Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование долголетия и старения на модельных линиях Musca domestica L. и в популяции человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование долголетия и старения на модельных линиях Musca domestica L. и в популяции человека"

На правах рукописи

СОМОВА РЕГИНА ШАМИЛЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДОЛГОЛЕТИЯ И СТАРЕНИЯ НА МОДЕЛЬНЫХ ЛИНИЯХ Musca domestica L. И В ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ДЕК 2013

Уфа 2013

005543544

005543544

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Беньковская Галина Васильевна

Официальные оппоненты:

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Доктор биологических наук, доцент

Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Заведующая лабораторией молекулярной генетики человека

Колосова Наталья Гориславовна

Ведущая организация :

Доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт цитологии и генетики СО РАН Заведующая сектором геномной и постгеномной фармакологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

2013 г. в

•а

Защита диссертации состоится

на заседании диссертационного совета ДЙ02.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: http://ibg.anrb.ru.

Автореферат разослан «АЗ» ноября 2013 і

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Во второй половине XX века сформировался феномен "седеющего населения". Произошло увеличение численности лиц пожилого и старческого возраста в развитых странах мира, а также и в Российской Федерации. В связи с выраженной тенденцией постарения населения актуальной и социально значимой является задача сохранения физических, психических и интеллектуальных качеств человека в преклонном возрасте. Очевидно, что решение такой сложной задачи неразрывно связано с развитием фундаментальных представлений о причинах и условиях вариабельности продолжительности жизни (ПЖ), о феноменах старения и долгожительства.

ПЖ представляет собой сложный количественный полигенный признак, наследуемость которого составляет около 25%. У организмов разных систематических групп выявлены гены, влияющие на ПЖ, многие из которых являются эволюционно консервативными. Большое внимание уделяется поиску аллельных вариантов генов, предрасполагающих к большей или меньшей ПЖ человека. Однако к настоящему времени полиморфизм генов-кандидатов долголетия исследован в ограниченном числе популяций и полученные результаты неоднозначны. Поэтому важной задачей является исследование полиморфизма генов-кандидатов старения и долголетия в популяциях разных народов мира В нескольких независимых исследованиях подтверждены ассоциации с долголетием человека для полиморфных локусов генов АРОЕ, FOXOIA, F0X03A и АКТІ [Franceschi et al., 2007; Lunetta et al., 2007; Lescai et al„ 2009; Newman et al., 2010; Boyden et al., 2010; Sebastiani et al., 2010; Deelen et al., 2011].

Существует важный аспект проблемы вариабельности ПЖ, связанный с поддержанием адаптивного потенциала популяций, их пластичности. Популяции гетеро-генны по признаку ПЖ. В них присутствуют субпопуляции особей, для которых характерны разные жизненные стратегии, ассоциированные со снижением или, напротив, повышением ПЖ (другими словами, с ускоренными или замедленными темпами старения). Так, в антагонизме с ПЖ находится высокая плодовитость. Исследование генетического полиморфизма субпопуляций организмов, запрограммированных на короткую и длинную ПЖ представляет значительный интерес. Эту возможность, прежде всего, предоставляют линии модельных организмов, сформированные по признаку разной ПЖ.

В целом общее положение о роли генетического полиморфизма в вариабельности внутривидовой ПЖ и сопряженных фенотипических признаков экспериментально

мало обосновано. В исследованиях по генетике старения и долгожительства, проводимых на модельных объектах, этот аспект проблемы практически не изучен. Природный полиморфизм описан для сравнительно небольшого числа генов известного модельного организма - Drosophila melanogaster [Hasson et al., 1998; Balakirev, Ayala, 2003; Palsson et al., 2004]. В отдельных работах была выявлена взаимосвязь природного полиморфизма с количественными признаками, включая ПЖ [De Luca et al., 2003; Carbone et al., 2006]. Ha Drosophila melanogaster впервые показана функциональная связь между полиморфизмом гена Lim3, определяющего развитие нервной системы, и ее ПЖ [Rybina, Pasyukova, 2010]. Значительный вклад в решение этой проблемы могут внести исследования на разных модельных организмах, в том числе на комнатной мухе. Комнатная муха Musca domestica L. входит в ряд объектов, на которых исследуются генетические основы резистентности к инсектицидам, фотопериодической регуляции поведенческой активности, механизмы определения пола [Scott et al., 2009]. Небольшие размеры объекта, быстрая смена поколений, удобство содержания, легкая синхронизация развития и получение больших количеств насекомых на нужной стадии компенсируют недостаточность сведений о геноме комнатной мухи.

В популяциях людей, в отличие от популяций модельных организмов, полиморфизм генов хорошо изучен, но из популяции людей трудно вычленить субпопуляцию, запрограммированную на «меньшую» ПЖ. Одним из подходов, позволяющим выявить генетические особенности субпопуляций человека, предрасположенных к разной ПЖ, может выступать анализ ассоциаций с возрастом аллельных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия. Проведение такого рода исследования в популяциях человека как возможно, так и целесообразно.

Цель исследования: анализ генетического полиморфизма в модельных линиях Musca domestica L. с различной продолжительностью жизни и поиск полиморфных локусов, ассоциированных со старением и долголетием в популяции человека.

Задачи исследования:

1) формирование и поддержание линий Musca domestica L. с разной продолжительностью жизни;

2) оценка фенотипических характеристик в инбредных линиях Sh28 и L2 (продолжительность жизни имаго, скорость развития преимагинальной стадии, плодовитость, выживаемость потомства, продолжительность репродуктивного периода, устойчивость к стрессам);

3) поиск полиморфных ДНК-маркеров для исследования генетических основ ПЖ Musca domestica L.;

4) анализ ассоциаций с возрастом в популяции человека полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия: генов интерлейкина 6 (IL6, -572G>C, rsl 800796), интерлейкина 10 (ILIO, -6270А, rsl800872), субъединицы бета интерлейкина 12 (IL12B, 1159С>А, rs3212227), фактора некроза опухолей альфа (TNF, -308G>A, rsl800629), янус киназы 1 (JAK1, 32454 С>Т, rs310216), янус киназы 3 (JAK3, 14385 С>Т, rs3212780), белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 1 (STAT1, 14228А>С, rsl2693591), белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 3 (STAT3, 19006G>C, rs2293152), белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 5А (STAT5A, 1985Т>С, rs9889323), субъединицы р150 (р50) ядерного транскрипционного фактора «каппа би» (NFKB1, 28081564Т>А, rs4648110), белка р53 (ТР53, p.72P>R, rsl042522), белка Вах (ВАХ, 919A>G, rsl805419), белка Вс12 (BCL2, 1400160Т, rsl2454712), траскрипционного фактора F0X03 (F0X03, c*35-2764A>G, rs3800231), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF1, 17685A>G, rs5742632).

Научная новизна. Впервые сформированы линии модельного организма Musca domestica L. с различающейся продолжительностью жизни. Впервые описана ранее не выявленная для имаго комнатной мухи мутация ломкости крыльев (fw- fragile wings) с зависимой от возраста экспрессивностью. Выявлены различия по частоте встречаемости мутации kdr в гене vsscl, определяющей резистентность к инсектицидам, между линиями S, Sh28 и L2 комнатной мухи.

Впервые охарактеризовано распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия IL6 (-572G>C), ILIO (-6270А), IL12B (11590А), TNF (-308G>A), JAK1 (324540T), JA КЗ (143850T), STAT1 (14228A>C), STAT3 (19006G>C), STAT5A (1985T>C), NFKB1 (28081564T>A), TP53 (p.72P>R), BAX (919A>G), BCL2 (1400160T), F0X03 (c*35-2764A>G), IG FI (17685A>G) в разных возрастных группах, включая стариков и долгожителей, в популяции татар. Выявлены ассоциации с возрастом аллельных вариантов этих генов у мужчин и женщин. Определены как генотипы, предрасполагающие к меньшей ПЖ, так и генотипы, способствующие долголетию.

