование играет роль . во :'гг;трзклвточной локализации фермента. Например, известно, что в гкелегкнх мышцах ГАФД участвует в образовании контакта между кигидропиридин-чувствительным Ca" -каналом сарколеммы и цистернами зархоплазматического ретикулума (Brandt et al, 1990). Нельзя гсклвчить и того, что ГАФД имеет изначально модифицированный

ADP-рибозой цистеин, что существенно занижает полученную величину включения ADP-риОозн. Эти возможности, впрочем как и многие другие, безусловно, нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке.

вывода

1. Показано существование двух форм (мембранной и цитоплазматической) цистеин-спецкфической ADP-рибозилтрансферазы в эритроцитах человека, использующей в качестве модельного субстрата Go-белок.

2. Показано, что нитропруссид активирует цистеин-специфичесхое авто моно-АОР-рибозилированив глицораяьдегад-3-фэсфат дегидрогёназа эритроцитов человека.

3. Показано, что З-фэсфоглицериновый альдегид активирует цистеин-специфическое моно-АОР-рибозилирование глицеральдогид-3-фосфат дегидрогеназы из мышц кролика.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, опубликованных по теме диссертации.

1.Коц А.Я., Скурат A.B., Буларгина Т.В. Изучение субстратов ADP-рибозилтрансферазы эритроцитов человека //Биохимия.- 1990.- Т. 65.- Стр. II69-II76. -

2. Скурат A.B., Коц А.Я., Буларгина Т.В., Северин Е.С. Идентификация GTP-связывавдих белков мембран эритроцитов человека // "Механизм регуляции клеточной активности" Тез. докл. 10 симпозиума биохик. обществ СССР-ГДР.- Ташкент.- 1989.- Стр. 70. .

3. Kotz A.Ya., Skurat A.Y., Sergienlco Е.А., Bulargina Г.У., Severin E.S. Nitroptueside stimulates the oysteine-speoifio mono (ADP-ribosylation) of glyoeraldehyde-3-phOBphate dehydrogenase

of human erythrocyteB/ZFEBS Lett.-1992.-У.300.-N.1.-P.9-12.