Научно-практическая значимость работы. Сформированы линии модельного организма Musca domestica L. с различающейся ПЖ, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярно-генетических основ старения и долголетия, а также как тест-объекты для скрининга предполагаемых геропротекторов.

Полученные в ходе исследования результаты представляют собой новые знания в области генетики человека, которые дополняют и расширяют представления о роли полиморфизма генов в старении и долголетии. Они могут иметь значение для разра-

ботки системы предикторов ПЖ, а также и геропротекторов для разных возрастных групп. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов по генетике на факультетах биологического профиля в университетах и других ВУЗах.

Степень достоверности результатов. Все результаты основаны на обширных экспериментальных исследованиях и анализе фактических данных с помощью современных статистических методов.

Апробация результатов работы. Материалы работы представлены в виде устных и постерных докладов на следующих конференциях: VI съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), VII Межрегиональное совещание энтомологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011), «European Human Genetics Conference» (Amsterdam, 2011), Международная научная конференция «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011), «Sixth International Symposium on Molecular Insect Science» (Amsterdam, 2011), Всероссийская школа-конференция молодых ученых (Уфа, 2012), «2nd International conference Genetics of aging and longevity» (Москва, 2012), V всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Новосибирск, 2012), Конференция ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013), «Genome Instability and Human Diseases» (Санкт-Петербург, 2013).

Конкурсная поддержка исследования. Исследования были поддержаны грантами РГНФ (№ 08-06-00426а), РФФИ (№ 10-04-01614), РФФИ -р_поволжье_а (№ 1104-97005), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № П325).

Публикации. По основным результатам исследования опубликовано 19 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых научных изданиях, 4 из них в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в зарубежном научном издании.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 3 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Она изложена на 173 страницах машинописного текста. Список использованной литературы включает 392 источников, в том числе 354 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Имаго комнатной мухи содержали в стандартных условиях по принятой методике (Рославцева, 1978). Линии Short span general (Shge„) и Long span general (Lge„) получали путем массового отбора на раннее и позднее репродуктивное усилие из исходной линии S (Cooper). Линии Sh28 и L2 получали путем индивидуального отбора на короткую и продленную ПЖ имаго в парах, отобранных из массовых линий Shgm и Lge„. В массовых линиях отбор проводили в каждом поколении. Показатели приспособленности (продолжительность развития на преимагинальных стадиях, выживание потомства, плодовитость, длительность репродуктивного периода) и чувствительность к стрессорам разного типа определяли для каждой линии в ряду экспериментов по описанным методикам (Беньковская, 2009, 2010). Для оценки чувствительности к токсическим и температурному стрессам использовали стадию личинок, реакцию на изменение светового режима оценивали на стадии имаго. В качестве стрессоров использовали химические нейротоксиканты, измененную продолжительность светового дня и резкие изменения температуры. ПЖ имаго определяли в ходе повторяющихся через 10 поколений экспериментов в 5-кратной повторности по 40 особей. Ежедневно отмечали количество погибших особей с учетом их пола и фенотипа. Наблюдения продолжали до вымирания всей когорты. Выявление мутации «ломкое крыло» (fw) проводили у особей из линий Shge„, Lge„, Sh28 и L2. Для анализа наследуемости признака самцов с фенотипом fw скрещивали с виргинными самками, у которых данный фенотип не наблюдался. Учет количества имаго с фенотипом fw проводили спустя 3540 суток с момента выхода из пупариев. Гибридологический анализ для выяснения влияния родительских генотипов на ПЖ потомства проводили в трех независимых сериях реципрокных скрещиваний между имаго из линий Sh28 и L2. Потомство F1 содержали по стандартной методике, регистрировали длительность развития на пре-имагинальной стадии, плодовитость самок и ПЖ самок и самцов.

Выделение ДНК из насекомых проводили методом ферментативного протеоли-за с протеиназой К [Aljanabi, Martinez, 1997] с фенол-хлороформной экстракцией [Маниатис, 1984; Chomczynski, Sacchi, 1987]. Мутацию kdr гена натриевых каналов Vsscl выявляли с использованием метода ПЦР-ПДРФ [Rinkevitch et al., 2006]. Для RAPD-ПЦР использовался праймер 5'- GTTTCGCTCC -3' [Сидоренко, Березовская, 2001]. Измерение длины амплифицированных последовательностей проводили в программе GelAnalyzer [Lazar, 2010]. Достоверность различий между группами считали по матрицам попарных генетических расстояний между особями всех групп с исполь-

зованием теста Мантеля [Mantel, 1967; Mantel, Valand, 1970; Sokal, 1979] в программе Passage 2 [Rosenberg, Anderson, 2011].

В соответствии с требованиями биоэтики было проведено анкетирование 1683 жителей Республики Башкортостан в возрасте от 13 до 109 лет, татар по этнической принадлежности, из них 759 мужчин и 924 женщины, в том числе 352 лица пожилого, 601 лицо старческого возраста и 184 долгожителей. Выборку дифференцировали на отдельные возрастные группы согласно классификации, принятой на 7-й Всесоюзной конференции по проблемам возрастной морфологии, физиологии и биохимии. ДНК из цельной венозной крови человека (8-10 мл) выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции. Типирование аллельных вариантов генов проводили методом ПЦР или ПЦР-ПДРФ. Подбор условий проведения эксперимента, последовательностей олигонуклеотидных праймеров и рестриктаз осуществляли с помощью электронных баз данных (www.snopper.chip.org, www.ncbi.nlm.gov/SNP) и пакета программ DNASTAR V.5.O. Для статистического анализа результатов исследования использовали программное обеспечение MS Excel 98 (Microsoft), компьютерную программу GENEPOP, а также пакет программ SPSS (V. 13.0). При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей применяли точный критерий Фишера или критерий с поправкой Йетса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипический полиморфизм в модельных линиях комнатной мухи

Модельные лабораторные популяции комнатной мухи, отличающиеся по многим фенотипическим показателям, представляют особый интерес, поскольку позволяют исследовать многие процессы на органном и тканевом уровне у отдельных особей, и в то же время позволяют выявлять различные популяционные закономерности, в том числе и изменения ПЖ [Zwaan et al., 1995; Reed, Bryant, 2000; Matsushima et al., 2007]. Многие корреляции признака ПЖ с другими демографическими характеристиками - репродуктивным потенциалом, жизнеспособностью и скоростью развития потомства, а также формирование адаптивных реакций изучаются именно на модельных популяциях комнатной мухи [Fletcher et al., 1990; Kence, Kence, 1993; Reed, Bryant, 2004].

Линии Sh28 и L2, выделенные как инбредные из полиморфной линии S, достоверно отличаются друг от друга по показателям минимальной и максимальной ПЖ поколения. Линия Sh28 отличается по минимальной и средней ПЖ и от исходной

линии (рис. 1), тогда как для линии Ь2 показано достоверное отличие от исходной линии по максимальной ПЖ.

Минимальная продолжительность жизни

100 ^упш ВО 60 40 20 0

_

Sh2t

L2

Максимальная продолжительность жизни

100 СУ™"

а

80 60

40 20

Sh28

, Рисунок 1. Показатели ПЖ в линиях комнатной мухи. Т - достоверное отличие от исходной линии (р < 0.01)

І40

І зо

І 20 і 101 oJ

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46

сутки

1 6 11 16 21 26 31 36

сутки

Рисунок 2. Динамика плодовитости в линиях М. domestica с различной ПЖ

Показатели приспособленности (жизнеспособность на стадии куколки, средняя масса пупариев, продолжительность развития на преимагинальной стадии) для двух инбредных линий близки, достоверно только различие по жизнеспособности личинок (р=0.045) - в линии Sh28 жизнеспособность личинок снижена.

При анализе динамики плодовитости в линиях Sh28 и L2 мы установили, что для линии с сокращенной ПЖ характерен частый (2 суток) воспроизводящийся ритм репродуктивных циклов, тогда как для линии с увеличенной ПЖ такой ритм не заре-

гистрирован, а сроки массовой откладки яиц существенно смещены (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о дифференциации репродуктивных стратегий для особей с разной ПЖ.

Для характеристики линий с разной ПЖ исследовали также чувствительность личинок к стрессорным воздействиям, которую расценивали как сложный феногене-тический признак. Оценив чувствительность личинок конца III стадии развития к токсикантам из 3-х различных химических классов - фипронилу (фенилпиразолы), пи-римифосметилу (фосфорорганические соединения), дельтаметрину (пиретроиды), мы установили, что для личинок из линии Ь2 показатель, характеризующий чувствительность данной линии, СК50 (концентрация, смертельная для 50% обработанных особей) выше, чем для личинок из линии 57г.2с? (табл. 1). Различия между показателями чувствительности значимы на уровне 0.05 для дельтаметрина, 0.01 для пиримифосме-тила и на уровне 0.001 для фипронила. Таким образом, для линии с большей ПЖ показана более высокая устойчивость личинок к токсическому стрессу.

Таблица 1 - Чувствительность к инсектицидам личинок комнатной мухи (III стадия) из линий с различающейся ПЖ

Линия СК50, % д.в.*

Фипронил Пиримифосметил Дельтаметрин

5/г 28 0.000123±0.00002 0.001286±0.00028 0.001005±0.00063

Ь2 0.00029±0.00007 0.001325±0.00031 0.001523±0.00041

* - д.в. - действующее вещество

Значения полулетального периода экспозиции при высокой (+65°С) температуре также ниже для особей из линий с пониженной ПЖ: для личинок Ь2 этот период составляет не менее 6.5 минут, тогда как для личинок 5А25 - не более 3 минут. Эти различия достоверны на уровне значимости 0.01. По всей видимости, для особей из линии с увеличенной ПЖ характерна более высокая устойчивость к температурному стрессу.

Оценка чувствительности имаго к изменению светового режима показала, что при постоянном содержании в темноте ПЖ в обеих линиях увеличилась достоверно, но в разной степени: на 8% в линии 5И28 и на 22 % в линии Ь2. Использование в наших экспериментах ингибитора рецепторов гамма-аминомасляной кислоты типа А (САВА-ЛА) фипронила позволило продемонстрировать зависимость ПЖ имаго комнатной мухи от участия механизмов, опосредующих влияние фотопериода.

Одна из проблем, связанных с изучением генетических основ признака ПЖ -вклад генотипа в формирование и проявление признака у потомства. В наших экспериментах была проведена оценка ПЖ самок и самцов в 30 парах, выделенных из массовых линий с коротким и длительным периодом жизни имаго, а также самок и самцов их потомства Я 1. Отмечена достаточно высокая степень корреляции ПЖ потомства с ПЖ самок родительского поколения у короткоживущих особей (коэффициент корреляции Пирсона, г, для самок составляет 0.77, для самцов 0.78 при р<0.05). Связь ПЖ самцов родительского поколения и потомства менее выражена (г для самок -0.48, для самцов - 0.54 при р< 0.05). В линиях долгоживущих особей также отмечена менее выраженная зависимость ПЖ потомства от ПЖ родительского поколения, хотя коэффициент корреляции для самок родительского поколения и потомства составлял не менее 0.56.

В серии реципрокных скрещиваний между имаго из инбредных линий мы установили, что основные признаки, по которым шел отбор, проявляются у гибридного потомства с определенными изменениями (табл. 2.).

Таблица 2 - Продолжительность жизни и плодовитость потомства в первом поколении реципрокных скрещиваний

Варианты скрещиваний Продолжительность жизни в Р1 (сутки) Плодовитость (количество яиц на 1 самку, за 20 суток)

Самки Самцы

БИ28*8И 28 25.0 ±1.1 25.0 ±8.5 28.65 ±1.05

Ь2хЬ2 36.0 ±4.0 36.0 ±12.5 30.09 ±0.25

5Уг 28 х/, 2 15.0 ±2.0* 10.5 ±1.5* 18.42 ±3.29*

£ 2 28 42.0±9.0 45.0±7.5 43.0 ±3.53*

Примечание: * - достоверное отличие от материнской линии, р < 0.05

У гибридного потомства в варианте скрещивания 57г2<§х/,2 ПЖ сократилась в среднем на 52%, тогда как в варианте скрещивания Ь2*81г28 отмечено увеличение в 1,8 раза. Расчеты фенотипической корреляции для значений ПЖ дали значения ст2 р = 0.712 для линии и 0.608 для линии £2. Коэффициент наследуемости признака 11Ж (И") составил 0.208 (р< 0.01). Результаты свидетельствуют о наличии ассортатив-ности спаривания, что выражается в снижении плодовитости при скрещиваниях в ва-

рианте 8И28*Ь2 и о повышении уровня вариабельности всех регистрируемых признаков в варианте скрещивания 28 и вариабельности ПЖ в варианте Бк28^Ъ2. Сопоставление результатов скрещивания с картиной четкого выделения двух пиков смертности как для самок, так и для самцов в исходной линии (рис. 3) позволяет нам утверждать, что в исходной полиморфной популяции присутствует не гетерогенная смесь фенотипов, а генетически обособленные вследствие ассортативности спаривания и, вероятно, наличия других видов репродуктивной изоляции группы особей, различающиеся как по репродуктивным стратегиям, так и по ПЖ.

смертность, %

1 23456789 10

Жизненный период, 50 суток

самки —— -самцы

Рисунок 3. Динамика смертности в исходной линии (S, F 45).

Обнаружение новой, сцепленной с полом мутации ломкости крыльев (/и1) у Musca domestica L. с зависимой от возраста экспрессивностью

Спустя 14-20 суток с момента выхода имаго из пупариев мы неоднократно отмечали в лабораторных линиях комнатной мухи проявление ломкости крыловой пластинки (рис. 4). После скрещивания отобранных по наличию этого фенотипа особей, все из которых оказались самцами, с виргинными самками из исходной линии, мы наблюдали в потомстве разделение самцов на две равновеликие группы - с проявлением фенотипа «ломкого крыла» и с нормальными крыльями. Далее все полученное потомство содержали как отдельную линию, периодически повторяя скрещивания внутри неё. Результаты последующих скрещиваний внутри полученного потомства представлены в таблице 3.

Рисунок 4. Проявление признака ломкой крыловой пластинки у самцов комнатной мухи.

Таблица 3 - Расщепление признаков при скрещиваниях брат/сестра

Поколение Количество самок с «диким» фенотипом Количество самок с фенотипом fw Количество самцов с «диким» фенотипом Количество самцов с фенотипом fw

Fl 20 0 23 22

F3 27 1 17 26

F7 80 0 41 39

Сохранение во всех последующих поколениях практически равных долей самцов с фенотипом fw и самцов с нормальными крыльями, а также единичные случаи встречаемости мутантного фенотипа у самок можно рассматривать как подтверждение предположения о сцепленности мутации fw с Х-хромосомой и летальном эффекте мутантного аллеля в гомозиготном состоянии, что возможно только у самок.

RAPD-анализ генотипических различий линий комнатной мухи с разной продолжительностью жизни

Проанализирована генетическая структура исходной линии комнатной мухи, а также линий, различающихся по ПЖ имаго с помощью RAPD-анализа. Для исследования был выбран праймер LD5. В итоге выявлено четыре полиморфных локуса с длинами фрагментов 1155, 475, 203 и 422 п.о. (рис. 5).

Мы провели попарные сравнения получившихся результатов посредством программы PopGene. Среднее межгрупповое разнообразие (Gst) по линиям составило 0.0876, в то время как по половой принадлежности 0.036. Данный результат показывает значительную дифференциацию между линиями в частотах RAPD-локусов. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что линии с различающейся ПЖ гено-типически значительно отличаются от исходной и друг от друга по нескольким полиморфным RAPD-локусам.

А

Б

Рисунок 5. RAPD - анализ полиморфизма ДНК линий комнатной мухи с разной продолжительностью жизни А - частоты встречаемости RAPD-маркеров ДНК имаго комнатной мухи; Б - электрофореграмма RAPD-маркеров ДНК имаго комнатной мухи.

Полиморфизм по наличию мутации kdr в линиях комнатной мухи с разной продолжительностью жизни

Основной задачей нашего исследования линий комнатной мухи является проверка предположения о генотипических различиях линий М. domestica L. с разной ПЖ. Одним из индикаторов генотипических различий между линиями комнатной мухи может служить динамика частот встречаемости мутантных генотипов. В качестве маркера была выбран полиморфизм L1014F (аллель R - 1014F, аллель S - 1014L), который возник на основе мутации kdr в гене натриевых каналов Vsscl. Частоту встречаемости генотипов определяли с помощью ПЦР в выборках из 20 имаго каждой линии S, L2 и Sh28. Согласно полученным результатам, в линиях S, L2 и Sh28 обнаруживаются носители генотипов как гетерозиготных (RS), так и гомозиготных (RR) по мутации kdr ( рис. 6).

Рисунок 6. Частоты обнаружения генотипов по полиморфному локусу кс!г в гене натриевых каналов Уже! в модельных линиях комнатной мухи.

Частоты встречаемости генотипов достоверно различаются как между каждой инбредной и исходной линиями (р<0.001), так и между обеими инбредными линиями (р<0.01). Генотип SS отсутствует у всех представленных особей. Частота генотипа RS увеличивается, а частота генотипа RR, напротив, уменьшается в линиях Sh28 и L2 по сравнению с исходной S линией. Если в линии L2 генотип RR все-таки имеется у большинства особей, то в линии Sh28 доминирует генотип RS, то есть баланс генотипов в линии L2 ближе к тому, что наблюдается в исходной линии. Резкое отличие структуры линии Sh 28 может иллюстрировать существующие между инбредными линиями генотипические различия.

Анализ ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия человека

Для исследования в популяции человека в качестве маркеров были выбраны полиморфные локусы генов-кандидатов старения и долголетия: IL6, ILIO, IL12B, TNF, JAK1, JA КЗ, STAT1, STAT3, STAT5A, NFKB1, TP53, BAX, BCL2, F0X03, IGF1. Эти гены кодируют белки, которые принимают участие в регуляции многих процессов, как на клеточном, так и на организменном уровне, и тем самым контролируют процессы развития, роста и устойчивости к стрессу.

Анализ ассоциаций частот генотипов с возрастом осуществляли с использованием разных подходов. Было проведено сравнение возрастных групп по частотам генотипов и аллелей и бинарный логистический регрессионный анализ взаимосвязи возраста и частоты генотипа. Подразделение выборки на возрастные группы было основано на схеме возрастной периодизации онтогенеза человека, учитывающей особенности морфо-функционапьных изменений организма в разном возрасте. Применение этого подхода дало возможность наблюдения за изменениями в популяции пред-

ставленности генотипов и аллелей в разные возрастные периоды. Модель логистической регрессии позволяет оценивать вероятность наблюдения генотипа как функции возраста, допуская, что частота генотипа, который влияет на индивидуальную выживаемость, может изменяться в генотипическом пуле с повышением возраста Анализ материалов исследования с помощью методов построения ROC-кривой и логистической регрессии предоставляет возможности поиска возрастных диапазонов, в пределах которых происходят изменения в распределении частот генотипов.

Основные результаты, полученные нами с использованием этого подхода, отражены в таблице 4. Принимая во внимание диапазоны лет, в пределах которых наблюдается ассоциация частот генотипов с возрастом, и величину показателя отношения шансов (0R<1 или OR>l), можно выделить отдельные группы генотипов. Одну из них составляют генотипы, которые ассоциированы с возрастом в диапазоне лет, не превышающих старческого возраста (75 лет) или включающих начало старческого периода (75-82 года). В выборке мужчин это генотипы /¿<5(-572)*G/*C (OR=0.978), IL6(-572)*G/*G (OR=1.023), IL10(-627)*C/*C (OR=0.956), /¿/0(-627)*C/*A (OR=1.034), JAK1(32454)*T/*T (OR=0.818), УЛА7(32454)*С/*Т (OR=1.201), TP53{12)* P/*R (OR=0.953), TP53(72)*P/*P (OR=1.028), BCX2(140016)*C/*C (OR=1-O17). В выборке женщин это генотипы IL6(-572)*G/*G (OR= 1.020), JAK1(32454)*T/*T (OR=0.928), JAK1{32454)*C/*T (OR=1.098), JAK1(32454)*C/*C (OR= 1.184), J//A'5(14385)*T/*C (OR=1.024), /ЛЮ(14385)*С/*С (OR=0.802), ST А T5A(l985)*T/*T (OR=0.965), STAT5A(\985)*T/*C (OR=1.044), 7P5J(72)*P/*R (OR=0.891), ГР53(72)*Р/*Р (OR=0.889), 77>5.?(72)*R/*R (OR=1.094). Можно полагать, что обозначенные генотипы являются маркерами выживаемости главным образом в пожилом возрасте. Те из них, которые «отрицательно» (0R<1) ассоциированы с возрастом у мужчин ((/¿tf(-572)*G/*C, IL10{-627)*С/*С, Л4Л7(32454)*Т/*Т, ТР53(72)*P/*R)) и женщин ((JAK1(32454)*Т/*Т, .Л4£3(14385)*С/*С, STAT5A(\9S5)*-l/*T, TP53(72)*P/*R, ТР53(П)*Р/*Р)), характеризуют часть популяции с потенциально меньшей ПЖ, в основе которой иная популяционная стратегия, чем долгожительство.

Следующая группа генотипов включает те, которые отрицательно и/или положительно ассоциированы с возрастом на протяжении главным образом старческого возрастного периода (75-89 лет) и периода долгожительства (90 и более лет), т.е. маркируют шансы выживания у тех, кто достиг старческого возраста.

Таблица 4 - Основные результаты анализа ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия в популяции татар

Ген (полиморфизм) Пол Генотип Возраст (годы) Р 01* 95% С1 ОЯ

1 2 3 4 5 6 7 8

116 (-5720С) Мужчины *с/*с 40-80 0.027 0.978 0.958 0.997

40-80 0.025 1.023 1.003 1.043

Женщины /Ю 21-74 0.023 1.020 1.003 1.037

то (-6270А) Мужчины *с/*с 23-70 <0.001 0.956 0.938 0.974

*С/*А 23-70 <0.001 1.034 1.015 1.053

*л/*л 23-70 0.022 1.034 1.005 1.064

Женщины *с/*с 22-109 0.048 0.992 0.983 0.999

1Ы2В (1159С>А) Мужчины *А/*С 37-98 0.022 0.985 0.973 0.998

Женщины *А/*А 16-50 0.014 0.962 0.932 0.992

*А/*С 16-50 0.048 1.032 1.000 1.065

ГМ^ (-3080А) Женщины *а/*а 23-95 0.008 0.986 0.975 0.996

Ю/*А 23-95 0.012 1.014 1.003 1.026

JAK¡ (32454С>Т) Мужчины *С/*Т 74-80 0.045 1.201 1.004 1.437

*т/*т 75-82 0.046 0.818 0.672 0.997

Женщины *с/*с 61-70 0.022 1.184 1.024 1.368

*с/*т 69-80 0.017 1.098 1.017 1.186

*т/*т 58-80 0.005 0.928 0.882 0.978

ЗАКЗ (14385С>Т) Женщины *т/*с 48-81 0.046 1.024 1.000 1.048

*с/*с 51-62 0.015 0.802 0.671 0.957

БТАТ1 (14228А>С) Женщины *С/*А 61 -88 0.041 1.035 1.001 1.069

*с/*с 55 -109 0.013 0.980 0.965 0.996

БТАТЗ (190060С) Мужчины *с/*с 25-98 0.027 1.016 1.002 1.031

*о/*с 73-98 0.044 0.950 0.903 0.999

8ТА Т5А (1985Т>С) Мужчины *т/*т 71-98 0.037 0.957 0.919 0.997

Женщины 46-82 0.001 0.965 0.946 0.985

*т/*с 46-82 <0.001 1.044 1.021 1.068

АФКВ1 (28081564Т>А) Мужчины *т/*т 74-87 0.007 0.872 0.790 0.963

*А/*А 48-87 0.048 1.132 1.001 1.280

Продолжение таблицы 4

1 2 3 4 5 6 7 8

ЫГКВ! (28081564Т>А) Женщины *Т/*Т 83-92 0.020 0.855 0.750 0.976

*Т/*А 82-90 0.023 1.188 1.024 1.378

*А/*А 66-94 0.036 1.139 1.008 1.287

ТР53 (р.72РЖ) Мужчины *р/*р 39-78 0.014 1.028 1.006 1.052

*Р/*Я 49-74 0.019 0.953 0.915 0.992

73-77 0.029 1.517 1.043 2.006

76-91 0.005 1.109 1.032 1.192

Женщины *р/*р 58-72 0.020 0.889 0.805 0.982

*Р/*Я 67-78 0.001 0.891 0.832 0.954

67-78 0.010 1.094 1.022 1.170

ВАХ (919А>0 Мужчины *А/*А 17-98 0.027 1.007 1.003- 1.025

*0/*0 68-98 0.008 0.908 0.845 0.975

Женщины *А/*А 75-109 0.002 1.041 1.015 1.068

*А/*в 75-109 0.013 0.968 0.943 0.993

*о/*о 80-106 0.035 0.921 0.853 0.994

ВСЬ2 (1400160Т) Мужчины *с/*с 18-79 0.01 1.017 1.006 1.050

Женщины *с/*с 65-109 0.009 0.971 0.950 0.993

50-109 0.002 1.023 1.008 1.037

РОХОЗ (с*35-2764А>С) Мужчины *А/*в 18-98 0.002 0.991 0.986 0.997

*о/*о 18-98 0.001 1.010 1.004 1.016

ЮР1 (17685А>0) Мужчины *А/*А 41-50 0.039 1.229 1.010 1.494

*д/*с 75-86 0.021 1.200 1.027 1.401

Женщины *А/*С 83-100 0.036 0.925 0.860 0.995

82-92 0.030 1.292 1.025 1.629

Отрицательно ассоциированы с возрастом в указанном диапазоне лет в выборке мужчин генотипы БТАТ3{19006)*0/*С, 5ТЛГ5Л(1985)*Т/*Т, ЛУ.КЗ/(28081564)*Т/*Т и ВАХ(9\9)*0/*С, в выборке женщин генотипы М^Й/(28081564)*Т/*Т, ВАХ(9\9)*а*0, ВСЬ2(140016)*С/*С и Л^/(17685)*А/*0. В этот же кластер входят генотипы положительно ассоциированные с возрастом в выборках мужчин ((МК1(3 2454)*С/*Т, ТР53(72)*К/*К, ЮГ1( 17685)*А/*0) и женщин

(ЛОТШ(28081564)*Т/*А, Л^А'В/(28081564)*Л/*А( ЯЛД919)*А/*А,

ВС£2(140016)*Т/*Т, /0/^/(17685)*С/*0)). Таким образом, выявлены генотипы, вероятность представленности которых в популяции татар среди долгожителей понижена или повышена Шансы дожития до 100 и более лет повышены у женщин старческого возраста с генотипами ВС12(140016)*Т/*Т, ВЛД919)*А/*А. Также выявлены положительные ассоциации с возрастом в широком диапазоне лет генотипов РОХОЗ(с*Ъ5-2764)*0/*0 и ВАХ(919)*А/*А (18-98 лет), 57МП(19006)*С/*С (25-98 лет) у мужчин, генотипа ГЛ7Г(-308)*0/*А (23-95 лет) у женщин. Эти генотипы можно расценивать как предрасполагающие в популяции татар к долгожительству.

Сведения о функциональной значимости аллельных вариантов анализируемых генов ограничены и противоречивы, поэтому обоснование наблюдаемых ассоциаций частот генотипов с возрастом затруднительно. Однако согласно литературным данным, полиморфизм целого ряда генов, и, в частности, генов цитокинов, ТР53, ШКВ1 и других из анализируемых в данном исследовании, может вносить вклад в заболеваемость и смертность людей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как следует из полученных нами результатов, вариабельность продолжительности жизни в модельных линиях комнатной мухи не является случайной. Сосуществование в исходной популяции генетически обособленных групп, различающихся по ПЖ, может объясняться плейотропными эффектами главных генов, контролирующих скорость и успех онтогенеза, трансформации в ходе метаморфоза, выбор репродуктивной стратегии. Популяционные механизмы, участвующие в реализации жизненной программы, исследуются на модельных популяциях, поскольку человек не может быть объектом подобных экспериментов. Однако универсальный характер проявления действия плейотропных генов, выражающийся в изменении интегральных показателей, и в первую очередь - продолжительности жизни, в равной мере может наблюдаться и в популяциях человека. Наблюдаемое нами в линии 57128 сокращение ПЖ сопряжено с изменением репродуктивной стратегии - укорочением и учащением репродуктивного цикла, что сопровождается изменениями и других показателей, в том числе устойчивости к стрессам. Сопоставление динамики частот генотипов, ассоциированных с ПЖ в популяциях человека, с процессами, наблюдаемыми при дивергенции по признаку ПЖ в модельных популяциях комнатной мухи, позволит подойти к пониманию роли генетического полиморфизма в определении ПЖ.

выводы

1. Сформированные по признаку продолжительности жизни модельные линии комнатной мухи Musca domestica L. Sh28 и L2 достоверно отличаются как по феногенети-ческим характеристикам (показателям успешности развития, репродуктивным стратегиям и чувствительности к стрессовым воздействиям), так и по частотам полиморфных RAPD-локусов и мутации kdr в гене vsscl.

2. Для особей из линии с сокращенной продолжительностью жизни Sh28 характерен ускоренный ритм репродуктивных циклов, тесная связь продолжительности жизни и репродуктивного периода, а также высокий уровень корреляции продолжительности жизни самок с продолжительностью жизни потомства, что позволяет считать материнское влияние важным фактором вариабельности продолжительности жизни.

3. Описана ранее не выявленная для имаго комнатной мухи мутация ломкости крыльев с зависимой от возраста экспрессивностью. Гибридологический анализ мутации позволяет сделать вывод о сцепленности мутации с Х- хромосомой и о летальном эффекте мутантного аллеля в гомозиготном состоянии.

4. Выявлены генотипы, относительные шансы представленности которых понижены в старческом возрасте в популяции человека: генотипы IL6(-512)*G/*C, IL10(-627)*С/*С, JAK1{32454)*Т/*Т, TP53(12)*?/*R среди мужчин, генотипы JAKl(b2A5A) *Т/*Т, ./ЛЮ(14385)*С/*С, S7M7X4(1985)*T/*T, 7P53(72)*P/*R, ТР53(72)*Р/*Р среди женщин в популяции татар. Можно полагать, что обозначенные генотипы являются маркерами выживаемости главным образом в пожилом возрасте и характеризуют часть популяции с потенциально меньшей ПЖ, в основе которой иная популяционная стратегия, чем долгожительство.

6. Обнаружены генотипы, которые можно расценивать как маркеры выживания в популяции татар у индивидов, достигших старческого возраста В старческом возрасте к большей продолжительности жизни предрасполагают среди мужчин генотипы JAK1(32454)*С/*Т, TP53(72)*R/*R, и 7GF/(17685)*A/*G, среди женщин генотипы ЛтаГВ/(28081564)*Т/*А, №0/(28081564)*А/*А, ВАХ( 919)*А/*А,

ВCL2(140016)*Т/*Т, IGF1{ 17685)*G/*G. Шансы дожития до 100 и более лет повышены у женщин старческого возраста с генотипами BCL2{ 140016)*Т/*Т, ВАХ(919)*А/*А.

1. Выявлены генотипы, предрасполагающие в популяции татар к долгожительству: генотипы FOTO.?(c*35-2764)*G/*G, ВАХ(919)*А/*А и 5ГЛ73(19006)*С/*С среди мужчин, генотипы TNF(-308) *G/*А среди женщин.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах m перечня ВАК

1. Мустафина, О.Е. Полиморфизм -627С>А гена интерлейкина 10: анализ ассоциаций с сердечно-сосудистыми заболеваниями / О.Е. Мустафина, Я.Р. Тимашева, Г.Х., Ту-лякова, Т.Р. Насибуллин, И.А. Туктарова, В.В. Паук, Р.Ш. Мустафина (Сомова), А.А. Саль-манов, А.Н. Закирова, И.М. Карамова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2010. -№5,- С. 12-17.

2. Мустафина, О.Е. Полиморфизм генов цитокинов и долголетие человека / О.Е. Мустафина, В.В. Паук, Р.Ш. Мустафина (Сомова), И.А. Туктарова, Т.Р. Насибуллин // Успехи геронтологии. - 2010. - Т.23. - №¡3. - С. 339-345.

3. Беньковская, Г.В. Выявление новой сцепленной с полом мутации ломкости крыльев (FW) у Musca domestica L. с зависимой от возраста экспрессивностью / Г.В. Беньковская, Р.Ш. Мустафина (Сомова) //Генетика. - 2012.-Т. 48. - №2. - С. 266-269.

4. Беньковская, Г.В. Влияние светового режима на биохимические показатели развития стресс-реакции в линиях Musca domestica L. с различной продолжительностью жизни / Г.В. Беньковская, Р.Ш. Мустафина (Сомова) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2012. - Т. 48. - № 5. - С. 433-438.

Публикации в других изданиях

5. Беньковская, Г.В. Варианты реализации жизненной программы: модельные линии Musca domestica L. с различной продолжительностью жизни / Г.В. Беньковская, Ю.М. Никоноров, Р.Ш. Сомова, М.Б. Удалов // Прикладная энтомология. - 2011. - Т. 2. - № 6. - С. 21-25.

6. Benkovskaya, G.V. Life span and reproduction in Musca domestica L.: nuclear and mitochondrial DNA ratio in house fly strains with différent displacement of reproductive efforts / G.V. Benkovskaya, Yu.M. Nikonorov, R.Sh. Mustafina (Somova) // Résistant Pest Management Newsletter. - 2011. - V. 20. - No. 2. - P. 48 - 50.

7. Мустафина, О.Е. Полиморфизм генов-кандидатов продолжительности жизни в популяции татар / О.Е. Мустафина, В.В. Эрдман, Т.Р. Насибуллин, Р.Ш. Мустафина (Сомова), И.А. Туктарова //Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г. - Мед. Генетика,- 2010,- №2,- С. 122.

8. Беньковская, Г.В. Реакция на действие антагониста GABA (А)-рецептора фи-пронила и смену светового режима в линиях комнатной мухи, различающихся по продолжительности жизни / Г.В. Беньковская, Р.Ш. Мустафина (Сомова) // Материалы VII Межрегионального совещания энтомологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 4-7 октября 2010 г. - Новосибирск, 2010. - С. 244 - 246.

9. Мустафина (Сомова), Р.Ш. Полиморфизм гена STAT3 и долголетие / Р.Ш. Мустафина (Сомова) //Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».-2011. - С.83 (http://Iomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2011/ structure_2_1392.htm).

10. Erdman, V. . Role of some apoptosis genes polymorphism in aging and longevity / V. Erdman, I. Tuktarova, T. Nasibullin, R. Mustafma, О Mustafina // European Human Genetics Conference. - Amsterdam, 2011.-P.341.

11. Беньковская, Г.В. Влияние светового режима на биохимические показатели развития стресс-реакции в линиях Musca domestica L. с различной продолжительностью жизни/ Г.В. Беньковская, Р.1П. Мустафина (Сомова) // Материалы Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». Санкт-Петербург, 2011,- С. 20.

12. Benkovskaya, G.V. Life span and reproduction in Musca domestica L.: nuclear and mitochondrial DNA ratio in house fly strains with different displacement of reproductive efforts / G.V. Benkovskaya, Y.M. Nikonorov, R.S. Mustafma //Sixth International Symposium on Molecular Insect Science. 2-5 October, 2011, Amsterdam, The Netherlands. - P. 2.11.

13. Сомова, Р.Ш. Полиморфизм генов JAK-STAT сигнального пути в популяции татар/ Р.Ш. Сомова / В сб: Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов. Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых. 24-26 сентября 2012 г. - Уфа, 2012. - С.152-155.

14. Mustafina, О. Polymorphism of genes and human longevity: association studies deliver // 2nd International conference Genetics of aging and longevity. / O. Mustafina, V. Erdman, R. Somova, T. Nasibullin, I. Tuktarova. - Moskow, 2012. - P. 63.

15. Эрдман, B.B. Исследование возрастной динамики частот генотипов по полиморфным маркерам генов-кандидатов старения и долголетия / В.В. Эрдман, Т.Р. Насибул-лин, И.А. Туктарова, Р.Ш. Сомова, О.Е. Мустафина // V всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий». - Новосибирск, 2012. - С.125.

16. Benkovskaya, G.V. Models of life programme realization: strains of Musca domestica L. with different life span / G.V. Benkovskaya, Y.M. Nikonorov, R.Sh. Somova, M.B. Udalov // 2nd International Conference Genetics of aging and longevity. Moscow, April 22-25, 2012. Abstract book. - Moscow, 2012. - P. 10-11.

17. Эрдман, B.B. Продолжительность жизни и генетический полиморфизм / В.В. Эрдман, Т.Р. Насибуллин, И.А. Туктарова, Р.Ш. Сомова, Д.Д. Каримов, О.Е. Мустафина // Конференция ВОГиС «Проблемы генетики и селекции». - Новосибирск, 1 - 7 июля 2013 г. http://conf.nsc.rU/files/conferences/vogis2013/.pdf

18. Мустафина (Сомова), Р.Ш. Исследование молекулярно-генетических основ продолжительности жизни на модельном объекте Musca domestica Ь.Мустафина (Сомова) Р.Ш., Беньковская Г.В. // Конференция ВОГиС «Проблемы генетики и селекции». - Новосибирск, 1 - 7 июля 2013 г. http://conf.nsc.ni/files/conferences/vogis2013/.pdf

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 19. Подписано в печать 20.11.2013 г. Формат 60x84,1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 01,07 Уч.-изд. л. 01,44 Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сомова, Регина Шамилевна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

л/ 1 лЛ / С/ЛАО \Л ¡.vnJTtV7

СОМОВА РЕГИНА ШАМИЛЕВНА

Молекулярно-генетическое исследование долголетия и старения на ¡модельных линиях Musca domestica L. и в популяции человека

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Беньковская Г. В.

Уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1 Обзор литературы 12

1.1 Современные концепции природы старения..................................................................................12

1.2 Феномен долгожительства человека....................................................................................................15

1.3 Достижения молекулярно-генетических исследований в познании природы 20 старения и долголетия....................................................................

1.3.1 Основные итоги исследований старения и долголетия, проведенных на 20 модельных организмах...................................................................

1.3.2 Основные результаты поиска генов старения и долголетия человека....................28

1.3.2.1 Итоги поиска генов старения и долголетия человека с использованием 29 больших родословных....................................................................

1.3.2.2 Итоги анализа ассоциаций аллельных вариантов генов-кандидатов с 30 возрастом человека........................................................................

1.3.2.3 Достижения полногеномных исследований старения и долголетия человека 32

1.3.2.4 Результаты полногеномного секвенирования супердолгожителей............................36

1.3.2.5 Итоги анализа транскрипционной активности и профиля метилирования 38 генов при старении........................................................................

Глава 2 Материалы и методы исследования........................................................................................................44

2.1 Материалы и методы исследования на модельном организме Musca 44 domestica L..................................................................................

2.1.1 Ведение культуры комнатной мухи Musca domestica L......................................................44

2.1.2 Условия экспериментов по развитию стресс-реакции в линиях Musca domestica L. с различной продолжительностью жизни........................................................45

2.1.3 Выявление особей с фенотипом ломкого крыла (fw) в линиях, различающихся по продолжительности жизни............................................................................45

2.1.4 Выделение ДНК из насекомых..................................................................................................................46

2.1.5 Выявление мутации kdr гена натриевых каналов Vsscl в линиях комнатной мухи....................................................................................................................................................................................47

2.1.6 RAPD анализ ДНК имаго комнатной мухи......................................................................................48

2.2 Материалы и методы молекулярно-генетического исследования старения и долголетия в популяции человека............................................................................................................50

2.2.1 Выделение ДНК из периферической крови человека............................................................53

2.2.2 Метод полимеразной цепной реакции..................................................................................................53

2.2.3 Метод электрофореза..........................................................................................................................................57

2.2.4 Статистическая обработка результатов исследования............................. 58

Глава 3 Результаты и обсуждение................................................................ 59

3.1 Молекулярно-генетическое исследование вариабельности продолжительности жизни на модельном объекте Musca domestica L......... 59

3.1.1 Фенотипический полиморфизм в модельных линиях комнатной мухи........ 60

3.1.1.1 Характеристика линий комнатной мухи с разной продолжительностью

жизни.......................................................................................... 60

3.1.2. Обнаружение новой, сцепленной с полом мутации ломкости крыльев {fw) у

Musca domestical; с зависимой от возраста экспрессивностью................. 71

3.1.3 Генетический полиморфизм в модельных линиях комнатной мухи............ 74

3.1.3.1 RAPD-анализ генотипических различий линий комнатной мухи с разной продолжительностью жизни............................................................ 74

3.1.3.2 Полиморфизм по наличию мутации kdr в линиях комнатной мухи с разной продолжительностью жизни............................................................ 76

3.2 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия человека........................................................ 78

3.2.1 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов цитокинов.... 78

3.2.1.1 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса -572G>C гена IL6... 79

3.2.1.2 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса -627С>А гена ILIO... 84

3.2.1.3 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса -1159С>А гена IL12B.......................................................................................... 89

3.2.1.4 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса -308G>A гена TNF... 91

3.2.2 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов JAK/STAT сигнального пути........................................................................... 95

3.2.2.1 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 32454С>Т гена JAK1...................................................................................................... 96

3.2.2.2 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 14385С>Т гена JAK3........................................................................................... 99

3.2.2.3 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 14228А>С гена STAT1......................................................................................... 102

3.2.2.4 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 19006G>C гена STAT3......................................................................................... 105

3.2.2.5 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 1985Т>С гена STAT5A...................................................................................... 107

3.2.3 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 28081564Т>А гена

АТРКВ1................................................................................................................................................................................109

3.2.4 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса р.Р72Я гена ТР53... 114

3.2.5 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфных локусов генов апоптоза ВСЬ2 и ВАХ.................................................................................................................................................................121

3.2.5.1 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 919А>0 гена В АХ... 122

3.2.5.2 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса gl40016C>T гена ВСЬ2....................................................................................................................................................................................126

3.2.6 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса с*35-2764А>0 гена РОХОЗ..............................................................................................................................................................................131

3.2.7 Анализ ассоциаций с возрастом полиморфного локуса 17685А/в гена ЮР1 134

Заключение..........................................................................................................................................................................................138

Выводы....................................................................................................................................................................................................145

Список цитированной литературы................................................................................................................................146

Приложения........................................................................................................................................................................................175

Приложение А....................................................................................................................................................................................176

Приложение Б....................................................................................................................................................................................212

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПДРФ

пж

ПЦР

Sh L

RAPD IL6 1110 IL 12В TNF JAK1 JAK3 STAT1 STAT3 STAT5А

NFKB1

ТР53

ВАХ

BCL2

F0X03

IGF1

SNP (ОНП) LOD

GWAS

Р Р

OR

полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

— продолжительность жизни

— полимеразная цепная реакция

— Short span (короткая ПЖ)

— Long span (длинная ПЖ)

— Random Amplified Polymorphic DNA

— ген интерлейкина 6

— ген интерлейкина 10

— ген субъединицы бета интерлейкина 12

— ген фактора некроза опухолей альфа

— ген янус киназы 1

— ген янус киназы 3

— ген белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 1

— ген белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 3

— ген белка сигнальной трансдукции и активации транскрипции 5А

— ген субъединицы р150 (р50) ядерного транскрипционного фактора «каппа би»

— ген белка р53

— ген белка Вах

— ген белка Вс12

— ген траскрипционного фактора F0X03

— ген инсулиноподобного фактора роста-1

— single-nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

— logarithm (base 10) of odds (десятичный логарифм соотношения правдоподобий)

— Genome Wide Association Studies (полногеномный анализ ассоциаций)

— экспериментальный уровень значимости различий

— вероятность события

— частота аллеля или генотипа

— ошибка частоты аллеля или генотипа

— Odds ratio (показатель соотношения шансов наступления события)

ВВЕДЕНИЕ

Во второй половине XX века сформировался феномен "седеющего населения". Произошло увеличение численности лиц пожилого и старческого возраста в развитых странах мира, а также и в Российской Федерации. В целом процесс демографического старения носит глобальный характер, необратим, и в первой половине XXI века его темпы увеличатся.

В связи с выраженной тенденцией постарения населения актуальной и социально значимой является проблема сохранения физических, психических и интеллектуальных качеств человека в преклонном возрасте. Поэтому Всемирная ассамблея ООН в 2002 г. приняла программу по исследованию старения в XXI веке. В настоящее время активно формируется новое направление фундаментальной и прикладной науки, посвященное профилактике старения. В рамках такого направления пожилые, старые люди и долгожители представляют значительный интерес как объект всестороннего изучения. Медико-биологические исследования с их участием необходимы для развития фундаментальных представлений о самом феномене старения, выявления факторов и маркеров риска возраст-зависимых заболеваний, разработки стратегии увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества в пожилом и старческом возрасте, формирования современных подходов направленной на снижение скорости старения и его последствий терапии (т.е. антивозрастной терапии), а также системы предикторов потенциального возраста дожития. Все это имеет значение для создания рекомендаций по продлению жизни и сохранению активного долголетия.

Вопрос о причинах вариабельности продолжительности жизни (ПЖ) человека, о том, почему одни люди доживают до весьма преклонного возраста, а другие не доживают, остается дискутабельным. К настоящему времени сложилась концепция, согласно которой на ПЖ человека могут оказывать влияние множество факторов различной природы. Их подразделяют на случайные (стохастические), экологические и генетические факторы. О важной роли наследственных факторов в детерминации ПЖ человека свидетельствуют семейная наследуемость долголетия, высокая конкордантность ПЖ однояйцовых близнецов, наследственные болезни преждевременного старения детей и взрослых (прогерии), низкая жизнеспособность организмов с нарушенным генотипом. Вклад наследственности в вариабельность ПЖ по разным оценкам составляет около 25%. В разные периоды онтогенеза роль генетических факторов неодинакова. Влияние

генетических факторов на ПЖ минимально в возрасте до 60 лет, но наиболее существенно в возрасте от 85 лет и старше [Franceschi et al., 2007].

Несмотря на очевидную роль наследственности в вариабельности ПЖ человека, остается открытым вопрос о том, какой вклад в вариабельность ПЖ вносит генетический полиморфизм, аллельные варианты каких генов детерминируют большую или меньшую ПЖ человека, его долголетие. Стратегия научного поиска в данной области базируется на таких основных подходах, как ассоциативные исследования с использованием аллельных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия (candidate gene association studies), анализ ассоциаций с использованием большого числа полиморфных локусов в качестве маркеров (Genome-Wide Association Studies - GWAS), эксперименты на модельных организмах. При выполнении ассоциативных исследований проводится сравнение групп индивидов разного возраста. Предполагается, что частоты аллелей и генотипов, которые влияют на индивидуальную выживаемость, могут изменяться в генотипическом пуле с повышением возраста, и среди индивидов, доживших до преклонного возраста (стариков и долгожителей), частота встречаемости аллельных вариантов генов, которые способствуют большей ПЖ, должна быть повышена.

Поиск аллельных вариантов генов, предрасполагающих к большей ПЖ с сохранением физического и психического здоровья, другими словами к «активному» долголетию, представляет значительные трудности. Этот поиск предполагает предварительный отбор тех генов, чьи продукты обладают плейотропными эффектами и занимают ключевые позиции в регуляции процессов, играющих важную роль в реализации механизмов старения (свободнорадикальных, воспалительных, аутоиммунных и апоптотических), и тех генов, которые детерминируют процессы развития, роста, устойчивости к стрессу. Для обоснования выбора имеют значение итоги исследований молекулярно-генетических основ сердечнососудистых, нейродегенеративных, онкологических и многих других заболеваний, ограничивающих ПЖ. Также в этом отношении большое значение имеют и результаты экспериментов, проведенных на модельных организмах, согласно которым ПЖ может существенно изменяться в результате манипуляций с геномом (нокаут генов, изменении числа копий генов и др.).

На протяжении ряда лет в связи с результатами исследований разного характера формируется список потенциальных генов старения и долголетия человека, который включает несколько десятков генов [http://genomics.senescence.info/]. К потенциальным генам долголетия относятся гены, вовлеченные в регуляцию репарации ДНК и ядерных структур, регуляцию длины теломер, гены «устойчивости к стрессу и оксидативному повреждению», гены митохондриальной ДНК, гены, опосредующие эффект рестрикции

калорий, инсулиновый сигналинг, липофильный сигналинг гонад, JNK- и TOR-сигналинг, гены «иммунного ответа и воспаления» [Barbieri et al., 2003; Kaeberlein, 2007; Kennedy, 2008; Balazsi, 2010; Slagboom et al., 2011; Selman, Withers, 2011].

К настоящему времени полиморфизм генов-кандидатов долголетия исследован в ограниченном числе популяций. Получены сведения о том, что ПЖ человека ассоциирована с полиморфизмом генов аполипопротеинов В, Е, AIV, CI, CIII {АРОВ, АРОЕ, АРОА4, АРОС1, АРОСЗ), ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), параоксоназы 1 (PON1), белка-переносчика эфиров холестерина (СЕРТ), тирозингидроксилазы (ТНО), белка рбб (SHC1), р53 (ТР53). Выявлены также ассоциации с ПЖ аллельных вариантов генов, связанных с функционированием иммунной системы и развитием воспаления: аллельных вариантов генов гистосовместимости (HLA-DRB1 и HLA-DQ), интерлейкина 10 (IL10), интерлейкина 19 (IL19), белка маренострина (MEFV), микросомального триглицерид-переносящего белка, белков семейства FOXO (FOXOIA и F0X03A) [Willcox et al., 2006, 2008; Lescai et al, 2009; Flachsbart et al., 2009; Humbert et al., 2009; Jylhava, Hurme, 2010; Pawlikowska et al., 2009]. Однако существует настоятельная необходимость подтверждения этих результатов для других популяций. В независимых когортных исследованиях подтверждены ассоциации с долголетием для полиморфных локусов генов АРОЕ, FOXOIA, F0X03A и АКТ1 [Franceschi et al., 2007; Lunetta et al., 2007; Lescai et al., 2009; Boyden et al., 2010; Newman et al., 2010; Sebastiani et al., 2010; Deelen et al., 2011].

Свободен от предварительно выдвигаемых гипотез о генах-кандидатах полногеномный анализ ассоциаций (GWAS - Genome Wide Association Studies). В одном из таких исследований показано, что продолжительность жизни ассоциирована с генами FOXOIA, GAPDH, KL, LEPR, PON1, PSENl, SOD2 и WRN [Lunetta K.L. et al., 2007]. В нескольких исследованиях GWAS по проблеме долголетия не было выявлено статистически значимых ассоциаций. Полагают, что для исследований такого рода необходимо формирование весьма обширных коллекций ДНК. Более того, результаты репликативных исследований с применением метода GWAS далеко не всегда совпадают [Franceschi et al., 2007; Lescai et al., 2009; Boyden et al., 2010; Newman et al., 2010; Sebastiani et al., 2010; Deelen et al., 2011].

Отдельной важной задачей является исследование полиморфизма генов-кандидатов долголетия в популяциях разных народов мира. Особенности генетической структуры популяций, обусловленные полиморфизмом генов долголетия, могут лежать в основе популяционно-специфической вариабельности ПЖ, а также и групповых эффектов долгожительства, наблюдаемых в популяциях некоторых народов мира.

К настоящему времени становится понятным, что из большого числа генов-кандидатов старения и долголетия человека многие являются эволюционно консервативными. Поэтому для исследования роли генетических факторов в детерминации ПЖ, проверки тех или иных гипотез о роли отдельных генов представляют значительный интерес модельные организмы.

Можно полагать, в вариабельность ПЖ вносят существенный вклад сочетанные эффекты многих генов, и организмы с разной ПЖ будут отличаться по спектру аллельных вариантов таких генов. Тогда следует ожидать, что организмы с генетически детерминированными различиями по ПЖ имеют и фенотипические различия (например, по репродуктивной стратегии, чувствительности к стрессу и прочим). Исследование взаимосвязи генетического полиморфизма, вариабельности ПЖ и фенотипических особенностей важно для выявления причин и условий, необходимых для увеличения ПЖ. В целом общее положение о роли генети